VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA

Justina Zykevičiūtė

VAISTINIŲ ARBATŲ SUDĖTIES IR

ANTIOKSIDACINIŲ SAVYBIŲ ĮVERTINIMAS
Magistrinis baigiamasis darbas

Studijų programa: cheminė analizė, valstybinis kodas: 62603P105,

studijų kryptis: chemija.

Vadovai: habil. dr. Audrius Maruška

(Moksl. laipsnis, vardas, pavardė ) (parašas) (data)
dr. Olga Kornyšova
(Moksl. laipsnis, vardas, pavardė ) (parašas) (data)

Apginta: prof. habil. dr. Gintautas Kamuntavičius

(Fakulteto dekanas) (parašas) (data)
Kaunas, 2009
TURINYS
Santrauka .............................................................................................................................. 5
Summary ............................................................................................................................... 6
1. ĮVADAS............................................................................................................................. 7
2. LITERATŪROS APŽVALGA........................................................................................ 9
2.1. Laisvieji radikalai. Oksidacinis stresas ....................................................................... 9
2.2. Antioksidantai.................................................................................................................10
2.3.Vaistinių arbatų mišinių naudingieji komponentai................................................... 10
2.4.Vaistinių arbatų mišinių atskiros sudėtinės dalys. .................................................... 11
2.5. Flavonoidų chemija ..................................................................................................... 13
2.5.1. Flavonoliai ................................................................................................................14
2.5.2. Flavonai ....................................................................................................................14
2.5.3. Katechinas ................................................................................................................14
2.5.4. Flavanonas................................................................................................................14
2.5.5. Antocianinai .............................................................................................................15
2.6. FLAVONOIDŲ ANALIZĖ......................................................................................... 15
2.6.1. Spektrofotometrija ................................................................................................... 15
2.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija....................................................................... 16
2.6.3. Kapiliarinė elektroforezė......................................................................................... 18
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI .......................................................................... 20
4. Tyrimų objektas ir metodika......................................................................................... 20
4.1. Medžiagos ir tirpikliai ................................................................................................. 20
4.2. Vaistinė žaliavos bandiniai ......................................................................................... 21
4.3. Bandinių ruošimas....................................................................................................... 23
4.4. Aparatūra ..................................................................................................................... 23
4.4.1.Efektyviosios skysčių chromatografijos ESC – DPPH aparatūra.......................24
4.4.2. Kapiliarinės elektroforezės aparatūra ..................................................................24
4.5. Skaičiavimai, duomenų įvertinimas........................................................................... 25
4.5.1. Flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu..............................25
4.5.2. Fenolinių junginių nustatymas...............................................................................26
4.5.3. Antioksidacinis aktyvumas.....................................................................................26
4.6. ESC eksperimentinė dalis ..............................................................................................27
4.7. Kapiliarinės elektroforezės metodo optimizavimas....................................................27
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ........................................................................... 30
5.1. Flavonoidų bendro kiekio įvertinimas spektrofotometru ..........................................30
5.2. Fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriškai .....................................31

2
5.3. Arbatų antioksidacinis aktyvumas ...............................................................................34
5.4. KE eksperimentinė dalis ir gauti rezultatai.................................................................36
5.5. Optimizuoto metodo įteisinimo žingsniai.....................................................................39
5.5.1. METODO ATRANKUMAS.................................................................................................................................39
5.5.2. TIESINIS INTERVALAS, APTIKIMO IR NUSTATYMO RIBOS .....................................................................40
5.5.3. REZULTATŲ GLAUDUMAS..............................................................................................................................41
5.5.4. METODO STABILUMAS....................................................................................................................................42
5.6. ESC analizė: ....................................................................................................................42
Antioksidacinis identifikuotų junginių įvertinimas pagal Rutino ekvivalentą ............. 43
6. METODŲ PALYGINIMAS IR APIBENDRINIMAS ................................................ 47
7. IŠVADOS ........................................................................................................................ 48
Padėka ................................................................................................................................. 56
Publikacijos darbo tema .................................................................................................... 57

3
 Santrumpos

ESC efektyvioji skysčių chromatografija

KE kapiliarinė elektroforezė
EOS elektroosmozė
N teorinių lėkštelių skaičius
PAM paviršinio aktyvumo medžiaga
Rs skiriamoji geba
NDS natrio dodecilsulfatas
tm migracijos trukmė
UV ultravioletas
KFE kietafazė ekstrakcija
RDJ aktyvios deguonies formos
LR laisvieji radikalai
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
ACN acetonitrilas
CH3OH metanolis
TFR trifluoracto rūgštis
1_04 ekstraktas,10ml atliktas 2008 04 mėn
1_10 ekstraktas, 10ml atliktas 2008 10 mėn
1_04k ekstraktas po KFE,10ml atliktas 2008 04 men
1_10k ekstraktas po KFE,10ml atliktas 2008 10 men
1_04s ekstraktas, 10ml atliktas 2008 04 mėn,
laikytas šaldytuve, tirtas 2008 10 mėn

4
 Santrauka

Vaistinės arbatos mišiniai vertingi dėl jose esančių komponentų, kaip fenoliniai junginiai
(atsakingi už antimikrobinį veikimą) ir flavonoidai (natūralūs antioksidantai, surišantys laisvuosius
radikalus). Flavonoidų cheminės savybės apžvelgtos darbe. Šio darbo tikslas - atlikti flavonoidų ir
fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę analizę bei nustatyti bendrą antioksidacinį aktyvumą vaistinių
arbatų mišinių ekstraktuose.
Paruošti metanoliniai vaistinių arbatų mišinių ekstraktai po kietafazės ekstrakcijos buvo
analizuojami spektrofotometru, kapiliarine elektroforeze ir efektyviąja skysčių chromatografija su
reakcijos detektoriumi. Spektrofotometru išmatuotas bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis
vaistinėse arbatose. Įvertintos metanolinių ekstraktų laikymo sąlygos šaldytuve bei sausos žaliavos
laikymo sąlygos sausoje, vėsioje vietoje. Efektyviąja skysčių chromatografija įvertintas fenolinių
junginių kiekis ir jų antioksidacinis aktyvumas su 2,2 - difenil – 1 - pikrilhidrazilo (DPPH • ) laisvuoju
radikalu. Blukinimo reakcija matuota UV detektoriumi ties 517 nm. Efektyviaja skysčių
chromatografija išskirstyti fenoliniai junginiai, taikant gradientą. Atliktas kapiliarinės elektroforezės
metodo optimizavimas: įvertintas buferio pH, organinio tirpiklio priedo, įtampos įtaka skirstymo
efektyvumui, skiriamajai gebai. Atlikti įteisinimo žingsniai: įvertintos aptikimo ir nustatymo ribos,
matavimų glaudumas, stabilumas ir atrankumas. Priedo metodu buvo identifikuoti flavonoidų
standartai vaistinių arbatų mišiniuose. Gauti rezultatai kapiliarine elektroforeze, efektyviąja skysčių
chromatografija buvo lyginami su spektrofotometru gautais rezultatais. Įvertintos sausos žaliavos ir
metanolinių ekstraktų vaistinių arbatų mišinių laikymo sąlygos. Didžiausias fenolinių junginių kiekis
nustatytas „Prakaitavimą skatinančioje“ arbatoje 3,53mg/g. Flavonoidų didžiausias kiekis nustatytas
„Tulžį varančioje“ arbatos mišinyje 2,08mg/g. Nustatytas suminis flavonoidų kiekis ne visiškai atitinka
fenolinių junginių kiekio pasiskirstymą, tačiau fenolinių junginių kiekiai koreliuoja su antioksidaciniu
aktyvumu.

5
 Summary

Previous studies refer mostly to the HPLC analysis of the flavonoids, for oxidative product
deterioration and radicals scavenging action. Methanolic extracts after solid phase extraction of 6
different functional teas were analyzed by means of capillary zone electrophoresis (CZE) and high
performence liquid chromatography (HPLC) with reaction detector. A rapid on-line method for
screening components was developed using methanolic solution 2,2 – diphenyl – picrylhydrazyl
(DPPH) as stable free radical. Bleaching reaction is detected as a negative peak by an absorbance
detector at 517 nm. HPLC gradient runs with mobile phase composition ranging from 33 to 90%
organic solvent (methanol) in water with 0.1% TFA. The activity of compounds in functional teas
(complex mixtures) was determined. Development and validation of the CZE method was carried out..
Limits of detection and quantification were determined. The results obtained using CZE are
comparable to the spectrophotometric and HPLC analysis results. The influence of the extraction
conditions (with solid phase extraction (SPE) and without SPE extraction), amount of flavonoids and
phenolic compounds in the various functional teas was studied. The highest content of flavonoids was
obtained in Choleretic herbs mixture 2,08 mg/g and the highest content of phenolic compounds was
determined in Diaphoretic functional tea 3,53mg/g in raw dry medicinal functional tea herbs. The total
amount of flavonoids did not directly correlate with the antioxidant activity, however amount of
phenolic compounds in functional teas has shown a correlation to the antioxidant activity.

6
1. ĮVADAS

Gydomųjų savybių turintys augalai vadinami Vaistiniais augalais. Pasaulio sveikatos

organizacijos duomenimis, dabar gydymo tikslais naudojami apie 35 000 rūšių vaistiniai augalai, bet iš
viso gali būti naudojami maždaug 75 000 rūšių augalai. Europos farmacijos pramonėje naudojama
beveik 1200 rūšių vaistinių augalų žaliava. Vaistingųjų arbatžolių arbatos teigiamai veikia organizmą -
jose esantys antioksidantai padeda surišti laisvuosius radikalus, atsiradusius dėl uždegiminių procesų,
šalutinio vaistų poveikio, norint išvengti įvairių ligų bei atitolinti senatvę.
Oksidacinis stresas yra ligų priežastis, kurį sukelia laisvieji radikalai ir singuletinio deguonies
atmainos. Antioksidantai – svarbūs fitocheminiai elementai, neutralizuojantys neigiamą laisvųjų
radikalų poveikį ląstelių sienelėms. Jei antioksidacinės organizmo sistemos nesugeba kovoti su
aktyviomis deguonies formomis, laisvųjų radikalų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo organizmo
veiklą.
Šiuolaikinei medicinai ypač svarbūs vaistai, pasižymintys antialerginiu, antioksidaciniu,
antimikrobiniu, antivirusiniu, imuninę sistemą stimuliuojančiu, kardiotoniniu ir medžiagų apykaitą
reguliuojančiu poveikiais. Didelis dėmesys skiriamas naujų priešmikrobinių ir ypač priešgrybelinių
junginių paieškai [1].
Svarbus yra antioksidacinių junginių išskyrimas. Flavonoidai – yra polifenoliniai junginiai
paplitę gamtoje. Jie klasifikuojami pagal jų strūktūrą: flavonoliai, flavononai, izoflavonai, katechinai,
antocianidinai ir chalkonai. Mišinio sudėtis dažniausiai būna labai sudėtinga, jį sudarantys junginiai
dažnai būna labai panašūs fizikinėmis ar cheminėmis savybėmis. Mišinio komponentams išskirstyti ir
juos analizuoti naudojami įvairūs cheminės analizės metodai: skysčių chromatografija (ESC) (tradicinė,
mikro formato ir kapiliarinė - nanochromatografija), elektromigraciniai metodai (kapiliarinė zonų
elektroforezė (KZE), izoelektrinis fokusavimas, kapiliarinė gelelektroforezė, izotachoforezė (ITF),
micelinė elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija (MEKC), dujų chromatografija (DC),
plonasluoksnė chromatografija (TLC), masių spektroskopija (MS). Efektyviosios skysčių
chromatografijos taikymas labai pagreitino atskyrimo procesą bei padidino efektyvumą. Tobulėjant
analizės metodams imta miniatiūrizuoti chromatografinę aparatūrą.
Visi paminėti metodai tinkami nustatant augalų sudėtines medžiagas: alkilamidus, poliacetilenus, kavos
rūgšties darinius - cikoro rūgštis, fenolines rūgštis, eterinį aliejų, polisacharidus, mineralines
medžiagas, vitaminą C, bornilacetatą, borneolį, kariofileną, germakreną D, kariofileno epoksidą,

7
palmitino rūgštį, taip pat ir mus dominančius – flavonoidus (rutiną, kvercetiną, epikatechiną ir kt.) –
mūsų imuniteto efektorius arba stimuliatorius.
Dažniausiai fenolinių junginių kiekybinei ir kokybinei analizei taikomi ESC ir KZE metodai.
Efektyvioji skysčių chromatografija yra patikimas daugiakomponenčių mišinių tyrimo metodas.
Spektrofotometrinė analizė tinkama nedideliems medžiagų kiekiams nustatyti, fenoliniams
junginiams bei flavonoidams dėl analičių savybės sudaryti reakcijos produktus su boro rūgštimi ir
aliuminio jonu, pasislenkant antram absorbcijos maksimumui UV spektro srityje (280nm) į regimosios
srities (760nm). Flavonoidų kiekiai skaičiuojami pagal jų absorciją UV spektre, išreikštus mg/g [2].
KZE tapo gana populiarus metodas augalų analizėms dėl aparatūros paprastumo, dominančių
farmakologinių junginių išskyrimu iš biologinių matricų. Šis metodas išsiskiria dideliu efektyvumu,
mažomis tirpiklių sąnaudomis, mažais injektuojamo bandinio kiekiais (nuo kelių nanolitrų iki
mikrolitrų), didele skiriamąja geba bei trumpu analizės laiku.
Šio darbo tikslas - atlikti flavonoidų ir fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę analizę bei nustatyti
bendrą antioksidacinį aktyvumą vaistinių arbatų mišinių ekstraktuose.
Šio darbo uždaviniai Nustatyti bendrą fenonolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei
bendrą antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu, įvertinant laikymo sąlygų įtaką ekstraktų
sudėčiai, atlikti ESC analizę su reakcijos detektoriumi, identifikuoti atskirus aktyvius komponentus
arbatų mišiniuose ir įvertinti antioksidacinį aktyvumą;
Atlikti KE analizę, optimizuojant sąlygas, įvertinti buferio pH, organinio tirpiklio priedo, įtampos įtaką
skirstymo efektyvumui, skiriamajai gebai. Atlikti kokybinę ir kiekybinę fenolinių junginių analizę
vaistinių arbatų mišinių ekstraktuose;
Atlikti KE metodo įteisinimo žingsnius nustatant matavimų glaudumą, stabilumą ir atrankumą;
Palyginti gautus rezultatus.

8
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Laisvieji radikalai. Oksidacinis stresas
Apie 90% sukeliamų ligų lemia aplinkos faktoriai, mitybos įporčiai. Daugiau nei trečdalio
vėžinių susirgimų įmanoma išvengti vien tik pakeitus mitybos įpročius [3]. Tarp daugelio pagrindinių
sukeliamų chroninių ligų, pavojingiausiais ir svarbaiusiais veiksniai laikomi laisvieji radikalai ir

aktyvios deguonies formos (RDJ) [3, 4]. Radikalai ir RDJ, tokie kaip superoksido anijonas (O 2 • ),
hidroksilo radikalas (OH • ) ir peroksido radikalas (ROO • ) yra tarpininkai tarp lėtinių, uždegiminių ir
imuninių ligų, cukrinio diabeto, kraujagyslių, kataraktos, artrito, įvairialypės sklerozės, miokardo,
išemijos pažeidimų, smegenų disfunkcijos bei senėjimo procesų. Daugelis laisvųjų radikalų yra
nestabilūs, o kadangi nesuporuotiems elektronams reikia poros, todėl gerai reaguoja. Radikalai
gaminasi aerobinio metabolizmo metu, gyvybei jie būtini. Imuninei sistemai laisvieji radikalai
reikalingi tam, kad organizmas galėtų kovoti su bakterijomis ar virusais. Tačiau, jų perteklius
organizmui yra žalingas, kadangi jie kenkia DNR, baltymams ir lipidams – svarbiausioms žmogaus
organizmo biomolekulėms [3-8]. Įprastomis sąlygomis kūno ląstelės apsaugotos antioksidantais.
Laboratorinėmis sąlygomis, įvertinant antioksidacinį junginių aktyvumą, naudojamas laisvasis
radikalas DPPH· (2,2-Difenil-1-pikrilhidrazilas). DPPH radikalo tirpalas, prisijungdamas protoną,
keičia spalvą iš purpurinės į geltoną ir praranda savybę absorbuoti 515 - 517 nm, bangos ilgio šviesą (9
pav.) [9-15].

.N. N
.. N. NH
.
+ AH + A
O2N N O2 O2N N O2

N O2 N O2

DPPH• + AH = DPPH – H + A• DPPH• + R• = DPPH – HR

1 pav. DPPH• radikalo reakcija su antioksidantu. AH antioksidantas

9
2.2. Antioksidantai
Antioksidantai - medžiagos, saugančios nuo žalingo oksidacinių reakcijų poveikio, galinčios
sumažinti laisvųjų radikalų veikimą ar stabdyti jų susidarymą. Reaguodami su laisvaisiais radikalais,
antioksidantai gali apsaugoti organizmą nuo nepageidaujamo oksidacijos proceso [6, 7]. Antioksidantai
kaip vitaminai C ir E yra pagrindinės gynybos priemonės prieš RDJ, tačiau didžiausią antioksidantų
aktyvumą lemia vaisių bei daržovių sudedamosios dalys, tokios kaip fenolinės rūgštys ir flavonoidai,
mažiau vitaminai C, E ar ß-karotinai. Antioksidantai taip pat lėtina senėjimo procesus, padeda išvengti
(sumažina) riziką sirgti lėtinėmis ligomis; išlaiko ląstelių struktūrą ir vientisumą. Dažniausiai
antioksidantai grupuojami į 3 grupes:
1. Antioksidantai, prijungiantys laisvuosius radikalus (karotinoidai, flavonoidai), nutraukiantys
grandinines reakcijas (nefermentiniai) – tai mažos molekulės, kurios gali priimti elektroną iš radikalo.
2. Fermentai antioksidantai, ardantys aktyviąsias deguonies formas – antioksidaciniai
fermentai, pvz. kaip superoksido dismutazė superoksidą paverčia vandenilio peroksidu, kurio suirimą
katalizuoja katalazė, glutationo peroksidazė yra pagrindinė peroksido šalintoja.
3. Antioksidacinai vitaminai (vitaminai C ir E), nutraukiantys grandinines LR susidarymo
reakcijas vandeninėje terpėje – (Vitaminas C, plazmoje esantys baltymai su tiolio grupe – albuminas,
transferinas) arba lipidinės terpės antioksidantai, stabdantys laisvųjų radikalų susidarymą, šalinantys
juos membranose, lipoproteinų dalelėse, taip apsaugodami lipidus nuo peroksidacijos (vitaminas E,
redukuotas koenzimas Q10, flavonoidai, antocianinai) [16]
2.3.Vaistinių arbatų mišinių naudingieji komponentai
Svarbu išsiaiškinti, kokiu metodu parenkant įvairias žolelių mišinių receptūras galima išgauti
didžiausią gydomąjį poveikį [17]. Norint išgauti sustiprintą poveikį, neužtenka vartoti vienos rūšies
vaistažoles. Kaip alternatyvą medikamentams, „Švenčionių vaistažolės“ gamina įvairius vaistingųjų
augalų mišinius, kurių veikliosios medžiagos pasižymi skirtingu poveikiu ir antioksidaciniu aktyvumu.
Vaistingose arbatžolėse aptinkami kvercitinas, kampferolis, rutinas, avikuliarinas valopatriatai
ir glikozidas valeridas kartumynų (pinicikrinas), karčiųjų glikozidų – mentiafolino, foliamentino,
loganino, meniantino, saponinų alkaloidų (achileinas, stachidrinas saponinų (saldžiai kartus glikozidas
glicirizinas, hidroksiglicirizinas, glabraninai A ir B, gliciretolis, glabrolidas), 3-4 % flavonoidų
(likviritinas, glabrolis) ir izoflavonoidų, asparaginas, fenolkarboninių rūgščių flavonoidų
(salipurpozidas, izosalipurpozidas, naringeninas, apigeninas), kartumynų glikozidai (sambunigrinas),
eterinio aliejaus, gleivių, flavonoidų (rutinas) furostanolio glikozidai pantoteninė rūgštis.

10
2.4.Vaistinių arbatų mišinių atskiros sudėtinės dalys.
Kiekvienas augalas kaupia skirtingas medžiagas, todėl svarbu išsiaiškinti, kaip kaupiamos medžiagos
įtakoja sveikatą, kokie komponentai trukdo analizei ir kaip standartizutoi bandinių paruošimo būdą,
tinkamą analizei. Vaistinių arbatų sudėtinės dalys mišiniuose pateiktos žemiau:
Svilarožių šaknys sukaupia 2–15 proc. triterpeninių saponinų, daugiausia glicirizino bei glicirizo
rūgšties kalio ir kalcio druskų (pagal Ph. Eur. 01/2002:0277) glicirizo rūgšties, 24-hidroksiglicirizino,
sojasaponinų (I ir II) bei kitų glikozidų. Šaknyse yra 0,65–2 proc. flavonoidų (prenilinti chalkonai,
flavonai ir izoflavonai, pvz., likochalkonas, glabrolis, hispaglabridinas, glabrenas, glabridinas;
kumarinai, pvz., glicikumarinas, likokumaronas), 0,04– 0,06 proc. kvapiųjų medžiagų (anetolas,
estragolas, geraniolis, alifatinės rūgštys, ketonai, alkoholiai ir angliavandeniliai), apie 10 proc.
polisacharidų,[18] Vandeninėje saldymedžių šaknų ištraukoje esantys saponinai, ypač glicirizo rūgštis,
palengvina atsikosėjimą. Ji skystina kvėpavimo takų sekretą ir skatina jo pasišalinimą kosint, sergant
viršutinių kvėpavimo takų uždegimu. Glicirizo rūgštis taip pat slopina virusų dauginimąsi ir
patogeniškumą. Glicirizino rūgštis skatina interferono sintezę, aktyvina leukocitus. Saldymedžių šaknų
ištraukoje esantys flavonoidai naikina bakterijas ir grybelius[19]
Liepų žiedai - daugiau kaip 1 proc. flavonoidų, daugiausia kvercetino glikozidų (rutino, hiperozido,
kvercitrino, ramnoksilozido, 3-gliuko-7-ramnozido), taip pat kemferolio glikozidų (astragalino, jo 6’’-
p-kumaro rūgšties esterio – tilirozido, 3-gliuko-7-ramnozido ir 3,7-diramnozido); apie 10 proc. gleivių,
daugiausia arabinogalaktanų; apie 2 proc. raugų; leukoantocianidinų; kavos, p-kumaro ir chlorogeno
rūgščių; 0,02–0,1 proc. Eterinio aliejaus, daugiausia monoterpenų (linalolio, geraniolio, 1,8-cineolo,
karvono, timolio, karvakrolio ir kt.) ir anetolo, eugenolio, benzilo alkoholio, 2-feniletanolio bei jo acto
ir benzenkarboksirūgšties esterių. Žieduose yra eterinio aliejaus (farnezolis, geraniolis, eugenolis), iki
10 % polisacharidų, iki 4 % flavanoidų (rutinas, kvercitrinas), fenolkarboninių rūgščių, vitamino C
[18].
Takažolė - kvercitinas, kemferolis, rutinas, avikuliarinas), kumarinų, vitaminų C, K, karotinoidų, 3 %
rauginių medžiagų, fenolkarboninių rūgščių, silicio druskų, dervų, gleivių
Aviečių lapai - Aviečių uogose yra 9-10 % sacharidų (gliukozė, fruktozė, sacharozė), organinių rūgščių
(citrinų, salicilo, skruzdžių rūgštys ir kt.), eterinio aliejaus, rauginių medžiagų, mineralinių medžiagų,
pektinų, ląstelienos, vitaminų C, PP, B1, B2, P, folio rūgšties, karotino, fitosterinų, flavonoidų.
Lapuose kaupiamų veikliųjų medžiagų sudėtis panaši.

11
Valerijonų šaknys - Kaupia 0,5-3,5 % eterinio aliejaus (borneolis ir jo esteriai su izovalerijono ir kt.
rūgštimis, limonenas, terpineolis). Taip pat alkaloidus (valerinas ir chelatinas), iridoidus (valopatriatai
ir glikozidas valeridas), raugines medžiagas, organines rūgštis, cukrų, mineralines medžiagas.
Šaknelėse daugiau eterinio aliejaus nei šakniastiebiuose, kurie suteikia būdingą kvapą.
Pušų pumpurai - yra iki 1,5 % eterinio aliejaus (pinenas, limonenas), rauginių medžiagų, kartumynų
(pinicikrinas), sakų. Spygliuose yra vitamino C, rauginių medžiagų, iki 1,3 % eterinio aliejaus,
alkaloidų, sakų.
Kraujažolė - Kaupia iki 0,8 % eterinio aliejaus, kurio pagrindinę dalį sudaro azulenai (chamazulenai),
kartu su ištirpusiais kartumynais (mono- ir bicikliniai seskviterpenai: achilicinas, leukodinas,
milefolinas). Taip pat žolėje yra flavonoidų, rauginių medžiagų, vitaminų C ir K, organinių rūgščių
(acto, izovalerijono, skruzdžių rūgštys), karotinoidų, mineralinių medžiagų, šiek tiek alkaloidų
(achileinas, stachidrinas).
Puplaiškis - Lapuose yra karčiųjų alkaloidų – gencianino ir gencinidino, karčiųjų glikozidų –
mentiafolino, foliamentino, loganino, meniantino, iki 7 % rauginių medžiagų, vitamino C, saponinų,
organinių rūgščių, cukrų, mineralinių medžiagų, flavonoidų, nedaug jodo.
Saldymedis- Šaknyse kaupiama apie 12 % saponinų (saldžiai kartus glikozidas glicirizinas,
hidroksiglicirizinas, glabraninai A ir B, gliciretolis, glabrolidas), 3-4 % flavonoidų (likviritinas,
glabrolis) ir izoflavonoidų, asparaginas, 30 % krakmolo, 20 % cukrų, 10 % baltymų, obuolių rūgštis,
mineralinės ir rauginės medžiagos.
Šlamutis - Graižuose yra flavonoidų (salipurpozidas, izosalipurpozidas, naringeninas, apigeninas),
kartumynų, rauginių medžiagų, sterinų, alkaloido inozito, vitamino K, nedaug eterinio aliejaus, dažinių
medžiagų.
Čiobrelis - Kaupia iki 2,5 % eterinio aliejaus (timolis, karvakrolis, borneolis, cineolis, linalolis ir kt.),
flavonoidus, raugines medžiagas, katumynus, vitaminą C, mineralines medžiagas
Šeivamedis - Žieduose yra glikozidų (sambunigrinas), eterinio aliejaus, gleivių, flavonoidų (rutinas),
rauginių medžiagų, organinių rūgščių, vitamino C, mineralinių medžiagų. Vaisiuose yra flavonoidų,
rauginių medžiagų, glikozidų (sambucinas, sambucianinas, chrizanteminas), eterinio aliejaus, cukrų,
vitamino C.
Pipirmėtė - Kaupia iki 5 % eterinio aliejaus (75% mentolio, kita dalis – mentonas, mentofuranas,
pinenas, limonenas, cineolis, mentolio esteriai su izovalerijono rūgštimi), flavonoidus, raugines
medžiagas, fenolkarbonines rūgštis, vitaminą C, mineralines medžiagas.

12
Ožragė – eteriniame aliejuje rasta 40 skirtingų komponentų, svarbiausi: hemiterpenoidas γ-laktonas,
sotolonas (3-hidroksi-4,5-dimetil-2(5H)-furanonas), n-alkanų, seskviterpenų, alkanolių ir laktonų. Iš
nelakių komponentų furostanolio glikozidai suteikia kartų skonį; sterol- ir diosgenino dariniai,
trigonelinas (N-metil-piridinium-3-karboksilatas, 0,4%) [ 18, 19 ].

2.5. Flavonoidų chemija

Flavonoidai yra didžiausia grupė fenolinių, metabolitinių junginių (kurių struktūra apima C6 –
C3 – C6 konfigūracijas), turinčių svarbią reikšmę augalų gynyboje bei siganlizuojamų junginių
gamybai, patogenezėje ir simbiozėje. Šie junginiai daugiausiai randami augalų vaisiuose, sėklose ir
lapuose. Antioksidacinis poveikis susijęs glaudžiai su chemine struktūra[19 - 21]. Flavonoidų
klasifikacijos pagrindas pateiktas 2 pav.
3'
2' 4'

8 B R1
1'
O 5'
7
9 2 6'
R A C
10 3
6
4 OR2
5
O

2 Pav. Bendra flavonoidų struktūra

Šioje formoje flavonoidai yra gliukozidų ar aglikonų pavidalo. Aktyvumas susijęs su B žiedo
struktūros pozicija (pav. 2) ir hidrolizacijos laipsniu (3‘ ir 4‘ pozicijos, turinčios OH grupes –
pakaitalus). Dažniausiai aglikonai yra aktyvesni už glikozidus ir apskritai, flavonoidai yra aktyvūs kaip
pirminiai antioksidantai. Daugiausiai flovanoidų klasifikacijos pagrindas yra pakaitų reakcijos. C
grandinė priklauso nuo B grandinės pozicijos, kurių pagrindinį subpogrupį sudaro flavonoidų grupės:
antocianinai, flavonai, izoflavonai ir katechinai. Augalų flavonoidai taip pat atsakingi mechanizmuose
prieš stresą, sukeltą didesnį UV – B spidulių radiaciją, prieš infekcijas sukeltas mikroorganizmų. Jie
yra pigmentų šaltiniai gėlių spalvotuose junginiuose ir todėl svarbūs sąveikai su vabzdžiais. Dėl
antioksidacinių reakcijų ir estrogenų poveikio yra plačiai taikomosiose antimikrobinėje ir
farmakaloginėje veiklose [22]. Antioksidaciniu aktyvumu pasižymi šie fenoliniai junginiai: flavonoidai
(kvercetinas, izokvercetinas, kampferolis, astragalinas, rutinas, kvervitrinas, apigeninas), flavonoidų
pogrupiai: izoflavonai (daidzeinas, genisteinas), katechinai, antocianinai; fenolinės rūgštys, ksantonai,
stilbenai, vitaminai (askorbo rūgštis, α-tokoferolis), rozmarininė rūgštis, karnozininė rūgštis,

13
karnozolis. Flavonoidai yra glikozidai ir jų aglikonai, todėl pagal aglikono struktūrą ir redukcijos
laipsnį flavonoidai skirstomi į žemiau pateiktas grupes. [22].
2.5.1. Flavonoliai

H
OH
OH
HO O
HO O
H

OH OH
OH O OH O

Kampferolis Galanginas Kvercetinas

2.5.2. Flavonai
OH
OH
OH O OH

HO
O HO O

HO O O
OH
OH
OH OH O

Apigenin – 7 – glukozidas Liuteolinas

2.5.3. Katechinas
2.5.4. Flavanonas

OH
HO O
HO O
OH

OH
OH OH O

Epikatechinas Pinocembrinas
O

O O
O
O CH3 OH

O O HO OCH3
O
O
O O O O
O O HO O
O
O
OH
HO OH
O O
O OH OH O

Rutinas Hesperidinas

14
 2.5.4. Fenolinės rūgštys

H OH HC C COOH
CH3 O O H H
HC C CO O
H H OH

O OH OH HO COOH
OH OH
HO HO OH OH

Ferulo rūgštis Trans – p –kumaro r. Chlorogeno r. Kavos r.

3 Pav. Struktūrinės fenolinių junginių formulės.

Katechinais vadinami flavon-3-ol flavanoido grupė, dažniausiai randama augaluose. Aukštas

gydomųjų savybių laipsnis yra susietas su antioksidacinėmis savybėmis šiuose junginiuose [21-23].
2.5.5. Antocianinai

Tai didžiausia grupė vandenyje tirpių gamtinių pigmentų. Be jų spalvinės charakteristikos,

keletas funkcijų yra atsakingos ir už antioksidacinį poveikį.

2.6. FLAVONOIDŲ ANALIZĖ

2.6.1. Spektrofotometrija
Paprasti fenoliniai junginiai turi absorbcijos maksimumus tarp 200 ir 320 nm, tačiau
Absorbcija daugiausiai priklauso nuo tirpiklio savybiu ir pH reikšmiu. Kai kurios medžiagos kaip
baltymai, nukleino bei amino rugštys absorbuoja taip pat UV.
Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui augalinėje žaliavoje taikomas Folin – Denis ir Folin–
Ciocalteu kolorimetriniai metodai. Metodai pagristi fenolinių junginių komplekso susidarymu
šarminiame tirpale su molibdeno ar volframo fosforo rugštimis (Folin – Denis ar Folin–Ciocalteu
fenolinis reagentas). Susidaręs kompleksas aptinkamas ties 760 nm bangos ilgiu. Tačiau Folin – Denis
ir Folin–Ciocalteu fenoliniais reagentais neaptinkami visi fenoliniai junginiai esantys ekstraktuose,
kartais analizei trukdo ekstraktuose esancios pašalinės redukuojancios medžiagos, pvz. askorbo rūgštis
[43].

15
2.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
ESC yra fizikinės-cheminės analizės metodas, leidžiantis bandinį išskirstyti į atskirus
komponentus. Skirstymo metu bandinio komponentai pasiskirsto tarp nejudrios ir judrios fazės. Po
atskyrimo komponentus galima nustatyti kiekybiškai ar net kokybiškai. Chromatografijos metu skirs-
tymas vyksta molekuliniame lygmenyje. Gali būti atskirti mažamolekuliai junginiai, jonai ir
makromolekulės [25, 26, 37].
Chromatografinę analizę sudaro bandinio įleidimas, skirstymas, atskirtų analičių detekcija ir
gautų duomenų apdorojimas bei įvertinimas. Mišinio komponentų atskyrimas vyksta dėl skirtingos
mišinio komponentų fizikines - cheminės sąveikos su nejudria ir judria fazėmis [27].
Fenolinėms rūgštims ir flavonoidams dažniausia sąlyga ESC metodams atvirščių fazių C18
kolonėlės, UV – matomos šviesos detektorius (arba diodų matricos (angl. DAD)), dvinarė skysčių
sistema sudaryta iš parūgštinto vandens (judrios fazės komponentas A) ir polinio organinio tirpiklio
(judrios fazės komponentas B). Tirpiklis A sudarytas iš parūgštinto vandens ar papildomo priedo, kaip
fosfatas.[40] Tirpiklis B paprastai sudarytas iš gryno švaraus ar parūgštinto metanolio ar acetonitrilo.
Keletas metodikų, apžvelgtų lentelėje Nr 1.
1 Lentelė. Metodikų apžvalga ESC flavonoidų analizei.
Tėkmės
Identifikuo-
Ekstraktas Eliuentas Gradientas greitis,
jami junginiai
ml/min.

judri fazė A: H2O; Polifenoliniai

0 min - 55% A ir 5%
Rausvųjų ir mėlynųjų B: ACN; junginiai,
B + 40% C,
vynuogių ekstraktai C: (1,5% H3PO4 ir 0,4 antocianinai
50 min – 29% A ir
(MeOH/H2O) 15% acto r).+ [41]
21% B + 50% C,
DPPH analizė

16
 Vaistažolės: Vitex
agnus-castus 0–10 min 100% A,
(Verbenaceae), 10–30 min 100% B,
Origanum dictamnus 30–50 min 90% B /
A: H2O+ 1%
(Lamiaceae), 10% C, 50–60 min
ledinės acto r.
Teucrium polium 80% B/ 20% C, 60–
B: H2O+ 6% Fenoliniai
(Lamiaceae), 70 min 70% B/ 30% 0,5
ledinės acto r. junginiai [42]
Lavandula vera C, 70–105 min 100%
C: ACN/H2O +
(Lamiaceae), C,
5% ledinės acto r.
Lippia triphylla 105–110 min 100%
(Verbenaceae) A
MeOH parūgštintas su
6 M HCl

Vaistinė melisa,
vaistinė ramunė,
vienapiestė gudobelė,
mažalapė liepa, A:ACN + 1% 0 min. - 95% B,
Flavonoidai
paprastoji jonažolė, B:TFA/H2O + 45 min – 55% B, 0,4
[14]
tikrasis imbieras, 1% TFA 60 min – 95% B
ceiloninis cinamonas,
tikroji levanda,
kvapusis rozmarinas

A:2 mM natrio
acetato
vandeninio Fenoliniai
vaisiuose tirpalo (v/v, pH 0,1 junginiai
2,55) + 6% acto [38]
rūgšties
B:acetonitrilas

17
2.6.3. Kapiliarinė elektroforezė

Kapiliarinė zonų elektroforezė (KZE), taip pat žinoma kaip laisvo tirpalo kapiliarinė
elektroforezė, yra paprasčiausia KE rūšis. Skirstymo mechanizmas yra pagristas krūvio ir masės
santykio skirtumais. KZE pagrindas buferio tirpalo homogeniškumas ir pastovus elektros lauko stipris
išilgai kapiliaro. Injektavus pavyzdžio mišinį ir altikus skirstymą elektros lauke, sudedamosios dalys
atskiriamos į pavienes sritis. Bendras krūvis paprastai priklauso nuo pH. Pavyzdžiui, pH intervale nuo
pH 4 iki pH 10, natrio jonų krūvis yra pastovus kaip ir jų mobilumas. Kiti jonai, tokie kaip acetatai ar
glutamatai šiame pH intervale yra neigiamai įkrauti, todėl jie turi neigiamus mobilumus (jie migruoja link
teigiamo elektrodo). Esant šarminiam pH, jų migracija vis dar tebebus link neigiamo elektrodo dėl EOS
[27]. KZE tinkama tiek mažų tiek didelių molekulių atskyrimui, net jei krūvio ir masės santykio
skirtumai yra nedideli.
Buvo identifikuota kaip keletas katechinų kartu su kitais flavanoidais KE. Identifikuoti šiuos
junginius, kaip katechinus, epikatechinus, rutiną, kampferolį ir kvercetiną galima naudojant 60 mM
borato buferį pH 9,0 ir įtampą 14 KV, analizė trukdavo ne daugiau kaip 21 minutę. Epikatechinai,
epigallokatechinai, epikatechingalatai, epigalokatechinchelatai ir katechinai aptikti naudojant 77cm
ilgio lydyto kvarco kapiliarą ( 70cm iki detektoriaus) ir 20 mM borakso buferį pH 8,0. Vienas pirmųjų
metodų buvo micelinė chromatografija, aptinkant katechinus (naudojant 25mM fosfato buferį pH 7,0
ir 100 mM NDS ir 6% metanolio) ir kitas, bevandenės kapiliarinės elektroforezės metodas naudotas
analizuojant teaflavinų sudėtį. KE darbinis buferis sudarytas iš 71% acetonitrilo, 25% metanolio su 0,1
M KOH, 4% ledinės acto rūgšties ir 90 mM amonio acetato [23].
KZE palyginus su ESC, naudojant 200 mM borato rūgštį, pH 8,6 atskyrimas pasiekiamas 6
kartus greičiau nei su ESC [22]. ESC buvo pagrindinis metodas tiriant antiocianinus ir tik keletas
pritaikymų naudojant KE [24]. Tyrimų autorius padarė išvadą, kad ESC yra pranašesnė techinka šio
tipo analizėms jautrumo ir laiko atžvilgiu. Atskyrimas buvo sėkmingas pasiektas naudojant 30 mM
borato buferį su 7,5 mM CyDTA ( trans-1,2-diaminocikloheksano-tetraacto rūgšties monohidratas ) pH
8,8. Tačiau rezultatai, kurie buvo pasiekti naudojant KZE, turėtų būti geresni ( geresnis atskyrimas )
naudojant rūgštinį buferį. Metodas buvo optimizuotas naudojant fosfato buferį pH 1,5 su 30%
acetonitrilo. Šie skirtumai pabrėžiami ir kituose darbuose: 2 lentelėje pateikiami kapiliarinės
elektroforezės pritaikymai flavonoidų analizei. Pagal šiuos literatūrinius duomenis, dauguma
flavonoidų atskyrimų atliekami taikant boratinius ar fosfatinius buferius, pH 7 -9.

18
2 Lentelė. Flavonoidų analizės KE metodu sąlygos
Detektuojami Detekcija Darbinis Įtampa kV Temperatūra °C Šaltinis
junginiai nm buferis
Izoflavonai, Diodų 25mM borato + 950mV 25 [21, 22]
kaip ir matricos buferio (pH
purarinai ir detektoriumi 7,8) su 10 mM
diazinai NDS;
tradicinėse 50 mM borato
kinų buferį (pH 9,0) + 0,9 V
medicinos
žolėse
Flavonoidai 230 20mM 10 - [44]
Na2B4O7, pH 8
Flavonoidai - 20mM 25 30 [45]
NaH2PO4
Flavonoidai 220 25mM 18 - [46]
Na2B4O7, pH
9,4

Analičių identifikavimui skaičiuojamas elektroforezinis judris µef (µtikr - µeos), pateikta 1 lygtyje.
( L)( Lef ) ( L)( Lef )
µ ef = µtikr − µ eos = − (1)
(V )(Tm ) (V )(Teot )

2(t r 2 − t r1 )
Rs = (2)
( wb 2 + wb1 )

Smailių kokybiniam atskyrimui taikoma 2 formulė, kur Rs – skiriamoji geba, w b,a - smailių

plotis ties smailės aukščio viduriu, t – migracijos laikas (smailės maksimumas).

19
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

DARBO TIKSLAS: Atlikti flavonoidų ir fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę analizę bei
nustatyti bendrą antioksidacinį aktyvumą vaistinių arbatų mišinių
ekstraktuose.
DARBO UŽDAVINIAI: 1. Nustatyti bendrą fenonolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei
bendrą antioksidacinį aktyvumą spektrofotometriniu metodu, įvertinant
laikymo sąlygų įtaką ekstraktų sudėčiai.
2. ESC analizė su reakcijos detektoriumi, identifikuoti atskirus aktyvius
komponentus arbatų mišiniuose.
3. KE analizė, optimizuojant sąlygas, įvertinti buferio pH, organinio tirpiklio
priedo, įtampos įtaką skirstymo efektyvumui, skiriamajai gebai. Atlikti kokybinę
ir kiekybinę fenolinių junginių analizę vaistinių arbatų mišinių ekstraktuose.
4. atlikti KE metodo įteisinimo žingsnius nustatant matavimų glaudumą,
stabilumą ir atrankumą, aptikimo ir nustatymo ribas.
5. Palyginti metodus.

4. Tyrimų objektas ir metodika

4.1. Medžiagos ir tirpikliai
acto rūgštis (99% analizės grynumo. Lachema, Čekijos respublika),
metanolis, grynas analizei, (Barta, Čekijos respublika),
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) (Sigma-Aldrich, Vokietija),
galo rūgštis (Sigma, JAV),
rutino hidratas, (95 % ESC analizės grynumo, Sigma-Aldrich Chemie, Stefnheim, Vokietija),
vanduo (bidistiliuotas),
žaliava – vaistažolių mišinių arbatos „Švenčionių vaistažolės“ (Švenčionys, Lietuva)
0,3g palyginamoji etaloninė medžiaga rutinas, min 95 % ESC (Sigma-Aldrich Chemie, Stefnheim,
Vokietija)
TFR trifluor-acto rūgštis, (Merck, Schuchardt, Vokietija)
AlCl3 - aliuminio trichloridas, (Lochema, Neratovice, Čekijos respublika),
Na2HPO4 – dinatrio hidrofosfatas, chemiškai švarus (LaChema, Čekija)

20
NaNO2 - natrio nitritas (Lachema, Neratovice, Čekijos respublika)
Na2CO3 - dinatrio karbonatas (analizei, Merck, Vokietija)
heksametilentetraminas (analizės grynumo, Heidelberg, New York)
Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma, JAV)
Flavonoidų standartai:
Rutino hidratas, 95 % ESC analizės grynumo (Sigma-Aldrich Chemie, Stefnheim, Vokietija),
galo rūgštis (Sigma, JAV),
Trans-p-kumaro rūgštis, RG,
Galanginas SH,
Hespiridino-7-rutinozė, Biochema, Fluka,
Kvercetino dihidratas, (98% ESC analizės grynumo, Sigma, Vokietija),
Kavos rūgštis (Sigma, Vokietija),
Chlorogeno rūgšties hemihidratas,
Epikatechinas, (90% grynumo Aldrich, Vokietija),
Apigenino-7-glikozidas, (90% grynumo Aldrich, Vokietija),
Pinocembrinas (Roth, Karlsruhe, Vokietija),
Ferulo rūgštis (Chromo Dex),
Kampferolis (Roth, Karlsruhe, Vokietija).
4.2. Vaistinė žaliavos bandiniai
Lentelė nr.3 „Švenčionių vaistažolių fabriko“ vaistinių arbatžolių mišiniai, naudotos analizei.
Eilės
Arbatos mišinys Sudėtinės dalys
nr.

Kosulį slopinantis vaistažolių mišinys Svilarožių šaknys, saldymedžių šaknys, liepų

su saldymedžių šaknimis žiedai (Naudojamas esant burnos gleivinės dirginimui bei
1
Species expectorales cum liquiritiae ryklės uždegimui, sergant peršalimo ligomis, kuomet
radices pasireiškia sausas kosulys)

Smiltyninių šlamučių žiedai, pupalaiškių lapai,

Tulžį varantis vaistažolių mišinys
2 pipirmėčių lapai, kalendrų vaisiai (Vartojama
Species cholagoga dispepsiniams negalavimams, spazminiams skausmams
pilve bei po dešiniuoju šonkaulių lanku ir vidurių pūtimui

21
 gydyti)

Prakaitavimą skatinantis vaistažolių Aviečių lapai, liepų žiedai (vartojamas sausam kosuliui
3 mišinys Nr.3 Species diaphoretica ir gerklės bei nosiaryklės dirginimui gydyti, prakaitavimui
skatinti sergant gripu ir kitomis ūminėmis viršutinių
Nr. 3
kvėpavimo takų ligomis)
Pupalaiškių lapai, pipirmėčių lapai, rūgčių
Tulžies apykaitą reguliuojantis takažolių žolė (gydyti diegliams pilve ir vidurių pūtimui
4 vaistažolių mišinys mažinti sergant lėtiniu cholecistitu, cholangitu, spazmine
Species cholametabolica tulžies takų ir pūslės diskinezija bei kitomis virškinamojo
trakto ligomis)

Pipirmėčių lapai, pupalaiškių lapai, valerijonų

šaknys, apynių spurgai (sukelia švelnų raminamąjį
Nervus raminantis vaistažolių mišinys poveikį, tinka nervinės kilmės miego sutrikimui gydyti,
5
Species sedativa esant nemaloniems pojūčiams ir baimei, gerinant miego
kokybę, mažinant jaudulį, šalinant streso sukeltus
virškinimo sutrikimus)

Pušų pumpurai, vaistinių čiobrelių žolė,

Atsikosėjimą gerinantis vaistažolių šeivamedžių žiedai (Atsikosėjimui gerinti, kosuliui

lengvinti bei bronchų spazmams atpalaiduoti, sergant
6 mišinys
peršalimo ligomis, viršutinių kvėpavimo takų kataru, ūminiu
Species pectorales
ir lėtiniu bronchitu, tracheitu, kokliušu, varginant sausam
kosuliui)

Senų lapai, kraujažolių žolė, šaltekšnių žievė,

kalendrų vaisiai, saldymedžių šaknys (Minkština
Vaistažolių mišinys nuo hemorojaus vidurius gydant hemorojų, šalina trumpalaikį vidurių
7 užkietėjimą, gydo išeinamosios angos įtrūkimus, tinka po
Species antihaemorrhoidales
išeinamosios angos arba tiesiosios žarnos operacijų.
Pagalbinė priemonė virškinimo ligoms, dispepsijai gydyti,
profilaktikai)

22
4.3. Bandinių ruošimas
Vaistinių arbatų kokybė daugiausiai priklauso nuo komponentų, kurie buvo sukaupti šviežiuose
lapuose ir žieduose. Ypatingai svarbu tiksliai įvertinti vaistinių arbatų kokybę. Cheminė analizė
tinkamas metodas įvertinti vaistinių arbatų kokybę.
Bandinių paruošimas yra pagrindinė užduotis, atliekant vaistinių arbatų analizę. [29].
Tiriamajame darbe taikomi 2 ekstrahavimo metodai: metanolinė (maceracija) bei kietafazė ekstrakcija
(KFE), siekant išvalyti bandinius nuo papildomų komponentų, trukdančių nustatyti analites. Žaliava
ekstrahuojama tirpikliais santykiu 1:20 – imamas 0,5g smulkintos žaliavos ir 9,5 ml tirpiklio
(palyginimui imta 0,5g sausos žaliavos ir 19,5ml tirpiklio). Paliekama 24 val orbitalinėje purtyklėje
„Titertek“ (Flow Laboratories, Vokietija). Nufiltruojama per popierinį filtrą, ekstraktai surenkami į
skaidrius sandarius buteliukus, kurie laikomi +4°C laipsnių temperatūroje, tamsoje. Paruošti 28
bandiniai flavonoidų kiekiui nustatyti: 9,5ml ir 19,5ml metanoliniu užpilu paruoštiems metanoliams
ekstraktams išmatuotas flavonoidų kiekis prieš ir po KFE ekstrakcijos. Tolimesnei analizei pasirinkta
0,5g sausos žaliavos ir 9,5 ml tirpiklio santykis dėl tikslesnių matavimo rezultatų.
KFE pagerina detektuojamų medžiagų jautrumą, kai vykdomas išvalymas nuo chlorofilų, nustatant
fenolinius junginius. Taikant parūgštintą vandeninę terpę, flavonoidai yra sulaikomi šerdelėje, kai tuo
metu kiti teršalai nesulaikomi. Flavonoidai sulaikomi ant adsorbento ir po vandeninės fazės gali būti
išplauti tirpikliu, pvz. Metanoliu [29]. Kietafazė ekstrakcija (KFE) atlikta AF-C18 (atvirkščių fazių)
šerdele (Merck, Vokietija), Supelco Visiprep (JAV) aparatu. Atlikti kietafazės ekstrakcijos žingsniai:
1. Kondicionavimas 1 ml 100% grynumo MeOH;
2. Kondicionavimas 1 ml H2O (pH 2, TFA);
3. Bandinio leidimas 10 ml praskiesto ekstrakto su parūgštintu vandeniu (0,5:9,5);
4. Teršalų plovimas 3 ml H2O (pH 2, TFR). Džiovinimas vakuumu – 3 min;
5. Bandinio surinkimas 1 ml 75 % MeOH.
Galo rūgšties kalibracinei kreivei naudojami tokių koncentracijų 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 µg/ml tirpalai.
4.4. Aparatūra
Spektrofotometru Spectronic MI – 1201 (Milton Roy, JAV) išmatuotas bendras fenolinių
junginių ir flavonoidų kiekiai vaistinėse arbatose, įvertintas antioksidacinis arbatų aktyvumas.

23
4.4.1.Efektyviosios skysčių chromatografijos ESC – DPPH aparatūra

4 pav. ESC su reakcijos detektoriumi schema

Efektyviųjų skysčių chromatografija atlikta naudojant ESC aparaturą su reakcijos detektoriumi:

2 siurbliai (vienas skirtas judriai fazei, kitas – antiradikalinės reakcijos reagentui), degazatorius
(Hewlett Packard series 1100, Waldbronn, Vokietija), autoinjektorius (Perkin Elmer, series 200
autosampler, JAV). Detekcijai naudoti 2 detektoriai: UV detektorius chromatografiniam skirstymui
(Spectra — Physics, Spectra 200, JAV), UV detektorius reagento absorbcijai „LINEAR VIS“, modelis
200, „Knauer“ kolonėlė (Eurosher 100 — 5, C18, porų dydis — 100 Å).
ESC aparatūra bendru atveju (pav 4.) sudaryta iš siurblio, tiekiancio judrias fazes (A ir B),
degazatoriaus, autoinjektoriaus, prieškolonės, kolonėlės, UV detektoriaus ir reakcijos detektoriaus,
kompiuterio.
ESC-DPPH privalumai [29]: Galima nustatyti laisvųjų radikalų surišimą ESC eliuentuose,
suderinamas su daugeliu dažniausiai vartojamų tirpiklių ESC (pH 3 – 7), paprasta aparatūra, taikomas
kinetiniuose radikalų išaktyvinimo tyrimuose, stabili bazinė linija.

4.4.2. Kapiliarinės elektroforezės aparatūra

Pav. 5 Kapiliarinės elektroforezės aparatūros schema.

24
 Vaistinių arbatų mišiniai išskirstyti Beckmann P/ACE System 2200 aparatu, duomenis
apdorojant C gold operacine sistema. Matuoti 3 fiksuoti UV bangos ilgiai: 230nm, 254nm ir 280nm,
bandiniai ir kapiliaras nėra termostatuojami, temperatūra palaikoma karuselėje apytiksliai 25ºC.
Skirstymui taip pat naudotas Beckmann P/ACE - MDQ aparatas, su diodų matricos
detektoriumi, skanuojantis pasirinktinai nuo 200nm iki 400nm Kapiliaras su aušinimo sistema,
temperatūros palaikymas bandiniams, kapiliarui yra reguliuojami automatiškai, pasirinkus pagal
literatūros šaltinius taikomą optimalią temperatūrą + 25ºC. Pasirinkta skirstymo įtampa 25 KV,
elektrinis laukas 240 V/cm kapiliarui.

4.5. Skaičiavimai, duomenų įvertinimas

4.5.1. Flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras flavonoidų kiekio (etalonu naudojant rutiną) nustatymas vaistinių arbatų ekstraktuose
buvo atliktas veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgštimi parūgštintoje terpėje.
Duomenys įvertinti gautą absorbcijos dydį palyginus su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos
koeficientu.
Flavonoidų kiekio skaičiavimas

Flavonoidų suminis kiekis, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas mg/g arbatų ekstraktuose (pav.
10), skaičiuotas naudojantis formule nr 1 pagal farmakopėjos straipsnį [2]:
mR × Vvaž × Avaž × 100
X= (3)
mvaž × AR × VR

čia: mR – rutino standarto masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti.
A važ – Arbatos ekstrakcijos absorbcija (absorbcijos dydis).
Vvaž – arbatos ekstrakto tūris
V važ- rutino tirpalo tūris
AR – standartinio rutino tirpalo (3mg/ml) absorbcijos dydis.
mvaž – arbatos bandinio masė.

25
Spektrofotometriniam tyrimui paruošiamas tirpalas:

Į 2ml mėgintuvėlį pilama 40 µl vaistinių arbatų ekstrakto, 0,4 ml metanolio, 20 µl 33% acto
rūgšties, 60 µl 10% aliuminio chlorido tirpalo, 80 µl 5% heksametilentetramino tirpalo, kolbutės
turinys skiedžiamas 0,4 ml distiliuoto vandens, sumaišoma. Praėjus 30 min matuojamas 10 mm tirpalo
sluoksnio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu, esant bangos ilgiui 407 nm.
Palyginamasis tirpalas, 1ml:
Į 2ml mėgintuvėlį pilama 40 µl arbatos ekstrakto, 70% 0,4 ml metanolio, 20 µl 33% acto
rūgšties tirpalo, skiedžiama 0,54 ml distiliuoto vandens.
Etaloninio tiriamojo ir palyginamojo tirpalo (rutino) paruošimas:
Į 2ml mėgintuvėlį vietoj arbatos ekstrakto pilama 40 µl etaloninio rutino tirpalo.

4.5.2. Fenolinių junginių nustatymas

Fenoliniams junginių kiekiams apskaičiuoti, naudojame galo rūgšties kalibracinę kreivę, iš jos
lygties apskaičiuojame fenolinių junginių kiekį. [31]

4.5.3. Antioksidacinis aktyvumas

Buvo nustatytas antioksidacinis aktyvumas “Švenčionių vaistažolės” mišinių arbatose.

Radikaliniam surišimui naudotas laisvasis radikalas DPPH· (2,2-Difenil-1-pikrilhidrazilas). Reaguojant
DPPH· su antioksidantais, esančiais arbatoje, jis atiduoda vieną vandenilio atomą ir tampa redukuotas.
Tai rodo spalvos pasikeitimas iš tamsiai violetinės i blyškią geltoną matuojant spektrofotmetru.

Antioksidacinis aktyvumas matuojamas prie 515 nm bangos ilgio ir jam paruošiamas

metanolinis DPPH tirpalas : 0,001 g DPPH ir 50 ml grynojo metanolio (pagal Brand Williams metodą)
[30].
Esant gana stipriam ir greitam DPPH sintetinio radikalo surišimui, metodas buvo modifikuotas,
bandiniai ruošiami su 3ml DPPH paruošto tirpalo ir 2 µl arbatos ekstrakto, skiesto su 75 µl bidistiliuotu
vandeniu. Paliekama 15 min tamsoje. Matuojama 1 cm mikrokiuvetėse.
Palyginamasis DPPH· tirpalas: imama 1,5 ml DPPH· ir iškart matuojama jo absorbcija.
Rezultatai skaičiuojami pagal formulę nr. 4 :
AB − AA
%išaktyvinimas = *100% (4)
AB

26
kur AB – absorbcija standartinio tirpalo, AA- arbatos ekstraktų absorbcija,

4.6. ESC eksperimentinė dalis

Atvirkščių fazių ESC – DPPH sistema demonstruoja puikų ir greitą nustatymą grynų
antioksidantų komponentų kompleksiniuose augalų mišiniuose. Pasirinkti flavonoidų standartai yra geri
vandenilio donorai, kurie atpažįstami iš neigiamos DPPH radikalo smailės, priklausomai nuo
koncentracijos.
ESC skirstymo sąlygos: Judrios fazės tėkmės greitis : 0,3 ml/min, Detekcija atliekama prie
bangos ilgių: skirstomų junginių 265 nm. Judrioji fazė: A: Bidistiliuotas vanduo, parūgštintas 0,1%
TFR rūgštimi. B: Metanolis, parūgštintas 0,1% TFR rūgštimi. Gradiento sąlygos: 0 – 35min 33% B, 35
– 80 min 50%, 80 – 85 min 90%, 85 – 91 min 95%, 91 – 112 min 33%. Metanoliniai vaistingųjų arbatų
ekstraktai, 0,05 g/mL, injekcinis tūris – 4 µL.
Reakcijos detektoriaus judrios fazės su radikalu tėkmės greitis 0,2 ml/min, palaikomas slėgis 0,2mPa,
maksimalus slėgis 2,0 mPa. Detektuojamų komponentų bangos ilgis 265nm, radikalo absorbcija, kaip
neigiama smailė detektuojama ties 517nm.
Metodo optimizavimui naudotas bangos ilgis: 265nm. Vaistinių arbatų junginiai geriausiai
matėsi ties 265nm ir šis bangos ilgis buvo pasirinktas tolesnei analizei. Remiantis priklausomybe nuo
tėkmės greičio iš ankstesnių tyrimų, buvo pasirinktas veikiant skirtingiems siurbliams : 0,3ml/l (UV)
0,2ml/l (reakcijos). Reakcijos kilpos ilgis pasirinktas 0,75 m iš ankstesnių tyrimų. Reakcijos kilpos
vidinis skersmuo – 3mm.

4.7. Kapiliarinės elektroforezės metodo optimizavimas

Pasirenkamas silikagelinis kapiliaras, (50µm skersmens, L = 47cm, Lef= 40.5cm), prieš naudojimą
kondicionuojamas: 10 min. plaunamas 0,2 M natrio hidroksido tirpalu, 10 min. vandeniu, ir 10 min.
buferiu. Kondicionavimo procedūra yra svarbi, kad kapiliaro paviršius būtų pilnai ir tolygiai įkrautas
(padengtas silanolinėmis grupėmis). Kai kuriuose metoduose būtina regeneruoti šį paviršių 1 M natrio
hidroksido tirpalu po kiekvieno skirstymo. Regeneracija yra būtina jei pastebima, kad kiekvieno atskyrimo
metu analičių migracijos trukmė kinta. Regeneracija nereikalinga, kai dirbama pH srityje virš pH 9,
išskyrus tuos atvejus, kai bandinio ar matricos komponentai linkę adsorbuotis ant kapiliaro sienelių [27].
Kuo mažesnis kapiliaro skersmuo, tuo jis labiau linkęs užsikimšti.

27
 Elektrolito sudėtis, buferio koncentracija, pH vertė ir organinių priedų buvimas, įtampa ir
temperatūra įtakoja KE skirstymą [32, 33]. Keičiant pH buferio reikšmes tarp 7,5 – 11,0, galima įtakoti
kompleksinį susidarymą tarp boratų ir flavonoidų kartu su cukraus dalimi ir flavonoidų struktūros cis-
1,2-hidorksilo bei orto – hidroksilo grupėmis. Pirminė buferio sudėtis pasirinkta pagal dažniausiai
flavonoidų analizei naudojamą buferį - natrio tetraboratą 20 mM Na2B4O7, pH privesta su 40mM
H3BO3 pH 9,2. [34].
Beckmann P/ACE System 2200 aparatu:

Buferis pagamintas iš 20 mMol/l Na2B4O7 ir 60 mMol/l H3BO3, be papildomo priedo. Pagal

literatūrą, flavonoidų skirstymui pasirenkamas pH intervalas (8,0; 8,4; 8,7; 9,0; 9,3). EOF markeris
pasirinktas tiošlapalas. Tiek elektroosmozinis, tiek elektroforezinis greičiai yra tiesiog proporcingi
elektros lauko stipriui, taigi didžiausios įmanomos įtampos panaudojimas sąlygoja trumpiausią atskyrimo
laiką, kuris lemia didžiausią efektyvumą (nes difuzija yra svarbiausias parametras veikiantis analitės
koncentracijos juostos išplatėjimą). Ribojantis faktorius yra Džaulio šiluma. Optimali įtampa nustatoma
palaipsniui ją didinant, kol pastebimas skiriamosios gebos pablogėjimas. Klampa yra temperatūros
funkcija, todėl svarbu tiksliai reguliuoti temperatūrą. Didėjant temperatūrai, klampa mažėja; taigi EFM
didėja. 25KV įtampa buvo per aukšta skirstymui, todėl pasirinkta 12KV, kuri laipsniškai buvo keliama
iki 15KV, vėliau analizė atlikta su 17KV. Galimi matuojamų junginių bangos ilgiai yra 230nm, 254nm
ir 280nm. Injektavimo pradinis laikas pasirinktas 3s, vėliau keičiant 5s, 8s, 10s, 12s, 15s, 18s iki 20 s,
optimalus laikas pasirinktas 15s. Slėginė injekcija 34,5mbar. Kapiliaras 50µm skersmens, nepadengtas,
visas ilgis 40,5cm, efektyvusis 47 cm. Dėl kapiliaro dažno užsikimšimo, sąlygos pakeistos ir metodas
modifikuotas ir optimizuotas pagal Chen, Li, Li, Song, Chai, Ma straipsnį (2004) [34]. Pagal nurodytą
straipsnio metodą flavonoidų analizei, kaip liuteolino – 7-O-galaktozidas, rutinas, hiperozidas,
kvercetinas ir liuteolinas taikomos sąlygos: 80m M boratinis ir 20mM fosfatinis buferis, kurio pH 8.1,
pridėjus 15% (v/v) acetonitrilo. Skirstymo įtampa naudota 28kV, palaikoma temperatūra 25ºC, slėgis
50mbar 8s. Pasirinktos matuojamos bangos ilgis 380nm.
Optimizuotos metodo sąlygos:
Buferis 20ml 100 mM Na2B4O7 ir 15ml 100 mM NaH2PO4 buferis sumaišomi, iki 100ml kolboj
praskiedžiama dejonizuotu vandeniu. Pasirenkamos pH vertės: 8,1; 8,30; 8,50 ir 8,70, bangos ilgiai
kaip minėta ankščiau, 15% (v/v) bendro tūrio acetonitrilo. Kapiliaras 50µm skersmens, nepadengtas,
visas ilgis 57,5cm, efektyvusis 50,5cm. Skirstymo įtampa 17 kV. Bandinio slėginė injekcija 15s
34,5mbar, elektrinio lauko stipris 240 V/cm.

28
Beckmann P/ACE System MDQ aparatu:
Metodo sąlygos:
Naudojamos prieš tai aprašytos buferio sąlygos, pasirenkamos 5 pH vertės: 8,10; 8,20; 8,30;
8,40; ir 8,50. Bangos ilgiai matuojami diodų matricos detektoriumi, skanuojančiu visą spektrą nuo
200nm iki 400nm, fiksuojant 3 tinkamiausius flavonoidų standartams bangos ilgius: 210nm, 280nm,
320nm. Kapiliaras 50µm skersmens, nepadengtas, visas ilgis 50cm, efektyvusis 60,2cm. Bandinio
slėginė injekcija 0,5s 0,5psi (35mbar). Bandinys praskiedžiamas per pusę su darbiniu buferiu.
Skirstymas vykdomas esant 25KV,
Karuselė ir bandiniai yra termostatuojami. Kapiliarą aušina aušinimo skystis. Dauguma
atskyrimų yra vykdomi 25° C temperatūroje. Naudojant skystus aušinimo agentus, puikiai valdoma
temperatūra, netgi esant didelės koncentracijos buferiams ir didelio skersmens kapiliarams. Mažesnė
buferio koncentracija sąlygoja mažesnį šilumos iššsikyrimą, tačiau tuomet sumažėjus fokusavimo
efektui sumažėja ir atskyrimo efektyvumas. Jei termostatavimas yra netinkamas, pasirenkamos mažos
buferių koncentracijos (pvz. 20 mM) arba atskyrimas atliekamas aukštesnėje temperatūroje. Siauro
skersmens kapiliarai padeda geriau išsisklaidyti šilumai, aušinimas skysčiu yra efektyviausia šilumos
pašalinimo ir kapiliarų termostatavimo priemonė [27].
Pačiam bandiniui taip pat gali būti svarbi buferio pH įtaka, nes analičių krūvis yra priklausomas
nuo pH, todėl ir skyrimo atrankumas yra stipriai įtakojamas terpės pH. Jei EOS yra greitas esant stipriai
šarminiam pH, vyksta nepilnas junginių atskyrimas.
Identifikuojant flavonoidus vaistažolių mišiniuose, eksperimentiškai pasirinkta viena pH vertė,
tinkamiausia bandinių išskirstymui 8,30. Pagal kitus literatūros šaltinius [34] buferio pH vertė
eksperimentiškai pasirinkta 8,20, tačiau atlikus 4 flavonoidų standartų identifikavimą, pH 8,20 parodė
visišką neatskyrimą. Geriausią skirstymą kampferolio, pinocembrino ir galangino demonstruoja pH 8,4
vertė, tačiau tokie junginiai, kaip kavos rūgštis elektroferogramoje jau nebematoma. Siekiant
optimalaus skirstymo visiems flavonoidų standartams, pasirenkama viena pH vertė 8,3. Bandinių
komponentai linkę adsorbuotis ant kapiliaro vidinių sienelių, todėl prieš kiekvieną dienos
eksperimentą, kapiliaras buvo kondicionuojamas 10 min 0,2M NaOH šarmu, 5 min dejonizuotu
vandeniu ir 5 min darbiniu buferiu. Prieš kiekvieną analizę, kapiliaras taip pat kondicionuojamas,
sutrumpinus trukmę 4min, 2 min ir 2 min, atitinkamai.
Mažesnis kapiliaro vidinis skersmuo sąlygoja geresnį atskyrimą (Skiriamoji geba), bet mažesnes
aptikimo ribas dėl sumažinto detekcijos kelio ilgio ir injektuoto bandinio kiekio.

29
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

5.1. Flavonoidų bendro kiekio įvertinimas spektrofotometru

Spektrofotometru išmatuotas bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis, randamas vaistinėse
arbatose, pateiktas grafikuose. Buvo tiriami metanoliniai vaistinių arbatų ekstraktai, paruošti 2008 metų
gegužės ir spalio mėn. Atliktas fenolinių junginių įvertinimas prieš KFE ir po jos. Įvertintos
metanolinių ekstraktų laikymo sąlygos šaldytuve.
Bendras flavonoidų kiekis pateiktas 5 pav., kuriame atsispindi kietafazės ekstrakcijos analičių
išvalymas nuo nepageidaujamų komponentų. Legendos simboliai aiškinami sutrumpinimuose.
Metanoliniai ekstraktai prieš kietafazę ekstrakciją parodė didesnį flavonoidų kiekį, nei po KFE.
Atlikus ekstrakcijas su skirtingais tirpiklių praskiedimo kiekiais, tolimesnei analizei pasirinktas 0,5: 9,5
žaliavos ir tirpiklio santykis. „Atsikosėjimą gerinačiais“ arbatai kietafazės buvo atsisakyta, dėl
bandiniuose esančių gleivių.

2,5 po KFE
2,08 prieš KFE
2 1,84
1,64
1,42 1,33
1,5 1,29
mg/g

1,05 0,97 1,00

1 0,78 0,57 0,76
0,56
0,5
0,00
0
ats ger tulz var prakait tulz ap nerv r kos slop Hem
reg

5 pav. Bendras flavonoidų kiekis, tirtas 2008 gegužės mėn. prieš KFE ir po jos.
Iš 5 pav. didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Tulžį varančioje“ arbatoje 2,08mg/g sausos žaliavos,
antroje vietoje „nuo hemorojaus“ arbata 1,64mg/g.

30
 1,4
1,14
1,2
1,02
0,94 0,89
1
0,82 0,79
0,8 0,59 0,71 0,66 1_10
mg/g

0,51 0,58 0,61

0,6 0,47 1_04s
0,42
0,4
0,2
0
kos slop tulz var prakait tulz ap nerv r ats ger Hem
reg

6 pav. Flavonoidų suminis kiekis spalio mėn. paruoštų ir gegužės mėn. (paruoštų bei laikytuose
šaldytuve iki spalio mėn.)

Bendras flavonoidų kiekis, išmatuotas spalio mėn. paruoštų metanolinių ekstraktų iš sausos
žaliavos, laikytos tamsioje vėsioje vietoje vienus metus lyginamas su metanoliniais ekstraktais,
laikytais pusę metų šaldytuve, pav. 6. „Tulžį varančioje“ arbatoje flavonoidų kiekis laikomose
šaldytuve metanoliniuose ekstraktuose sumažėjo beveik per pusę.
Didžiausi flavonoidų kiekiai randami „nuo Hemorojaus“, 1,14±0,15mg/g arbatos ekstraktuose.

5.2. Fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriškai

Fenolinių junginių kiekiai mg/g arbatose skaičiuojami pagal formulę galo rūgšties gradavimo grafiką,
pateiktą 7 pav.

31
 y = 64,052x
R2 = 0,9934
0,6

Absorbcija

0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01
Galo r. koncentracija mg/ml

7 pav. Galo rūgšties gradavimo grafikas

4
3,53
3,5 3,20
fenol.junginių kiekis, mg/g

2,96
3 2,81
2,67
2,5 2,30
2,18 2,15
1_04
2
1,64 1,56 1_04k
1,50
1,5 1,26
1,04
1

0,5
0,16
0
kos slop tulz var prakait tulz ap reg nerv r ats ger Hem

8 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis mg/g

Didžiausias fenolinių junginių kiekis randamas „prakaitavimą skatinančioje“ arbatoje

3,53±0,079 mg/g, nežymus sumažėjimas po KFE 3,20±0,01 šiek tiek mažesni kiekiai randami ir „nuo
Hemorojaus“ arbatoje, 2,96±0,21mg/g.

32
 3,5
3,10
3 2,87
2,60
2,46
2,5 2,34
2,02
2 1_10
mg/g

1,60
1,43 1,36 1,35 1_04s
1,5 1,32 1,32
1,11 1,13
1

0,5

0
kos tulz var prakait tulz ap nerv r ats ger Hem
slop reg

9 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas mg/g iš galo rūgšties gradavimo grafiko
gegužės mėn. (laikytų šaldytuve) ir spalio mėn. paruoštų ekstraktų.
Fenolinių junginių kiekio kitimas metanoliniuose ekstraktuose, saugant juos +4ºC temperatūroje
6 mėn. Pateiktas 9 pav.. Metanoliniai ekstraktai buvo ruošti 2008m gegužės mėn. Ir naujai paruošti iš
sausos žaliavos spalio mėnesį. Fenoliniai junginiai įvertinti lyginant skirtumus. Yra tendencija, jog
fenolinių junginių kiekiai mažėja laikui bėgant laikomuose metanoliniuose ekstraktuose šaldytuve.
Pasikeitė fenolinių junginių kiekiai, lyginant pradinius ekstraktus gegužės mėn. su naujais
padarytais ekstraktais spalio mėn. Labiausiai pasikeitė „Nuo Hemorojaus“ fenolinių junginių kiekis
laikant metanolinius ekstraktus šaldytuve. Galima pastebėti, jog šaldytuve laikomi metanoliniai
vaistinių arbatų ekstraktai greičiau praranda fenolinius junginių kiekius, nei laikomi kaip džiovinta
žaliava sausoje vėsioje vietoje.

33
 3,5
3,10
3 2,89
2,60
2,46
2,5 2,34
2,13 2,10
2,02
2 1,73 1,79 1_10
mg/g

1,32 1,36 1_10k

1,5
0,95
1

0,5
0,10
0
kos slop tulz var prakait tulz ap reg nerv r ats ger Hem

10 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis spalio mėn. Ruoštuose ekstraktuose prieš ir po
kietafazės ekstrakcijos
Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas „prakaitavimą skatinančioje“ arbatoje 3,10 mg/g,
po kietafazės ekstrakcijos (KFE) nuostuoliai neviršija 7%. „Atsikosėjimą gerinančioje“ arbatoje gauti
žymūs nuostoliai po kietafazės ekstrakcijos, dėl kurių vėliau ši arbata nebuvo analizuojama. Arbatoje
„nuo hemorojaus“po KFE fenolinių junginių nuostoliai viršija 30% , dėl aktyvių centrų trūkumo
kietafazėje šerdelėje, dalis fenolinių junginių išplaunami.

5.3. Arbatų antioksidacinis aktyvumas

Metanolinių arbatos ekstraktų duomenys pateikiami 11 pav. Pamatavus išvalytus teršalus po
KFE ekstrakcijos, reakcija su DPPH radikalu neparodė jokio ženklaus aktyvumo, kurį būtų galima
fiksuoti kaip reikšmę ir vertinti. Vadinasi, išvalyti junginiai neturi aktyvumo, kurį parodo po kietafazės
ekstrakcijos surinkti metanoliniai ekstraktai.
Tiriant spektrofotometriškai arbatas paaiškėjo, jog didžiausią antioksidacinį aktyvumą turi
prakaitavimą skatinanti arbata, taikant tiek grynąją metanolinę ekstrakciją 62±0,15% kietafazę
ekstrakciją 52,02±0.6% (12 pav.). Antra pagal aktyvumą yra nervus raminanti arbata 50, 08±0,15%.
Tiriant šaldytuve laikytus metanolinius ekstraktus, buvo pastebėtas iki 40% aktyvumo sumažėjimas.

34
 40

35 32,84

30
aktyvumas, %

25 22,04
20,06 20,22 1_10
20 16,97
15,70 15,76 14,99 1_04s
13,44 12,62 13,39 13,66
15 11,85
9,64
10

0
kos tulz var prakait tulz ap nerv r ats ger Hem
slop reg

11 pav. Arbatų aktyvumas, po metanolinės ekstrakcijos (gegužės mėn., laikyta šaldytuve) ir

naujai paruoštos spalio mėn.
Palygintas arbatų aktyvumas, kurių metanoliniai ekstraktai buvo paruošti prieš pusmetį ir laikyti
šaldytuve (2008m. Gegužės mėn.) bei paruoštų spalio mėn.. „Prakaitavimą skatinanti“ arbata pasižymi
dideliu antioksidaciniu aktyvumu, 32,84 ±0.6% spalio mėn paruoštuose ekstraktuose. Didžiausias
aktyvumo sumažėjimas „prakaitavimą skatinančioje“ arbatoje pasiekiamas iki 40%, laikant
metanolinius arbatos ekstraktus šaldytuve.

70
62,60
60
52,13 1_04
50,08
47,97 47,24
50 45,53
1_04k
41,30
38,00 38,02
40
1_10
32,84
%

30 27,80 1_10k
25,04 24,39
22,04
20,22
17,58 18,19 18,05
20 15,76
13,39 13,66
12,02 10,57
10,28
10

0
kos slop tulz var prakait tulz ap reg nerv r Hem

12 pav. Arbatų aktyvumas, po naujai paruoštos metanolinės ekstrakcijos ir po bandinių išvalymo

kietafaze ekstrakcija.
Laikoma sausoje vėsioje vietoje daugiau nei metus sausa vaistinių arbatų žaliava praranda taip pat
praranda aktyvumą dėl fenolinių junginių oksidacijos. Fenolinių junginių kiekiai koreliuoja su

35
antioksidaciniu aktyvumu ir pastebimas panašus santykis tarp antioksidacinio aktyvumo sumažėjimo ir
fenolinių junginių sumažėjimo.
Tirtų arbatų SSN neviršija 4%, didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi grynu
metanoliniu ekstraktu daryta „prakaitavimą skatinanti arbata“. Rezultatų glaudumas neviršija 0,72%.

5.4. KE eksperimentinė dalis ir gauti rezultatai

Kapiliarinės elektroforezės metodo optimizavimui taikytas skirtingas injektavimo laikas ir

skirtingos buferio pH reikšmės. Paprastai natrio tetraboratas kaip elektrolitas pasirenkamas kapiliarinei
elektroforezei [40,41] dėl jo sugebėjimo sudaryti kompleksus su flavonoidų cukraus puse ir cis-1,2-
hidroksilo grupėmis. Pradinė buferio sudėtis buvo pasirinkta 20 mm Na2B4O7, pH 9,2. Smailių
skiriamoji geba Rs = 0,373 . Naudojant kitą buferį, 20 mM Na2B4O7 privestą su 40 mM H3BO3 pH 8,2,
standartų mišinys buvo atskirtas nevisiškai. 20mm Na2B4O7 buferis privestas su 40mm H2PO4 pH 8,3
ir pH 8,4 buvo sėkmingai pritaikytas standartų mišinio atskyrimui, tačiau privedus buferį iki pH 8,2 ,
Rutinas ir Galanginas nebuvo atskirti (žr. 15 pav. C, atitinkamai). Šis metodas buvo papildomai
optimizuotas. Atsižvelgiant į kompleksinį poveikį realiems bandiniams, daug įvairių veiksnių įtakoja
atskyrimą, kaip buferis, pH, elektrolitų ir organinio modifikatoriaus koncentracija, taikoma įtampa,
injektuojamo bandinio tūris. Optimizavus atskyrimo sąlygas, buvo pasirinktas 20 mM Na2B4O7, pH 8,3
buferis tolimesnėms vaistinių arbatų mišinių analizėms. Smailių identifikavimas buvo tikrinamas
užrašant kiekvieno junginio spektrą, naudojant UV diodų matrcios detektorių (priedas Nr.1).

1 4
EOS
3
2

A)

Rs=0,3732
B)

Rs=0
C)

13 pav. KE metodo optimizavimas 4 flavonoidams, naudojant skirtingų pH verčių buferius: A

– 20 mM Na2B4O7 pH 8,4, B - 20 mM Na2B4O7 pH 8.3, C - 20 mM Na2B4O7, pH 8.2

36
Skirstymo įtampa: 25 kV, kapiliaras termostatuojamas: 25°C, L= 60cm (LD=50.2 cm),
injekcija: slėginė 34,5 mbar * 15s, UV detekcija ties 230 nm. Skirstomi 4 flavonoidų
standartai: 1 – pinocembrinas, 2 – rutinas, 3- galanginas, 4 – kampferolis.

Skiriamoji geba (Rs) apskaičiuota rutinui and kampferoliui. Geresnis atskyrimas pasiektas prie
pH 8.4 tarp visų keturių standartų, tačiau tolimesnei analizei pasirinktas pH 8,3 dėl gerenės
skiriamosios gebos kavos rūgščiai, kuri geriau matoma prie pH 8,3.
Lyginant efektyvumus, didesnis efektyvumas gautas pinocembrinui ir rutinui ties pH 8,4,
tačiau geresnis efektyvumas buvo gautas galanginui ir kampferoliui ties pH 8,3.

0,03

20s

0,02
18s

12s
uA

0,01 10s

8s

0,00

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020

2 -1 -1
µep/(-1) mm V s

14 pav . Epikatechino injektavimo trukmės optimizavimas. Nepadengtas kapiliaras 50µm sk.,

40,5cm ef.ilgis; 47cm visas ilgis, įtampa 15kV, bandinys injektuojamas nuo 8 iki 20s, buferis 20mM
Na2B4O7*10H2O; 40 mM NaH2PO4 ; 15% Acetonitrilo bendro tūrio, pH 8,1.

Praleidus standartų mišinį duotom sąlygom buvo pastebėta, kad epikatechino ekstincijos koeficientas
yra daug mažesnis nei kitų analizuotų flavonoidų standartų. Standartų mišinio elektroferogramoje
epikatechinas buvo vos matomas, todėl optimizavus injektavimo trukmę katechinui, pagerinta jo
skiriamoji geba. Optimalus laikas 15 s parodė (žr. 16 pav.) pakankamai aukštą smailę ir buvo
standartizuota visiems flavonoidų standartams.

37
 Pinocembrinas Galanginas Liuteolinas
Rutinas Kampferolis
EOF Ferulo r.
Apigeninas 230nm
Epikatechinas Trans-p
0,04

Kvercetinas
Hesperidinas Chlorogeno r.
254nm
uA

0,02

280nm

0,00

0,00 0,01 0,02 0,03

2 -1 -1
µep/(-1) mm V s

15 pav . Standartų mišinys prie skirtingų bangos ilgių. Skirstymo sąlygos: nepadengtas kapiliaras
50µm sk., 50,5cm ef.ilgis; 57cm visas ilgis, įtampa 17KV, bandinys injektuojamas 15s , buferis 20mM
Na2B4O7*10H2O; 60mM NaH2PO4 ; 15% Acetonitrilo bendro tūrio, pH 8,1. Matavimai 230nm,
254nm, 280nm.
Standartų mišinys buvo analizuotas prie 3 galimų bangos ilgių. Labiausiai netinkamas bangos
ilgis 254nm (žr. 15 pav.), epikatechino ir pinocembrino ties 254nm ir 280nm nepavyko rasti. Šiuo
atveju pH 8,1 vertė nėra tinkama standartų mišinio skirstymui, vėliau jos atsisakyta.

0,10 pH 8,1

10 12
2 pH 8,3 13
89
1 3 45 7 11
0,05
uA

6
pH 8,5

pH 8,7
0,00

0 5 10 15 20 25
t, min

16 pav. pH buferio įtaka standartų mišinio skirstymui. Skirstymo sąlygos kaip ir 17 pav.,
keičiamos buferių pH vertės: 8,1; 8,3; 8,5; 8,7. 1- Hesperidinas, 2- Apigeninas, 3 -Epikatechinas, 4 –

38
 Pinocembrinas, 5 - Rutinas, 6 - Galanginas, 7 - Kampferolis, 8 – Chlorogeninė r. 9 –Ferulinė r., 10 –
Trans – p – kumaro r., 11 – Kvercetinas, 12 – Liuteolinas, 13 – Kavos r.

Geriausias skirstymas atiliktas kai pH vertė yra 8,3 (16 pav). Ties pH 8,1 blogai išskirstomas
Galanginas, Kampferolis ir Pinocembrinas, jų migracijos laikai sutampa, matoma viena plati smailė.
Maža įtampa blogina skirstymo sąlygas, tačiau dėl netinkamo termostatavimo ir džaulio didelės
šilumos pasirinkta mažesnė 17 kV įtampa. Eksperimento sąlygos kaip ir prieš tai, skirtingos pH vertės:
8,1; 8,3; 8,5; 8,7. Matavimai ties 280nm. Tolimesni tyrimai atliekami Beckmann MDQ, matuojant
diodų matricos detektoriumi. Galimybė pasirinkti optimalų bangos ilgį prie skirtingų pH verčių.
Duomenys integruojami, priedo metodu nustatomi arbatose esančių flavonoidų kiekiai.

5.5. Optimizuoto metodo įteisinimo žingsniai

Pritaikius naujas analizės sąlygas, būtina atlikti metodo įteisinimo žingsnius, t.y. nustatyi visų
galimų faktorių įtaką analizės kokybei ir rezultatams. Eletroforezės metodo įteisinimą sudaro
linijiškumo, savitumo, jautrumo, aptikimo ir nustatymo ribų, glaudumo, tikslumo įvertinimas.

5.5.1. Metodo atrankumas

Norint parodyti, kad kiekviena smailė atitinka ieškomą analitę, diodų matricos detektoriumi
registruojamas kiekvieno fenolinio junginio spektras ir lyginamas su bandinio mišiniuose esančiais
spektrais. Fenolinių junginių spektrai pateikti priede, nr.1.
Taikant priedo metodą, į analizuojamą ekstraktą pridedamas žinomos koncentracijos flavonoidų
standartas ir stebimas padidėjusios smailės aukštis ir plotas, 17 pav.. Įdėjus priedo, keičiasi analizės
trukmė, metanolinis priedas leidžia junginius išskirstyti per trumpesnį laiką, tačiau nukenčia smailių
efektyvumas ir skiriamoji geba. Priedo metodu buvo identifikuoti flavonoidų standartai vaistinių arbatų
mišiniuose.

39
 17 pav. Analizuojamas „Tulžį varančios“ vaistinės arbatos ekstraktas (aukščiau, stebimi 2
smailės pokyčiai), ir ekstraktas su flavonoidų standartų hesperidino priedu ( pažymėtas 3 nr.
žemiau esančioje elektroferogramoje).
5.5.2. Tiesinis intervalas, aptikimo ir nustatymo ribos
Optimizavus flavonoidų standartų mišinio atskyrimą, gautos tiesės lygtys iš gradavimo kreivių,
nustatytos detekcijos ir aptikimo ribos, pateikta 4 lentelėje. Aptikimo (AR) ribos skaičiuojamos pagal
bazinės linijos triukšmo ir signalo santykį 1:2~3 ir nustatymo riba skaičiuojama (NR) 1:9.
Lentelė nr 4. Standartų regresijos lygtys bei detekcijos ir nustatymo ribos

Koreliacijos Koncentracijos Aptikimo Nustatymo

Regresijos lygtis Standartai
koef. ribos, µg/g riba, µg/g riba, µg/g
y = 2E+07x - 11267 R2 = 0,999 Kampferolis 4-40 0,064 0,210
y = 6E+07x - 93228 R2 = 0,996 Liuteolinas 4-40 0,078 0,257
y = 9E+06x - 21412 R2 = 0,993 Rutinas 4-40 0,094 0,309
y = 1E+07x + 10518 R2 = 0,999 Kvercetinas 4-40 0,114 0,377
trans-p-kumaro
y = 2E+07x - 76650 R2 = 0,996 4-40 0,086 0,285
r.
2
y = 7E+06x + 2284,7 R = 0,995 Kavos r. 4-40 0,072 0,239
y = 1E+07x - 45449 R2 = 0,994 Ferulinė r. 0,048-0,096 0,099 0,326
y = 2E+07x + 17190 R2 = 0,990 Epikatechinas 4-40 0,083 0,275
y = 6E+06x + 57129 R2 = 0,991 Hesperidinas 4-40 0,094 0,310
y = 3E+07x - 118842 R2 = 0,999 Galanginas 0,026-0,52 0,072 0,237
y = 3E+07x - 44152 R2 = 0,998 Apigeninas 0,006-0,12 0,103 0,341
y = 2E+07x + 167505 R2 = 0,999 Pinocembrinas 0,0095-0,095 0,104 0,344
Chlorogenine
y = 7E+06x - 7813,7 R2 = 0,998 4-40 0,076 0,252
r.

40
Iš 4 lentelės, aptikimo ribos svyruoja nuo 0,072µg/g (kavos r.) iki 0,114µg/g (kvercetinui).
Identifikuoti junginiai metanoliniuose ektstraktuose pateikiami 5 lentelėje.
Lentelė nr.5 Apskaičiuoti KE identifikuotų junginių kiekiai sausoje vaistinių arbatų žaliavoje.
tulz var prak skat tulz ap ger nerv r
mg/g SSN(%) mg/g SSN(%) mg/g SSN(%) mg/g SSN(%)
Kaempferolis 0,354 0,572 0,055 2,105 0,935 2,56 - -
Liuteolinas 0,095 2,621 1,176 0,262 0,073 2,897 0,050 3,630
Rutinas 0,201 0,135 - - 0,952 2,397 0,721 0,894
Kvercetinas n - 0,197 0,345 0,184 0,034 0,383 4,931
trans-p-kumaro 0,088 0,597 - - n - 0,117 4,672
Kavos r. 0,077 0,038 - - 0,102 2,764 0,166 3,083
Ferulo r. 0,152 0,735 n - n - n -
Epikatechinas 0,287 3,036 1,017 2,734 0,028 0,848 n -
Hesperidinas 0,477 0,010 n - 0,062 1,922 0,029 3,689
Galanginas n 0,110 - - n - n -
Apigeninas 0,413 0,066 1,02 1,25 n - 0,600 1,335
Pinocembrinas 0,070 3,574 0,209 0,508 0,032 4,772 0,042 2,967
Chlorogeno r. 0,461 0,083 n - 0,463 4,165 0,095 4,392
n- rasti kiekiai mažesni už nustatymo ribas
5.5.3. Rezultatų glaudumas
Metodo glaudumas pateikiamas santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN). 5 matavimai
atliekami pakartojamumui įvertinti migracijos laikui ir smailės plotui, 6 Lentelėje.
Lentelė nr. 6 Migravimo trukmės ir integruoto smailių ploto paklaidos.
SSN, %
Smailių plotas, padalintas iš
Migracijos trukmė
trukmės
Flavonoidai Analizė po Analizė po Diena po
Diena po dienos
analizės analizės dienos
Kampferolis 1,287 2,176 2,529 6,424
Liuteolinas 1,737 2,233 2,518 5,572
Rutinas 1,782 2,538 2,280 5,181
Kvercetinas 1,225 4,848 2,683 5,885
trans-p-coumaric 2,120 3,049 2,775 6,352
Kavos r. 1,942 2,929 2,274 3,818
Ferulinė r. 1,782 2,625 2,261 2,081
Epikatechinas 1,133 1,604 2,685 3,758
Hesperidinas 1,593 2,142 2,002 2,472
Apigeninas 1,717 2,100 2,231 3,420
Pinocembrinas 1,682 2,688 2,937 6,203
Chlorogeninė r. 1,115 2,436 2,705 3,935

41
5.5.4. Metodo stabilumas
Metodo stabilumas vertinamas pagal įtakojančių faktorių nukrypimą nuo gautų flavonoidų
standartų skirstymo rezultatų.
Nedideli buferio joninės jėgos pakitimai , pH verčių svyravimas, temperatūros pokyčiai
bandiniams, ar skirstymo kapiliarui turi įtakos analičių mobilumui, todėl gali pailgėti ar sutrumpėti
analizės trukmė. Naudojant 8,1 pH vertės buferį, analizė sutrumpėja, tačiau sumažėja ir skiriamoji
geba. Netermostatuojamo kapiliaro smailių efektyvumas žymiai mažesnis (16 pav.).

5.6. ESC analizė:

Atliktas atskirų fenolinių junginių standartų skirstymas, identifikuojant standartų sulaikymo
trukmę, 18 pav. .
Rutinas
Pinocembrinas
70000 Kampferolis Galangas

60000
Apigeninas

50000

40000
Kavos r.
uA

30000 Kvercetinas
Liuteolinas
Chlorogeno r.
20000
Epikatechinas
Ferulo r.
10000 Trans-p-kumaro r.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
t, min

18 pav. Fenolinių junginių standartų mišinio analizė ESC

Skirstymo sąlygos nurodytos metodikoje. 7 - toje lentelėje pateikta flavonoidų standartų sulaikymo
trukmės.

Lentelė nr. 7 Flavonoidų standartų ESC sulaikymo trukmė.

Standartai Sulaik. trukmė, min Laiko SSN (%)

Apigeninas 46,74 0,17
Galanginas 73,38 0,07
Kampferolis 63,79 0,58
Liuteolinas 43,28 1,10

42
 Rutinas 66,34 0,45
Pinocembrinas 57,02 0,37
Kvercetinas 28,24 0,25
trans-p-kumaro r. 13,24 0,25
Kavos r. 29,58 0,73
Ferulinė r. 15,66 0,13
Epikatechinas 34,88 1,12
Hesperidinas 61,14 0,79
Chlorogeninė r. 18,51 0,16

Apskaičiavus jungnių kiekius sausoje žaliavoje, gauti duomenys pateikti 8 lentelėje.

Lentelė nr. 8. ESC Identifikuoti fenolinių junginių standartai arbatose pagal sulaikymo trukmę.

Tulžies
Prakaitavimą Nervus Nuo
mg/g Tulžį varanti apytaką
skatinanti raminati Hemorojaus
gerinanti
Kampferolis 0,194 n 0,716 0,016 0,117
Liuteolinas 0,548 1,178 0,042 0,327 0,204
Rutinas 0,376 - 0,550 0,012 0,123
Kvercetinas n - 0,118 0,050 -
trans-p-kumaro 0,068 - n n 0,005
Kavos r. n - n n 0,087
Ferulo r. 0,292 - 0,134 0,339 0,527
Epikatechinas 0,163 1,290 0,092 0,546 0,913
Hesperidinas n - 0,034 0,047 0,528
Galanginas 0,048 - 0,186 0,212 0,631
Apigeninas 0,662 0,262 0,063 0,607 0,650
Pinocembrinas 0,067 0,099 0,078 0,029 0,583
Chlorogeno r. 0,571 n 0,423 0,145 -
n - aptikta, bet kiekiai mažesni už aptikimo ribą
Antioksidacinis identifikuotų junginių įvertinimas pagal Rutino ekvivalentą
Pagal rutino ekvivalentą ir sudarytą antioksidacinį gradavimo grafiką 19 Pav., paskaičiuotas
bendras vaistinių arbatų antioksidacinis aktyvumas.

43
 450000
400000
350000
Smailių plotai

300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
0 20 40 60 80 100 120
C, µg/ml

19 Pav. Rutino antioksidacinis gradavimo grafikas

9 Lentelė. RE lygtis
Tiesės lygtis Koreliacijos koeficientas
y = 3855,6x R2 = 0,9811

Efektyviąja skysčių chromatografija buvo išskirstyta 5 vaistinių arbatų mišiniai ir išmatuotas

antioksidacinis vaistinių arbatų aktyvumas. Likę 2 mišiniai dėl jose esančių kompleksinių junginių,
iškrentančių nuosėdomis ir sudarančių prastai atskiriamus junginius, nebuvo tirti. Vaistinių arbatų
antioksidacinis aktyvumas pateiktas 10 lentelėje. Pagal išreikštą rutino ekvivalentą „Prakaitavimą
skatinanti“ arbata turi didžiausią antioksidacinį aktyvumą, antra pagal antioksidacinį aktyvumą yra
„Nervus raminanti“. Mažiausią aktyvumą turėjo „Tulžies apytaką gerinanti arbata“.
10 lentelė. Vaistinių arbatų antioksidacinis aktyvumas pagal rutino ekvivalentą

Vaistinė arbata Antioksidacinis aktyvumas, mg/g RE

Species cholagoga
0,78
Tulžį varanti
Species diaphoretica Nr. 3
1,5
Prakaitavimą skatinanti
Species cholametabolica
0,39
Tulžies apytaką gerinanti

44
 Species sedative
1,12
Nervus raminanti
Species antihaemorrhoidales
1,06
Nuo Hemorojaus

Efektyviosios chromatografijos skirstymas su reakcijos detektoriumi pateiktas 20 pav. „prakaitavimą

skatinančiai“ arbatai.

40

Liuteolinas
30 Apigeninas

20
Epikatechinas
uA

Kampferolis
10

0
Pinocembrinas
-10

-20
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
t, min

20 pav. „Prakaitavimą skatinanti” arbata

Identifikuoti junginiai rodo gana stiprų antioksidacinį aktyvumą, didžiausią aktyvumą turi
liuteolinas ir epikatechinas, pinocembrinas.
11 Lentelė. „Prakaitavimą skatinančios“ arbatos fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas pagal
rutino ekvivalentą.

Epikatechinas Liuteolinas Pinocemrbinas

mg/g RE 0,166 0,181 0,0679

45
Liuteolinas pasižymėjo didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu (11 lentelėje). Lyginant antioksidacinį
aktyvumą pagal flavonoidų koncentracijos ir sureagavusio laisvojo radikalo DPPH koncentracijos
santykį, iš 20 pav. matyti, kad epikatechinas yra aktyvesnis antioksidantas nei liuteolinas.

“Nervus raminanti” arbata - Antioksidaciniu aktyvumu identifikuotas epikatechinas, rutinas,

galanginas, ferulinė rūgštis.

„Tulžį varanti“ arbata - Antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo epikatechinas, liuteolinas, rutinas bei
galanginas.

„Tulžies apytaką gerinanti“ arbata - didžiausią antioksidacinį aktyvumą rodo identifikuotas

liuteolinas, rutinas, epikatechinas bei ferulo rūgštis.

60
Galanginas
Liuteolinas

30
Epikatechinas
Apigeninas
Chlorogeninë r. Pinocembrinas
Rutinas
Kampferolis
Kavos r.
0
uA

Hesperidinas

-30

-60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
t, min

21 pav. Vaistinės arbatos “Nuo Hemorojaus” ESC skirstymas

Aktyviausias junginys pagal antioksidacinę kreivę (21 pav.) yra epikatechinas, mažesnį
aktyvumą turi liuteolinas, kampferolis, rutinas, kavos rūgštis, identifikuoto apigenino aktyvumas

46
mažiausias. Šioje chromatogramoje matoma daug smulkių smailių, kurios nėra identifikuotos, tačiau
turi gana ryškų antioksidacinį aktyvumą.

6. METODŲ PALYGINIMAS IR APIBENDRINIMAS

Daugelis studijų yra įrodę augalų naudą žmonių sveikatai. Įvertinus antioksidantų fitochemines
savybes vaistingųjų arbatų mišiniuose, galima pagerinti ar net sustiprinti vaistažolių gydomąsias
savybes, derinant vaistažoles tarpusavyje. Tinkamai įvertinus antioksidantų komponentų kiekius ir
atsižvelgus į jų fitocheminių junginių aktyvumą, galima daryti tam tikras išvadas apie šių junginių
kompleksinį veikimą, radikalų slopinimą. Mažos aktyvių junginių koncentracijos, junginių
nestabilumas, sukelia tam tikrų problemų analizuojant junginius, kaip blogą atskyrimą ar net detekciją.
Lyginant ESC ir KE metodus gauti rezultatai rodo, kad KE metodas yra šiek tiek pranašesnis
dėl analizės trukmės, analizės jautrumo, tačiau arbatų antioksidaciniam aktyvumui įvertinti,
tinkamiausia ESC-DPPH sistema, gaunamos neigiamos smailės, vykstant tiesioginei reakcijai tarp
sintetinio radikalo ir aktyviųjų komponentų. Bendram fenolinių junginių kiekiui ir bendram flavonoidų
kiekiui nustatyti pakankamas spektrofotometrinis metodas, kaip pirminis metodas vaistažolėse
esantiems fenoliniams komponentams įvertinti. Iš gautų spektrofotometrinių rezultatų paaiškėjo, kad
didžiausi fenolinių junginių kiekiai randami „Prakataivimą skatinančioje arbatoje“ 3,53 mg/g, o
flavonoidų, 2,08mg/g „Tulžį varančioje“ arbatoje.
Lentelė nr. 12 Paskaičiuota sausoje žaliavoje esantys fenolinių junginių kiekiai.
mg/g KE ESC KE ESC KE ESC KE ESC
Tulžį varanti Prakait. skatinanti Tulžies apyt. Ger. Nervus raminanti
Kampferolis 0,354 0,194 0,055 n 0,935 0,716 - 0,016
Liuteolinas 0,095 0,548 1,176 1,178 0,073 0,042 0,050 0,327
Rutinas 0,201 0,376 - - 0,952 0,550 0,721 0,012
Kvercetinas n n 0,197 n 0,184 0,118 0,383 0,050
trans-p-kumaro 0,088 0,068 - - n n 0,117 n
Kavos r. 0,077 n - - 0,102 n 0,166 n
Ferulo r. 0,152 0,292 n - n 0,134 n 0,339
Epikatechinas 0,287 0,163 1,017 1,290 0,028 0,092 n 0,546
Hesperidinas 0,477 n n - 0,062 0,034 0,029 0,047
Galanginas n 0,048 - - n 0,186 n 0,212
Apigeninas 0,413 0,662 1,02 0,262 n 0,063 0,600 0,607
Pinocembrinas 0,070 0,067 0,209 0,290 0,032 0,078 0,042 0,029
Chlorogeno r. 0,461 0,571 n - 0,463 0,423 0,095 0,145
Bendri kiekiai: 2,68 2,99 3,67 3,02 2,831 2,436 2,203 2,33

47
n – nerasta arba per maži kiekiai identifikavimui.
Lyginami tik 4 vaistinių arbatų mišinių ekstraktai, dėl medžiagų, esančių „kosulį slopinančioje“
arbatoje ir „nuo hemorojaus“ arbatose, kurios atliekant kapiliarinę elektroforezę išsėda ant kapiliaro
sienelių užkimšdamos kapiliarą. Didžiausi suminiai flavonoidų kiekiai randami „Prakaitavimą
skatinančioje“ arbatoje 3,67mg/g (KE) ir 3,02 mg/g (ESC); „Tulžies varančioje“ arbatoje 2,68mg/g
(KE) ir 2,99 mg/g (ESC), „Nervus raminančioje“ 2,20 (KE)mg/g ir 2,33(ESC)mg/g, „Tulžies apytaką
gerinančioje“ arbatoje 2,83 mg/g ir 2,43mg/g; „Nervus raminančioje“ 1,82mg/g (KE) ir 2,33 mg/g
(ESC). Lyginant antioksidacinius aktyvumus, spektrofotometriškai yra didžiausias „Prakaitavimą
skatinančios“ arbatos, lyginant su ESC paskaičiuotu rutino ekvivalentu, pagal kurį, didžiausias
aktyvumas pagal smailių plotus randamas taip pat „Prakaitavimą skatinančios“ arbatos.

7. IŠVADOS

1. Atlikus metanolinių vaistinių arbatų ekstraktų kietafazę ekstrakciją (kuri neviršijo 20 % šešioms
arbatoms, išskyrus „atsikosėjimą gerinančią“ arbatą), nustatytas vaistinių arbatų bendras fenolinių
junginių ir bendras flavonoidų kiekis spektrofotometru. Didžiausią fenolinių junginių kiekį kaupia
„Prakaitavimą skatinanti“ arbata, 3,18±0,06mg/g,. Didžiausias flavonoidų kiekis randamas „Tulžį
varančioje arbatoje“ 2,08±0,01mg/g. Pagal antioksidacinį aktyvumą, arbatos pasiskirsto tokia tvarka:
1. „Prakaitavimą skatinanti“arbata, 62% 2.„Tulžies apytaką gerinanti“ 50% 3. „Kosulį slopinanti“
47,97%. 4. „Tulžį varanti“ 47,24 % 5. „Nuo Hemorojaus“ 41,30%, 6. „Nervus raminanti“ 27,80% 7.
„Atsikosėjimą gerinanti“ 13,39%. Ištirta metanolinių ekstraktų laikymo įtaka bei sausos žaliavos
laikymo įtaka fenoliniams junginiams, flavonoidams bei antioksidaciniui aktyvumui. Sausos žaliavos
saugojimas tamsioje, sausoje vietoje ir paruoštų metanolinių ekstraktų saugojimas šaldytuve +4°C pusę
metų, turi įtakos fenolinių junginių kiekio sumažėjimui. Laikant metanolinius vaistinių arbatų ekstratus
pusę metų šaldytuve, fenolinių junginių randama apie 20% mažiau, laikant sausos žaliavos pavidalu,
fenolinių junginių kiekis sumažėja iki 12%. Vaistinių arbatų antioksidacinis aktyvumas sumažėja iki
50%, laikomiems metanoliniams ekstraktams.
3. Efektyviąja skysčių chromatografija identifikuoti fenoliniai junginiai ir nustatytas jų antioksidacinis
aktyvumas (gebėjimas surišti laisvą radikalą, taip išblukinant tirpalą, chromatogramose pateikiama kaip
neigiamos smailės). Didžiausi fenolinių junginių kiekiai randami „Prakaitavimą skatinančioje“ ir

48
3,02mg/g (ESC). Ji taip pat pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu 1,06 mg/g pagal rutino
ekvivalentą.
4. Fenoliniai junginiai buvo isškirstyti kapiliarine elektroforeze. Skiriamoji geba (Rs) apskaičiuota
rutino ir kampferolio smailėms, Rs = 0,373. Optimizuotos skirstymo sąlygos: buferio joninė jėga, pH,
organinio tirpiklio priedas, temperatūra, įtampa, kapiliaro ilgis: 20 mM Na2B4O7 privestas su H2PO4 iki
pH 8.3, 15% bendro tūrio organinio tirpiklio acetonirilo priedo. Skirstymo įtampa: 25 kV, kapiliaras
termostatuojamas: 25°C, L= 60cm (LD=50.2 cm), injekcija: slėginė 34,5 mbar * 15s, UV detekcija 210
nm.
5. Atlikti kapiliarinės elektroforezės metodo įteisinimo žingsniai: nustatytos aptikimo ir nustatymo
ribos, kurios buvo tarp 0,072µg/g - 0,114µg/g ir tarp 0,24µg/g - 0,377µg/g, atitinkamai. Įvertintas
pakartojamumas laikui (SSN neviršija 2,94% analizei po analizės ir 6,424% ekstrakcijai po
ekstrakcijos) ir koreguotam plotui , (SSN neviršija 2,12% analizei po analizės ir 4,85% ekstrakcijai po
ekstrakcijos), įvertintas metodo atrankumas – smailės buvo identifikuotos, tiesinis intervalas, kurio
koreliacijos koeficientai tarp 0,990 – 0,999, metodo stabilumas - keičiant eksperimento sąlygas,
smailės buvo pakankamai gerai atskirtos.
6. Spektrofotometru išmatuotas didžiausias fenolinių junginių kiekis randamas „prakaitavimą
skatinančioje“ arbatoje 3,53±0,079 mg/g, Efektyviąja skysčių chromatografija nustatyti didžiausi
fenolinių junginių kiekiai randami „Prakaitavimą skatinančioje“ arbatoje, 3,043±0,15mg/g. Didžiausias
bendras arbatos antioksidacinis aktyvumas pagal rutino ekvivalentą „Prakaitavimą skatinančioje“
arbatoje yra 1,5 mg/gRE. Didžiausią antioksidacinį aktyvumą arbatose lemia epikatechinas, liuteolinas,
rutinas, šiek tiek mažesnį – galanginas, kampferolis, apigeninas.
Kapiliarine elektroforeze nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis „Prakaitavimą skatinančioje“
arbatoje buvo didžiausias, 3,59mg/g ir atitinka randamus kiekius spektrofotometru.

49
 Literatūros sąrašas

[1] KMU mokslinių tyrimų programa „Naujų vaistų paieškos ir jų rinkos tyrimai“
http://www.kmu.lt/index.php?cid=1566 (prieiga per Internetą 2008 05 01)
[2] Lietuvos farmakopėjos straipsnis FS 105:1998
[3] J.A. Milner, in I. Goldberg (Ed.), Funtional Foods – Designer Foods, Pharmafoods,
Nutraceuticals, Chapman & Hall, New York, 1994, pp. 39-70
[4] Rong Tsaoa, Zeyuan Deng, Separation procedures for naturally occurring
antioxidant phytochemicals / Journal of Chromatography B, 812 (2004) 85–99
[5] O. Yesil-Celiktas, G. Girgin, H. Orhan, H.J. Wichers, E. Bedir, F. Vardar-Sukan. Screening of free
radical scavenging capacity and antioxidant activities of Rosmarinus officinalis extracts with focus on
location and harvesting times // European Food Research and Technology, 2006, Vol. 224 N.4. P. 443–
451
[6] G. Shui, L.L. Peng. An improved method for major antioxidants of Hibiscus esculentus Lim //
Journal of Chromatography A, 2004. Vol. 1048. P. 17-24
[7] B.C. Behera, N. Verma, A. Fonone, U. Makhija. Antioxidant and antibacterial activities of lichen
Usnea ghattensis in vitro // Biotechnology letters, 2005. Vol. 27, P. 991 – 995
[8] E.I. Korotkova, O.A. Avramchik, M.S. Yusubov, M.V. Belousov, T.I. Andreeva. Determination of
the antioxidant activity of plant extracts by means of cathode voltammetry // Pharmaceutical Chemistry
Journal, 2003. Vol. 37. N. 9. P. 511-513
[9] V. Exarchou, Y.C. Fiamegos, T.A.van Beek, Ch. Nanos, J. Vervoort. Hypheneted chromatographic
techniques for the rapid screening and identification of antioxidants in methanolic extracts of
pharmaceutically used plants // Journal of Chromatography A, 2006. Vol. 1112. P. 293 – 302
[10] M. Kosar, H.J.D. Dorman, O. Bachmayer, K.H.C. Baser, R. Hiltunen. An improved on-line HPLC-
DPPH method for the screening of free radical scavenging compounds in water extracts of lamiaceae
plants // Chemistry of natural compounds, 2003. Vol. 39. N. 2. P. 161-166
[11] A. Ogawa, H. Arai, H. Tanizawa, T. Miyahara, T. Toyo‘oka. On-line screening method for
antioxidants by liquid chromatography with chemiluminecence detection // Analytica Chimica Acta,
1999. Vol. 383. P. 221-230

50
[12] D.G. Watson, C. Atsriku, E.J. Oliviera. Review role on liquid chromatography-mass spectrometry
in the analysis of oxidation products and antioxidants in biological systems // Analytica Chimica Acta,
2003. Vol. 492. P. 17-47
[13] G. Miliauskas, T.A. van Beek, P.R. Venskutonis, J.P.H. Linssen, P. de Waard. Antioxidative
activity of Geranium macrorrhizum // European Food Research and Technology, 2004, Vol. 218. N.3.
P. 253–261. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts,
Food Chemistry 85 (2004) 231–237
[14] V.Briedis, V.Povilaitytė, S.Kazlauskas, P.R.Venskutonis. Polifenolių ir antocianinų kiekis
vynuogėse, vynuogių sultyse ir raudonuose vynuose bei jų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas //
Medicina, 2003. 39 tomas, 2 priedas. P. 104-112.
[15] A. Dapkevičius, T.A. van Beek, H.A.G. Evaluation and comparison of two improved techniques
for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography eluates // Journal of
Chromatography A, 2001. Vol.912. P. 73-82
[16] Giedrė Kasparavičienė, Vitalis Briedis Kai kurie antioksidantų veikimo aspektai mažinant
neigiamą laisvųjų radikalų poveikį, Biomedicina, T.2, Nr. 2 , 2002m gruodis
[17] G. Puodžiūnienė, V. Janulis, A. Milašius, V. Budnikas. Medicina (Kaunas) 2005; 41(6)
[18] http://www.supplementfacts.com/BioflavonoidBookS2.htm (Interneto prieiga 12 04 2009)
[19] S. Sakanaka , Y. Tachibana, Y. Okada Food Chemistry 89 (2005) 569–575
[20] M. A.Berhow, Modern analytical techniques for flavonoid determination, “Flavonoids in Cell
Function”, edited by B. Buslig and J. Manthey. K. Academic/Plenum Publishers, New York, 61 – 68
(2002)
[21] J. S. Amaral, R. M. Seabra, P. B. Andrade, P. Valantao, J. A. Pereira, F. Ferreres, Food Chemistry
88 (2004) 373-379.
[22] María Gómez-Romero et al. / J.Sep. Sci. 2005, 28, 883 - 897
[23] E. De Rijke et al. / J. Chromatogr. A 1112 (2006) 31-63
[24] I. Merfort / J. Chromatogr.Journal of Chromatography A, 967 (2002) 115-130
[25] Federica Pellati, Stefania Benvenuti, Lara Magro, Michele Melegrati, Fabrizia Soragni Analysis of
phenolic compounds and radical scavenging activity of Echonacea spp. / Journal of Pharmaceutical
and Biomedicinal Analysis 35 (2004) 289- 301
[26] http://www.agilent.com/chem (Interneto prieiga 2009-05-24)

51
[27] A. Maruška, O. Kornyšova. Kapiliarinė elektroforezė mokomoji knyga. – VDU leidykla, Kaunas
2003
[28] A.Maruška, O. Kornyšova, E. Machtejevas. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai,
vadovėlis. – VDU leidykla Kaunas 2005
[29] de Rijke, E.; Out, P.; Niessen, W.M.A.; Ariese, F.; Gooijer, C.; Brinkman, U.A.Th. Analytical
separation and detection methods for flavonoids • Review article
Journal of Chromatography A, Volume 1112, Issue 1-2, 1 April 2006, Pages 31-63
[30] T. Goto, Y. Yoshida, I. Amano, H. Horie, Foods Food, Ingredients J. Jpn. 170 (1996) 46.
[31] Brand-Williams, Cuvelier, and Berset (1995)
[32] W. Cu, HN Murthy, EJ Hahn, KY Paek. PMID: 17879746 [PubMed - indexed for MEDLINE]
2007 Aug;30(8):945-9 Improved production of caffeic acid derivatives in suspension cultures of
Echinacea purpurea by medium replenishment strategy.
[33] A.M. Siouffi, R.Phan-Tan-Luu, J.Chromatogr. A2000, 892, 75-106
[34] P.Schmitt-Kopplin, J.Junkers, J.Chromotogr. A2003, 998, 1-20
[35] V.Vaher, M.Koel, J.Chromatogr.A2003, 990, 225-230
[36] M. Criado, F. Castro-Rubio, J. Sep. Sci. 2005, 28, 365-372
[37] Rong Tsao, Zeyuan Deng, Separation procedures for naturally occuring antioxidant
phytochemicals, Journal of chromatography, B 812 (2004), 85-99
[38] A.Escarpa, M.C. Gonzalez, J. Chromatogr. A 823 (1998) 331
[39] A.Escarpa, M.C. Gonzalez, J. Chromatogr. A 30 (1999) 301
[40] Jun Chen Song – Lin Li ir kt. , J. Sep, Sci. 2005, 28, 365 – 372
[41] M. S. Fernandes-Pachon, D. Villano, A. M. Troncoso, M. C. Garcia-Parrilla, Analytica Chimica
Acta (2005);
[42] O. Ragažinskienė, S. Rimkienė, V. Sasnauskas “Vaistinių Augalų Enciklopedija”, Kaunas, Lututė,
(2005) 275-277
[43] C. D. Stalikas. Extraction, separation and detection methods for phenolic acids and
flavonoids. J. Sep. Sci. 2007, 30, 3268 – 3295
[44] Dantuluri M., Riaz M., J. Analytical Biochemistry 336 (2005) 316 – 32
[45] Suntornsuk L., Anurukvorakun O. A., Electrophoresis, 26 ( 2005) 648 – 660
[46] Vaher M., Koel M., J. Chromatogr. A, 990 (2003) 225 – 230;

52
Priedas nr.1

Žemiau pateiktuose spektruose atsispindi fenolinių junginių UV absorbcijos maksimumai, gauti

Beckman PACE-MDQ diodų matricos detektoriumi.

12 8.37 Min 12
apigenin

mAU 23.73 Min

caffeic
10 10 8 8

mAU 8 8
6 6

mAU

mAU
6 6

4 4

4 4

2 2

200 250 300 350 400

nm 200 250 300 350 400
nm

Apigenino spektras Kavos rūgšties spektras

12.5 12.5
14.12 Min
chlorogen

9.65 Min
epicatechin
10.0 10.0
30 30
m AU

m AU

7.5 7.5 20 20
m AU

m AU
5.0 5.0
10 10

2.5 2.5
0 0
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
nm nm

Chlorogeno rūgštis Epikatechino spektras

12 12
11.24 Min
11.80 Min galangin
20 ferulic 20

10 10

15 15

8 8
m AU

m AU
mAU

mAU

10 10

6 6

5 5

4 4

0 0
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
nm nm

Ferulo rūgštis Galangino spektras

53
 6.53 Min
hesperidin 11.61 Min
30 30 kaempferol
10 10

20 20 8 8
m AU

m AU
m AU

m AU
6 6
10 10

4 4

0 0

200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
nm nm

Hesperidino spektras Kampferolio spektras

16.20 Min 10.82 Min
liuteolin 40 pinocembrin 40

25 25

30 30

20 20
m AU

m AU
m AU

m AU

20 20

15 15

10 10

10 10

0 0

200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
nm nm

Liuteolino spektras Pinocembrino spektras

11.36 Min
15.89 Min rutin
25 25
quercetin

6 6
20 20
mAU

mAU
mAU

mAU

15 15
4 4

10 10

2 2

200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
nm nm

Kvercetino spektras Rutino spektras

54
 13.51 Min
transp

15 15

10 10

m AU

m AU
5 5

200 250 300 350 400

nm

Trans – p – kumaro r. Spektras

55
 Padėka

Dėkoju vadovams habil. dr. Audriui Maruškai, dr. Olgai Kornyšovai ir prof. Utei Pyell
(Philipps – Universitaet Marburg, Vokietija) už nuoseklų darbą, patarimus bei suteiktas žinias. Už
vaistinę žaliavą dėkoju „Švenčionių vaistažolių“ fabriko atstovams. Dėkoju doktorantei Vilmai
Ratautaitei už pagalbą atliekant duomenų analizę. Dėkoju savo grupiokams, Anai Frolovai, Ramūnui
Sirtautui, Eglei Ardavičiūtei ir Mantui Stankevičiui už palaikymą.

56
 Publikacijos darbo tema

1. J.Zykevičiūtė, A.Maruška, O.Ragažinskienė „Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

blyškiojoje ežiuolėje (echinacea pallida (nutt.)) spektrofotometriniu metodu.
Gamtos mokslų konferencija „Kur gamta siejasi su mokslu“, Kaunas, 2006 – 05 –
19
2. J.Zykevičiūtė, R.Milašienė, O. Kornyšova, A. Maruška „Evaluation of total amount
of flavonoids in green and black tea by means of spectrophotometric method with
DPPH reaction. Internetional young scientist conference „The vital nature sign“,
Kaunas, 2007 – 05 – 17
3. J. Zykevičiūtė, O. Kornyšova, A. Maruška „Evaluation of total amount of phenolic
compounds, flavonoids and antioxidant activity in medicinal functional teas by
means of the spectrophotometric methods“. Internetional young scientist conference
„The vital nature sign“, Kaunas, 2008 – 05 – 21
4. J. Zykevičiūtė, U. Pyell, O. Kornyšova, A. Maruška „Evaluation of composition and
antioxidant activity of the functional teas extracts“. Internetional young scientist
conference „The vital nature sign“, Kaunas, 2009 – 05 – 23

57