Advanced Fermentation and Cell

Technology, 2 Volume Set Byong H.

Lee
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/advanced-fermentation-and-cell-technology-2-volume
-set-byong-h-lee/
Advanced Fermentation
and Cell Technology
Advanced Fermentation
and Cell Technology
Volume 1

Byong H. Lee
SportBiomics, CA, USA and Heilenex Pharma Inc., Toronto, Canada
Kangwon National University, Chuncheon, South Korea
Jiangnan University, Wuxi, China
McGill University and AAFC, Quebec, Canada
Advanced Fermentation
and Cell Technology
Volume 2

Byong H. Lee
SportBiomics, CA, USA and Heilenex Pharma Inc., Toronto, Canada
Kangwon National University, Chuncheon, South Korea
Jiangnan University, Wuxi, China
McGill University and AAFC, Quebec, Canada
This edition first published 2022
© 2022 John Wiley & Sons Ltd
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or
transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording or
otherwise, except as permitted by law. Advice on how to obtain permission to reuse material from
this title is available at http://www.wiley.com/go/permissions.
The right of Byong H. Lee to be identified as the author of this work has been asserted in accordance
with law.
Registered Offices
John Wiley & Sons, Inc., 111 River Street, Hoboken, NJ 07030, USA
John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex, PO19 8SQ, UK
Editorial Office
The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex, PO19 8SQ, UK
For details of our global editorial offices, customer services, and more information about Wiley
products visit us at www.wiley.com.
Wiley also publishes its books in a variety of electronic formats and by print-on-demand. Some
content that appears in standard print versions of this book may not be available in other formats.
Limit of Liability/Disclaimer of Warranty
While the publisher and authors have used their best efforts in preparing this work, they make no
representations or warranties with respect to the accuracy or completeness of the contents of this
work and specifically disclaim all warranties, including without limitation any implied warranties of
merchantability or fitness for a particular purpose. No warranty may be created or extended by sales
representatives, written sales materials or promotional statements for this work. The fact that an
organization, website, or product is referred to in this work as a citation and/or potential source of
further information does not mean that the publisher and authors endorse the information or
services the organization, website, or product may provide or recommendations it may make. This
work is sold with the understanding that the publisher is not engaged in rendering professional
services. The advice and strategies contained herein may not be suitable for your situation. You
should consult with a specialist where appropriate. Further, readers should be aware that websites
listed in this work may have changed or disappeared between when this work was written and when
it is read. Neither the publisher nor authors shall be liable for any loss of profit or any other
commercial damages, including but not limited to special, incidental, consequential, or other
damages.
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
Names: Lee, Byong H., author.
Title: Advanced fermentation and cell technology / Byong H. Lee,
SportBiomics, CA, USA and Heilenex Pharma Inc., Toronto, Canada, Kangwon National
University, Chuncheon, South Korea, Jiangnan University, Wuxi, China, McGill University and
AAFC, Quebec, Canada.
Description: Hoboken, NJ, USA : Wiley-Blackwell, 2022. | Includes
bibliographical references and index.
Identifiers: LCCN 2020026477 (print) | LCCN 2020026478 (ebook) | ISBN
9781119042761 (cloth) | ISBN 9781119042785 (adobe pdf) | ISBN
9781119042778 (epub)
Subjects: LCSH: Fermentation. | Industrial microbiology.
Classification: LCC TP505 .L44 2021 (print) | LCC TP505 (ebook) | DDC
660/.28449–dc23
LC record available at https://lccn.loc.gov/2020026477
LC ebook record available at https://lccn.loc.gov/2020026478
Cover Design: Wiley
Cover Images: Tubular bioreactors filled green algae fixing CO2 © Santiago Urquijo / Getty Images,
Cultures growing on Petri dishes © WLADIMIR BULGAR/SCIENCE PHOTO LIBRARY / Getty
Images, CAR T cell immunotherapy, illustration © KEITH CHAMBERS/SCIENCE PHOTO
LIBRARY / Getty Images, Bison or Aurochs in winter season in their habitat © danm / Getty
Images, CoronaVirus CopySpace © BlackJack3D / Getty Images, illustration 3d DNA Spin Futuristic
digital background, Abstract background for Science and technology © Jackyenjoyphotography /
Getty Images
Set in 9/11pt and TimesTenLTStd by Straive, Chennai, India

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Contents

Volume 1

Preface ix

Overview on Market Size of Bioproducts and Fundamentals of Cell Technology xiii

Part I 1

1 Microbial Cell Technology 1

1.1 Basic bacterial growth and mode of fermentation 1
1.2 Basic fungal growth 22
1.3 Classical strain improvements and tools 26
1.3.1 Natural selection and mutation 26
1.3.2 Recombination 30
1.4 Modern strain improvement and tools 32
1.4.1 Genome shuffling 33
1.4.2 Recombinant DNA technology 34
Summary 58
1.4.3 RNA interference (RNAi) and CRISPR/Cas technology for genome editing 59
Summary 72
1.4.4 Molecular thermodynamics and down-stream processes on bioproducts 72
Summary 83
1.4.5 Protein engineering 84
Summary 91
1.4.6 Genomics, proteomics, metagenomics, and bioinformatics 91
Summary 99
1.4.7 Systems/synthetic biology and metabolic engineering 100
Summary 106
1.4.8 Quorum sensing and quenching 106
Summary 110
1.5 Bioengineering and scale-up process 111
1.5.1 Microbial and process engineering factors affecting performance and economics 114
1.5.2 Fermenter and bioreactor systems 114
1.5.3 Mass transfer concept 116
1.5.4 Heat transfer concept 120
1.5.5 Mass and heat transfer practice 123
1.5.6 Scale-up and scale-down of fermentations 137
1.5.7 Scale-up challenges 146
Summary 150
vi CONTENTS

1.6 New bioprocesses of fermentation 150

1.6.1 Growth-arrested bioprocesses 150
1.6.2 Integrated bioprocesses 154
1.6.3 Consolidated bioprocessing (CBP) 158
Summary 160
Bibliography 161

Part II 173

2 Applications of Microbial Fermentation to Food Products, Chemicals and

Pharmaceuticals 173
2.1 Fermented dairy products 173
2.1.1 Basic knowledge of manufacture of dairy products 177
2.1.2 Genetic engineering of lactic acid bacteria 186
Summary 197
Bibliography 197
2.2 Fermented meat and fish products 199
2.2.1 Fermented meat products 199
2.2.2 Fermented fish products 204
Summary 207
Bibliography 208
2.3 Fermented vegetable and cereal products 209
2.3.1 Fermented vegetable products 209
2.3.2 Fermented cereal products 214
Summary 219
Bibliography 220
2.4 Organic acids 220
2.4.1 Acetic acid 221
2.4.2 Citric acid 224
2.4.3 Lactic acid 225
2.4.4 Malic acid 227
2.4.5 Fumaric acid 228
Summary 229
Bibliography 230
2.5 Fermentation-derived food and feed ingredients 231
2.5.1 Flavors and amino acids 232
Summary 247
2.5.2 Sweeteners 249
Summary 259
Bibliography 260
2.5.3 Vitamins and pigments 264
Summary 274
Bibliography 274
2.5.4 Microbial polysaccharides and biopolymers 276
Summary 291
Bibliography 293
2.6 Bacteriocins and bacteriophages 296
2.6.1 Bacteriocins 296
2.6.2 Bacteriophage 307
Summary 309
Bibliography 310
2.7 Enzymes 314
Summary 330
Bibliography 331
2.8 Biomass (SCP) and mushrooms 332
 CONTENTS vii

2.8.1 Biomass (SCP) 332

2.8.2 Mushrooms 343
Summary 347
Bibliography 347
2.9 Functional foods and nutraceuticals 349
2.9.1 Probiotics and prebiotics 349
2.9.2 Microbiome 364
Summary 373
Bibliography 374
2.10 Alcoholic beverages 385
2.10.1 Beer 386
2.10.2 Wine 393
Summary 400
Bibliography 401
2.11 Other fermentation chemicals 401
2.11.1 Bioethanol 402
Summary 412
Bibliography 412
2.11.2 Biobutanol 414
Summary 424
2.11.3 Biobutanediol 425
Summary 433
Bibliography 434
2.11.4 Biodiesel 438
Summary 444
Bibliography 445
2.11.5 Biomethane 446
Summary 453
Bibliography 454
2.11.6 Biohydrogen 455
Summary 465
Bibliography 465
2.12 Pharmaceuticals, growth promoters, and biopesticides 467
2.12.1 Antibiotics 467
2.12.2 Antibiotic (or antimicrobial) growth promoters (AGPs) 489
Summary 496
Bibliography 498
2.12.3 Antitumor drugs 503
Summary 531
Bibliography 532
2.12.4 Steroids 536
2.12.5 Statins 551
Summary 561
Bibliography 562
2.12.6 Biopesticides 568
Summary 575
Bibliography 575
Contents

Volume 2

Preface vii

Part III 579

3 Animal Cell Technology 579

3.1 Animal cell culture 579
3.1.1 Introduction 579
3.1.2 Techniques of RNAi and CRISPR 580
3.1.3 Animal cell lines 580
3.1.4 Upstream and downstream bioprocessing 590
3.1.5 Strain development of animal cell cultures 593
3.1.6 Applications of animal cell cultures 595
3.2 Transgenic animal bioreactors 661
3.2.1 Introduction and techniques 661
3.2.2 Applications of transgenic animals 664
Summary 672
Bibliography 673

Part IV 687

4 Plant Cell Technology 687

4.1 Introduction 687
4.2 Plant tissue culture 689
4.3 Applications of plant tissue culture 697
4.3.1 Traditional plant breeding (non-recombinant DNA techniques) 698
4.3.2 General media for plant tissue culture 739
4.3.3 Bioreactor types of plant cell cultures 741
4.3.4 Modern plant breeding or Biotech/GM crops (recombinant DNA techniques) 759
Summary 781
Bibliography 782
vi CONTENTS

Part V 801

5 Safety Issues of New Biotechnologies on Microbial, Animal, and Plant Cells 801
5.1 Introduction 801
5.2 Safety evaluation of novel foods and cell culture products 802
5.2.1 Genetically modified microorganisms and their products 804
5.2.2 Genetically modified animal cell cultures, animals, fishes and their products 807
5.2.3 Genetically modified plants and their products 820
Summary 830
Bibliography 831

Index 835
Preface

The term fermentation derived from the Latin verb fevere (boil) used by humans for the
production of food and beverages since the Neolithic age is the oldest of all biotechno-
logical processes. The fermentation process used in the production of antibiotics, alco-
hol, bread, vinegar and other food or industrial products differs from respiration in that
organic substances rather than molecular oxygen are used as electron acceptors. After suc-
cessful microbial fermentation processes on microbial cells (biomass), microbial enzymes,
microbial metabolites including antibiotics, and other fermented foods, currently more
than 3500 different fermented foods are consumed by humans worldwide. The potential
of fermentation techniques was dramatically increased in the late 1960s and 1970s through
achievements in molecular genetics, cell fusion, and enzyme technology. However, addi-
tional completely novel, powerful techniques such as genetic engineering via recombinant
DNA technology in 1973 and hybridoma technology (monoclonal antibody) in 1975 were
responsible for the current biotechnology boom.
In genetic engineering, a known gene is inserted into a microbial, animal, or plant cell in
order to achieve a desired trait for the overproduction of target compounds, but microor-
ganisms have played a major role in the development of biotechnology. This is due to the
rapid growth of microbes, cheap growth media, massive diversity in the metabolite types
and easy of genetic manipulation. However, mass culture of animal cell lines is also impor-
tant to manufacture viral vaccines and other therapeutic recombinant products such as
enzymes, hormones, immunologicals (monoclonal antibodies, interleukins, lymphokines,
etc), and anticancer agents. Mammalian cells cultivated in bioreactors have surpassed
microbial systems for producing therapeutic recombinant proteins because of their
capacity for proper protein folding, assembly and post-translational modification. Major
therapeutic recombinant proteins are successfully commercialized, but expensive animal
free media, cost of production in large scale with low yield (the tens-of-milligrams/liter),
microbial contamination, and gene regulation are the important issues to be resolved.
Other cell culture research is also underway to produce such complex therapeutic proteins
in insect cell (baculovirus) or in higher plants. Molecular biopharming using transgenic
animals such as goat and pig for rDNA proteins have also successfully commercialized.
Fermentation technology for the production of compounds that find application in food,
biochemical, biomaterial, bioenergy, pharmaceutical sectors encompasses a broad field, not
only including (1) conventional microbial and enzyme systems, (2) genetic and metabolic
engineering, along with systems biology/synthetic biology, and genome editing, but also
including (3) mammalian cell and plant cell systems. Despite a long history of fermentation
processes for generations, the requirement for sustainable production of bioenergy and bio-
materials is also demanding innovation and development of novel fermentation concepts.
Continued introduction of new technology in cell culture systems demands innovation in
new bioreactor process development and scale up processes for cell factory potential.
x PREFACE

This book reflects this transition from traditional fermentation technology to new cell
fermentation technology, that provides equal emphasis on microbial, mammalian as well as
plant cell technologies for new and improved processes and products in today’s biochemical
process industry.
Currently two fermentation textbooks available on the market (1999) are outdated and
do not deal with current progress in fermentation and cell culture technologies and com-
mercial recombinant bioproducts. Most other edited volumes are the work of multiple
contributors and normal didactic criteria for explanation of evolving new techniques and
applications are lacking. Experience in teaching this subject has made clear that the basic
concepts and essential features have not been covered in a typical science curriculum. The
primary objective of writing this book is to relate the food fermentation and cell culture
biopharmaceutical actives using different expression hosts. Product diversity makes fer-
mentation technology a multi -disciplinary expertise associated with microbiology, organic
chemistry, biochemistry, and molecular biology. Remarkable advances in these areas will
help to lift people out of wretched and empower them with new knowledge. The subject
matter is divided into Part V, including microbiology, biotechnology, molecular biology,
biochemical engineering, and global market size of bioproducts, and their applications.
Part I covers microbial cell technology and culture tools (including classical strain
improvements and tools) and modern strain improvement and tools (genome shuffling,
recombinant DNA technology, RNA interference (RNAi) and CRISPR)/Cas technol-
ogy for genome editing; also includes molecular thermodynamics for biotechnology,
protein engineering, genomics, proteomics and bioinformatics, systems/synthetic biol-
ogy and metabolic engineering, quorum sensing and quenching. Other bioengineering
and scale-up processes and new bioprocesses of fermentation such as growth-arrested
bioprocess, integrated bioprocess, and consolidated bioprocessing (CBP) are included.
Part II deals applications of microbial fermentation to food products (dairy, meat/fishes,
vegetable/cereals), organic acids, food ingredients, chemicals, and pharmaceuticals. Food
products/ingredients included flavors and amino acids, sweeteners, vitamins and pig-
ments, microbial polysaccharides/biopolymers, bacteriocins and bacteriophages, enzymes,
biomass (SCP)/mushrooms, functional foods and nutraceuticals such as probiotics and
prebiotics, and microbiome. Others included alcoholic beverages and other fermentation
chemicals (bioethanol, biobutanol/biobutandiol, biodiesel, biomethane, biohydrogen). In
final section, pharmaceuticals such as antibiotics, antibiotic growth promoters, antitumor
drugs, steroids/statins, and biopesticides included.
Part III covers (i) animal cell technology including animal cell culture, bioprocessing,
strain development, applications (monoclonal antibodies, different vaccines (DNA vac-
cines, edible vaccines, zika vaccines, hepatitis vaccines, HIV vaccines, COVID 19 vaccines),
and (ii) transgenic animal bioreactors, and applications in animals and fishes, etc. Part IV on
plant cell technology covered plant tissue and cell culture and applications, bioreactor types
(seed-based bioreactor, plant cell suspension bioreactor, hairy root bioreactor, chloroplast
bioreactors) and modern plant breeding or biotech/GM crops and their applications.
Finally, Part V deals with safety issues of new biotechnologies on microbial, animal, and
plant cells.
This book aims to give readers, general science students, researchers, and industrial
practitioners as well as instructors, an overview of the essential features of advanced fer-
mentation and cell culture technology. I would like to thank my students, post-docs, and
former colleagues at McGill University (Canada), Jiangnan University (China) and Kang-
won National University (Korea), who, for the past 37 years, have helped and suggested
me in teaching this subject course.
 PREFACE xi

Among the over hundres of my former graduate students and post-docs, I would like to
dedicate this book specifically to my beloved former students, Dr. Young J. Choi and Dr.
Marcio Belem in Montreal, whom both passed away suddenly.
Last but not least, I must thank my wife Young for her love and encouragement, together
with the patience of my sons, Edward and his family (wife Maria, son Maxim) in Toronto
and David and his family (wife Ronit, daughter Romy) in Santa Monica, California during
the preparation of this volume.

September, 2021 Byong H. Lee

Toronto, Canada
Overview on Market Size of
Bioproducts and
Fundamentals of Cell
Technology

Biotechnology and global market size of bioproducts

The term “biotechnology” was first used by Karl Ereky in 1919, meaning the production of
products from raw materials with the aid of living cells such as microbe, animal, and plant
in fermenters or bioreactors through process optimization.
Biotechnology is a broad discipline using all living cells, or parts of this to develop
products, and services to meet the needs of humans. New tools and products developed by
biotechnology have been useful in research, agriculture, industry, and the clinic. Industrial
biotechnology experience in fermentation technology started in the field of single-cell
protein production and then moved on to the developments of fermentation technologies
producing antibiotics, amino acids, antitumor agents, statins, vitamins, steroids, and
majority of fermented foods. As a result of this process development activity, microbial
cell culture technology has become one of the leading suppliers of top-quality fermenta-
tion technologies. This domain market is continuously expanding in all continents, with
confidential cooperation involving small and multinational companies. Microbial cell
fermentation technology has been a long-favored organic process because of its simplicity
of reaction, high specificity, low costs, and flexibility of application. Majority industries
have complemented the essential principle of fermentation with advances in techniques
and biotechnology to increase its application to the assembly of a spread of biochemicals,
biomolecules, and biofuels.
Table 1 shows the fermentation biotechnology milestones and some recombinant pro-
teins.
The fermentation’s application areas are broad from food stuffs like wine, cheese,
bread, and beer, into high-value chemicals, pharmaceutical products, and food-related
chemicals. Among many more than 100 recombinant proteins known (Sandez-Garcia
et al., 2016), only few are listed in this table. Further, rising hydrocarbon costs and
depleting fuel reserves have also created a strong case for affordable and easy fermen-
tation processes for manufacturing biofuel chemicals. Microbial cell factories for the
production of bio-based chemicals have been useful for diverse industrial applications
and for achieving a sustainable future, but the overexpression of heterologous enzymes in
xiv OVERVIEW ON MARKET SIZE

Table 1 Fermentation biotechnology milestones and some recombinant proteins

Date Milestone

Old biotechnology
Before 6000 Bread leavening, alcoholic drinks, and fruit vinegars
B.C.
Before 14th Beer and wine, vinegar by the Orleans process
century
1650 Cultivation of French mushrooms
1680 Anton van Leeuwenhoek first observation of yeast cells
1857–1876 Louis Pasteur first discovery of microorganisms causing fermentation
1881 Lactic acid production by microbe
1885 Artificial growing of mushrooms in the USA)
19th century Production of ethanol, acetate, butanol, acetone, and citrate, glycerol, baker’s yeast, and
sewage treatment
1940s Mass cultivation of microbes for antibiotics (penicillin, streptomycin, chlorotetracycline),
bioingredients (amino acids, enzymes, vitamins, polysaccharides), steroids, and vaccines
1953 Discovery of DNA by Watson and Crick
1957 L -Glutamate production by Kinoshita et al.
1955–60 Citric acid production by submerged fermentation
New Biotechnology
1970–1972 Transformation of E. coli by plasmid DNA
1973 First discovery of restriction enzymes and DNA ligases by Cohen and Chang
1974 First expression of heterologous gene in E. coli
1975 Invention of hybridoma technique for monoclonal antibodies by César Milstein and
Georges J. F. Köhler
1978 First discovery of recombinant protein, somatostatin
1980 Cohen/Boyer patent on recombinant DNA technology; Genentech established
1982 Recombinant human insulin (Humulin®) by E. coli
1983 Heterologous plant gene expression; Polymerase Chain Reaction (PCR) by Kary Mullis/Cetus
(Nobel prize)
1985 Recombinant human growth hormone (Protropin®) by E. coli
1986 Recombinant vaccine, Recombivax HB (hepatitis B vaccine by S. cerevisiae
Recombinant gamma−interferon, Roferon A® by E. coli
1987 Recombinant tryptophan, recombinant tissue plasminogen activator, Activase®) by CHO*
1989 Recombinant interleukin-2, Proleukin® by E. coli, Recombinant γ-interferon, Immuneron®
by E. coli
1989–1991 Recombinant chymosin (Gist-Brocades, Genencor, and Pfizer) by E. coli and Aspergillus
oryzae
Recombinant production of vitamin C (ascorbic acid) by Genencor International, lactic acid
bacteria resistant to bacteriophage
1990 Maltase-enhanced baker’s yeast (Gist-Brocades)
1992 Recombinant blood clotting factor VIII (Recombinate® by Genetic Institute/Baxter;
Kogenate® by Bayer, Defacto® (Wyeth) using animal cell lines; Lipase (Unilever),
Amylase (Novomil®)
1993 Site-directed mutagenesis by Michael Smith at UBC (Nobel prize)
1994 Genetically modified Flavr Savr tomato (Calgene, discontinued in 1997), recombinant
bovine somatotropin, BST (Eli Lilly; Monsanto), engineered brewing yeast (Carlsberg
Research Centre), and acetolactate decarboxylase (Maturex)
2003–2013 Epogen (erythropoietin, EPO) by mammalian cells (Amgen), Neupogen (granulocyte
colony-stimulating factor, G-CSF) by E. coli (Amgen), Fabrazyme (human
alpha-galactosidase, Genzyme) by CHO 1996–2015
Over 47 herbicide-resistant (HT) and insect-resistant (BT) crops on market 2018
Golden Rice (a provitamin) approved by US FDA; GM Atlantic salmon developed by
AquaBounty Technologies on market in Canada and USA (FDA approved)
∗ CHO:Chinese Hamster ovaries.
Source: Lee, 2015.
 OVERVIEW ON MARKET SIZE xv

Cell Culture Technology

Microbial cells Animal cells Plant cells

– Fermented foods – Animal breeding – Crop breeding
(beer, yogurt, soy, etc) – Transgenic animals – Transgenic plants
– Bioingredients – Animal (mammalian) – Plant cell culture
(enzyme, amino acid, gum, cell culture
vitamin, etc)
– Pharma products
(antibiotics, steriods,
recombinant proteins, etc)

Figure 1 Concept of cell culture technology derived from microbes, animals, and plants. Source: Nader
Khouri/Getty Images; Toni Barros / https://en.wikipedia.org/wiki/Dolly_(sheep)#/media/File:Dolly_face_
closeup.jpg / CC BY-SA 2.0; Dreamstime; Shutterstock.com; Flickr, Inc.; Thomas Northcut/Getty Images;
maksym yemelyanov/123RF. (See insert for color representation of this figure.)

recombinant strains often leads to metabolic imbalance, resulting in growth retardation

and suboptimal production of the target compounds (Lu et al., 2018). Thus, it is essential
to address metabolic imbalances caused by engineered pathways in microbial hosts. For
establishing a vibrant bio-based economy, multivariate modular metabolic engineering,
modular co-culture engineering, systems biology, and integrative genome-scale metabolic
modeling can be exploited to expedite strain optimization and improve the production
yield of many high-value bio-based chemicals.
Figure 1 shows concept of cell culture technology derived from microbes, animals, and
plants. In transgenic (genetic engineering) technology either in cells of microbes, animals,
or plants, a known gene for a desired trait is inserted into them by recombinant DNA tech-
niques or genome editing by CRISPER/Cas9 techniques. Despite of the potential use of all
living forms, a major player in the development of fermentation biotechnology is microor-
ganisms, because of the ease of mass growth, the rapid growth in cheap waste materials as
media, and the massive diversity of metabolic types, which in turn gives diverse potential
products and the ease of genetic manipulation to improve strains for new products.
It is estimated that the global economic value of industrial biotechnology, renew-
able chemicals and polymers, biofuels, enzymes, and bio-based materials is about
US$355.28 billion, among which US generates 58% of the value, or more than
US$205 billion (www.bio.org/worldcongres). The production of bio-based chemi-
cals alone can yield an annual revenue of US$10–15 billion in the global chemical
industry by 2020 (www.iwbio.de/fileadmin/Publikationen/IWBio-Publikationen/WEF_
Biorefineries_Report_2010.pdf).
xvi OVERVIEW ON MARKET SIZE

Fermentation’s application areas are broad from food stuffs like wine, cheese, bread,
and beer, into high-value chemicals, pharmaceutical products, and food-related chemicals.
Among many more than 100 recombinant proteins (Sandez-Garcia et al., 2016), only few
are listed in this table. Further, rising hydrocarbon costs and depleting fuel reserves have
also created a strong case for affordable and easy fermentation processes for manufacturing
biofuel chemicals. Microbial cell factories for the production of bio-based chemicals have
been useful for diverse industrial applications and for achieving a sustainable future, but the
overexpression of heterologous enzymes in recombinant strains often leads to metabolic
imbalance, resulting in growth retardation and suboptimal production of the target com-
pounds (Lu et al., 2018). Thus, it is essential to address metabolic imbalances caused by
engineered pathways in microbial hosts. For establishing a vibrant bio-based economy,
multivariate modular metabolic engineering, modular co-culture engineering, systems biol-
ogy, and integrative genome-scale metabolic modeling can be exploited to expedite strain
optimization and improve the production yield of many high-value bio-based chemicals.
Genetically modified bacteria such as the Gram-negative Escherichia coli (E. coli) are used
to produce large amounts of proteins for industrial use, but because of the high cost of
extraction and purification, only high value products have been produced at an industrial
scale. Although the recently developed secretary expression system of E. coli using sig-
nal peptide optimization, periplasmic leakage, and chaperones co-expression are reported
(Zhou et al., 2017), the E. coli species exhibits some limitations as the heterologous pro-
teins are typically expressed intracellularly, which results in problems with formation of
inclusion bodies and incorrect protein folding. Thus, Bacillus subtilis has become an indus-
trial workhorse for recombinant protein production due to an easy cultivation, the products
of generally recognized as safe (GRAS), ease of genetic manipulation, well-characterized
expression systems, absence of significant codon bias, and exceptional ability to secrete
heterologous proteins allowing cost-effective downstream processing (Eivind et al., 2018).
However, many recombinant proteins require protein modifications, such as glycosylation
that are available only in eukaryotic cells in that this sometimes leads to the use of yeast,
insect cells, and mammalian cell culture systems. Some medicinal use of recombinant bacte-
ria (E. coli) or yeasts (Saccharomyces cerevisae, Pichia pastoris) was to produce the protein
insulin to treat diabetes, clotting factors to treat hemophilia, human growth hormone to
treat various forms of dwarfism, interferon to treat some cancers, erythropoietin for anemic
patients, and tissue plasminogen activator which dissolves blood clots.
Outside of medicine they have been used to produce recombinant chymosin (cheese
coagulating enzyme), lipase, biofuels, and bioremediation, etc. Besides, with greater under-
standing of the role that the microbiome plays in human health, there is the potential to
treat diseases by genetically altering the bacteria to themselves be therapeutic agents in our
review (Daliri et al., 2018). The main ideas include altering gut bacteria to destroy harm-
ful bacteria or using bacteria to replace or increase deficient enzymes or proteins. One
research focus is to modify Lactobacillus bacteria that naturally provide some protection
against HIV, with genes that will further enhance this protection. However, the microbiome
could also raise safety concerns as interactions between bacteria and the human body are
less well understood than with traditional drugs. There are concerns that horizontal gene
transfer to other bacteria could have unknown effects. As of 2018 there are many clinical
trials underway testing the efficacy and safety of these treatments (Reardon, 2018).
Besides microbial fermented foods, for over a century, bacteria have also been used in
agricultural crops in which Rhizobia (and more recently Azospirillum) have been inoc-
ulated to increase their production or to allow them to be grown outside their original
habitat. It is well known that application of Bacillus thuringiensis (Bt) and other bacteria
can help protect crops from insect infestation and plant diseases. With advances in genetic
 OVERVIEW ON MARKET SIZE xvii

engineering, these bacteria have been manipulated for increased efficiency and expanded
host range as well as tracing the spread of the bacteria by markers. Pseudomonas strains
of bacteria causing frost damage by nucleating water into ice crystals around themselves
led to the development of ice-minus bacteria, that have the ice-forming genes removed.
When applied to crops they can compete with the ice-plus bacteria and confer some frost
resistance (Yetisen et al., 2015). Other applications of genetically modified bacteria include
bioremediation, where the bacteria are used to convert pollutants into a less toxic form such
as removal of petroleum hydrocarbon pollutants by increasing the levels of the enzymes
used to degrade a toxin or to make the bacteria more stable under environmental condi-
tions (Fuentes et al., 2014; Yuniati, 2018).
However, mass culture of animal cell lines is fundamental to the manufacture of viral
vaccines and many biological products produced by recombinant DNA technology in ani-
mal cell cultures include enzymes, synthetic hormones, immunobiologicals such as mono-
clonal antibodies, interleukins, lymphokines, and anticancer agents.
Many simpler proteins can be produced by engineered bacterial cell cultures, but protein
glycosylation (post-translational modification, PTM) is only made in animal cells. As the
production cost of mammalian cell cultures is high, however, other insect cells or higher
plants using single embryonic cell and somatic embryos are using as a source for direct gene
transfer through particle bombardment, and transit gene expression. Mammalian cell-line
products produced from CHO, BHK, NSO, meyloma cells, C127, HEK293) account for
over 70% of currently approved biotherapeutic products including monoclonal antibodies.
Biopharmaceuticals may thus be produced from engineered microbial cells such E. coli
or yeast, mammalian cell culture, plant cell/tissue culture, and moss plants in various biore-
actors or photo-bioreactors. The main issues of mammalian cell culture are cost of produc-
tion and microbial contamination by bacteria, viruses, mycoplasma, or viruses. Potential
safety and ethical issues include in engineered whole plants and animals, which represent
a significant investor risk and risks over consumer acceptance.
Major kinds of recombinant therapeutic proteins (biopharmaceuticals) include: blood
factors (Factor VIII and Factor IX), thrombolytic agents (tissue plasminogen activator),
hormones (insulin, glucagon, growth hormone, gonadotrophins, hematopoietic growth
factors (erythropoietin, colony stimulating factors), interferons (interferons-α, -β, -γ),
interleukin-based products (interleukin-2), vaccines (hepatitis B surface antigen), mon-
oclonal antibodies (various), and additional products (tumor necrosis factor, therapeutic
enzymes).
The important animal cell culture products as monoclonal antibodies are pro-
duced by fusing normal cells with an immortalized tumor cell line. Recent advances
in therapeutic protein drug development are available from: www.researchgate.net/
publication/313463806_Recent_advances_in_therapeutic_protein_
drug_development.
Many other transgenic animals have also been used to secrete human proteins
secreted in the milk of transgenic livestock. Since 1985, several animals, including cow,
goat, pig, horse, cat, rabbits, chickens, and most recently dog as well as fishes, have
been cloned, but the most research has been on cattle. Many applications of animal
biotechnologies are controversial for environmental, health, animal welfare, and social
reasons. For example, only a small percentage of cloning attempts produce live off-spring
and many animal clones are unhealthy. Human-animal chimeras raise safety concerns
about whether new diseases could be transmitted to humans, legal issues about whether
such creatures can be patented and owned, and the troubling possibility that they
could display human-like behavioral characteristics (www.geneticsandsociety.org/topics/
animal-biotechnologies).
xviii OVERVIEW ON MARKET SIZE

Molecular pharming is based on three perceived advantages: the low costs of grow-
ing animals or plants, the immense scalability of agricultural production, and the inherent
safety of animals or plants as hosts for producing pharmaceuticals. This can produce a range
of proteins produced from cloned animals. The main potential benefits of cloned animals
include the production of food, pharmaceuticals (“pharming”), the provision of organs for
xenotransplantation into humans, and the development of models of human diseases. The
benefits to agriculture include resistance to disease, altering the carcass composition such
that it is healthier to consume, improving the pig’s resistance to heat stress, and protecting
the environment. Additional types of genetic modifications will likely provide animals with
characteristics that will benefit humans in currently unimagined ways.
Although the majority of genetically engineered animals are still in the research phase,
some GM animals and fishes already on sale include cloned pet cats, GM ornamental
fish, GM salmon, cloned horses, and at least one rodeo bull. The GM cows by biotech
company SAB Biotherapeutics produced human antibodies, that fight pathogens, that
may one day treat infectious diseases like Ebola, influenza, and Zika and their potential
to address global outbreaks. The US Food and Drug Administration also approved a
GM chicken that makes a drug in its eggs to treat “lysosomal acid lipase deficiency” –
a rare genetic condition that prevents the body from breaking down fatty molecules inside
cells. In 2014, the FDA approved a drug collected from the milk of lab-made rabbits
to treat hereditary angioedema, a genetic disease that causes body swelling and can
be fatal. In 2009, the FDA approved a GM goat that can make a drug in its milk that
prevents fatal blood clots (www.theverge.com/2016/12/3/13819482/genetically-engineered-
animals-drugs-sab-cows-pharming-future).
Despite the ban on cloned animals adopted by the EU, the cloned livestocks would be
used as parents of slaughter pigs, beef cattle, and possibly also milk-producing dairy cows
in China, Canada, USA, and elsewhere. By 2020, the US FDA ruled that food products
derived from cloned animals (cattle, swine, goats, and the offspring of clones of any species
traditionally consumed as food) are safe enough and that labeling is not required because
food products from cloned animals are not materially different (www.fda.gov/animal-
veterinary/animal-cloning/primer-cloning-and-its-use-livestock-
operations).
Human antithrombin, ATryn (brand name) by rEVO Biologics (former GTC Biother-
apeutics) in 2006 was first medicine produced from the milk of genetically modified goats
by microinjection of human antithrombin genes into the cell nucleus of their embryos.
A goat that produces spider’s web protein, stronger (7–10 times) and more flexible than
steel (BioSteel) was successfully produced by a Quebec based Canadian company, Nixia
Biotechnologies, and later by the Randy Lewis lab of the University of Wyoming and Utah
State University (Service, 2002). This company also had created lines of goats to produce
recombinant versions of either the MaSpI (Major ampullate spidroin I) or dragline I (for its
superior elasticity, flexibility and strength) from Nephila clavipes, the golden orb weaver)
or MaSpII (Major ampullate spidroin 2 or dragline 2 from Nephila clavipes) dragline pro-
teins in their milk. When the female goat lactates, the milk containing the recombinant
DNA silk was to be harvested and subjected to chromatographic techniques to purify the
recombinant silk proteins. The purified silk proteins can be dried, dissolved using solvents
(DOPE formation) and transformed into microfibers using wet-spinning fiber production
methods. The spun fibers tend to have tenacities in the range of 2–3 grams/denier and elon-
gation range of 25–45%. The “Biosteel biopolymer” had been transformed into nanofibers
and nanomeshes using the electrospinning technique.
Nexia is the only company which has successfully produced fibers from spider silk
expressed in goat’s milk. The Lewis lab has produced fibers from recombinant spider
 OVERVIEW ON MARKET SIZE xix

silk protein and synthetic spider silk proteins and genetic chimeras produced in both
recombinant E. coli and the milk of recombinant goats, however, no one has been able
to produce the silk in commercial quantities thus far. The company was founded in
1993 by Dr. Jeffrey Turner and Paul Ballard that was sold in 2005 to Pharmathene. In
2018, two transgenic goats were sold to the Canada Agriculture Museum after Nexia
Biotechnologies went bankrupt (https://en.wikipedia.org/wiki/BioSteel). Research has
since continued by Randy Lewis, a professor formerly at the University of Wyoming and
now at Utah State University, where he was also able to successfully breed spider goats
to create artificial silk. There are now about 30 spider goats at a university-run farm.
Applications of artificial spider silk biopolymers include using it for the coating of all
kinds of implants and medical products as well as for artificial ligaments and tendons due
to its elastic tendencies, and also since it is a natural product which will synthesize well
with the body. Furthermore, artificial silk biopolymers can be applicated in personal care
products as well as in textile products.
AquaBounty Technologies originally developed in Canada and later based in Mas-
sachusetts (US) have sold about 4.5 tons of GM salmon fillets in Canada. The engineered
Atlantic salmons developed by AquaBounty are produced by cloning a growth hormone
gene from chinook salmon and a second added gene from the ocean pout accelerates
growth by keeping the hormone gene on permanently. AquaBounty says the salmon grow
twice as fast as typical salmon and consume 20–25% less food per gram of new flesh
(http://aquabounty.com/about). However, the first GM fish to go on sale in the world has
faced fierce opposition from environmental groups, which fear that if they escape from the
tanks where they are reared on Prince Edward Island in eastern Canada, they will upset
natural ecosystems by breeding with native salmon. In the US, the salmon was cleared for
sale in late 2015, but its market debut has been stalled by arguments over how it should be
labelled. Now the salmon is being sold in Canada, other species may eventually follow it
onto the market.
The genetically modified pig (Enviropig™) developed by University of Guelph in
Canada is to excrete less phosphorus in its feces. It will produce the enzyme phytase in
its salivary glands to enable more effective digestion of phytate, the form of phosphorus
found in pig feed ingredients like corn and soybeans.
An ornamental fish that glows in the dark was created by cloning jellyfish DNA into a
zebrafish and is on the market. However, GM fish may escape and cause genetic damage
by hybridizing with native species. Some tropical exotic fish such as piranhas may cause
major problems. The details will be covered in the section of Animal Cell Technology.
Recently, advances have also been made in the production of foreign proteins in trans-
genic plants as alternative to microbial fermentation or mammalian cell culture. Many
therapeutic proteins, including antibodies, blood products, vaccines, hormones, cytokines,
other therapeutic agents, and enzymes are being produced in transgenic plants. The proper
selection of host plant and gene expression system in a food crop or a non-food crop
can act as bioreactors to produce recombinant proteins in larger quantities than those
of mammalian cell systems. Plant systems have the advantages in large-scale production
of recombinant proteins without contaminating human pathogens. Although in the last
two decades, approximately 95 biopharmaceutical products including cytokines, enzymes,
hormones, monoclonal antibodies, and vaccines have been approved for the treatment of
various human diseases, none of the commercial products are currently produced in plants,
mainly due to the low yield and expensive purification costs. However, plant-based DNA
vaccines have potential even for COVID-19 (Rosales-Mendoza et al., 2020).
Genetic modification of plants involves adding a specific stretch of DNA into the plant’s
genome, giving it new or different characteristics. This could include changing the way the
xx OVERVIEW ON MARKET SIZE

plant grows or making it resistant to a particular disease. The new DNA becomes part of
the GM plant’s genome which the seeds produced by these plants will contain. The details
of transgenic plants will be covered in Part IV.
Most biopharmaceutical products are currently manufactured commercially through
various fermentation processes by genetically engineered microorganisms (e.g., E. coli,
yeast, fungi). Some highly successful drugs obtained through fermentation routes are:
human insulin, streptokinase, erythropoietin, hepatitis B vaccine, human growth hormones,
interleukin, granulocyte-colony stimulating factor (GC-SF), granulocyte-macrophage
colony stimulating factor (GM-CSF), interferons (α, β, γ), and many recombinant proteins.
The three domains of microbes, animals, and plants are not only involved in production of
biopharmaceuticals, but also have their applications in foods (Figure 1). Although public
support for new biotechnology is high for new drugs (e.g., insulin, interferon, hormone,
etc.), diagnostics (cancer detection kits), food enzymes (e.g., recombinant rennet and other
enzymes), and vaccines, public perceptions are against GM foods on the whole, because
of their safety issue and because foods are an issue that affect everyone, as everyone eats,
as will be covered in Part V.
Besides the concept of whole cell culture technology derived from microbes, animals,
and plants in Figure 1, a novel cellular agriculture (CA) terminology was first used in
2015. Providing food and healthy diets for growing population, tackling deforestation and
climate change, and reducing negative environmental impacts of conventional agriculture
constitute the grand challenges of current times. By 2050, the global population will
reach to 9.8 billion, demand of our food supplies will be 60% higher than it is today.
At the same time, climate change, urbanization, and soil erosion will decrease of the
availability of arable land and crops account for only about 2% of all plant biomass
including non-food crop (dx.doi.org/10.1038/nature25138). Deforestation is also a direct
consequence of animal agriculture as more and more farmland is required to grow
crops for animal feed. CA will reduce deforestation as the production practices are
decoupled from land use. Although the world currently produces more than enough food
to feed everyone, 815 million people (roughly 11% of the global population) were in a
state of hunger in 2016 (www.fao.org/fileadmin/templates/wsfs/docs/expert_paper/How_
to_Feed_the_World_in_2050.pdf). Not only is providing sufficient food important, but
the low-quality diets causing micronutrient deficiencies and obesity are also currently
problems (dx.doi.org/10.1016/SO140-6736(18)31788-4).
This CA field is not new, as microbial cell production of food protein (single-cell protein),
bioplastics (e.g., biofilm, headset, etc.), leather-like mycelium biomaterials, recombinant
rennet, spider silk protein, bacterial cellulose, and so on, are already commercialized (see
Part II). In vitro animal cell cultures are well established and over 32 therapeutic proteins
including human insulin are commercialized (see Part III). Also, in vitro plant cell culture
has already been used to produce various secondary metabolites and ingredients of phar-
maceutical (e.g. paclitaxel, vinbrastine for anticancer drugs, etc.), cosmetics (pigments),
and foods, etc. (see Part IV). However, recent CA terminology include more for develop-
ing agricultural products, such as cell-based animal products, by cell cultures than living
farm animals (Stephens and Ellis, 2020).
This includes in vitro or cultured meat, and animal products like milk, leather, eggs,
gelatin and silk through tissue engineering and recombinant DNA fermentation-based
industrial biotechnology process for food and materials (Rischer et al., 2020).
In recent years, a number of cellular animal agriculture companies and non-profit orga-
nizations have emerged due to this technological advances and increasing concern over the
animal welfare and rights, environmental, and public health problems associated with con-
ventional animal agriculture. Some examples are: (i) in the US, lab-grown Memphis Meats,
 OVERVIEW ON MARKET SIZE xxi

Bluefin tuna-based Finless Foods, fermentation-based Geltor (gelatin), Clara Foods (egg
white), Perfect Day and New Culture (animal-free dairy products), Modern Meadow (fer-
menting collagen for leather), (ii) in UK, lab-grown hamburger which was cooked and
tasted, (iii) in Netherlands, Mosa Meat and Meatable, (iv) in Israel, Future Meat Technol
and Aleph Farms, (v) in Canada, Appleton Meats, Biosteel (spider web silk), (vi) in Japan,
Integriculture and spider silk, and (vii), in Singapore, Shiok Meats. Although cell-based
meat may be identical to conventional meat, CA technology is hard to develop because
of structural complexity. Moreover, the texture that tastes meat will be hard to mimic.
Biotech-derived ingredients such as tofu and more recently fungal protein Quorn are well
known, but cell-based meat which will taste like animal meat, with the same nutritional
value, requires expensive serum to grow cells and scale up, and safety issue are formidable
challenges to overcome
Despite the many difficult challenges ahead, CA will be a major part of the solution
for three of humanity’s greatest challenges: feeding 10 billion people by 2050, mitigat-
ing climate change, and mitigating the threat of antibiotic-resistant and zoonotic diseases
(www.futurefields.io/post/cellular-agriculture-in-canada).
Figure 2 shows a scheme of microbial bioproducts and global sales (%) of micro-
bial products except for fermented foods and alcohol beverages. Global sales (%)
of bioproducts excluding fermented food/beverages and biorefinery products can be
shown, among which antibiotics (42%) and biopharmaceuticals (25%+ 17%) are the
major bioproducts. The global market for bioproducts is expected to grow to US$700.7
billion by 2018, with a five-year compound annual growth rate (CAGR) of 5.5%. The
non-energetic market, which includes chemicals, pharmaceuticals, and materials, is the
fastest-growing segment overall at a tremendous 14.9% CAGR, reaching US$472.8
billion by 2018, up from US$236.3 billion in 2013 (www.bccresearch.com). The global
market for biorefinery products alone is expected to clinch US$714.6 billion by 2021 from
US$466.6 billion in 2016 at a whopping CAGR of 8.9% (https://tradeessential.com/events/
biorefinery-bio-based-chemical-2).
In the global fermented ingredients market, amino acid has had a significant market
share due to the growing demand for amino acids by food and beverage and animal feed
additive industries from the last few years. The growing preference for fermented ingre-
dients by several personal care product manufactures in their products led to the growth
in demand of fermented ingredients in personal care industry (www.marketwatch.com/
press-release/the-global-fermented-ingredients-market-to-2023-driven-by-the-growing-
demand-of-fermented-ingredients-to-prompt-the-process-of-fermentation---
researchandmarketscom-2018-09-26). Vitamins are also expected to witness substan-
tial growth as key fermented ingredients in the food & beverage sector, especially
due to their increasing application in probiotic drinks such as kefir. Global markets
of biorefinery products are also high with data, from 2010 to 2013, and projections of
CAGRs through 2018. Biorefinery products broken down by product demand include
energetic (ethanol, biodiesel, electricity/heat), non-energetic (chemicals, materials,
herbal/botanicals), and by other segments, such as fuel (transport, mechanical, etc.),
energy (heat, electricity), material (plastics, resins), chemical (alcohols, solvents, acids,
surfactants, etc.), and herbal/botanical (drugs, body care, aroma, etc.). Forecasts for
biomass conversion processes and equipment to produce fuels, power, and chemicals
from biomass are included in the prospects for biorefineries built on different plat-
forms, such as the “sugar platform,” based on fermentation of sugars extracted from
biomass feedstocks, versus the “syngas platform,” based on thermochemical conversion
processes. The non-energetic bioproducts market will reach US$477.0 billion by 2021
from US$281.7 billion in 2016 at a CAGR of 11.1%, from 2016 to 2021. The energetic
xxii OVERVIEW ON MARKET SIZE

Grain

Stach

Industrial enzymes Fructose syrup

- α-amylase Energy of water Glucose syrup Sugar substitute Bio fertilizers
- glucoamylase Biopesticides
- protease - bioinsecticides
- lipase - biofungicides
- cellulase - Nitrogen fixer
- Pectinase etc. - biostimulators
Microbiological industry
Fuel ethanol Chemicals
Vitamins
- riboflavin (B2) - Milk acid
- Ascorbic acid (C) - Lemon acid
- nicotiamide (PP) - 1.3 - propanediol
- kobolamine (B12) Antibodies - Thin products for
Amino Acids pharmaceutical
- L-lysine
Carotenoids industry.
Biomass of live cells - L-threonine
- β-carotene - Biocatalysis in chemistry - L-tryptophane
- astacsantene - Cleaning of soil, water Polisacharides
- lycopene and air - for technical needs
- for food industry

(a)

Other products Organic Acids 3%

(Steroids, immuno drugs Polysaccharides 1%
etc) 17%
Vitamins 1%
Aminoacids 8%

Antibiotics 42%

Biopharmaceuticals 25%

Enzymes 3%
(b)

Figure 2 (a) Scheme of microbial bioproducts except for fermented foods and alcohol beverages and
(b) Global sales (%) of microbial products except for fermented foods and alcohol beverages by 2023
(www.marketresearchfuture.com/sample_request/765).

bioproduct market is estimated to be US$237.6 billion by 2021 from US$184.9 billion

in 2016 at a CAGR of 5.1%, from 2016 to 2021 (www.prnewswire.com/news-releases/
biorefinery-products-global-markets-300426425.html).
Beside the bioproducts as chemicals (or ingredients) and pharmaceuticals described
above, many different types of fermented foods and beverages are also produced in world-
wide such as fermented milks, cereal-based fermented food, and non-alcoholic beverage,
fermented fruits, and vegetables, and fermented meat. The yogurt and fermented milk
 OVERVIEW ON MARKET SIZE xxiii

market in 2014 alone was worth US$55.01 billion, with North America, Europe, and Asia
accounting for 77% of the market. This is largely due to the reported health benefits
of their probiotic properties (so-called functional foods), and their weight management
factor as well as the minimal preparation needed for fermented foods. The health benefits
of fermented foods are predicated on the presence of bacteria in the foods, which served
as probiotics in the human body to positively contribute to naturally occurring intestinal
flora and therefore support gut health. Fermented foods also contain necessary enzymes,
omega-3 fatty acids, and B vitamins among their health repertoire, illustrating vast poten-
tial to boost health of those choosing to eat fermented products. Consumers are also wary
of food additives, rather choosing fermented products because there are inherently less
preservatives in these choices. Since the bioprocess technology depends on the cultivation
and secretion by the live microbial cells, the risk of contamination by the non-desirable
microbes with the consequent toxicity might restraint the objective and success of fermen-
tation technology. Alcoholic drinks gained a significant market share and are expected to
continue and the global alcoholic beverages market was valued at around US$650 billion
in 2017. Asia Pacific was the largest region in the alcoholic beverages market in 2017,
accounting for nearly 45% market share, among which China was the largest country in
the market in 2017, accounting for nearly 25% market share (www.google.com/search?biw
=1280&bih=913&ei=8JpSXPerL4va8QXgjKfwBQ&q=fermented+alcoholic+beverage+
products%3B+global+market+%28%25%29%3B+2019).
In terms of annual world-wide sales, biotechnology-derived products can be divided
into the three categories. First, fine chemicals as low-volume products and as bulk chemical
products usually fall within the 100 kg per year to 100 tons per year range. This category
broadly includes bioproduction of high-value molecules such as vaccines, rDNA products,
5′ -nucleotides, some of the amino acids, enzymes (for medical applications), monoclonal
antibodies, and bioconversion of high-value starting materials such as antibiotics, and
steroids, and so on. A significant fraction of the production costs of these products are
involved in purification and testing of the product to meet the demand of quality and
safety specifications. Intermediate volume chemicals are usually chemicals or ingredients
that are produced microbiologically in the range of 100 to 20,000 tons per year. Such
products have less vigorous quality and safety specifications than do fine chemicals. Some
examples are glutamic acid (monosodium glutamate, MSG), which is used as a flavor
enhancer, antibiotics used for protecting agricultural crops, food and industrial enzymes,
organic acids (citric, lactic, gluconic acids), solvents (acetone, butanol), many fermented
beverages, and food products. Finally, the bulk product sector consists of products that are
usually produced in continuous reactors, exceeding 20,000 tons per year. These products
are marketed on the basis of commodities and overall product performance criteria
rather than on the basis of rigid quality specifications. The microbial products that fall
within this category are single-cell protein (SCP), gasohol (ethanol), biogas (methane), and
biopolymers for enhanced oil recovery.
The use of biopharmaceuticals has grown worldwide in the last few years. In 2016, the
total number of products approved by the Foods and Drugs Administration (FDA) and
European Medicines Agency (EMA) for use in humans reached 1357, of which >130 have
different formulations (reference products), 737 are biosimilars, and the remaining 482 are
classified as biobetters (www.biopharma.com). From 2013 to 2016, 73 biopharmaceuticals
were approved for use in humans. Among them, high prominence was given to mono-
clonal antibodies (23 approvals) widely used in several diagnostic procedures, treatment of
inflammatory diseases, and neoplastic tumors.
The European Medicines Agency (EMA) also licensed two new products based on
gene therapy (insertion of a corrective gene able to produce a normal protein in the
xxiv OVERVIEW ON MARKET SIZE

patient’s genome to cure a genetic disease) for use in human therapeutic protocols. These
products were Glybera, developed by the German company UniQure for the treatment
of lipoprotein lipase deficiency, and Strimvelis, developed by GlaxoSmithKline (GSK)
for the treatment of adenosine deaminase deficiency. Although biopharmaceuticals
can be very effective for disease control or cure, treatment costs can reach up to US$1
million per patient. Jozala et at. (2016) reviewed the biopharmaceuticals from microor-
ganisms: from production to purification. Table 2 lists some recombinant biopharma
products.

Cellular organization and membrane structure

of three domains
Microorganisms were the first living organisms on Earth, and have been around for at least
3.8 billion years – 80% of the Earth’s 4.6 billion’s year history. It has been estimated that
the total number of microbial cells on Earth on the order of 2.5 × 1030 cells, making it the
major fraction of biomass on the planet.
The three-domain system was first introduced by Carl Woese in 1990. This classifica-
tion system is also known as the Six Kingdoms and Three Domains Classification because
it divides the life forms into three domains and six kingdoms. The three domains of Carl
Woese’s Classification system include archaea, bacteria, and eukaryotes, and the six king-
doms are Archaebacteria (ancient bacteria), Eubacteria (true bacteria), Protista, Fungi,
Plantae, and Animalia. This classification system divides life based on the differences in
the 16S ribosomal RNA (rRNA) structure as well as the cell’s membrane lipid structure
and its sensitivity to antibiotics. The main difference from earlier classification systems is
the splitting of archaea from bacteria.
As a result of useful rRNA molecules, perform the identical function throughout nature,
their structure modifications have changed little over time. Therefore, similarities and dis-
similarities in rRNA nucleotide sequences are a good indication of how related or unrelated
different cells and organisms are. There are various hypotheses as to the origin of prokary-
otic and eukaryotic cells. Because all cells are similar in nature, it is generally thought that
all cells came from a common ancestor cell, termed the last universal common ancestor
(LUCA). These LUCAs eventually evolved into three different cell types, each represent-
ing a domain. The three domains based on Carl Woese’s Classification are thus the Archaea,
the Bacteria, and the Eukarya. Figure 3 illustrates a phylogenetic tree based on rRNA data,
showing the separation of bacteria, archaea, and eukaryota domains.
More recently various fusion hypotheses have been proposed, among which one the-
ory is that the diploid or 2N nature of the eukaryotic genome occurred after the fusion of
two haploid or 1N prokaryotic cells. Other hypothesis is that the domains of Archaea and
Eukarya emerged from a common archaeal-eukaryotic ancestor that itself emerged from a
member of the domain Bacteria. Some of the evidence behind this hypothesis is based on a
“superphylum” of bacteria called PVC, members of which share some characteristics with
both archaea and eukaryotes. Growing evidence shows that eukaryotes may have origi-
nated within a subset of archaea. A “superphylum” of bacteria (PVC) refers to the three
members of that superphylum: the Planctomycetes, the Verrucomicrobia, and the Chlamy-
diae. Members of the PVC, while belonging to the domain Bacteria, show some features of
the domains Archaea and Eukarya. Some of these bacteria show that cell compartmen-
talization, wherein membranes surround portions of the cell interior such as groups of
ribosomes or DNA, is close to eukaryotic cells. Some divisions by budding or contain-
ing sterols in their membranes are again similar to eukaryotes. Similar to eukaryotes and
Another random document with
no related content on Scribd:
 Storia. Giornalismo
CLXXXVI. Scienze morali e sociali 506
CLXXXVII. Scienze matematiche e naturali 534
CLXXXVIII. Belle arti 558
 NOTE:

1. Il decreto 17 giugno 1791 dell’Assemblea Costituente contesta che le

persone della stessa professione possano avere interessi comuni.

2. Napoleone Buonaparte, allora tenente d’artiglieria, scriveva contro

costui: — O Lameth, o Robespierre, o Pétion, o Volney, o Mirabeau, o
Barnave, o Bailly, o Lafayette, ecco l’uomo che osa sedersi al vostro
lato. Grondante del sangue dei fratelli, lordo d’ogni specie di delitti,
presentasi sotto l’abito di generale, iniqua ricompensa de’ suoi delitti;
osa dirsi rappresentante della nazione egli che la vendette, e voi lo
soffrite! osa alzar gli occhi e tender le orecchie a’ vostri discorsi, e voi lo
soffrite! Non è la voce del popolo, ma sol quella di dodici nobili ch’egli
ebbe. Ajaccio, Bastia, la più parte de’ contorni han fatto della sua effigie
quel che avrebbero voluto fare della sua persona».

3. Cum omnibus regni incolis enixissime gratulamur de egregia comparata

sardo nomini regnoque nunquam interemtura gloria. Breve 31 agosto
1793.

4. Quelle intenzioni ci sono rivelate dall’elogio del Semonville, recitato alla

Camera dei pari il 7 febbrajo 1840. Era con essi Montholon, che avea
fatto le prime armi in Corsica sotto Buonaparte, e dovea poi raccorne
l’ultime parole a Sant’Elena.

5. Allocuzione 17 giugno 1793.

6. Il contado Venesino era appartenuto a Raimondo VII di Tolosa, il quale,

sospettato d’eresia e scomunicato da Gregorio IX, per sottrarsi a Luigi
XVIII di Francia rassegnò le terre di là del Rodano al papa, che tenne
quel contado. I re di Francia più volte l’aveano reclamato invano: or ecco
il popolo stesso vuole staccarsi dal papa per darsi alla rivoluzione.
Subito si trovarono divisi fra patrioti e papisti: Carpentras, gelosa
d’Avignone, non volea unirsi a lei per non esserle sottoposta, e
pretendeva esser capo di dipartimento, e cominciossi ad assassinare
d’ambe le parti; gli Avignonesi v’entrano armati, e si canta il Tedeum;
Carpentras respinge gli assalitori, per tutto si uccide, si beve il sangue,
si mangia la carne de’ nemici. Si manda a domandar la fusione: allora
l’Assemblea e tutti i circoli di Parigi prendono parte per gli uni o per gli
altri. In queste fusioni un Governo non insano sa sopire l’avidità del
momento per addomandarsi se un popolo abbia diritto di disporre di sè e
di cangiare la propria amministrazione, e a che porterebbe un tal diritto
applicato a tutti. Menou agitò tal quistione davanti all’Assemblea, e
conchiuse che i Venesini e gli Avignonesi n’aveano il diritto secondo il
sistema antico quando la Francia non era una; cessava dacchè, messisi
in rivoluzione, volontariamente eransi legati a un patto sociale con tutti.
S’apersero dunque i registri; e quelle quarantacinque leghe quadrate di
paese, così opportunamente situate fra il Rodano e i dipartimenti della
Drôme e delle Basse Alpi, furono aggregate alla repubblica. Ma
Liancourt mostrava che è impossibile accertar il voto della pluralità
durante la guerra civile; Mably, che a spogliar il papa non v’avea nè
generosità nè giustizia; Jessé, che abbastanza litigi religiosi agitavano la
Francia; Malouet, che la Francia accettando Avignone sgomentava
tutt’Europa: e per quanto Robespierre, Goupil, Pétion sostenessero il
contrario, l’Assemblea dichiarò che «Avignone e il contado non
formavano parte integrante della Francia». Avignone era stata venduta
al papa per ottantamila fiorini: acquisto regolare dunque, ma pretendeasi
infirmarlo perchè Giovanna aveva ereditato la contea di Provenza come
inalienabile, e di tenerla tale avea giurato ella stessa; perchè era in età
minore; e perchè è «da supporre avesse operato per comprare dal papa
l’assoluzione». Intanto però la guerra civile menava sterminio in quei
paesi; i faziosi scannavano chi repugnasse, e insistevano presso la
repubblica perchè li ricevesse nella gran famiglia; talchè finalmente
l’Assemblea li accettò, benedetta da quei ch’erano stanchi di tante
stragi. Ma non cessarono per questo, e i bravi briganti dell’armata di
Valchiusa, com’erano intitolati nei proclami, esercitarono ogni peggior
misfatto: avendo un commissario voluto rapire i pegni del Monte di pietà
e i voti alla Madonna, il popolo lo trucidò; e lo spaventevole mulattiere
Jourdan, il quale una volta tagliò tutte le dita d’un nemico, e se le pose
in bocca un dopo l’altro a guisa di sigaro, lo vendicò con centinaja di
vittime, che invece di sepolcro furono buttati a riempiere una ghiacciaja.
Questo da Luigi Blanc e dal Michelet è dato tra i fatti che mostravano «la
potente attrazione, il sorprendente effetto del poter morale esercitato
dalla rivoluzione francese», una gloriosa conquista non della forza, ma
dello spirito nuovo. Blanc sopra tutto dice che «bisogna confessare che
la dominazione di Roma non presentava nulla che di ben tollerabile»; e
domandandosi perchè dunque gli Avignonesi avessero voluto essere
alla Francia, esclama: — Oh prestigio del diritto vittorioso! o potenza per
sempre santa della giustizia sopra gli uomini».
7. Secondo una dissertazione di Depoisier, inserita nell’Investigateur del
1855, le relazioni sopra quella campagna sono molto inesatte. Tutti i
documenti d’allora attestano la meraviglia de’ Francesi per l’inattesa
ritirata, e Lebrun, ministro degli affari esteri, scriveva a Montesquiou: La
retraite subite des troupes du roi de Sardaigne, et ce qu’il peut avoir
concerté avec les Suisses, donnent lieu à tant de réflexions, qu’on ne
peut trop multiplier les précautions.
Prese parte a quella spedizione il famoso conte Giuseppe De Maistre, e
scrisse un’Adresse de quelques parents des militaires savoisiens à la
Convention Nationale, ove, dopo detto che le truppe dans une
honorable impatience attendaient le moment de signaler leur valeur,
soggiunge: Mais il était écrit que leur bonne volonté devait être inutile: il
fallut s’éloigner sans combattre. Tirons le rideau sur des événements
inexplicables, et surtout gardons-nous d’insulter l’honneur. Le courage
malheureux et trompé doit exciter dans tous les cœurs bienfaits une
compassion respectueuse, fort éloignée du langage adopté par tant
d’hommes inconsidérés.
Con De Maistre militava pure il marchese Enrico Costa de Beauregard,
che scrisse un ragguaglio di quella spedizione, poi i Mémoires
historiques sur la Maison de Savoie (Torino 1816), e altre opere, fra cui
merita attenzione il Saggio sull’eloquenza militare. Nella spedizione del
94 perdette suo figlio Eugenio, e De Maistre ne scrisse quel bellissimo
Discours à madame la marquise de C... sur la vie et la mort de son fils
lieutenant au corps des grenadiers royaux.
Sull’Investigateur di Parigi (1856 giugno: luglio...) comparvero alcune
memorie sulla situazione della Savoja e sull’occupazione di
Montesquiou. Allora il paese contava 402,724 abitanti, e ventimila
migravano; le imposte salivano a due milioni e mezzo di lire tornesi; il
sale a due soldi la libbra. Costa de Beauregard, Mém. historiques
precitate, vol. iii.

8. Come Mazzini a Carlo Alberto, così l’ex-marchese Gorani scriveva

consigli a Vittorio Amedeo. Dipingeagli la sua posizione, e come quattro
occasioni avesse avuto Casa di Savoja d’ingrandirsi: sotto il Conte
Verde impadronendosi della Francia, sotto Carlo III profittando della
Riforma, sotto Carlo Emanuele valendosi dei disastri di Maria Teresa, e
adesso. «Perchè si vedono nel Canavese e fin alle porte di Torino tante
sodaglie? perchè ricusò i progetti di canali navigli e d’irrigazione? perchè
non accettò l’offerta de’ Ginevrini di render navigabile l’Arve, e così
utilizzare le selve della Tarantasia? perchè invece volle favorire quegli
otto o dieci signori che non voleano veder deprezziate le loro foreste del
Sciablese? perchè abbandonar l’isola di Sardegna a vicerè e preti che
 ne scemarono la fertilità e la popolazione? E tutto ciò potea farsi colla
metà del denaro sprecato in ricompense a indegni, in costruzioni inutili,
in una Corte trista, in un compassionevole esercito, in inutili
ambasciadori». E qui s’avventa contro il servidorame grande e piccolo,
gli esuberanti uffiziali, le fastose ambascerie, le grandi cariche, e peggio
gli ecclesiastici, dei quali non rifina di sparlare. «Con ciò, con tanti
biglietti di banco senza ipoteca ruinò le provincie, mentre, se le avesse
prosperate, sarebbero l’asilo di tutti i malcontenti d’Europa, e il Milanese
si getterebbe nelle sue braccia». Lo sconsiglia dal romper colla Francia,
potenza tanto maggiore e con eserciti invincibili; «ritiri dunque le truppe
dai confini, congedi le austriache, si dichiari neutro negli affari di
Francia, altrimenti non avrà che accelerato la sua ruina».
Pensate quel che costui diceva al papa in un altro indirizzo!

9. Kellermann il 1º luglio 1795 si lagna con Devins perchè i soldati austriaci

infierissero contro i prigionieri e i vinti, sin a tagliarli a pezzi. Devins
risponde che ciò è contro i suoi ordini; mais vous savez que nous avons
des corps francs et d’autres troupes, en partie sujets turcs, et en partie
des confins de la Turquie: vous savez que, par leur éducation, ces
peuples sont beaucoup plus cruels que toutes les autres troupes de
l’Europe. Pinelli, Storia militare del Piemonte, documento iv.
Kellermann fu poi chiamato a Parigi a giustificarsi dell’umanità usata
verso i Lionesi, e gli sottentrò Dumas.
Il libro Victoires et conquêtes des armées françaises esagera
stranamente la forza degli eserciti nemici ai Francesi; e per esempio nel
1795 dà all’esercito austro-sardo centomila Piemontesi,
quarantacinquemila Tedeschi e cinque in seimila Napoletani, mentre in
tutto giungeano appena ai cinquantamila. Così esagerate vi sono
sempre le perdite dei nostri.

10. «Lo spettacolo dell’armata (quand’entrò in Milano) facea stupore a chi

ha conosciuto quelle di Federico. Accampavano i Francesi senza tende,
marciavano senza compassata forma; erano vestiti di colori diversi e
stracciati; alcuni non aveano armi; pochissima artiglieria; cavalli smunti e
cattivi; stavano in sentinella sedendo; anzichè d’un esercito, avean
l’aspetto d’una popolazione arditamente uscita dal suo paese per
invadere le vicine contrade. La tattica, la disciplina, l’arte cedevano
costantemente all’audacia e all’impegno nazionale d’un popolo che
combatte per se medesimo, contro automi costretti a battersi per timore
del castigo». Pietro Verri mss.
11. Il maggior elogio di Ercole III di Modena sta nella Memoria che
Giambattista Venturi scrisse intorno alla vita del marchese Gherardo
Rangone, che fu ministro di quel duca (Modena 1818). Annovera tutti i
miglioramenti che esso introdusse nel ducato.

12. Vent’anni appresso, nella calma della sfortuna, Napoleone descriveva la

punizione di Pavia, e come n’avesse concesso ai soldati il sacco per
ventiquatt’ore; dopo tre ore le grida della popolazione gliel fecero
sospendere, attesochè aveva soli mille cinquecento soldati: se n’avesse
avuto ventimila, avrebbe lasciato intero il castigo. Mémoires de Sainte-
Hélène, tom. iv. p. 280.

13. Il Gianni era fuggito da Roma dopo l’assassinio di Bassville col Salfi, che
su questo fatto compose un poemetto. A Firenze il Gianni improvvisava
colla Fantastici; e l’Alfieri ammirandolo diceva però che quello non era
improvvisare, ma un comporre in fretta, alludendo al suo lento
declamare.

14. Notificazione del comitato centrale di polizia, 14 brumale, anno v.

15. Vedasi Mémoires et correspondance du roi Joseph. Parigi 1853. Al 10

dicembre Buonaparte scriveva a questo: — La pace con Parma è fatta.
Torna al più presto; metti sesto ai nostri affari domestici, principalmente
alla nostra casa (in Corsica), che per tutte le evenienze desidero sia
capace e degna d’esser abitata: bisogna rimetterla nello stato di prima,
attaccandovi l’appartamento d’Ignazio».

16. Correspondance de Bonaparte, tom. ii. p. 518.

17. Il pittore Gros ricusò le offerte de’ Perugini, pur promettendo levare sol
due o tre quadri.

18. Era console allora Antonio Onofrio, sul cui mausoleo nella pieve fu poi
scritto Patri patriæ.

19. Raccolta cronologica dei documenti veneti, tom. ii. part. ii.

20. Forfait, nell’Extrait d’un Mémoire sur la marine de Venise, espose le

forze di questa al suo cadere; ma più attendibile ci pare il quadro esibito
dal Tonello nelle Lezioni intorno alla marina, Venezia 1829, e ch’è
siffatto:

Vascelli da 70 cannoni Nº 10
Vascelli da 66 » 11
 Vascelli da 55 » 1
Fregate da 42 a 44 » 13
Fregate da 32 » 2
Galere » 23
Bombarde » 1
Cutter » 2
Barche cannoniere, armate di un cannone da 4, e »
quattro da 6 16
Brich da 16 a 18 cannoni » 3
Golette da 16 » 1
Galeotte da 30 a 40 remi » 7
Sciabecchi » 7
Feluche » 5
Barche obusiere armate con due obici da 40 o da »
50, e quattro cannoni da 6 31
Galleggianti sulle botti, armati con due cannoni da »
30 10
Passi, armati d’un cannone da 20 o quattro da 6 » 40
Batteria galleggiante di sette cannoni da 50 sul »
perno, detta Idra 1

Baraguay-d’Hilliers, il 16 maggio 1797, scriveva a Buonaparte: — Ho

visitato l’arsenale, e l’ho esaminato minutamente; è uno de’ più belli del
Mediterraneo, e c’è dentro ogni cosa a proposito per armare in due mesi
e colla spesa di due milioni un’armata da sette ad otto vascelli da
settantaquattro, sei fregate da trenta a quaranta, e cinque cutter. C’è
un’immensa artiglieria sì di ferro che di bronzo, fonderie, legnami, una
corderìa superba, cantieri sommamente belli. I fondachi sono zeppi di
legnami, di canapa, di ferro, di catrame, di sartiame e di tele. Ci sono
circa due mila fucili, seimila pistole d’arcione, e pezzi per montarne altri
assai, e tutti i lavorieri sono nel massimo buon ordine».
Nell’arsenale aveasi una preziosa raccolta d’armi vecchie; e parchi di
ben 5293 bocche da fuoco, delle quali 1518 di bronzo; inoltre ne’ forti di
Venezia, di terraferma, di Levante e sulle navi, non contando le piazze
dell’Istria, della Dalmazia, dell’Albania, v’erano pezzi 4468, di cui 1925 di
bronzo. Vedasi da ciò quale depredamento fecero gli avvicendati
conquistatori.
Dopo tanto rubare che fecero i Francesi, dopo aver mantenuto diciotto
mesi l’esercito, collo sperpero che si suole, l’erario veneto potè
 sussidiare tutte le città di terraferma più devastate dai Giacobini, e diede
per provvedere l’esercito francese a

Verona ducati 2,070,026

Brescia » 200,010
Padova » 800,781
Vicenza » 52,332
Crema » 21,000
Feltre » 7,000
Treviso, Belluno, Ceneda, Cadore, »
Pordenone 91,026
Cividal del Friuli » 4,000
Oderzo » 5,000
Asolo » 10,000
Conegliano » 39,000
Bassano » 70,976

Quadro economico delle rendite straordinarie, percepite dal veneto

aristocratico Governo dal 1º giugno 1796 fin al cadere dell’aristocrazia.
Italia 1799.
Sei erano le grandi confraternite di Venezia, dotate di amplissimi
privilegi, e che dai ricchi erano lasciate amministratrici de’ legati che
istituivano pei poveri. L’annuale loro guardian grande avea dignità pari ai
procuratori di San Marco. La più insigne era quella di San Rocco, che
disponeva dell’annua rendita di sessantamila ducati in beneficenze,
massime pei carcerati e gli appestati. In tempo di guerra mantenea molti
soldati ai servigi della repubblica; per questa si fece garante di un
prestito di sei milioni di ducati; avea ottocentomila ducati a censo nella
zecca; e negli ultimi disastri diede diciottomila oncie d’argento, un dono
di cinquantamila ducati, e garantì la repubblica per un prestito di ducati
ducentomila. Tutto perdette nella rivoluzione.

21. Mémoires de Sainte-Hélène.

22. Mutinelli ebbe la pazienza di notare che, negli otto giorni che i quaranta
elettori stettero in conclave per eleggere l’ultimo doge, si spese in pane,
vino, olio, aceto lire 129,421; in pesce 24,410; in carni, polli, selvaggina
23,360; in salami, salciciotti, prosciutti 3980; in confetti e candele di cera
47,660; in vini, caffè, zuccaro 63,845; in frutti, fiori, condimenti 6314; in
masserizie da cucina, legna, carbone 31,851; per guasto di mobili
noleggiati 41,624; per spese minute 108,910; stuzzicadenti 25: tabacco
4931; carte da giuoco 200; altri giuochi 606; berrette di notte 506; calze
 e borse di seta nera per la coda 64; tabacchiere 3067; pettini 2150;
essenze 182.

23. Avea promesso salvar Venezia se gli pagassero ducentomila ducati;

Buonaparte sventò il negozio, e Venezia perì. Ma l’ambasciadore
Querini aveva già emesso obbligazioni per quei seicento mila franchi, e
caduta Venezia, non potè pagarle, onde fu messo prigione a Milano, ma
riuscì a fuggire.

24. Leggendo la Correspondance inédite di Napoleone col Direttorio, ogni

onest’uomo freme al vedere que’ disegni prestabiliti d’iniquità, che
appena sarebbero compatibili nel calore della guerra; e gl’Italiani
sempre vilipesi come la peggior canaglia: Venise va en décadence
depuis la découverte du cap de Bonne Espérance et la naissance de
Trieste et d’Ancône; elle peut difficilement survivre aux coups que nous
venons de lui porter; population inepte, lâche, et nullement faite pour la
liberté. Sans terre, sans eau, il parait naturel qu’elle soit laissée à ceux à
qui nous donnons le continent. Nous prendrons les vaisseaux, nous
dépouillerons l’arsenal, nous enlèverons tous les canons, nous
détruirons la banque, et nous garderons Corfou et Ancône. 26 maggio
1797.

25. Il maresciallo Marmont nel vol. i, p. 36 delle sue Memorie (Parigi 1857),
racconta che i Veneziani mandarono Dandolo ed altri al Direttorio per
lamentarsi del turpe mercato di Buonaparte, e che questo, prevedendo
come un tal passo sarebbe stato la sua ruina, spedì Duroc dietro alla
deputazione, e se la fece condurre a Milano. J’étais (soggiunse) dans le
cabinet du général en chef quand celui-ci les y reçut: on peut deviner la
violence de sa harangue. Ils l’ecoutèrent avec calme et dignité, et quand
il eut fini, Dandolo répondit. Dandolo, ordinairement dénué de courage,
en trouva ce jour-là dans la grandeur de sa cause. Il parlait facilement:
en ce moment il eut de l’éloquence. Il s’étendit sur le bien de
l’indépendance et de la liberté, sur les intérêts de son pays et le sort
misérable qui lui était réservé; sur les devoirs d’un bon citoyen envers
sa patrie. La force de ses raisonnements, sa conviction, sa profonde
émotion agirent sur l’esprit et sur le cœur de Buonaparte au point de
faire couler les larmes de ses yeux. Il ne répliqua pas un mot, renvoya
les députés avec douceur et bonté, et, depuis, a conservé pour Dandolo
une bienveillance, une prédilection qui jamais ne s’est démentie: il a
toujours cherché l’occasion de le grandir et de lui faire du bien: et
cependant Dandolo était un homme médiocre: mais cet homme avait fait
vibrer les cordes de son âme par l’élévation des sentiments, et
l’impression ressentie ne s’effaça jamais. Celui qui pouvait éprouver de
 pareilles émotions, et garder de semblables souvenirs, n’était pas
assurément tel que tant de gens ont voulu le représenter.
Questo Dandolo non appartiene all’antica nobiltà: era un chimico, che
salì poi ad alti posti ed ebbe il titolo di conte come senatore del regno.

26. Credesi da molti fosse un prezioso documento di storia italiana; ma

realmente era un almanacco della nobiltà che stampavasi ogni anno.
Fra le mille prove del disprezzo in che si presero allora le cose patrie,
racconterò che i dogi portavano un anello come distintivo di lor dignità, e
il giorno dell’Ascensione lo buttavano in mare, ma legato a una
cordicella con cui si ritirava. Quello del doge Manin aveva sul diritto
l’impronta stessa dello zecchino, e sul rovescio lo stemma della casa. Al
momento della caduta della repubblica l’aveva il cavaliere del doge, cioè
il capo degli scudieri, e andò a venderlo a un orefice per censessanta
lire venete. Trovossi chi lo ricomprò, e finì nel tesoro imperiale di Vienna.
Il doge Manin lasciò centomila ducati da adoprarsi a mantenere pazzi e
figliuoli abbandonati, pei quali dura col suo nome uno de’ meglio ordinati
istituti.
De’ capi d’arte tolti a Venezia è il catalogo nel Mutinelli, Ultimi
cinquant’anni, pag. 226. Dei preziosissimi ornati del famoso breviario
Grimani la più parte andò perduta: il bassorilievo rappresentante le
suovetaurilia è rimasto nel museo del Louvre. Nelle altre città si fece
altrettanto; ma qui noi vogliamo notare soltanto gli undici preziosi
manoscritti, tolti dalla biblioteca di San Daniele nel Friuli. Da Verona
Buonaparte tolse la raccolta d’ittioliti del conte Gazzola.

27. Berthier scriveva al Direttorio: Je n’ai pu réussir, comme vous m’en

aviez chargé par votre lettre, à enlever à Venise la fabrique des
marguerites.

28. Or ora il conte Ermanno Lanzi di Zacinto stampò la storia della

dominazione veneta nelle isole Jonie, περὶ τῆς πολιτικῆς καταστάσεως
τῆς Επτανῆσου ἐπὶ Ἐνετῶν. Atene 1856.

29. A Campoformio fu messa la statua della Pace, di Comolli, che poi fu

trasferita sulla piazza Contarena di Udine.

30. Lettera del 5 messidoro anno iv.

Quando si pretendeva da tutti gl’impiegati il giuramento d’odiare i tiranni,
esso astronomo scrisse al cittadino Baldironi commissario del Direttorio
esecutivo della repubblica Cisalpina presso il dipartimento dell’Olona: —
Barnaba Oriani stima e rispetta tutti i Governi ben ordinati, nè sa
 comprendere come, per osservare le stelle ed i pianeti, sia necessario di
giurare odio eterno a questo o a quel Governo. Egli è stato in età di
ventitre anni impiegato nella specola di Brera da un Governo
monarchico, e si acquistò qualche nome in questa professione coi mezzi
che gli vennero dal medesimo Governo accordati per vent’anni continui.
Sarebbe dunque il più ingrato degli uomini se ora giurasse odio a chi
non gli ha fatto che del bene. Pertanto egli dichiara che, non potendo
giurar odio al Governo dei re, si sottomette alla legge che lo priva del
suo impiego alla specola di Milano, e malgrado questo castigo, non
cesserà mai di fare i più fervidi voti per la prosperità della sua patria».
Scarpa pure fu dimesso per lo stesso titolo: ma quando Buonaparte
andò a visitare l’Università, chiese di lui, e udito il motivo della sua
rimozione, — E che? le scienze son esse d’alcun partito? A qualunque
appartengano, i grand’uomini devono essere onorati»
Dell’Oriani stesso si ha una lettera al Pioltini ministro di polizia, del 22
piovoso anno vii, ove, a nome suo, del Parini, del Reggio, del Brambilla,
si lagna delle prepotenze che ai professori di Brera usava un uffiziale
della guardia nazionale per obbligarli a montar la guardia, e a pagar
doppia tassa come così detti preti.

31. Il 1º giugno 1797, cioè nel maggior parossismo repubblicano,

Buonaparte, discorrendo con Melzi e col conte Miot de Melito, diceva:
«Credete ch’io trionfi in Italia per la grandezza degli avvocati del
Direttorio, dei Carnot, dei Barras? Credete sia per fondar una
repubblica? che idea! una repubblica di trenta milioni d’uomini, coi
costumi nostri e i nostri vizj! Possibil mai? È una chimera de’ Francesi,
ma che passerà come tante altre. Essi han duopo di gloria, di soddisfare
la vanità, ma della libertà non s’intendono un’acca. La nazione ha
bisogno d’un capo: capo illustre per la gloria, non delle teoriche di
governo, delle frasi, dei discorsi di ideologhi. Diansi loro dei balocchi, e
basta: si spasseranno e lasceransi guidare, purchè si dissimuli la meta a
cui sono incamminati». Mém. du comte Miot de Melito, tom. i. p. 163.

32. Di que’ Governi esponemmo i disordini nella Storia della città e diocesi
di Como, lib. ix.

33. Quelle pazzie venivano così riferite dal cittadino Poggi alla Società di
pubblica istruzione di Milano: — Il popolo tutto ondeggiava nelle
dolcezze, ai puri repubblicani serbate, se il truce oligarca si tragga, che
in segreto angolo appiattato mordeva forse la polvere, vedova rimasta
del mal seminato oro fatale; quando improvvisa fama annunzia
clamorosa, che nel quartiere di Prè, creduto per influsso molesto il men
democratico, si è innalzato il primo albero di libertà per mano del popolo
esultante. Fu questa una voce creatrice: in un istante comparvero alberi
su d’ogni piazza, entro poche ore parve Genova un bosco, e, meraviglia
ai presenti ed ai lontani popoli, più di cento ne sursero lo stesso giorno! I
sermoni dettati dall’eloquenza repubblicana si udivano per le vie tutte e
appiè degli alberi, e varj d’abito e di colore i ministri del culto peroravano
collo zelo maggiore la causa del popolo; ben diversi da quegli impostori,
che non bramando esser utili, anzi cercando di nuocere alla pubblica
cosa, protestano di non volersi immischiare in oggetti politici.
«I pranzi repubblicani, tanto opportuni per nodrire il piacere
dell’eguaglianza, e per stringere i nodi della fraternità, erano pubblici, e
senza numero moltiplicati: i suoni di numerose bande, gl’inni ed i balli
patriotici e marziali, che allumarono in Francia il fuoco della libertà, e
scossero i debellatori dei re, condivano le mense di non mai gustate
dolcezze: i saporosi brindisi alla morte de’ tiranni, alla salute della patria,
alla libertà dell’Italia, alla memoria del liberatore de’ popoli Buonaparte,
si rispondevano all’unissono da mille canti.
«L’ora s’accostava intanto, in cui il popolo ligure dovea dar prova
dell’odio profondo che nodrir denno i figli di Bruto contro ogni ombra di
tirannia: quindi abbattutosi egli nelle due statue colossali dei tiranni
Doria, animato dal genio siracusano, a cui l’immortale Timoleone fu
padre, le diroccò, le stritolò, le teste e le braccia ne appese all’albero
della salute, e alcuni pezzi del busto ne destinò a formar patere e vasi
per la Dea Cloacina.
«Sul declinare del giorno il popolo sovrano richiese l’esecrabile libro
d’oro: si tentò d’ingannarne l’ordine assoluto colla esibizione di altri libri:
era già pronta la pubblica vendetta, se i veri originali in cinque volumi
non venivano immediatamente consegnati. Un decreto del nuovo
Governo consolò il popolo, e que’ libri, che come in Roma i sibillini, si
tenevano in venerazione, furono con universale esecrazione lacerati ed
arsi solennemente all’Acquaverde in presenza di venti e più mila
cittadini. Ma chi descriverà colle tinte della natura la brillante energia, i
vivi trasporti e la nobile fierezza, onde fu accompagnata la gloriosa
impresa? Le ceneri furono consegnate ai venti, che le recarono sul mar
Tirreno, onde confonderle con quelle del libro d’oro pochi dì prima
abbrugiato sulle adriatiche Lagune, che sull’ale di altri venti si
trasportavano alla cumea voragine d’Acheronte.
«Popolo lombardo che belle lezioni repubblicane!
«Nuovi canti, nuovi balli, nuove grida di tripudio chiusero quest’illustre
giornata, che viverà eterna nella memoria de’ liberi nipoti».
34. Moniteur, anno vi, nº 167.

35. Per le incertezze che accompagnano ogni minaccia di guerra, il debito

pubblico di Roma era ingrossato sotto Pio VI, che fece cavare da Castel
Sant’Angelo scudi cinquecento mila del fondo di riserva, che diceasi
tesoro di Sisto V; fece prestiti, levò per venti milioni sui beni ecclesiastici,
impose tasse; chiese la volontaria consegna degli ori e argenti, che
salirono, per parte de’ privati, a scudi 560,438; del monte di Pietà a
962,102; della casa di Loreto a 179,517. Per l’armistizio di Bologna si
dovette dare ai Francesi quindici milioni in denaro, e quasi sei in merci e
animali, onde si fecero pegni e debiti e si vendettero molte proprietà:
undici milioni si ebbero da gioje del tesoro pontifizio: sicchè in quattro
mesi lo Stato papale pagò trentadue milioni di franchi: e al 1797 avea il
debito di settantadue milioni di scudi, non compresi i debiti delle
comunità, mentre era ridotto a soli 1,700,000 abitanti. Dal solo tesoro di
Sisto V (che allora fu vuotato) si mandarono alla zecca 3155 libbre
d’oro: i cardinali dovettero dare le mazze d’argento dorato, da cui si
faceano precedere nelle funzioni, e dove il lavoro superava la materia.
La succeduta repubblica mandò tutto a sconquasso.
Oltre i libri levati alla Biblioteca Vaticana e i quadri e le statue, si tolse un
ricchissimo medagliere di numismi antichi e moderni, spesso donati dai
regnanti, o comprati da diversi papi, fra’ quali il medagliere Albani con
323 medaglioni d’imperatori di gran modulo, quel dei Carpegna con 175
medaglioni; quel di Clemente XIV colla serie degl’imperatori e delle
famiglie romane in numero di 1261 in argento, e 1989 di altri popoli e
città in argento e bronzo; altre 737 da Giulio Cesare a Probo; e la serie
dei papi: 200 stupendi cammei, insignemente legati in oro, una croce
pettorale gemmata, un prezioso vaso d’oro, 105 cammei della regina
Cristina illustrati da Sante Bartoli; un ricchissimo forziere regalato da
Maria Teresa colle sue medaglie in oro.
Inoltre da Roma si portarono via moltissimi reliquiarj preziosi, e
principalmente da Santa Croce di Gerusalemme; e da Santa Maria
Maggiore la lunga cassa d’argento, in cui Filippo IV avea fatto chiuder
gran parte del presepio; dalla basilica lateranense due grandi busti
d’argento giojellati.
Fu pure tolto un famoso ostensorio, che la casa Doria Pamfili possedeva
e imprestava per le quarant’ore alla chiesa di Sant’Agnese in piazza
Navona, e che si valutava da 174,000 scudi.
Poi nel 1807 fu dall’imperatore comprato il famoso museo Borghesi con
255 preziosi monumenti, contro voglia del proprietario e con protesta del
Governo.
 Al fine del iii vol. della Correspondance de Napoleon I, che si pubblica
ora da Napoleone III è il catalogo de’ capidarte spediti da Roma a Parigi
da Buonaparte e da Berthier.

36. Tavanti, Fasti di Pio VI.

37. Lettera del Milizia, 2 marzo 1798, in De Potter, Vie de Ricci. A Tavoleto
nell’Urbinate altre sollevazioni, dove accorso il generale Sahuguet, pose
il fuoco al paese, bruciandovi vecchi, donne, fanciulli; e innocenti ben
più che malfattori.

38. I tribuni fatti da Berthier erano i poeti Monti, Gagliuffi, Solari genovese e
il medico Corona. L’editto 5 ottobre del senato di Bologna dice «d’ordine
del comandante di piazza a cui siamo in dovere di obbedire».

39. Correspondance de Napoléon I, t. iv. p. 14.

40. Secondo la corrispondenza di Nelson, le sole gioje che la regina confidò

a Emma Leona, passavano il valore di sessanta milioni di franchi.
* Si è molto detto ed esagerato sulle frodi usate da Ferdinando IV al
Banco pubblico, ma vuolsi correggere coll’opera del barone Savarese
Sulle carte dei Banchi di Napoli, emesse dal 1796 al 1799, e ritirate nel
1800. I Banchi, riordinati da Carlo III, rilasciavano fedi di credito,
dinotanti la somma depositata, ed esigibili a vista; comodo impiego, pel
quale eransi accumulati quindici milioni di ducati. Il Governo pensò
profittare di questa fiducia con pagare le sue spese mediante fedi di
banchi senza deposito precedente: niuno se n’accorgeva, sicchè non
alteravasi il valore. Ove se ne fossero accorti, bastava a pagarli il
patrimonio de’ banchi stessi in terre e capitali fruttiferi. Prima si andò con
misura, ma imminendo la guerra, si attinse largamente a questa fonte; e
allora il valore delle fedi scadde, stentaronsi i pagamenti, e più quando
la Cassa di guerra si dotò con cedole siffatte di nuova emissione; e
l’aggio fu sino di cinque sesti del valor nominale. I debitori pretendeano,
come avanti, pagar in carta, e i creditori ricusavano, ma il Governo
ordinò ai tribunali di tenerle buone. Ciò scompigliò non poco gli averi, e
sopraggiunta la repubblica, si trovò ch’eransi emessi venti milioni di
ducati senza deposito; talchè le carte scaddero al decimo del valor
nominale. Ristabilito il Governo regio, e dirigendo le finanze l’abilissimo
Giuseppe Zurlo, il Governo confessò il torto suo, giacchè ritirò i
ventiquattro milioni di cedole, che costarono cinque milioni di ducati di
beni dello Stato, e la rendita iscritta d’annui quattrocento mila ducati.
L’operazione piacque al re, che volle premiarne lo Zurlo con sessanta
 mila ducati, ma esso ricusò dicendo non voler trarre un utile privato da
una pubblica sventura.

41. Perchè non si vantino d’originalità i nostri contemporanei, ecco il

proclama che allora divulgò:
«Championnet generale in capo dell’armata di Napoli a tutti gli abitanti
del fu regno napolitano.
«Siete liberi finalmente; la vostra libertà è il solo prezzo che la Francia
vuol ritrarre dalla sua conquista, e la clausola del trattato di pace, che
l’armata della Repubblica giura solennemente con voi fin dentro le mura
della vostra capitale, e sopra il trono rovesciato dell’ultimo re vostro.
«Guaj a chiunque rifiuterà di segnare con noi questo onorevole patto, in
cui tutto il frutto della vittoria è pel vinto, e che altro non lascia al
vincitore, che la sola gloria d’avere consolidata la vostra felicità! sarà
egli trattato come un pubblico nemico, contro del quale noi restiamo
armati. — Se si trovano dunque fra voi persone di cuore così ingrato da
rigettare la libertà, che abbiamo loro conquistata a prezzo del sangue
nostro; se si trovano uomini così insensati da richiamare un re decaduto
dal diritto di comandarli mercè la violazione del giuramento che aveva di
difenderli, fuggano eglino sotto le bandiere disonorate dello spergiuro, la
guerra contro di loro è a morte ed esterminati saranno.
«Repubblicani, la causa per la quale avete così generosamente sofferto
è finalmente decisa: ciò che non aveano potuto terminare le brillanti
vittorie dell’armata d’Italia, ciò che aveano sì lungo tempo ritardato
gl’interessi pubblici dell’Europa intiera, ciò che aveano sospeso le
speranze d’una pace generale, ciò che avevano impedito fino a questo
giorno la religione dei trattati, ed il timore d’una nuova guerra:
l’acciecamento dell’ultimo re l’ha felicemente operato. — Accusi egli
dunque solamente il proprio orgoglio insensato e l’audacia della sua
oppressione, della felicità dei vostri destini e delle sue disgrazie: ma sia
egli giustamente punito colla perdita di una corona che ha disonorata, e
col rammarico di avervi egli medesimo resi liberi, e aver attaccato contro
la fede dei giuramenti una nazione alleata, e d’aver voluto rapire la
libertà ad un popolo vicino.
«Il sentimento d’una felicità tanto inaspettata non sia in voi per niun
modo avvelenato da alcun timore. L’armata che comando resta fra voi
per difendervi: perderà essa financo l’ultimo de’ suoi soldati, e spargerà
fino l’ultima goccia del suo sangue pria di soffrire che l’ultimo vostro
tiranno conservi nè tampoco la speranza di rinnovare le proscrizioni
delle vostre famiglie, e di riaprire le prigioni oscure nelle quali vi ha fatto
gemere per lungo tempo.
 «Napoletani, se l’armata francese prende oggi il titolo di armata di
Napoli, e ciò che in sequela dell’impegno solenne che essa prende di
morire per la vostra causa, e di non fare altro uso delle sue armi che
quello di conservare la vostra indipendenza, e sostenere i vostri diritti,
che essa ha conquistati per voi. — Si rassicuri dunque il popolo su la
libertà del suo culto, cessi il cittadino d’inquietarsi sui diritti della sua
proprietà: un grande interesse ha stimolato i tiranni a grandissimi sforzi
che hanno fatto per calunniare agli occhi delle nazioni i sentimenti e la
lealtà della nazione francese; ma pochi giorni sono necessarj ad un
popolo tanto generoso per disingannare gli uomini creduli delle odiose
presunzioni di cui si serve la tirannia per condurli ad eccessi deplorabili.
— L’organizzazione della rapina, e dell’assassinio dall’ultimo re vostro
immaginata, e da’ suoi agenti perversi eseguita, quale un mezzo di
difesa, ha prodotto disastrose e serie conseguenze funestissime; ma
rimediando alla cagione del male facile cosa sarà arrestare gli effetti e di
riparare a queste conseguenze.
«Che le autorità repubblicane, che saranno create, ristabiliscano l’ordine
e la tranquillità su le basi d’un’amministrazione paterna, dissipino gli
spaventi dell’ignoranza, e calmino il furore del fanatismo con un zelo
eguale a quello ch’è stato impiegato dalla perfidia per inasprirli ed
irritarli, ben presto la severità della disciplina, che si ristabilisce con tanta
facilità nelle truppe d’un popolo libero non tarderà di mettere un termine
ai disordini provocati dall’odio, e che il diritto di rappresaglia ha
permesso di reprimere.
«Fatto in Napoli il cinque piovoso anno vii (24 gennajo v. st.).
Championnet».

42. L’avvocato Brofferio, nella Storia del Piemonte, part. i. c. 5, addurrebbe

un fatto, ch’egli attesta avere diligentemente verificato. I cittadini d’Alba
erano stati dei primi a chiarirsi pei Francesi; ma dopo la pace di
Cherasco si avvidero che Buonaparte amava tutt’altro che la repubblica,
onde mandarono al Direttorio una protesta contro il generale. Dovendo
poi pagare una contribuzione di ottantamila lire, spedirono a Buonaparte
a Milano per chiedere una proroga. L’inviato fu Parussa, uno de’ primi
patrioti, e che aveva firmato la protesta suddetta. Buonaparte gli mostrò
questa protesta e congedollo; ma nell’uscire fu preso e subito fucilato
nel cortile della villa di Milano.
Per esortare i Piemontesi ad unirsi colla repubblica Cisalpina, Leopoldo
Cicognara che ne era commissario a Torino, scrisse un opuscolo Agli
amici della libertà italiana, Torino 1798. I Francesi vi fecer fare dal
 cavaliere Gaspare Gregori piemontese la Risposta agli amici della
libertà italiana.

43. Pettegolezzi chiariti nei Mémoires tirés des papiers d’un homme d’Êtat,
tom. vii.
* La nota del Moniteur conchiudeva: On regarde cette innovation comme
une victoire de la grande nation: ma a Ginguené fu scritto che il Governo
francese era rappresentato da ambasciadori, non da ambasciatrici.
Fra le altre insistenze con cui Ginguené molestava incessantemente il
Governo piemontese, era che fosse punito di morte chiunque si trovasse
con uno stilo o coltello, per qualsivoglia uso. Gli si domandava se un
codice, dove fosse scritta tal legge, s’addirebbe alla filantropia tanto
predicata dall’ambasciadore.
Barante, nell’Histoire du Directoire, stampata al tempo stesso di questa
nostra, e che noi conoscemmo solo adesso, parla a lungo delle vicende
d’Italia nel triennio; ma non ci parve una novità, nè in modo da cambiare
i giudizj da noi portati. Sulla lettera del Pignatelli al Priocca (pag. 86) non
mette alcun dubbio. Si estende su questo incidente del Ginguené;
honnête homme, mais la philosophie et la révolution lui avaient inspiré
des opinions absolues et orgueilleuses. Les chimères systématiques et
l’emphase sentimentale étaient devenues dans son esprit une croyance
sincère et intolérante,... il attribuait (aux princes d’Italie) des complots, et
révait les poignards et les poisons, tandis qu’il parlait avec admiration de
la loyauté du Directoire, qui l’avait chargé d’exciter contre le roi les
révoltes de ses sujets.
Segue a dire che aveva preparato un discorso accademico e panegirico;
ma vista la semplicità della Corte, ne proferì uno meno enfatico, ma
sconveniente, lodando la lealtà del Direttorio, a fronte della perfidia degli
altri Governi, ecc. Carlo Emanuele, invece di rispondergli, gli domandò
se avea fatto buon viaggio, se stava bene di salute; gli parlò della
propria infermità, dei dispiaceri, delle consolazioni che gli dava la santa
sua moglie Clotilde, ecc. ecc.

44. Il Bossi finì prefetto in Francia nel 1823; compose l’Oromasia, poema
italiano sui fatti della rivoluzione, ma freddo. Il dottore Botta divenne poi
storico famoso.

45. «Suwaroff detestava di cuore i Francesi. Era magro, ossoso: la brillante

divisa ondeggiava s’un corpo scarnato, e traverso le innumerevoli croci
sul suo petto vedevasi una camicia di tela grossa come i soldati. Capelli
bianchi, rasi davanti secondo l’ordinanza militare: piccoli occhi,
scintillanti di passione e di indomita energia. Il giorno che arrivai al
 campo, il feldmaresciallo mi tenne a pranzo. Due cosacchi posero sulla
tavola, coperta d’una grossolana tovaglia e senza mantili, un enorme
piatto di salcraut e uno di aringhe, e qui consistette tutto il desinare.
Dopo si portò il punc, e Suwaroff dava un bicchiere a ogni soldato che
entrasse, e che dopo trangugiatolo non mancava mai di dire: «Su, papà,
ancora un altro». Adorato dai soldati e dai bassi uffiziali, benchè non
potessero fidarsi delle sue promesse: sua passione era la gloria. Niente
scrupoloso di mentire o ingannare, detestando di tutto cuore gli Alleati,
l’unica cosa di cui tenesse conto era battere Napoleone: il resto, dice
non valere una pipa di tabacco. Prode, freddo di sangue ma vendicativo,
univa le qualità più disparate. Ostentava pietà, ma abbandonavasi a
tutta la foga della passione. Passava per rozzo e ignorante, mentre
aveva un’istruzione estesissima, un cervello da pensatore, una
conoscenza perfetta della storia: non poteva soffrire quei che scrivono
lungo, e diceva: «Quand’uno non vale nè pel pensiero nè per l’azione,
attacca grand’importanza all’inutile scribacchiare». Guaj all’ajutante di
campo che non sapesse esser conciso ne’ rapporti! li stracciava a
bocconi, e gettandoli via diceva stizzoso: «Rifate, e corto». Quando il
segretario della guerra gli dirigeva un rapporto, dicea sempre: «Questi
asini non saprebbero scrivere senza far sempre marciare un esercito di
cento mila lettere?» D’attività prodigiosa, non lasciava far nulla agli
uffiziali: non dormiva si può dire mai; nè mai riposava: spesso correva in
manica di camicia, e sprezzava mille cose, che son bisogni per gli altri. Il
suo difetto come capitano era l’impazienza, che sperdeva spesso i piani
meglio concepiti, e lo privava del frutto de’ suoi vantaggi». Memorie d’un
legittimista dal 1770 al 1830, sopra il giornale manoscritto, le lettere e le
note lasciate dal marchese Enrico Gastone di B*** (ted. 1861), per
Giulio de Wickede. Quel marchese scrive che, dopo la battaglia di
Cassano, Suwaroff gli disse solo «Contento», e quest’unica parola lo
eccitò in modo, che si sarebbe fatto uccidere per lui.

46. Di questo Mammone, così orribilmente dipinto dal Coco, non fa il minimo
cenno Lomonaco, la cui relazione a Carnot è vera opera d’un frenetico,
eppure è la fonte a cui principalmente attinsero i narratori di quelle
tragedie, e principalmente Carlo Didier nella Caroline en Sicile. Molte
falsità emendò il barone Leon d’Hervey Saint-Denys nella Histoire de la
révolution dans les Deux Siciles depuis 1793: ma resta ancora il dovere
a qualche storico onesto di vagliare la verità dalla sistematica menzogna
delle gazzette e dei settarj. Il tempo nostro v’è meno adatto che nessun
altro.

47. Il fatto è asserito comunemente, ma di tal lettera non c’è vestigio; la

negano il Sacchinelli (Vita del Ruffo) e il barone d’Hervey, e che più
 monta, non la adducono gl’Inglesi, interessatissimi a discolpare Nelson.
Nelson scriveva al cardinale Ruffo. «Milord Nelson informa V. E. che egli
disapprova affatto cotali capitolazioni, e che egli è risolutissimo di non
restare neutrale, colla forza rispettabile che ha l’onore di comandare....
Milord spera che il cardinale Ruffo sarà del suo avviso e che allo spuntar
del giorno di domani esso potrà agire d’accordo con S. E. I loro intenti
non possono esser che gli stessi, cioè di ridurre il nemico comune, e di
sottomettere alla clemenza di S. M. Siciliana i suoi sudditi ribelli».
Il Cacciatore nell’Esame della storia del Colletta (Napoli 1850), difende il
Ruffo, e ne reca una lettera con cui il comandante del Castelnovo
significava che «sebbene egli (Ruffo) e i rappresentanti degli Alleati
tenessero per sacro e inviolabile il trattato, nulladimeno il
contrammiraglio Nelson non voleva riconoscerlo; e siccome era in libertà
delle guarnigioni di avvalersi dell’articolo 5º della capitolazione, come
avevano fatto i repubblicani della collina di San Martino che erano tutti
partiti per terra, così gli faceva questa partecipazione, affinchè, sulla
considerazione che in mare comandavano gl’Inglesi, le guarnigioni
potessero prendere quella risoluzione che meglio loro piacesse e che
sicuri li rendesse»; lib. i, pag 145. Vedasi pure Memorie storiche sulla
vita del cardinale Fabrizio Ruffo, scritte dall’abate Domenico
Sacchinelli (Napoli 1836): e marchese Filippo Malaspina Occupazione
de’ Francesi nel regno di Napoli dell’anno 1799; invasione del regno nel
1806, e l’impresa intrapresa dal cardinale F. Ruffo, ecc. Parigi 1846. Il
Malaspina fu ajutante di campo del Ruffo, che per sospetto lo fe gettar in
carcere. Il Sacchinelli, segretario del Ruffo, reca documenti irrefragabili.

48. La vita del Coco, inserita nella Biographie Universelle, racconta che egli
viveva in intimità colla San Felice: un Bacher per rivalità minacciò di
denunziarlo: ma la San Felice denunziò più prontamente il Bacher come
reazionario, e fu mandato al patibolo. Cambiato vento, essa pure fu
condannata. Il Coco divenne giornalista nella repubblica Cisalpina, poi
nel regno d’Italia; fu impiegato sotto Murat, ma aspirava a esser capo
dell’istruzione o ministro, e non ottenendolo, trescò contro i Napoleonidi.
Di ciò gli fece merito Ferdinando IV, che lo conservò direttore del tesoro.
Trovavasi così a una Corte che egli avea violentemente denigrata: e una
volta il principe reale avendogli espresso il desiderio di leggere la sua
Storia della rivoluzione di Napoli, egli ne prese tale sgomento, che
divenne pazzo, e sopravvisse in tale infelicità fino al 1823.

49. Il Colletta dice furono parecchie centinaja: il parabolano Coco li porta a

quattro mila: il marchese Gualterio a quaranta mila!! La lista che ne dà il
 Lomonaco è di cendiciannove, oltre la San Felice. Il Sacchetti riduce i
giustiziati a novantanove.

50. Fra i detenuti era il famoso naturalista Dolomieu, che, partitosi dalla
spedizione d’Egitto, fu spinto sulle coste napoletane il giugno 1799, e
toltogli il portafoglio, fu gettato in un fondo di torre senza libri e penne;
dove, fattosi inchiostro col fumo della lampada, sui margini di qualche
volume sottratto alla vigilanza scrisse la Filosofia mineralogica. Fu
liberato il 15 marzo 1801.

51. Motuproprio del 10 febbrajo 1800. In una circolare del 20 aprile

successivo l’arcivescovo Martini di Firenze invitava i pievani della sua
diocesi a dar una nota dei Giacobini, assicurandoli del massimo segreto;
chiesti da qualche altra autorità d’informazioni simili, se ne disimpegnino
come possono, giacchè il Governo non terrebbe conto se non della nota
che trasmetterebbero mediante l’arcivescovo; e così concorrano «ad
estirpare una cancrena che tanto male ha prodotto, ed è capace di
produrre sino all’esterminio delle nazioni».

52. Lettera all’abate di Caluso, 27 luglio 1799.

* Il furore dell’Alfieri contro i Francesi appare, non solo dal Misogallo, ma
dalla Vita e dalle lettere. Basti per tutte una del 5 agosto 1800 al famoso
Lagrange. — La Grangia, sei tu francese o italiano? Se francese, non
contaminerò la mia voce parlandoti, ma se italiano pur sei adempirò
l’indispensabile sacro dovere d’indipendente e verace scrittore italiano
col dirti; che non può nè deve un tuo pari menare i suoi giorni in Francia
tra codesti schiavi malnati, e sotto una sì infame e stolta tirannide.
Aggiungo che molto meno tu dei (e fosse pur anco a costo di una
onorevole anzi gloriosa mendicità) ricevere tu il tuo pane dagli
oppressori, assassini della desolata tua terra natale».

53. Lavergne, nella Vie de Souwaroff, racconta che Paolo di Russia

interpellò uffizialmente l’Austria se volesse ripristinare il re di Sardegna e
la repubblica di Venezia; in tal caso Suwaroff resterebbe, e sarebbegli
mandato un altro esercito: l’Austria non volle promettere. Vedi anche
Lettres et opuscules inédits di J. De Maistre. Parigi 1851, tom. i. p.
178.
Il conte di Cobentzel, nel novembre 1799, rispondeva al conte Panin
ministro russo: — Come potrebbe esigersi in cessione delle tre
Legazioni, che nel trattato di Tolentino furono annesse alla repubblica
Cisalpina da noi conquistata? È un giusto compenso delle spese di
guerra. Io non dubito che la mia Corte non renda il Piemonte al re di
Sardegna; ma Alessandria e Tortona, che furono già coll’armi staccate