Effects of dietary different

canthaxanthin levels on growth

performance, antioxidant capacity,
biochemical and immune-physiological
parameters of white shrimp (
Litopenaeus Vannamei ) Samia Fawzy
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/effects-of-dietary-different-canthaxanthin-levels-on-gr
owth-performance-antioxidant-capacity-biochemical-and-immune-physiological-param
eters-of-white-shrimp-litopenaeus-vannamei-samia-fawzy/
 Aquaculture 556 (2022) 738276

Contents lists available at ScienceDirect

Aquaculture
journal homepage: www.elsevier.com/locate/aquaculture

Effects of dietary different canthaxanthin levels on growth performance,

antioxidant capacity, biochemical and immune-physiological parameters of
white shrimp (Litopenaeus Vannamei)
Samia Fawzy a, f, 1, Weilong Wang a, b, c, 1, Meiqin Wu d, Ganfeng Yi a, e, Xuxiong Huang a, b, c, *
a
Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, China
b
Shanghai Collaborative Innovation Center for Cultivating Elite Breeds and Green-culture of Aquaculture Animals, Shanghai Ocean University, China
c
National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, China
d
College of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
e
Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd, Beijing 100080, China
f
Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Kafrelsheikh University, Kafrelsheikh, Egypt

A R T I C L E I N F O A B S T R A C T

Keywords: An 8-week feeding trial was conducted to evaluate the effects of different dietary canthaxanthin (CX) levels on
Canthaxanthin growth performance, pigmentation, antioxidant capacity, hemolymph biochemical parameters, immune
Growth performance response, and resistance to hypoxia stress of white shrimp (Litopenaeus vannamei). Juveniles (initial weight 1.15
Pigmentation
± 0.12 g) were fed with five iso‑nitrogenous and isolipidic diets supplemented with/without CX: 0 (control), 50,
Antioxidant
100, 200, and 400 mg kg− 1 diet. Results showed that the growth performance, survival, and feed conversion ratio
Litopenaeus vannamei
improved significantly in CX supplemented treatments compared to the control. The redness of cooked shrimp
tended to increase with increasing CX level; however, no significant difference was observed among the treat­
ments that received CX of more than 100 mg kg− 1. Further, the activities of digestive enzymes, total antioxidant
capacity, and peroxidase increased significantly (P < 0.05), while the activities of glutathione peroxidase,
catalase, and malondialdehyde decreased significantly (P < 0.05) in the hepatopancreas with increasing dietary
CX levels. The immune-related enzymes (alkaline phosphatase, lysozyme, alanine aminotransferase, and
aspartate aminotransferase) and hemolymph biochemical parameters (cholesterol, high-density, and low-density
lipoprotein) are significantly affected by different dietary CX levels. Total carotenoids and astaxanthin contents
in shrimp muscle, shell, head, and whole-body showed an upward trend with the increment of dietary CX. After
exposure to hypoxia stress, juveniles in 200 mg kg− 1 supplementation treatment exhibited the highest LT50 value
among all the treatments. Moreover, broken-line regression analysis indicated that a dose of 173.73 to 202.13
mg kg− 1 of CX was suitable in the diet of L. vannamei as a potential carotenoid source for substituting dietary
astaxanthin in the shrimp feed industry.

1. Introduction
Shrimp has tremendous importance among seafood products due to
the significant economic benefits it yields (Mialhe et al., 2013). White
shrimp (L. vannamei) is a major cultivated species which exhibits rapid
growth rate and tolerance to a wide range of environmental conditions
such as temperature and salinity (Landsman et al., 2019; Li et al., 2017).
Nowadays, intensive shrimp farming is widely practiced to meet the
market demand and generate more profit (Shinji et al., 2019). As a result
of this intensification, shrimp are losing their natural red color and
suffering from “blue disease” (Chien and Jeng, 1992). Unfortunately,
crustaceans do not have the pathway for de novo synthesis of the pig­
ments (Goodwin, 1984). Under such conditions, only the dietary inter­
vention through carotenoids supplementation can maintain the desired
color, improve the product quality and further raise their market price
(Kalinowski et al., 2005; Parisenti et al., 2011). The typical red color of

* Corresponding author at: Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean
University, China.
E-mail address: xxhuang@shou.edu.cn (X. Huang).
1
These authors have contributed equally to this work and share first authorship.

https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2022.738276
Received 3 January 2022; Received in revised form 30 March 2022; Accepted 18 April 2022
Available online 21 April 2022
0044-8486/© 2022 Published by Elsevier B.V.
S. Fawzy et al. Aquaculture 556 (2022) 738276

crustaceans could be obtained by incorporating astaxanthin into their Table 1

diets (Niu et al., 2009; Wade et al., 2017a). Nevertheless, astaxanthin is Formulation and composition of the experimental diets (g kg− 1, dry matter
an expensive carotenoid supplement that leads to a significant increase basis).
in feed costs despite constituting a small portion from their diet (Hansen Ingredients Treatments
et al., 2016). In this regard, several trials have been done to find other Control CX50 CX100 CX200 CX400
carotenoid sources that can come up with results similar to those of
Caseina 425 425 425 425 425
astaxanthin but at lower prices. Ample evidence had proven that
Lysineb 15 15 15 15 15
canthaxanthin (CX) could be as effective as, if not better than, astax­ Methionineb 10 10 10 10 10
anthin in pigmentation of Atlantic salmon (Buttle et al., 2001) and red L-arginineb 20 20 20 20 20
porgy (Kalinowski et al., 2015). Additionally, it has been reported that Fish oila 40 40 40 40 40
shrimp could efficiently utilize dietary synthetic CX and deposit it as Soybean lecithina 30 30 30 30 30
PUFAc 8 8 8 8 8
astaxanthin in their tissues (Yamada et al., 1990). Consequently, CX Cholesterolb 5 5 5 5 5
would be a substrate for astaxanthin, the most abundant carotenoid in Vitamin mixtured 12 12 12 12 12
crustaceans. Mineral mixturee 34.4 34.4 34.4 34.4 34.4
CX (β,β-carotene-4,4′ -dione), also known as red ketocarotenoid, is a a-Starcha 50 50 50 50 50
Sucroseb 50 50 50 50 50
member of xanthophylls and is widely used as a feed additive in aqua­
Glucoseb 50 50 50 50 50
culture (Rebelo et al., 2020). Its market value was estimated at 75 Glucosamine-HClb 8 8 8 8 8
million dollars in 2017 and is expected to hit 85 million dollars by 2024, Sodium citrateb 3 3 3 3 3
with aquaculture and livestock sectors utilizing about 40% of the total Sodium succinateb 3 3 3 3 3
volume (Mussagy et al., 2021). Moreover, synthetic CX is considered the Wheat gluten mealb 55 55 55 55 55
Ca(H2PO4)2a 51.6 51.6 51.6 51.6 51.6
primary dietary source available in the market that could provide suf­ Cellulosea 130 129.5 129 128 126
ficient supply as the natural sources are limited (Pi et al., 2020; Sanchez Canthaxanthinf 0 0.5 1 2 4
et al., 2013). Due to its attractive color and pigmentation property, CX Total 1000 1000 1000 1000 1000
was added predominantly to the diets of Salmon, Rainbow trout (Baker a
Yuehai Feed Group Co., Ltd., Zhejiang, China.
et al., 2002; Buttle et al., 2001), and Penaeus monodon shrimp (Niu et al., b
Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, China.
2012) for their flesh color enhancement. In addition to color improve­ c
PUFA: (eicosapentaenoic acid) EPA 4 g and (docosahexaenoic acid) DHA 4 g,
ment, previous studies have reported multiple benefits for CX, such as Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, China.
growth promotion, antioxidant activities, and immune modulation d
Vitamin mixture (12 g kg− 1 diet) (vitamin A free): p-aminobenzoic acid
properties (Elia et al., 2019; Shahidi and Brown, 1998; Venugopalan 0.092 g; biotin 0.004 g; inositol 3.668 g; nicotinic acid 0.368 g, Ca-pantothenate
et al., 2013). The antioxidative role of carotenoids is closely associated 0.552 g; pyridoxine-HCl 0.112 g; riboflavin 0.072 g; thiamine-HCl 0.036 g;
with improving the resistance of aquatic animals to the stressors during menadione 0.036 g, α-tocopherol 0.184 g; cyanocobalamin 0.0008 g; cholecal­
the culture period (Niu et al., 2009). Oxygen depletion (hypoxia) ciferol 0.012 g; stay-C 1.36 g, folic acid 0.008 g; choline chloride 5.5 g.
e
Mineral mixture (34.38 g kg− 1 diet): C6H10CaO6⋅5H2O, 1.75; K2HPO4, 11.98;
generally results in oxidative stress and increased ROS release, which
MgSO4.7H2O, 12.28; NaH2PO4, 7.04; C6H5O7Fe⋅5H2O, 0.23; CuSO4.5H2O, 0.34;
negatively affects the survival and growth performance of shrimp
ZnSO4⋅7H2O, 0.48; CoCl2, 0.07; MnSO4⋅H2O, 0.21.
(Zhang et al., 2013). It had been reported that the increase in dietary and f
Canthaxanthin: CarophyllⓇ Yellow containing 10% canthaxanthin made by
body carotenoids could alleviate the destructive effects of hypoxia, so DSM Nutrition, Switzerland.
CX as a carotenoid may be effective in such cases (Chien and Shiau,
2005).
premixed and then added to the dry ingredients with continuous mixing.
Therefore, CX, with its numerous properties and relatively low
Subsequently, water (30% of dry ingredients mixture) was added and
market price compared with astaxanthin, may be a potential carotenoid
carefully mixed for another 10 min. Finally, the blend was transferred
source in the shrimp diet. As long as the utilization efficiency differs
into a single-screwed mincer to produce pellets (1.5 mm in diameter).
from one species to another, it was essential to study the effect of dietary
The pellets were then dried in a dryer mechanical convection oven at
CX on L. vannamei. Based on this background, the current study was
35 ◦ C until moisture content was reduced to about 10%. Once the
carried out to investigate the effect of different dietary CX levels on
experimental diets were dried, they were packed and stored at − 20 ◦ C
growth performance, pigmentation, antioxidant activity, immune
until use. The approximate analysis of the diets is shown in Table 2.
response, and resistance to hypoxia stress of L. vannamei. The findings of
the current study would contribute to achieving a cost-effective feed
formulation to control the blue disease of farmed shrimp. 2.2. Shrimp and culture conditions

2. Materials and methods Juvenile white shrimp (L. vannamei) were obtained from

2.1. Diet formulation and preparation

Table 2
Proximate composition (g kg− 1, dry matter basis) of the experimental diets.a
A chemically synthesized pigment (CarophyllⓇ yellow) containing
Parametersa Treatments
10% CX produced by DSM Nutrition, Switzerland, was used as a source
for CX in the current experiment. Five semi-purified pelleted diets were Control CX50 CX100 CX200 CX400
formulated to be iso‑nitrogenous and isolipidic as described in Table 1 Crude Protein 471.20 ± 475.80 ± 473.33 ± 475.33 ± 476.70 ±
and supplemented with different levels of CX (0, 50, 100, 200, 400 mg (CP) 1.45 1.81 0.50 0.98 2.55
kg− 1 of diet). Casein was used as the major protein source. Crystalline Crude Lipid 62.93 ± 61.87 ± 60.27 ± 61.80 ± 60.63 ±
(CL) 3.24 1.63 5.26 5.22 1.64
amino acids were added to meet the amino acid requirement of this 78.57 ± 79.43 ± 80.17 ± 81.00 ± 85.73 ±
species according to Zhou et al. (2012). Fish oil, soybean lecithin, Ash
2.72 0.55 0.63 0.55 2.04
cholesterol, and PUFA were used as the lipid source. The mineral and 49.31 ± 98.86 ± 199.85 ± 398.37 ±
CX (mg kg− 1) NDb
vitamin mixtures were added according to Xie et al. (2012) with slight 0.25 0.11 0.88 0.49
modifications. The diet-making process started with weighing all dry a
Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. CX,
ingredients and mixing thoroughly with a mixer (B10, Rudong, China) canthaxanthin.
for 10–15 min. Lipid ingredients and fat-soluble components were also b
ND: not detected.

2
S. Fawzy et al.
Haixingnong Aquaculture Cooperatives (Shanghai, China). Juveniles
were maintained in a cement pool at 27 ± 0.5 ◦ C and fed the control diet
for two weeks to acclimate to water conditions. After the acclimation, six
hundred juveniles with mean initial weight (1.15 ± 0.12 g) were
selected and randomly distributed into 15 PVC net cages (Length = 1 m,
Width = 1 m, and Height = 1.2 m) fitted inside a cement pond (Length =
10 m, Width = 5 m, and Height = 1.5 m) corresponding to 40 shrimp/
cage. The cement tanks used in the study were provided with a drainage
system and water flow system. Each tank’s water was changed every two
days to two-thirds of its capacity. Each experimental diet was tested in
triplicate in a randomized design. The experiment was carried out in­
door and lasted for 56 days. During this period, juveniles were manually
fed four times per day (7:00, 12:00, 17:00, and 22:00). A fixed feeding
method was applied in which the shrimp were fed at 5–8% of their body
weight. In order to determine the amount of feed required, a weekly
random sampling was done to check the average body weight of shrimp.
The diet was introduced through disk-shaped feeders placed inside the
rearing nets. Therefore, the uneaten feed was kept inside the feeders and
could be easily collected. Three hours after feeding, the uneaten feed
was collected while the fecal matter was siphoned out of the cages. All
uneaten food was freeze-dried to calculate feed intake and feed effi­
ciency ratio. During the experiment, water conditions were measured
everyday: temperature, 29–32 ◦ C; dissolved oxygen concentration, > 5
mg L− 1; ammonia nitrogen, < 0.05 mg L− 1; pH, 8.0–8.5; salinity, 1–2‰.
2.3. Determination of growth performance parameters
At the end of 8 weeks feed trial, all the shrimp were fasted for 24 h,
and the survivors from each cage counted and weighed to evaluate the
growth performance based on the following formulae:
Body weight gain (BWG, %) = [(final weight-initial weight)/initial
weight] × 100.
Specific growth rate (SGR, % day− 1) = [(Ln final weight-Ln initial
weight)/duration] × 100.
Feed conversion ratio (FCR) = dry weight of feed consumed (g)/live
weight gain (g).
Survival (%) = (final number of shrimp/initial number of shrimp) ×
100.
2.4. Sampling techniques
After counting and weighing, 15 shrimp from each treatment (5
shrimp per cage × 3 replicates) were randomly sampled and used to
analyze whole-body composition and carotenoid content. Using a 1-mL
sterile syringe, hemolymph was collected from the ventral sinus of 10
shrimp per cage. Also, the hepatopancreas of 6 shrimp from each cage
were dissected out and collected separately in 5 mL tubes. Hemolymph
and hepatopancreas samples were frozen immediately in liquid nitro­
gen, while whole-body shrimp samples were chilled in ice. Finally, all
samples were transported to the laboratory and stored at − 80 ◦ C until
analysis.
2.5. Determination of biochemical parameters
According to the Association of Official Analytical Chemists, the
proximate composition (crude protein, crude lipid, and ash) of whole
shrimp and experimental diets were determined after freeze-drying and
grinding (AOAC, 2006). Briefly, crude protein was analyzed using the
Kjeldahl method (2300-Autoanalyzer, Foss Tecator, Sweden). Crude
lipid was determined by the ether extraction method using Soxtec Sys­
tem HT (Soxtec System HT6, Sweden). Ash content was determined by
pre-incineration on a hot plate followed by 6 h in a muffle furnace at
550 ◦ C.
For assaying enzymatic activities, serum was obtained from the su­
pernatant by centrifuging the hemolymph at 10000 rpm, 4 ◦ C for 10
min. Parameters including urea, cholesterol, triglycerides, high-density
3
Aquaculture 556 (2022) 738276
lipoprotein (HDL), and low-density lipoprotein (LDL) were measured by
the colorimetric method performed using a chemistry analyzer
(iChem340, China). Serum was also used for the determination of non-
specific immune parameters, including lysozymes (LZM), aspartate
aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT), and alkaline
phosphatase (AKP). All enzymes were assayed using Nanjing Kits
(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China) according to the
instructions of the manufacturer.
Furthermore, hepatopancreas was prepared by homogenization,
dilution with shrimp saline solution and centrifugation at 8000 rpm,
4 ◦ C for 15 min (Wang et al., 2019). Hepatopancreas samples were used
for assaying the activities of antioxidant enzymes, including total anti­
oxidant capacity (T-AOC), peroxidase (POD), glutathione peroxidase
(GSH-Px), Malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), and digestive en­
zymes (protease, lipase, and amylase). Nanjing Kits (Nanjing Jiancheng
Bioengineering Institute, China) were used according to the instructions
of the manufacturer.
2.6. Color reading
The color was assessed using a colorimeter (Chroma Meter CR400,
Konica Minolta Sensing Inc., Osaka, Japan) after putting shrimp samples
into plastic bags and placed into a boiling water bath for 3 min and
cooling in tap water (about 5 ◦ C) (Ju et al., 2011). The color values were
expressed according to CIE L*a*b* color space (Nickell and Bromage,
1998), with L*, a*, and b* representing lightness, redness, and yellowness
of the cooked shrimp, respectively.
2.7. Determination of carotenoid content
Total carotenoid content in the whole-body shrimp, shell (including
carapace, telson, and uropod), muscle, and head tissues (without
hepatopancreas) was quantified spectrophotometrically. Dried and
crushed samples of the whole body (1.5 g), muscle (2 g), shell (1 g), and
head (1 g) were weighed and placed separately into 50 mL poly­
propylene tubes in triplicates. Chloroform was added to the samples,
thoroughly mixed for 10 min, centrifuged at 4 ◦ C at 10000 rpm for 5
min, and stored for 2 h in darkness. This step was repeated three times
until the extract became completely clear. The extracts were collected
and pooled into new tubes, then dried in a vacuum evaporator (Eyela SB
1100, Japan). After that, 8 mL acetone was added to each dried sample.
3 mL of the solution were used for measuring the carotenoid concen­
tration using a spectrophotometer (Puxi T6, China) at 475 nm and E1%
value of 2100 against a blank of acetone (Wang et al., 2021).
The remaining 5 mL were dried by N2 and delivered for Ultra Per­
formance Liquid Chromatography (UPLC, Waters ACQUITY, USA)
analysis after re-dissolving in 2 mL of mobile phase solution (Acetoni­
trile: Methanol, 70:30 v/v). UPLC was equipped with Waters ACQUITY
H-Class BEH C18 column (1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm). The mobile
gradient phase consisted of A (100% dH20), B (Acetonitrile: Methanol,
70:30 v/v), and C (100% methyl tert-butyl ether). Initial ratio of 5% A:
95% B for 16 min, 5% A: 10% B: 85% B for 39 min, then returned to
initial ratio over 4 min at a flow rate of 0.2 mL/min. An ultraviolet-
visible detector set quantified relative amounts of carotenoids to 475
nm by calculating the area under the curve of each peak and it to a
known standard. The standards of astaxanthin, CX, echinenone, zeax­
anthin, and β-carotene were purchased from Sigma-Aldrich (USA), and
the β-cryptoxanthin standard was purchased from CaroteNature (Swit).
Since relatively significant differences were detected in the amount of
free and esterified carotenoids in shrimp tissues, only the free-type ca­
rotenoids were considered and presented in the current study.
2.8. Hypoxia stress resistance test
Fifteen shrimp from each treatment were randomly selected after the
feeding trial and distributed into 5 L white plastic buckets in triplicates
S. Fawzy et al. Aquaculture 556 (2022) 738276

with five shrimp per bucket. Each bucket was filled with the same water
(temperature 28 ◦ C, salinity 1‰, pH 8.2, and DO 1 mg L− 1). DO in the
test buckets was measured using an oxygen meter (HACH HQ30d, USA),
while low DO conditions were maintained by nitrogen gas bubbling.
Shrimp survival was recorded and expressed as LT50 for each hour
during the resistant test. LT50 (the time required for 50% mortality of
tested shrimp by a stressor) was calculated by a regression equation
according to Yokoyama et al. (2005). The equation is as the following:
3.2. Shrimp whole-body composition
The findings of the shrimp whole-body composition analysis are
presented in Table 4. CX50 and CX100 treatments differed significantly (P
< 0.05) from the control in crude protein content. In contrast, dietary CX
feeding did not significantly affect (P > 0.05) the crude lipid and ash
content of the shrimp body.

Y = a X+b 3.3. Body color reading

X = time to individual death of shrimp.
LT50 (X) was obtained when Y = log10 (50) =1.7.
The equation resulted from the plotting of values of log survival
against the time of mortality to determine LT50 for each treatment. The
values obtained from the equation were statistically compared, and the
higher value indicated a greater tolerance to hypoxia stress.
2.9. Statistical analysis
The statistical analyses were performed using SPSS 20.0. All data are
presented as means ± standard error of the mean (S.E.M., n = 3). One-
way analysis of variance was used to test the differences among the
treatments at p-value (P < 0.05), followed by Duncan’s multiple range
test to compare the treatments’ means. The broken-line analysis was
performed using OriginPro 2021. The relationships among parameters
were estimated by Pearson coefficient of correlation, thus visualized by
heatmap of correlation, using ggcorrplot package (ver. 0.1.2.999) and
heatmaply package (ver. 1.3.0) with R version 4.1.2.
The color reading values of cooked shrimp fed different dietary CX
levels are shown in Fig. 1. Shrimp fed with CX-containing diets exhibited
higher (P < 0.05) redness (a*) values than the control treatment, how­
ever, lightness (L*) showed an opposite trend. Further, CX100, CX200, and
CX400 treatments were similar in a* and L* values. Although yellowness
(b*) values were higher in CX fed treatments than in the control, no
significant difference (P > 0.05) was observed among treatments.
3.4. Antioxidant capacity
Dietary manipulation significantly affected the hepatopancreatic
antioxidant parameters of L. vannamei (Table 5). T-AOC showed a sig­
nificant increase (P < 0.05) in shrimp-fed CX-containing diets compared
to those fed the control diet. POD activity showed a similar trend, but
CX400 treatment did not exhibit a significant difference with the control
treatment. On the contrary, GSH-Px, MDA, and CAT levels decreased
significantly in CX supplemented treatments (P < 0.05) compared to the
control treatment.

2.10. Ethical statement 3.5. Hemolymph biochemical and hemato-immunological parameters

The present experimental procedures were carried out in strict The immunological parameters in the hemolymph of L. vannamei fed
accordance with the recommendations in the ethical guidelines of EU with different CX levels were represented in Table 6. The findings
Directive 2010/63/EU for animal experiments. cleared that the AKP and LZM activities tended to increase markedly (P
< 0.05) when dietary CX levels increased, while AST and ALT showed an
3. Results opposite trend. However, a higher dose of CX (400 mg kg− 1) caused
neither a further significant increase in AKP and LZM nor a significant
3.1. Growth performance parameters and feed utilization decrease in AST and ALT.
The results of hemolymph biochemical parameters of the studied
Growth performance (FBW, BWG, and SGR), FCR, and the survival shrimp are shown in Table 7. The findings showed that with increasing
rate of shrimp fed with experimental diets are given in Table 3. The dietary CX levels, cholesterol showed a significant decreasing trend
results indicated that all the parameters as mentioned above improved compared to the control treatment (P < 0.05). The lowest levels of HDL,
significantly in shrimp fed with CX supplemented diets compared to LDL, and TP were observed in the control treatment, which significantly
those fed the control diet (P < 0.05). CX400 treatment had the lowest differs (P < 0.05) from the higher CX supplemented treatments (CX200
FBW, BWG, and SGR among CX supplemented treatments, while there and CX400). In contrast, the parameters of triglycerides and urea in
was no significant difference (P > 0.05) in survival among them. experimental treatments did not show a significant difference (P > 0.05)
among all the treatments.
Table 3
Growth parameters and nutrient utilization of Litopenaeus vannamei fed the 3.6. Digestive enzymes activities
experimental diets for 56 days.
Parametersa Treatments The effect of dietary CX on digestive enzymes activities is shown in
Control CX50 CX100 CX200 CX400
Table 4
7.67 ± 9.21 ± 9.38 ± 9.62 ± 8.57 ±
FBW (g) Whole-body proximate analysis (g kg− 1, dry matter basis) of Litopenaeus van­
0.28a 0.11c 0.14c 0.14c 0.17b
SGR (% 3.64 ± 3.97 ± 3.99 ± 4.04 ± 3.84 ± namei fed with experimental diets for 56 days.
day− 1) 0.06a 0.02c 0.02c 0.02c 0.03b Parametersa Treatments
667.35 ± 821.33 ± 837.52 ± 861.96 ± 757.12 ±
BWG (%) Control CX50 CX100 CX200 CX400
28.94a 11.04c 14.35c 14.54c 17.12b
1.63 ± 1.36 ± 1.49 ± 1.44 ± 1.31 ± Crude Protein 767.60 ± 780.93 ± 792.73 ± 771.26 ± 767.63 ±
FCR
0.03c 0.03a 0.02b 0.03ab 0.05a (CP) 4.73a 4.87b 0.69c 1.93ab 2.70a
86.67 ± 95.83 ± 95.00 ± 97.50 ± 96.67 ± Crude Lipid 56.36 ± 54.17 ± 54.63 ± 53.17 ± 53.07 ±
Survival (%)
3.63a 2.20b 1.44b 1.44b 2.20b (CL) 4.78 0.46 2.33 3.26 0.68
a 122.27 ± 115.93 ± 124.87 ± 119.43 ± 125.47 ±
FBW, final body weight; FCR, feed conversion ratio; BWG, body weight gain; Ash
2.04 1.68 1.28 3.33 2.94
SGR, specific growth rate. Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate
a
groups. Mean values in the same row with different letters are significantly Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. Mean values in
different (P < 0.05). the same row with different letters are significantly different (P < 0.05).

4
S. Fawzy et al. Aquaculture 556 (2022) 738276

Table 7
Effect of dietary different canthaxanthin levels on hemolymph biochemical pa­
rameters of Litopenaeus vannamei.
Parametersa Treatments

Control CX50 CX100 CX200 CX400

HDL (mmol 0.07 ± 0.10 ± 0.09 ± 0.12 ± 0.11 ±

L− 1) 0.01a 0.01abc 0.01ab 0.01c 0.01bc
LDL (mmol 0.25 ± 0.29 ± 0.29 ± 0.42 ± 0.37 ±
L− 1) 0.02a 0.01a 0.02a 0.02b 0.01b
CHO (mmol 2.51 ± 2.41 ± 2.01 ± 1.33 ± 0.78 ±
L− 1) 0.31c 0.36bc 0.29b 0.29ab 0.17a
TG (mmol 0.45 ± 0.51 ± 0.43 ± 0.48 ± 0.46 ±
L− 1) 0.01 0.02 0.02 0.03 0.01
46.90 ± 54.14 ± 59.20 ± 60.46 ± 52.25 ±
TP (g L− 1)
Fig. 1. Color parameters of cooked whole-body shrimp fed with different levels 0.45a 0.74b 1.34c 0.89c 0.41b
of canthaxanthin for 56 days. Data were expressed as mean ± S.E.M from Urea (mmol 7.86 ± 7.58 ± 7.31 ± 7.27 ± 7.07 ±
triplicate groups. Bars with different letters represented significant differences L− 1) 0.19 0.35 0.38 0.26 0.59
between various treatments (P < 0.05). a
Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. Mean values in
the same row with different letters are significantly different (P < 0.05). HDL,
high-density lipoprotein; LDL, low-density lipoprotein; CHO, cholesterol; TG,
Table 5 triglycerides; TP, total protein.
Effect of dietary different canthaxanthin levels on hepatopancreatic antioxidant
statuses of Litopenaeus vannamei.
Parametersa Treatments

Control CX50 CX100 CX200 CX400

T-AOC (mmol 0.07 ± 0.20 ± 0.20 ± 0.17 ± 0.16 ±

mg− 1 protein) 0.01a 0.01c 0.01c 0.01b 0.01b
POD (U mg− 1 0.37 ± 0.49 ± 0.50 ± 0.43 ± 0.39 ±
protein) 0.01a 0.01c 0.01c 0.01b 0.02a
GSH-Px (U mg− 1 8.07 ± 6.85 ± 6.74 ± 5.12 ± 5.34 ±
protein) 0.33c 0.20b 0.35b 0.37a 0.40a
MDA (nmol mg− 1 0.28 ± 0.20 ± 0.17 ± 0.12 ± 0.18 ±
protein) 0.01d 0.01c 0.01b 0.01a 0.01b
CAT (U mg− 1 1.30 ± 1.03 ± 0.74 ± 0.69 ± 0.87 ±
protein) 0.02c 0.07b 0.06a 0.05a 0.07ab
a
Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. Mean values in
the same row with different letters are significantly different (P < 0.05). T-AOC, Fig. 2. Effect of dietary different canthaxanthin levels on digestive enzymes
total antioxidant capacity; POD, peroxidase; GSH-Px, glutathione peroxidase; activities in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei. Data were expressed as
MDA, malondialdehyde. CAT: catalase. mean ± S.E.M from triplicate groups. Bars with different letters represented
significant differences between various treatments (P < 0.05).

Table 6
Effect of dietary different canthaxanthin levels on hemato-immunological pa­ with experimental diets for 56 days are shown in Fig. 3. With increasing
rameters of Litopenaeus vannamei. the dietary CX levels, the total carotenoid content in different tissues
significantly increased (P < 0.05). The highest carotenoid content in the
Parametersa Treatments
muscle, head, shell, and whole-body was observed in shrimp fed with
Control CX50 CX100 CX200 CX400 400 mg kg− 1 CX. Meanwhile, the lowest content was found in the control
AKP (U 100 2.65 ± 3.64 ± 4.03 ± 4.79 ± 4.29 ± treatment.
mL− 1) 0.33a 0.33b 0.15bc 0.27c 0.16bc The profile of carotenoids in various tissues of L. vannamei (muscle,
30.70 ± 27.71 ± 24.88 ± 20.93 ± 23.07 ±
AST (U L− 1) shell, head, and whole-body) analyzed by UPLC was given in Table 8.
0.88d 0.83c 0.79b 0.72a 0.43a
103.25 ± 95.12 ± 88.92 ± 70.09 ± 81.74 ±
ALT (U L− 1)
3.73d 2.07c 1.32bc 2.46a 0.42b
LZM (U 83.33 ± 115.38 ± 147.44 ± 224.36 ± 160.26 ±
mL− 1) 6.41a 11.10ab 6.41bc 6.41d 16.95c
a
Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. Mean values in
the same row with different letters are significantly different (P < 0.05). AKP,
alkaline phosphatase; AST, aspartate aminotransferase; ALT, Alanine amino­
transferase; LZM, lysozyme.

Fig. 2. It was observed that the dietary CX inclusion significantly (P <

0.05) affected the activities of digestive enzymes in shrimp hepatopan­
creas. The highest (P < 0.05) protease and lipase activities were detected
in CX200 treatment, while amylase was detected in the CX400 treatment.
The control treatment had the lowest levels (P < 0.05) of the three
enzymes.
Fig. 3. Effect of different dietary canthaxanthin levels on total carotenoid
content in different tissues of Litopenaeus vannamei. Data were expressed as
3.7. Carotenoid contents mean ± S.E.M from triplicate groups. Bars with different letters represented
significant differences between various treatments (P < 0.05). TC,
The total carotenoid contents of different tissues of L. vannamei fed total carotenoid.

5
S. Fawzy et al. Aquaculture 556 (2022) 738276

Table 8 (P > 0.05) from CX100 and CX200 treatments in the head. Relative to
Effect of dietary canthaxanthin levels on carotenoids composition in tissues (μg astaxanthin concentration, CX content in L. vannamei tissues was lower.
g− 1) of Litopenaeus vannamei.
Tissue CDa Treatments 3.8. Quantification of optimum dietary CX level for L. vannamei
Control CX50 CX100 CX200 CX400
Fig. 4 presented the findings obtained after performing the broken-
Muscle
line regression analysis to determine the optimum dietary CX levels.
0.12 ± 0.14 ± 0.26 ± 0.37 ± 0.42 ±
Astaxanthin
0.01a 0.02a 0.01b 0.01b 0.04c The analysis was based on SGR, survival, a* (redness), protease, MDA,
0.003 ± 0.004 ± 0.009 ± 0.011 ± 0.013 ± AST, lysozyme, and LT50. These parameters figured out that the optimal
Canthaxanthin
0.001a 0.001a 0.001b 0.001c 0.001c dietary CX levels were 177.42, 173.72, 180.40, 193.71, 188.14, 200.30,
0.005 ± 0.005 ± 0.008 ± 0.013 ± 0.012 ± 202.13, and 198.76 mg kg− 1 diet, respectively.
Zeaxanthin
0.001a 0.001a 0.001b 0.001c 0.001c
0.04 ± 0.04 ± 0.05 ± 0.08 ± 0.10 ±
β-cryptoxanthin
0.01a 0.01a 0.01a 0.01b 0.01c 3.9. Hypoxia stress resistance test
0.06 ± 0.07 ± 0.08 ± 0.15 ± 0.17 ±
Echinenone
0.01a 0.01a 0.01a 0.01b 0.01b After exposure to low DO stress, the time required for the death of
0.09 ± 0.15 ± 0.18 ± 0.23 ± 0.31 ±
β-Carotene 50% of the stressed shrimp (LT50) was calculated and presented in Fig. 5.
0.01a 0.01b 0.01b 0.02c 0.02d
LT50 values were significantly (P < 0.05) influenced by the dietary in­
clusion of CX. The maximum LT50 value was observed in the CX200
Head
2.10 ± 4.17 ± 5.46 ± 6.60 ± 6.88 ±
treatment with significant differences from the other treatments, while
Astaxanthin the minimum value was given by the control treatment (P < 0.05).
0.25a 0.04b 0.65bc 0.26c 0.90c
0.07 ± 0.08 ± 0.05 ± 0.06 ± Further, no significant difference was observed in LT50 between CX100
Canthaxanthin ND
0.01bc 0.01c 0.01b 0.01bc and CX400 treatments.
0.06 ± 0.08 ± 0.09 ± 0.12 ± 0.12 ±
Zeaxanthin
0.01a 0.02ab 0.01ab 0.03b 0.01b
0.62 ± 0.80 ± 1.05 ± 0.86 ± 0.66 ± 3.10. Person correlation analysis
β-Cryptoxanthin
0.12 0.20 0.43 0.22 0.06

Echinenone
0.86 ± 1.17 ± 1.48 ± 1.13 ± 1.50 ± A heat map visualization was used to present the correlation asso­
0.18 0.24 0.47 0.27 0.32 ciation between the carotenoid composition in shrimp whole body
0.87 ± 1.13 ± 0.81 ± 1.11 ± 1.83 ±
β-Carotene
0.08a 0.12ab 0.05a 0.04ab 0.19b
(Fig. 6) and whole-body carotenoids with biochemical and immune-
physiological parameters (Fig. 7). The results indicated significant and
positive associations between carotenoids in shrimp whole body and
Shell
2.56 ± 3.39 ± 3.35 ± 4.08 ± 5.48 ± amylase, a* (redness), AKP, LT50, LDL, and HDL. While, ALT, AST, L*, CL,
Astaxanthin
0.22a 0.42ab 0.43ab 0.20b 0.12c GSH-Px, Urea, and CHO showed an opposite pattern.
0.30 ± 0.54 ± 0.68 ± 0.78 ± 1.08 ±
Canthaxanthin
0.02a 0.05b 0.02c 0.03c 0.02d 4. Discussion
0.10 ± 0.18 ± 0.22 ± 0.23 ± 0.30 ±
Zeaxanthin
0.01a 0.02b 0.01b 0.02b 0.01c
1.26 ± 1.63 ± 1.77 ± 1.80 ± 2.74 ± Carotenoid pigments are multi-functional feed additives. They are
added to the diets of aquatic animals, essentially for improving their
β-Cryptoxanthin
0.10a 0.18ab 0.06b 0.12b 0.11c

Echinenone
1.65 ± 3.02 ± 3.06 ± 3.76 ± 5.03 ± organoleptic properties (De Carvalho and Caramujo, 2017; Pereira da
0.21a 0.18b 0.41b 0.23b 0.01c
Costa and Campos Miranda-Filho, 2020) and consequently providing
2.77 ± 3.88 ± 4.07 ± 4.31 ± 5.07 ±
β-Carotene
0.15a 0.36ab 0.34b 0.25b 0.54b better market prices (Parisenti et al., 2011). Moreover, carotenoids were
recognized to perform many physiological and metabolic functions with
evidence for their beneficial effects on physical performance (Man­
Whole body
0.54 ± 0.99 ± 1.39 ± 1.64 ± 2.13 ± ikandan et al., 2020; Wade et al., 2017b). Our results indicated that
Astaxanthin
0.05a 0.04b 0.10c 0.02d 0.02e dietary inclusion of CX dramatically improved growth performance,
Canthaxanthin
0.05 ± 0.17 ± 0.21 ± 0.30 ± 0.34 ± enhanced survival, and decreased the FCR of Litopenaeus vannamei. The
0.01a 0.01b 0.01b 0.01c 0.03c
results were consistent with the previous studies on giant tiger shrimp
0.04 ± 0.08 ± 0.10 ± 0.12 ± 0.15 ±
Zeaxanthin
0.01a 0.01b 0.01bc 0.01c 0.01d
(P. monodon) fed with CX supplemented diet (Niu et al., 2012), oriental
0.42 ± 0.47 ± 0.57 ± 0.81 ± 0.84 ± river prawn (Macrobrachium nipponense) fed with lutein supplemented
β-Cryptoxanthin
0.06a 0.03a 0.04a 0.07b 0.06b diet (Ettefaghdoost and Haghighi, 2021); and swamp crayfish, Pro­
0.66 ± 0.76 ± 0.94 ± 1.18 ± 1.34 ± cambarus clarkii (Cheng and Wu, 2019), L. vannamei (Flores et al., 2007;
Echinenone
0.10a 0.08a 0.16ab 0.10bc 0.12c
Liu et al., 2018; Wang et al., 2020), and kuruma shrimp, Marsupenaeus
0.58 ± 0.65 ± 0.84 ± 0.98 ± 1.22 ±
β-Carotene
0.02a 0.03ab 0.01b 0.01b 0.02c japonicas (Wang et al., 2018a) fed with astaxanthin supplemented diets.
a
Furthermore, the studies carried out on a variety of fish species showed
Data were expressed as mean ± S.E.M from triplicate groups. Mean values in
that dietary CX supplementation could boost the growth and survival of
the same row with different letters are significantly different (P < 0.05). CD,
Lake Kurumoi rainbowfish, Melanotaenia parva (Allen) (Meilisza et al.,
carotenoids.
2017), Atlantic salmon (Torrissen, 1984), and red porgy, Pagrus pagrus
(Kalinowski et al., 2015).
Astaxanthin, CX, zeaxanthin, β-cryptoxanthin, echinenone, and β-caro­
The growth-promoting role of carotenoids such as CX could be
tene were detected as the main carotenoids in the tissues of L. vannamei.
related to their capability on activating digestion and metabolism (Amar
The six carotenoids mentioned above were significantly (P < 0.05)
et al., 2001), shortening the molting cycles intervals (Petit et al., 1997),
affected by the dietary manipulation and showed increasing trends in
inhibition of nicotinamide adenine dinucleotide phosphoric acid
different tissues by increasing dietary CX supplementation. The most
(NADPH) reductase, decreasing energy consumption, and further pro­
abundant carotenoid accumulated in various tissues was astaxanthin.
moting the biosynthesis and growth (Ohno et al., 2011) in aquatic ani­
The highest astaxanthin content in all tissues was given by CX400
mals. Additionally, the higher survival rate of shrimp fed with CX
treatment, which was significantly different (P < 0.05) from other
supplemented diets could be associated with the superior antioxidant
treatments in muscle, shell, and whole-body but did not differ markedly
activity of carotenoids which ameliorates the effect of stressors and

6
S. Fawzy et al. Aquaculture 556 (2022) 738276

Fig. 4. Broken-line analysis of optimal dietary CX levels based on SGR, survival, a* (redness), protease, MDA, AST, lysozyme, and LT50.

7
S. Fawzy et al.
Fig. 5. Time to 50% mortality (h) after exposure to hypoxia stress tolerance of
Litopenaeus vannamei fed with different levels of canthaxanthin for 56 days.
Data were expressed as mean ± S.E.M. from triplicate groups. Bars with
different letters represented significant differences between various treatments
(P < 0.05).
Fig. 6. The correlation heatmap characterizes the Pearson correlation co­
efficients (r) between the carotenoid composition in shrimp whole body. The
red bar means the positive correlation, while the blue bar means the negative
correlation. Moderate correlation was defined following (0.5 < |r| < 0.8) and
high correlation (0.8 < |r| < 1), respectively. (For interpretation of the refer­
ences to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of
this article.)
prolongs the shrimp life (Cheng and Wu, 2019; Niu et al., 2012). Wade
et al. (2017a) demonstrated that carotenoid supplementation could
improve only the weight gain but not the survival of P. monodon.
Moreover, other counterpart studies on kuruma shrimp Penaeus japoni­
cus (Yamada et al., 1990), P. monodon (Boonyaratpalin et al., 2001),
tropical spiny lobster Panulirus ornatus (Barclay et al., 2006), L. vannamei
(Ju et al., 2011) and Chinese mitten crab Eriocheir sinensis (Jiang et al.,
2020) indicated that the growth and survival were similar regardless of
addition or omission of dietary carotenoids. The dissimilarity of these
studies with ours could be attributed to the variations in diet composi­
tion, culture conditions, state of animal health, species-specific carot­
enoid requirements, source of carotenoid supplement, and the initial
carotenoid level in shrimp (Chien and Jeng, 1992; Wade et al., 2017b).
In the aquaculture industry, dietary carotenoid additives constitute
about 15–20% of the salmon feed cost (Forsberg and Guttormsen, 2006),
which dramatically increase the total production costs of some aquatic
animals (Hansen et al., 2016). Therefore, it was necessary to determine
8
Aquaculture 556 (2022) 738276
Fig. 7. The heatmap characterizes the Pearson correlation coefficients (r) be­
tween the whole-body carotenoids with other measured parameters in the
current study. The blue bar suggests that the whole-body carotenoids positively
correlate with the other parameters, while the orange bar means the negative
correlation. The asterisk (* and **) indicates P < 0.05 and P < 0.01, respectively.
Moderate correlation was defined following (0.5 < |r| < 0.8) and high corre­
lation (0.8 < |r| < 1), respectively. (For interpretation of the references to color
in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
the optimum CX level for better physical performance. In such a way,
only the requirements of the species will be provided, wastage will be
avoided, and the feed cost will be maintained.
One of the most critical indicators for the nutritive value of the
cultured species is the proximate composition (Shao et al., 2014). Ac­
cording to Kawamura et al. (2020), carotenoids intake could stimulate
protein synthesis leading to an increase in protein content and muscle
mass. This agrees with our study where the protein content in the body
of shrimp fed CX-containing diets was significantly higher than that fed
the control diet, which was reflected by the growth performance. A
similar finding was observed for P. monodon (Niu et al., 2014) and
E. sinensis (Long et al., 2017). The authors suggested that the efficiency
of carotenoids in reducing oxidative stress and hence, energy expendi­
ture is possibly the cause for the elevation of protein concentration.
CX has been reported to have potent antioxidant and immune
modulation properties (Venugopalan et al., 2013). T-AOC is an essential
index for both enzymatic and non-enzymatic antioxidant activities, and
its higher value indicates an improved antioxidant capacity. The current
study revealed that CX feeding significantly increased T-AOC compared
to the control diet. This is in the line of findings on P. monodon (Niu
et al., 2012) and O. mykiss (Cui et al., 2009; Elia et al., 2019). The au­
thors concluded that the antioxidant activity was greatly enhanced after
feeding a diet supplemented with CX compared to CX-free diet. POD, a
pivotal antioxidant enzyme, also increased in the current study with
increasing dietary CX supplementation which is similar to the finding of
Long et al. (2017) on E. sinensis. Another major enzyme in the antioxi­
dant defense system, CAT, acts as a scavenger for hydrogen peroxide
(H2O2) and catalyzes its decomposition into molecular oxygen and
water to protect the cell from oxidative damage (Chien et al., 2003;
Ighodaro and Akinloye, 2018). In the current study, CAT activity
decreased significantly by increasing the dietary CX levels. Similar
findings were observed on astaxanthin fed L. vannamei (Zhang et al.,
2013), P. monodon (Niu et al., 2014), Oncorhynchus mykiss (Rahman
et al., 2016), and lutein fed M. nipponense (Ettefaghdoost and Haghighi,
2021). The GSH-Px enzyme also participates in the removal of H2O2. Its
decreasing activity in CX supplemented treatments compared to the
control treatment indicates that higher cell protection was provided by
CX as reported on yellow perch, Perca flavescens (El-Gawad et al., 2019),
and characins, Hyphessobrycon callistus (Wang et al., 2006). Addition­
ally, Pearson correlation analysis indicated that GSH-Px activity was
S. Fawzy et al.
significantly and positively reflected by carotenoid level in shrimp body
(Fig. 7). These authors suggested that carotenoid pigments, including
CX, have a vigorous O2 quenching activity. Therefore, they could
effectively neutralize and remove the free radicals and hence, lower the
need to produce endogenous antioxidant enzymes like CAT and the
GSH-Px, which is consistent with the findings of the current study.
Further, increased CX supplementation level resulted in a significant
decrease in MDA level in L. vannamei. According to Munoz et al. (2000),
MDA level reflects the degree of cellular damage and lipid peroxidation.
So, the decreased MDA level in our study indicates CX’s effective role in
the inhibition of lipid peroxidation and protection of the cell against free
radicals (Sahin et al., 2014). Combining these data, the efficient anti­
oxidant properties of CX can be concluded.
It is well-known that shrimp, as a crustacean, rely entirely on the
innate immune system to defend themselves against the invading
pathogens (Zhao et al., 2009). Innate immunity includes two main
components, the cellular and humoral immune responses. Hemocytes
are the critical element that mediates cellular immunity and are
involved in the secretion of various humoral components in the hemo­
lymph (Li and Xiang, 2013; Liu et al., 2020). In this respect, non-specific
immune biomarkers (AKP, AST, ALT, and lysozyme) in the serum were
used to evaluate the immune response of L. vannamei after feeding with
CX. AKP is a pivotal regulatory enzyme that participates in phosphory­
lation and dephosphorylation processes in organisms and its role in
improving the absorption and utilization of nutrients in shrimp. Lyso­
zyme is another important index of non-specific immunity in crusta­
ceans due to its function as a potent killer for Gram-positive bacteria
(Wang et al., 2018c). The activity of lysozyme points out an enhance­
ment of the immune response of aquatic animals. The results of the
current study showed that the activities of AKP and lysozyme signifi­
cantly increased in shrimp fed with CX supplemented diets compared to
those fed the control diet. Our findings were in agreement with the
studies carried out on P. clarkii (Cheng and Wu, 2019), E. sinensis (Jiang
et al., 2020), and crucian carp, Carassius auratus (Wu and Xu, 2021). The
similarity between the present and the previous studies clarifies that CX,
like other carotenoids, exerts a significant role in improving the non-
specific immunity of shrimp. Given the vital role of AST and ALT en­
zymes in protein metabolism, they are widely used to evaluate the
health status of aquatic animals (Haque et al., 2021). The activities of
these enzymes in serum reflect the physiological status of hep­
atopancreatic cells because their higher levels in hemolymph indicate
severe damage and increased leakage of hepatopancreatic cells (Ette­
faghdoost and Haghighi, 2021; Mohankumar and Ramasamy, 2006).
The current study demonstrated that shrimp fed with CX exhibited
reduced levels of AST and ALT in comparison to those fed the control
diet. Similarly, Ettefaghdoost and Haghighi (2021), Lim et al. (2017),
and Niu et al. (2012) demonstrated that carotenoids supplementation
significantly decreased the activities of AST and ALT in the serum of
shrimp. Combining the results, dietary CX could be a beneficial immu­
nostimulant for enhancing the health status of the studied shrimp.
Hepatopancreas is the primary digestive gland in shrimp. It combines
the functions of the intestine, liver, and pancreas, taking part in the
synthesis of digestive enzymes, absorption of nutrients, and their
metabolism (Vogt, 2019). Therefore, the hepatopancreatic digestive
enzymes were used as indicators for nutritional physiology in the
studied shrimp. Evaluation of digestive enzymes activities gives an
indication about the digestion processes and nutrient utilization effi­
ciency, which is reflected by the growth of aquatic animals (Abolfathi
et al., 2012; Lovett and Felder, 1990). Lutein, a carotenoid pigment, had
been reported to significantly increase the activities of the digestive
enzymes of M. nipponense (Ettefaghdoost and Haghighi, 2021). Likewise,
Wang et al. (2018b) noticed an improvement in the activities of diges­
tive enzymes in kuruma shrimp, M. japonicus after feeding astaxanthin
added diet. Similarly, our findings revealed that the dietary incorpora­
tion of CX markedly increased protease, amylase, and lipase activities
more than CX-free diet. Together with the previous reports, these
9
Aquaculture 556 (2022) 738276
findings support the positive role of carotenoids in enhancing the
digestion process and nutrient utilization, which probably explains the
better growth performance of shrimp in the treatments received CX
compared to those in the control treatment.
Due to the disability to synthesize carotenoids de novo, L. vannamei
and other crustaceans mainly depend on the dietary carotenoids to ac­
quire the attractive reddish coloration (Goodwin, 1984; Wade et al.,
2017b). Moreover, the color of crustaceans’ bodies is determined by
factors such as the concentration and composition of carotenoids, spe­
cies, and environmental conditions (Long et al., 2017; Niu et al., 2012).
Our results clearly indicated that the total carotenoids and astaxanthin
contents in the shell, muscle, head, and whole body of L. vannamei
increased significantly and positively with increasing dietary CX levels
(Fig. 6). Deposition of CX primarily in the form of astaxanthin supports
the findings on P. japonicus (Yamada et al., 1990) and P. monodon
(Boonyaratpalin et al., 2001), which implied that crustaceans could
transform or modify the pigments precursors like CX into astaxanthin
and accumulate them in different tissues. Jiang et al. (2020) also stated
that the red color is related to astaxanthin content in the exoskeleton of
E. sinensis. Consistent with this report, Pearson correlation analysis
indicated that the redness (a*) value of cooked shrimp in treatment
received CX was significantly and positively affected by astaxanthin
levels in shrimp body in the current study (Fig. 7). Additionally, CX had
been proved to be as effective as astaxanthin in the pigmentation of
Atlantic salmon (Buttle et al., 2001). On the contrary, the L* value of
cooked shrimp showed a decreasing trend with increasing dietary CX,
and it was also found that carotenoids included in diets decreased the
lightness of red king crab, Paralithodes camtschaticus (Daly et al., 2013),
and red porgy, P. pagrus (Kalinowski et al., 2005). The results confer that
L. vannamei could utilize the dietary CX effectively to improve their red
appeal and other biological functions. One more observation is that the
lowest total carotenoids and astaxanthin contents were observed in
muscle tissue which is consistent with the findings reported earlier (Niu
et al., 2012). Nevertheless, the carotenoid deposition in muscle is
beneficial for the consumer’s health since carotenoids are effective an­
tioxidants besides having other properties that make them an essential
human food supplement (De Carvalho and Caramujo, 2017).
Shrimp culture under an intensive system is constantly subjected to
different environmental stressors such as hypoxia (Chien and Shiau,
2005) that can arise from temperature fluctuations or the formation of
algal blooms due to the presence of organic pollutants (Belão et al.,
2011). Hypoxia causes significant economic losses and is considered a
threat to productivity due to its negative impact on shrimp survival
(Diaz and Rosenberg, 2011). Previous studies showed that the
enhancement of resistance in penaeid shrimp to hypoxia stress is closely
related to dietary carotenoids uptake (Niu et al., 2012; Niu et al., 2009).
Moreover, a positive correlation was detected between the improvement
of shrimp resistance to stressors and pigment concentration in the diet
and tissue (Chien et al., 2003). Similarly, in the current study, LT50
values increased with increasing dietary CX levels, with the maximum
values observed for the shrimp-fed diets containing the higher CX levels
(200 and 400 mg kg− 1). Therefore, it can be concluded that dietary CX
pigment could enhance the resistance of the studied shrimp against
hypoxia stress and prolong its life, as reported by Chien et al. (1999) and
Niu et al. (2012) on P. monodon, and Zhang et al. (2013) on L. vannamei.
This is probably associated with the antioxidant property of carotenoids
(Table 5), which is closely linked to stress resistance (Niu et al., 2014).
They play a vital role in protecting sensitive structures of the cell from
oxidative damage, which is reflected by an increase in shrimp survival.
5. Conclusion
Overall, the findings of the current study revealed that supplemen­
tation of the diet with CX in the range of 173.73 to 202.13 mg kg− 1 is of
primary importance to shrimp growth performance and health status.
Therefore, with its numerous properties and relatively low market price,
S. Fawzy et al.
antioxidant and metabolic conversion characters, CX could be a poten­
tial astaxanthin precursor in the diet of L. vannamei.
Credit author statement
Weilong Wang finished the data analysis and worked on paper
revision; Fawzy Samia finished the biochemical analysis and drafted the
manuscript; Meiqin Wu put forward relevant experimental guidance;
Ganfeng Yi and Xuxiong Huang designed the research. All authors read
and gave final approval of the manuscript.
Declaration of Competing Interest
The authors have no conflict of interest to declare.
Acknowledgments
The work was supported by the Shanghai Agriculture Applied
Technology Development Program, China (No.
202102080012F00761); National Science Foundation of China
(31902385); Chinese Postdoctoral Science Foundation (219724);
Shanghai Collaborative Innovation Center for Cultivating Elite Breeds
and Green-culture of Aquaculture Animals, Key Laboratory of Aquatic
Functional Feed and Environmental Regulation of Fujian Province Open
Project (FACE20200001); and China Scholarship Council (CSC) sup­
ported this research through a Ph.D scholarship (No.2018 GBJ008472).
References
Abolfathi, M., Hajimoradloo, A., Ghorbani, R., Zamani, A., 2012. Effect of starvation and
refeeding on digestive enzyme activities in juvenile roach, Rutilus rutilus caspicus.
Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 161, 166–173.
Amar, E.C., Kiron, V., Satoh, S., Watanabe, T., 2001. Influence of various dietary
synthetic carotenoids on bio-defence mechanisms in rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss (Walbaum). Aquac. Res. 32, 162–173.
Association of Official Analytical Chemists (AOAC), 2006. Official Methods of Analysis,
Eighteenth ed. AOAC, Arlington, VA.
Baker, R., Pfeiffer, A.M., Schöner, F.J., Smith-Lemmon, L., 2002. Pigmenting efficacy of
astaxanthin and canthaxanthin in fresh-water reared Atlantic salmon, Salmo salar.
Anim. Feed Sci. Technol. 99, 97–106.
Barclay, M., Irvin, S., Williams, K., Smith, D., 2006. Comparison of diets for the tropical
spiny lobster Panulirus ornatus: astaxanthin-supplemented feeds and mussel flesh.
Aquac. Nutr. 12, 117–125.
Belão, T., Leite, C., Florindo, L., Kalinin, A., Rantin, F., 2011. Cardiorespiratory responses
to hypoxia in the African catfish, Clarias gariepinus (Burchell 1822), an air-breathing
fish. J. Comp. Physiol. B. 181, 905–916.
Boonyaratpalin, M., Thongrod, S., Supamattaya, K., Britton, G., Schlipalius, L., 2001.
Effects of β-carotene source, Dunaliella salina, and astaxanthin on pigmentation,
growth, survival and health of Penaeus monodon. Aquac. Res. 32, 182–190.
Buttle, L., Crampton, V., Williams, P., 2001. The effect of feed pigment type on flesh
pigment deposition and colour in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L. Aquac. Res.
32, 103–111.
Cheng, Y., Wu, S., 2019. Effect of dietary astaxanthin on the growth performance and
nonspecific immunity of red swamp crayfish Procambarus clarkii. Aquaculture. 512,
734341.
Chien, Y.H., Jeng, S.C., 1992. Pigmentation of kuruma prawn, Penaeus japonicus bate, by
various pigment sources and levels and feeding regimes. Aquaculture. 102, 333–346.
Chien, Y.H., Shiau, W.C., 2005. The effects of dietary supplementation of algae and
synthetic astaxanthin on body astaxanthin, survival, growth, and low dissolved
oxygen stress resistance of kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus bate. J. Exp. Mar.
Biol. Ecol. 318, 201–211.
Chien, Y.H., Chen, I.M., Pan, C.H., Kurmaly, K., 1999. Oxygen depletion stress on
mortality and lethal course of juvenile tiger prawn Penaeus monodon fed high level of
dietary astaxanthin. J. Fish. Soc. Taiwan 26, 85–93.
Chien, Y.H., Pan, C.H., Hunter, B., 2003. The resistance to physical stresses by Penaeus
monodon juveniles fed diets supplemented with astaxanthin. Aquaculture. 216,
177–191.
Cui, W., Leng, X., Li, X., Li, X., Xu, J., 2009. Effects of astaxanthin and canthaxanthin on
pigmentation of muscle and total antioxidant capacity of liver in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). J. Fish. China 33, 987–995.
Daly, B., Swingle, J., Eckert, G., 2013. Dietary astaxanthin supplementation for hatchery-
cultured red king crab, Paralithodes camtschaticus, juveniles. Aquac. Nutr. 19,
312–320.
De Carvalho, C.C., Caramujo, M.J., 2017. Carotenoids in aquatic ecosystems and
aquaculture: a colorful business with implications for human health. Front. Mar. Sci.
4, 93.
10
Aquaculture 556 (2022) 738276
Diaz, R.J., Rosenberg, R., 2011. Introduction to environmental and economic
consequences of hypoxia. Int. J. Water Resour. Dev. 27, 71–82.
El-Gawad, A., Eman, A., Wang, H.P., Yao, H., 2019. Diet supplemented with synthetic
carotenoids: effects on growth performance and biochemical and immunological
parameters of yellow perch (Perca flavescens). Front. Physiol. 10, 1056.
Elia, A.C., Prearo, M., Dörr, A.J.M., Pacini, N., Magara, G., Brizio, P., Abete, M.C., 2019.
Effects of astaxanthin and canthaxanthin on oxidative stress biomarkers in rainbow
trout. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 82, 760–768.
Ettefaghdoost, M., Haghighi, H., 2021. Impact of different dietary lutein levels on growth
performance, biochemical and immuno-physiological parameters of oriental river
prawn (Macrobrachium nipponense). Fish Shellfish Immunol. 115, 86–94.
Flores, M., Díaz, F., Medina, R., Re, A.D., Licea, A., 2007. Physiological, metabolic and
haematological responses in white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone) juveniles
fed diets supplemented with astaxanthin acclimated to low-salinity water. Aquac.
Res. 38, 740–747.
Forsberg, O.I., Guttormsen, A.G., 2006. A pigmentation model for farmed Atlantic
salmon: nonlinear regression analysis of published experimental data. Aquaculture.
253, 415–420.
Goodwin, T., 1984. The Biochemistry of the Carotenoids Volume II: Animals, 2. vyd.
Chapham and Hall, New York.
Hansen, Ø.J., Puvanendran, V., Bangera, R., 2016. Broodstock diet with water and
astaxanthin improve condition and egg output of brood fish and larval survival in
Atlantic cod, Gadus morhua L. Aquac. Res. 47, 819–829.
Haque, R., Sawant, P.B., Sardar, P., Xavier, K.M., Varghese, T., Chadha, N., Naik, V.A.,
2021. Synergistic utilization of shrimp shell waste-derived natural astaxanthin with
its commercial variant boosts physio metabolic responses and enhances colouration
in discus (Symphysodon aequifasciatus). Environ. Nanotechnol. Monit. Manag. 15,
100405.
Ighodaro, O., Akinloye, O., 2018. First line defence antioxidants-superoxide dismutase
(SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX): their fundamental role in
the entire antioxidant defence grid. Alexandria J. Med. 54, 287–293.
Jiang, X., Zu, L., Wang, Z., Cheng, Y., Yang, Y., Wu, X., 2020. Micro-algal astaxanthin
could improve the antioxidant capability, immunity and ammonia resistance of
juvenile Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Fish Shellfish Immunol. 102,
499–510.
Ju, Z.Y., Deng, D.F., Dominy, W.G., Forster, I.P., 2011. Pigmentation of Pacific white
shrimp, Litopenaeus vannamei, by dietary astaxanthin extracted from Haematococcus
pluvialis. J. World Aquacult. Soc. 42, 633–644.
Kalinowski, C., Robaina, L., Fernandez-Palacios, H., Schuchardt, D., Izquierdo, M., 2005.
Effect of different carotenoid sources and their dietary levels on red porgy (Pagrus
pagrus) growth and skin colour. Aquaculture. 244, 223–231.
Kalinowski, C.T., Socorro, J., Robaina, L.E., 2015. Effect of dietary canthaxanthin on the
growth and lipid composition of red porgy (Pagrus pagrus). Aquac. Res. 46, 893–900.
Kawamura, A., Aoi, W., Abe, R., Kobayashi, Y., Wada, S., Kuwahata, M., Higashi, A.,
2020. Combined intake of astaxanthin, β-carotene, and resveratrol elevates protein
synthesis during muscle hypertrophy in mice. Nutrition. 69, 110561.
Landsman, A., St-Pierre, B., Rosales-Leija, M., Brown, M., Gibbons, W., 2019. Impact of
aquaculture practices on intestinal bacterial profiles of Pacific Whiteleg shrimp
Litopenaeus vannamei. Microorganisms. 7, 93.
Li, E., Wang, X., Chen, K., Xu, C., Qin, J.G., Chen, L., 2017. Physiological change and
nutritional requirement of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei at low salinity.
Rev. Aquac. 9, 57–75.
Li, F., Xiang, J., 2013. Recent advances in researches on the innate immunity of shrimp in
China. Dev. Comp. Immunol. 39, 11–26.
Lim, K.C., Yusoff, F.M., Shariff, M., Kamarudin, M.S., 2017. Astaxanthin as feed
supplement in aquatic animals. Rev. Aquac. 10, 738–773.
Liu, M., Jiang, X., Chen, A., Chen, T., Cheng, Y., Wu, X., 2020. Transcriptome analysis
reveals the potential mechanism of dietary carotenoids improving antioxidative
capability and immunity of juvenile Chinese mitten crabs Eriocheir sinensis. Fish
Shellfish Immunol. 104, 359–373.
Liu, X., Wang, B., Li, Y., Wang, L., Liu, J., 2018. Effects of dietary botanical and synthetic
astaxanthin on E/Z and R/S isomer composition, growth performance, and
antioxidant capacity of white shrimp, Litopenaeus vannamei, in the nursery phase [for
this article an erratum has been published]. Invertebr. Surviv. J. 15, 131–140.
Long, X., Wu, X., Zhao, L., Liu, J., Cheng, Y., 2017. Effects of dietary supplementation
with Haematococcus pluvialis cell powder on coloration, ovarian development and
antioxidation capacity of adult female Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis.
Aquaculture. 473, 545–553.
Lovett, D.L., Felder, D.L., 1990. Ontogenetic change in digestive enzyme activity of larval
and postlarval white shrimp Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda, Penaeidae).
Biol. Bull. 178, 144–159.
Manikandan, K., Felix, N., Prabu, E., 2020. A review on the application and effect of
carotenoids with respect to canthaxanthin in the culture of fishes and crustaceans.
Int. J. Fish. Aquat. Stud. 8, 128–133.
Meilisza, N., Jusadi, D., Zairin Jr., M., Artika, I.M., Priyo Utomo, N.B., Kadarini, T.,
Suprayudi, M.A., 2017. Digestibility, growth and pigmentation of astaxanthin,
canthaxanthin or lutein diets in Lake Kurumoi rainbowfish, Melanotaenia parva
(Allen) cultured species. Aquac. Res. 48, 5517–5525.
Mialhe, F., Gunnell, Y., Mering, C., 2013. The impacts of shrimp farming on land use,
employment and migration in Tumbes, northern Peru. Ocean Coast. Manag. 73,
1–12.
Mohankumar, K., Ramasamy, P., 2006. Activities of membrane bound phosphatases,
transaminases and mitochondrial enzymes in white spot syndrome virus infected
tissues of Fenneropenaeus indicus. Virus Res. 118, 130–135.
S. Fawzy et al.
Munoz, M., Cedeno, R., Rodriguez, J., van der Knaap, W.P., Mialhe, E., Bachere, E., 2000.
Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the
penaeid shrimp, Penaeus vannamei. Aquaculture. 191, 89–107.
Mussagy, C.U., Khan, S., Kot, A.M., 2021. Current developments on the application of
microbial carotenoids as an alternative to synthetic pigments. Crit. Rev. Food Sci.
Nutr. 1–15.
Nickell, D., Bromage, N., 1998. The effect of timing and duration of feeding astaxanthin
on the development and variation of fillet colour and efficiency of pigmentation in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture. 169, 233–246.
Niu, J., Tian, L.X., Liu, Y.J., Yang, H.J., Ye, C.X., Gao, W., Mai, K.S., 2009. Effect of
dietary astaxanthin on growth, survival, and stress tolerance of postlarval shrimp,
Litopenaeus vannamei. J. World Aquacult. Soc. 40, 795–802.
Niu, J., Li, C.H., Liu, Y.-J., Tian, L.X., Chen, X., Huang, Z., Lin, H.Z., 2012. Dietary values
of astaxanthin and canthaxanthin in Penaeus monodon in the presence and absence of
cholesterol supplementation: effect on growth, nutrient digestibility and tissue
carotenoid composition. Br. J. Nutr. 108, 80–91.
Niu, J., Wen, H., Li, C.H., Liu, Y.J., Tian, L.X., Chen, X., Lin, H.Z., 2014. Comparison
effect of dietary astaxanthin and β-carotene in the presence and absence of
cholesterol supplementation on growth performance, antioxidant capacity and gene
expression of Penaeus monodon under normoxia and hypoxia condition. Aquaculture.
422, 8–17.
Ohno, M., Darwish, W.S., Ikenaka, Y., Miki, W., Ishizuka, M., 2011. Astaxanthin can alter
CYP1A-dependent activities via two different mechanisms: induction of protein
expression and inhibition of NADPH P450 reductase dependent electron transfer.
Food Chem. Toxicol. 49, 1285–1291.
Parisenti, J., Beirão, L.H., Tramonte, V.L., Ourique, F., da Silveira Brito, C.C., Moreira, C.
C., 2011. Preference ranking of colour in raw and cooked shrimps. Int. J. Food Sci.
Technol. 46, 2558–2561.
Pereira da Costa, D., Campos Miranda-Filho, K., 2020. The use of carotenoid pigments as
food additives for aquatic organisms and their functional roles. Rev. Aquac. 12,
1567–1578.
Petit, H., Nègre-Sadargues, G., Castillo, R., Trilles, J.P., 1997. The effects of dietary
astaxanthin on growth and moulting cycle of postlarval stages of the prawn, Penaeus
japonicus (Crustacea, Decapoda). Comp. Biochem. Physiol. A 117, 539–544.
Pi, S., Xi, M., Deng, L., Xu, H., Feng, C., Shen, R., Wu, C., 2020. Practical synthesis of
canthaxanthin. J. Iran. Chem. Soc. 17, 493–497.
Rahman, M.M., Khosravi, S., Chang, K.H., Lee, S.-M., 2016. Effects of dietary inclusion of
astaxanthin on growth, muscle pigmentation and antioxidant capacity of juvenile
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Prev. Nutr. Food Sci. 21, 281.
Rebelo, B.A., Farrona, S., Ventura, M.R., Abranches, R., 2020. Canthaxanthin, a red-hot
carotenoid: applications, synthesis, and biosynthetic evolution. Plants. 9, 1039.
Sahin, K., Yazlak, H., Orhan, C., Tuzcu, M., Akdemir, F., Sahin, N., 2014. The effect of
lycopene on antioxidant status in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) reared under
high stocking density. Aquaculture. 418, 132–138.
Sanchez, S., Ruiz, B., Rodríguez-Sanoja, R., Flores-Cotera, L., 2013. Microbial Production
Of Carotenoids, Microbial Production of Food Ingredients, Enzymes and
Nutraceuticals. Elsevier, pp. 194–233.
Shahidi, F., Brown, J.A., 1998. Carotenoid pigments in seafoods and aquaculture. Crit.
Rev. Food Sci. Nutr. 38, 1–67.
Shao, L., Wang, C., He, J., Wu, X., Cheng, Y., 2014. Meat quality of Chinese mitten crabs
fattened with natural and formulated diets. J. Aquat. Food Prod. Technol. 23, 59–72.
Shinji, J., Nohara, S., Yagi, N., Wilder, M., 2019. Bio-economic analysis of super-
intensive closed shrimp farming and improvement of management plans: a case
study in Japan. Fish. Sci. 85, 1055–1065.
Torrissen, O.J., 1984. Pigmentation of salmonids—effect of carotenoids in eggs and start-
feeding diet on survival and growth rate. Aquaculture. 43, 185–193.
Venugopalan, V., Tripathi, S.K., Nahar, P., Saradhi, P.P., Das, R.H., Gautam, H.K., 2013.
Characterization of canthaxanthin isomers isolated from a new soil Dietzia sp. and
their antioxidant activities. J. Microbiol. Biotechnol. 23, 237–245.
11
Aquaculture 556 (2022) 738276
Vogt, G., 2019. Functional cytology of the hepatopancreas of decapod crustaceans.
J. Morphol. 280, 1405–1444.
Wade, N.M., Cheers, S., Bourne, N., Irvin, S., Blyth, D., Glencross, B.D., 2017a. Dietary
astaxanthin levels affect colour, growth, carotenoid digestibility and the
accumulation of specific carotenoid esters in the Giant Tiger shrimp, Penaeus
monodon. Aquac. Res. 48, 395–406.
Wade, N.M., Gabaudan, J., Glencross, B.D., 2017b. A review of carotenoid utilisation and
function in crustacean aquaculture. Rev. Aquac. 9, 141–156.
Wang, W., Ishikawa, M., Koshio, S., Yokoyama, S., Dawood, M.A., Zhang, Y., 2018a.
Effects of dietary astaxanthin supplementation on survival, growth and stress
resistance in larval and post-larval kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Aquac.
Res. 49, 2225–2232.
Wang, W., Ishikawa, M., Koshio, S., Yokoyama, S., Hossain, M.S., Moss, A.S., 2018b.
Effects of dietary astaxanthin supplementation on juvenile kuruma shrimp,
Marsupenaeus japonicus. Aquaculture. 491, 197–204.
Wang, W., Ishikawa, M., Koshio, S., Yokoyama, S., Dawood, M.A., Hossain, M.S.,
Zaineldin, A.I., 2019. Interactive effects of dietary astaxanthin and cholesterol on the
growth, pigmentation, fatty acid analysis, immune response and stress resistance of
kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus). Aquac. Nutr. 25, 946–958.
Wang, W., Liu, M., Fawzy, S., Xue, Y., Wu, M., Huang, X., Lin, Q., 2021. Effects of dietary
phaffia rhodozyma astaxanthin on growth performance, carotenoid analysis,
biochemical and immune-physiological parameters, intestinal microbiota, and
disease resistance in Penaeus monodon. Front. Microbiol. 12.
Wang, Y., Wang, B., Liu, M., Jiang, K., Wang, M., Wang, L., 2020. Comparative
transcriptome analysis reveals the potential influencing mechanism of dietary
astaxanthin on growth and metabolism in Litopenaeus vannamei. Aquac. Rep. 16,
100259.
Wang, Y.J., Chien, Y.H., Pan, C.H., 2006. Effects of dietary supplementation of
carotenoids on survival, growth, pigmentation, and antioxidant capacity of
characins, Hyphessobrycon callistus. Aquaculture. 261, 641–648.
Wang, Z., Cai, C.F., Cao, X.M., Zhu, J.M., He, J., Wu, P., Ye, Y.T., 2018c.
Supplementation of dietary astaxanthin alleviated oxidative damage induced by
chronic high pH stress, and enhanced carapace astaxanthin concentration of Chinese
mitten crab Eriocheir sinensis. Aquaculture. 483, 230–237.
Wu, S., Xu, B., 2021. Effect of dietary astaxanthin administration on the growth
performance and innate immunity of juvenile crucian carp (Carassius auratus). 3.
Biotech. 11, 1–6.
Xie, F., Zeng, W., Zhou, Q., Wang, H., Wang, T., Zheng, C., Wang, Y., 2012. Dietary lysine
requirement of juvenile Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Aquaculture.
358, 116–121.
Yamada, S., Tanaka, Y., Sameshima, M., Ito, Y., 1990. Pigmentation of prawn (Penaeus
japonicus) with carotenoids: I. effect of dietary astaxanthin, β-carotene and
canthaxanthin on pigmentation. Aquaculture. 87, 323–330.
Yokoyama, S., Koshio, S., Takakura, N., Oshida, K., Ishikawa, M., Gallardo-Cigarroa, F.J.,
Teshima, S.I., 2005. Dietary bovine lactoferrin enhances tolerance to high
temperature stress in Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture. 249,
367–373.
Zhang, J., Liu, Y.J., Tian, L.X., Yang, H.J., Liang, G.Y., Yue, Y.R., Xu, D.H., 2013. Effects
of dietary astaxanthin on growth, antioxidant capacity and gene expression in Pacific
white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquac. Nutr. 19, 917–927.
Zhao, D., Song, S., Wang, Q., Zhang, X., Hu, S., Chen, L., 2009. Discovery of immune-
related genes in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) by expressed sequence tag
analysis of haemocytes. Aquaculture. 287, 297–303.
Zhou, Q.C., Zeng, W.P., Wang, H.L., Wang, T., Wang, Y.L., Xie, F.J., 2012. Dietary
arginine requirement of juvenile Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei.
Aqauculture 364-365, 252–258.
Another random document with
no related content on Scribd:
 — Vaan sinäpä et nukkunut, pyssynlaukaukset sinut herättivät.

— Sinä luulet siis, että teidän pyssynne pitävät semmoista melua?

Isäni tussari pamahtaa paljon kovemmin.

— Vieköön sinut saakeli, senkin kirottu vetelys! Että sinä olet

nähnyt Gianetton, siitä olen varma. Kenties olet hänet kätkenytkin.
Hoi, kumppalit, käykää tupaan ja katsokaa, eikö junkkarimme ole
siellä. Hän nilkutti enää vain yhdellä käpälällä, ja se lurjus on liian
viisas lähteäkseen sillä tavoin palolle asti pyrkimään. Sitäpaitsi
loppuvat verijäljetkin tähän.

— Vaan mitäs isä sanoo, kysyi Fortunato ilkamoiden, jos saa

tietää, että te olette hänen poissa ollessaan tunkeutuneet tupaan?

— Kuules, junkkari, sanoi ajutantti Gamba nipistäen poikaa

korvasta, tiedätkös sinä, että minä voin helposti saada sinut toista
virttä veisaamaan? Ehkäpä sinä vielä sanotkin, jos saat parisen
kymmentä lyöntiä sapelin lappeella.

Fortunato vain naureskeli pilkallisesti.

— Isäni nimi on Mateo Falcone! sanoi hän juhlallisesti.

— Tiedätkös sinä, pikku veijari, että minä voin viedä sinut joko
Corteen tai Bastiaan. Panen sinut vankeuteen, raudat jaloissa
olkivuoteelle makaamaan, ja mestautan sinut, jos et sano missä
Gianetto
Sanpiero piileksii.

Poika remahti suureen nauruun kuullessaan tämän lystikkään

uhkauksen.
Hän vain toisti:
 — Isäni nimi on Mateo Falcone.

— Ajutantti, sanoi aivan hiljaa eräs jääkäreistä, älkäämme

riitaantuko
Mateon kanssa.

Gamba näytti todellakin joutuneen ymmälle.

Hän puheli kuiskaten sotamiesten kanssa, jotka olivat tarkastaneet

koko talon, toimitus, joka muuten ei kauan kestänytkään, sillä
korsikkalaisen asuntoon ei kuulu muuta kuin yksi neliskulmainen
tupa. Huonekaluja on pöytä, penkkejä, kirstuja ja metsästys- sekä
talouskapineita. Sillä aikaa pikku Fortunato hyväili kissaansa ja näytti
ilkamoiden nauttivan jääkärien ja sukulaisensa hämmennystilasta.

Eräs sotamiehistä lähestyi heinäsuovaa. Hän huomasi emäkissan

ja sohaisi pistimellä huolettomasti heinäsuovaan kohauttaen
olkapäitään merkiksi, että tämä teko tuntui hänestä naurettavalta.
Suovassa ei mikään liikahtanut, eivätkä pojan kasvotkaan ilmaisseet
vähintäkään mielenliikutusta.

Ajutantti ja hänen joukkonsa miettivät heittää hiiteen koko

toimituksen ja katselivat jo totisina nummelle päin ikäänkuin aikoen
palata takaisin samaa tietä, jota olivat tulleetkin, kun päällikkö,
vakuutettuna siitä, etteivät uhkaukset vaikuttaneet mitään Mateo
Falconen poikaan, päätti tehdä vielä viimeisen ponnistuksen ja
koettaa hyväilyjen ja lahjojen mahtia.

— Kuules, pikku serkkuni, sanoi hän, sinä näyt olevan hyvin

kasvatettu viikari ja tulet varmaankin vielä menemään pitkälle. Mutta
nyt sinä lasket minusta ilkeää leikkiä, ja ellen minä pelkäisi
suututtavani sukulaistani Mateo Falconea, niin piru vieköön
ottaisinkin sinut mukaani.

— Hui-hai!

— Vaan kun sukulaiseni tulee kotiin, niin kerron koko jutun

hänelle, ja silloin saat valheistasi verisen selkäsaunan.

— Jokohan?

— Saat nähdä… Vaan kuuleppa… ole nyt siivo poika, niin minä
annan sinulle jotain.

— Ja minä annan sinulle, serkku, erään neuvon: että jos te vielä

viivyttelette, niin Gianetto ehtii jo palolle, ja silloin täytyy olla
useampia sinunlaisiasi uskalikkoja, jos mieli häntä sieltä etsiä.

Ajutantti otti taskustaan hopeakellon, joka maksoi ainakin

kolmekymmentä frangia, ja huomatessaan, että pikku Fortunaton
silmät säteilivät sitä katsellessa, hän riiputti sitä teräksisten vitjojen
nenästä sanoen:

— Sinä veijari tahtoisit kai mielelläsi tämmöisen kellon kaulaasi ja

astuskelisit Porto-Vecchion katuja ylpeänä kuin riikinkukko; ja ihmiset
kyselisivät sinulta: »paljonko kello on?» ja sinä vastaisit: »katsokaa
kelloani».

— Kun tulen isoksi, niin korpraali-enoni kyllä antaa minulle kellon.

— Antaa jos antaa, vaan enosi pojallapa on jo kello… ei sentään

niin kaunis kuin tämä… Ja hän on kuitenkin sinua nuorempi.

Poikanen huokasi.
 — No, tahdotkos tämän kellon, pikku serkku?

Fortunato näytti syrjäsilmällä kelloa katsellessaan kissalta, jolle

tarjotaan kokonainen kananpoika. Tuntien itseään vain härnättävän
ei se uskalla iskeä siihen kynsiänsä, vaan kääntää tuontuostakin
silmänsä poispäin, ettei houkutus kävisi liian suureksi; kuitenkin se
nuoleksii myötäänsä suupieliänsä ja näyttää tahtovan sanoa
isännälleen: »Teidän leikkinne on liian julmaa!»

Ajutantti Gamba tuntui sentään todenteolla tarjottelevan kelloansa.

Fortunato ei ojentanut kättänsä, vaan sanoi happamesti hymyillen:

— Mitä te minua suotta pilkkaatte?

— En, jumal’avita, pilkkaakaan. Sano vain missä Gianetto on, niin

on kellokin sinun.

Fortunaton huulille ilmestyi epäilyksen hymy, ja katsoen mustilla

silmillänsä ajutantin silmiin koetti hän niistä lukea, minkä verran
tämän sanoihin oli luottamista.

— Vietäköön minulta olkaliput, huudahti ajutantti, jollen anna

sinulle kelloa sillä ehdolla! Kumppalini tässä ovat todistajina, enkä
minä saata lupaustani rikkoa.

Tätä sanoessaan hän vei kelloa yhä lähemmäksi, kunnes se

melkein kosketti pojan kalpeata poskea. Tämän kasvoilla kuvastui
selvästi sisällinen sieluntaistelu pyyteen ja vierasvaraisuuden
kunnioittamisen välillä. Paljas rinta kohoili kiihkeästi, ja hän näytti
olevan tukehtumaisillaan.

Sillä välin kello heilui ja kääntelihe koskettaen toisinaan hänen

nenänsä päätä. Vähitellen alkoi vihdoin pojan oikea käsi kohota
kelloa kohti: sormen päät jo koskettivat sitä, ja pian se lepäsi
kokonaan hänen kädessään, vaikka ajutantti yhä piteli sitä vitjojen
toisesta päästä… Numerotaulu oli taivaansininen… kuori vasta
kiillotettu… päivänpaisteessa se tulena välähteli… Houkutus oli liian
suuri.

Fortunatolla nousi jo vasen käsikin, ja olkansa yli hän viittasi

peukalollaan heinäsuovaa, jota vastaan hän nojasi. Ajutantti
ymmärsi hänet heti. Hän päästi vitjat kädestään, ja Fortunato tunsi
olevansa kellon ainoa omistaja. Hän hypähti pystyyn vikkelästi kuin
metsäpeura ja poistui kymmenen askeleen päähän heinäsuovasta,
jota jääkärit heti kävivät penkomaan.

Pian nähtiinkin heinäsuovan liikahtelevan: sieltä ilmestyi verissään

oleva mies, puukko kädessä; mutta koettaessaan nousta seisoalleen
ei hän hyytyneeltä haavaltaan jaksanutkaan pysyä pystyssä, vaan
suistui maahan. Ajutantti syöksyi heti hänen kimppuunsa ja väänsi
tikarin hänen kädestään. Samassa hänet lujasti köytettiin
vastustuksestaan huolimatta.

Maaten kentällä pitkällään, sidottuna kuin mikäkin lyhde, Gianetto

käänsi päänsä lähestynyttä Fortunatoa kohti.

— Senkin… sikiö! sanoi hän tälle enemmän ylenkatseellisesti kuin

vihaisesti.

Poika heitti hänelle saamansa hopearahan takaisin tuntien, ettei

sitä enää ansainnut; mutta vangittu ei näyttänyt huomaavankaan tätä
liikettä. Vallan kylmäverisesti hän sanoi ajutantille:

— Kuulkaas, hyvä Gamba, minä en jaksa kävellä, teidän täytyy

kantaa minut kaupunkiin.
 — Äsken sinä kuitenkin juoksit kuin vuorikauris, vastasi julma
voittaja; mutta olehan huoletta: minä olen niin hyvilläni siitä, että
sinut vihdoinkin sain kiinni, jotta vaikka selässäni kantaisin sinua
penikulman väsymystä ensinkään tuntematta. Muuten aiomme
valmistaa sinulle paarit oksista ja päällystakistasi; ja Crespolin
vuokratalolla on meillä hevosetkin.

— Hyvä, sanoi vangittu; kai te panette hiukan olkia paareille, jotta

minun on mukavampi olla.

Sillä välin kuin muutamat jääkäreistä puuhailivat valmistellen

jonkinlaisia kantopaareja kastanjan oksista ja toiset sitoivat
Gianetton haavaa, ilmestyi Mateo Falcone vaimoineen äkkiä erään
palolle vievän polun käänteestä. Vaimo asteli hyvin kumarassa
kantaen tavattoman suurta kastanjasäkkiä, sillä aikaa kuin hänen
miehensä kulki herrana edellä, ainoastaan pyssy kädessä ja toinen
kantohihnassa; miehen arvo ei näet salli hänen kantaa muita
taakkoja kuin aseensa.

Nähdessään sotamiehet arveli Mateo heti, että ne olivat tulleet

häntä vangitsemaan. Mutta mistä tämä ajatus? Oliko Mateolla
mitään oikeuden kanssa tekemistä? Ei. Hänhän oli päinvastoin
hyvässä maineessa. Hän oli, kuten sanotaan, hyvämaineinen ja
itsenäinen mies; mutta hän oli korsikkalainen ja vuoristolainen, eikä
Korsikan vuoristolaisten joukossa ole monta, joka ei tarkoin
muistellessaan löytäisi menneisyytensä ansioluettelosta jotakin pikku
rikosta, sellaista kuin pyssynlaukausta, tikarinpistoa tai jotakin muuta
vähäpätöisyyttä. Mateolla oli parempi omatunto kuin ehkä
kenelläkään muulla, sillä ainakaan kymmeneen vuoteen ei hän ollut
tähdännyt pyssyänsä ihmistä kohti; mutta siitä huolimatta hän oli
varovainen ja varustausi ankaraan itsepuolustukseen, jos tarvis
sellaista vaati.

— Vaimo, sanoi hän Giuseppalle, heitä maahan säkkisi ja ole

varuillasi.

Tämä tottelikin silmänräpäyksessä. Mateo antoi hänelle pyssyn,

joka oli ollut kantohihnassa ja joka ehkä olisi ollut vain vastuksena.
Sitten hän latasi kädessään olevan tuliputken ja astui verkalleen
taloansa kohti pujotteleiden tien varrella kasvavien puiden välitse ja
ollen valmiina pienimmänkin vihamielisyyden huomatessaan
viskautumaan paksuimman puunrungon taakse, mistä saattoi
turvassa ollen itse ampua. Vaimo astui hänen jälkiään kantaen
varapyssyä ja patruunalaukkua. Hyvän aviovaimon velvollisuus on
näet taistelun tullessa ladata miehensä ampuma-aseet.

Ajutantille taas tuli aika hätä, kun näki Mateon lähestyvän näin
verkkaisin askelin, pyssy tanassa ja sormi liipasimella.

— Jos Mateo, ajatteli hän, sattuisi olemaan Gianetton sukulainen

tai ystävä ja tahtoisi häntä puolustaa, niin tulisivat luodit hänen
molemmista pyssyistään kahteen meistä yhtä varmasti kuin kirjeet
postissa; ja jos hän tähtää minuun, sukulaisuudesta huolimatta…

Tällaisessa hämmennystilassa hän teki sangen rohkean

päätöksen: hän astui näet yksin Mateota kohti kertoakseen hänelle
koko tapauksen ja lähestyi häntä kuin ainakin vanhaa tuttavaa; mutta
tuo pieni välimatka, joka erotti hänet Mateosta, tuntui hänestä
hirveän pitkältä.

— Hei, kuules, vanha toveri, huusi hän, — mitäs sinulle kuuluu,

hyvä ystävä? Tunnetko sinä minua, Gamba serkkuasi?
 Sanaakaan vastaamatta Mateo pysähtyi, ja sillä aikaa kuin toinen
puheli, nosti hän verkalleen pyssyänsä, niin että sen suu oli taivasta
kohti ajutantin likelle saapuessa.

— Hyvää päivää, veliseni [Buon giorno, fratello, korsikkalaisten

tavallinen tervehdys], sanoi ajutantti ojentaen hänelle kätensä. Onpa
siitä aikoja, kun olen sinua nähnyt.

— Päivää, veli.

— Tulin ohikulkiessani sanomaan sinulle ja serkku Pepalle

hyvänpäivän. Olemme tänään olleet pitkällä matkalla, vaan ei sovi
valitella vaivojaan, kun on saanut sellaisen saaliin kuin me. Saimme
näet juuri kiinni Gianetto Sanpieron.

— Jumalan kiitos! huudahti Giuseppa. Viime viikolla hän varasti

meiltä lypsyvuohen.

Gambaa nämä sanat ilahuttivat.

— Kurja raukka, sanoi Mateo, hän oli nälissään.

— Se veijari puolustihe kuin jalopeura, jatkoi ajutantti hiukan

nolostuneena, — hän tappoi minulta yhden jääkärin eikä tyytynyt
vielä siihenkään, vaan katkaisi korpraali Chardonilta käsivarren… no,
vahinko ei ollut suuri, olihan tämä vain ranskalainen… Sitten hän oli
piiloutunut niin viisaasti, ettei lempokaan olisi häntä keksinyt. Ilman
pikku Fortunatoa en olisi häntä ikinä löytänyt.

— Fortunatoa! huudahti Mateo.

— Fortunatoa? toisti Giuseppa.

 — Niin, Gianetto oli kätkeytynyt tuohon heinäsuovaan, mutta pikku
serkkunipa ilmaisi viekkauden. Minä aionkin sanoa hänen enolleen,
korpraalille, että lähettää Fortunatolle kauniin lahjan palkinnoksi. Ja
hänen sekä sinun nimesi tulevat raporttiin, jonka lähetän yleiselle
syyttäjälle.

— Kirous! mutisi hiljaa Mateo.

He olivat saapuneet jääkärijoukon luo. Gianetto lepäsi jo

paareillaan valmiina lähtöön. Nähdessään Mateon tulevan Gamban
seurassa hän hymyili omituisesti, käänsihe talon ovelle päin ja
sylkäisi kynnykselle sanoen:

— Kavaltajan asunto!

Täytyi olla valmis kuolemaan sen, joka uskalsi käyttää kavaltajan

nimeä Falconesta. Tarkka tikarinpisto, jota ei tarvitse uusia, olisi
tavallisissa oloissa loukkauksen heti kostanut. Mateo ei nyt
kuitenkaan tehnyt muuta liikettä kuin nosti murtuneen näköisenä
kätensä otsalleen.

Nähdessään isänsä tulevan oli Fortunato vetäytynyt tupaan. Sieltä

hän ennen pitkää palasi tuoden maitotuopin, jonka hän katse
maahan luotuna tarjosi Gianettolle.

— Pysy loitolla minusta! ärjäisi vangittu jyrkästi.

Kääntyen sitten erään jääkärin puoleen hän virkkoi: — Toveri

hyvä, annas minulle juotavaa!

Sotamies antoi litteän juomapullonsa hänelle käteen, ja rosvo joi

sen miehen antamaa vettä, jonka kanssa äsken oli laukauksia
vaihtanut. Sitten hän pyysi, että kätensä, jotka olivat köytetyt selän
taakse, sidottaisiin ristiin rinnalle.

— Lepään mieluummin mukavasti, sanoi hän.

Pyyntö täytettiin oitis; sitten antoi ajutantti lähtömerkin, lausui

jäähyväiset Mateolle mitään vastausta tältä saamatta, ja niin
lähdettiin kiireisin askelin nummelle päin.

Kului lähes kymmenen minuuttia, ennenkuin Mateo suunsa avasi.

Poikanen katseli levotonna vuoroin äitiänsä, vuoroin isäänsä, joka
pyssyynsä nojaten tuijotti häneen tuimasti.

— Sinä alottelet hyvin, sinä! sanoi Mateo vihdoin tyynellä äänellä,

joka kuitenkin värisytti sitä, ken miehen tunsi.

— Isä! huudahti poika lähestyen kyyneleet silmissä ikäänkuin

aikoen heittäytyä hänen jalkojensa juureen.

Mutta Mateo ärjäisi hänelle:

— Pois minusta!

Poika pysähtyi ja seisoi nyyhkyttäen liikkumattomana muutaman

askeleen päässä isästään.

Giuseppa tuli lähemmäksi. Hän oli huomannut kellonvitjat, joiden

pää pisti Fortunaton paidan aukeamasta esille.

— Kuka sinulle tämän kellon antoi? kysyi hän ankarasti.

— Serkkuni, ajutantti.
 Falcone tempasi kellon ja lennätti sen sellaisella voimalla vasten
kiveä, että se pirstausi tuhanneksi muruksi.

— Vaimo, sanoi hän, onko tuo poika minun tekemäni?

Giuseppan ruskeat posket lensivät tulipunaisiksi.

— Mitä sinä sanotkin, Mateo, ja muistatko kenelle puhut!

— No niin, tuo poika on siis heimonsa ensimäinen kavaltaja.

Fortunaton nyyhkytykset kävivät kahta vertaa äänekkäämmiksi, ja

Falcone tuijotti häneen yhäti ilveksensilmillään. Vihdoin hän löi
pyssynsä perällä kerran maahan, heitti sen sitten olalleen ja lähti
astumaan palolle päin huutaen Fortunatoa tulemaan perästä. Poika
totteli.

Giuseppa juoksi Mateon jälkeen ja tarttui häntä käsivarteen.

— Hän on sentään sinun poikasi, sanoi hän vapisevalla äänellä ja

katsoi mustilla silmillään miestänsä silmiin nähdäksensä mitä hänen
mielessään liikkui.

— Laske irti minut! vastasi Mateo. Minä olen hänen isänsä.

Giuseppa syleili poikaansa ja meni itkien tupaan. Siellä hän

heittäysi polvilleen pyhän Neitsyen kuvan eteen ja rukoili kiihkeästi.
Sillä välin astui Falcone pari sataa askelta polkua myöten eikä
pysähtynyt ennen kuin tuli erään laakson luo, jonne laskeusi. Siinä
hän tutki maaperää pyssynsä perällä ja huomasi sen olevan
pehmeän ja helpon kaivaa. Paikka tuntui hänestä tarkoitukseen
soveliaalta.
 — Fortunato, mene tuon suuren kiven luo.

Poika teki niinkuin käskettiin ja laskeusi sitten polvilleen.

— Lue rukouksesi.

— Isä, isä, älkää tappako minua.

— Lue rukouksesi! toisti Mateo hirvittävällä äänellä.

Supattaen ja nyyhkyttäen poikanen luki Isämeidän ja

uskontunnustuksen.
Isä vastasi kovalla äänellä: Amen! kummankin rukouksen jälkeen.

— Siinäkö ovat kaikki rukoukset, mitä osaat?

— Isä, osaan minä vielä Ave Marian ja sen, jonka täti minulle
opetti.

— Se on kovin pitkä, mutta menköön.

Poika luki rukouksensa sammuvalla äänellä.

— Oletko lopettanut?

— Voi, isä hyvä, armahtakaa! Antakaa anteeksi! En minä koskaan

enää semmoista tee! Ja minä rukoilen niin kauan korpraali-enoa,
että hän armahtaa Gianettoa!

Hän puhui vielä, kun Mateo jo oli virittänyt pyssynsä ja painoi

perän poskelleen lausuen:

— Jumala antakoon sinulle anteeksi!

 Poika teki epätoivoisen yrityksen noustakseen isänsä polvia
syleilemään, mutta hänellä ei ollut siihen aikaa. Mateo laukaisi, ja
Fortunato kaatui kuolleena paikalle.

Luomatta silmäystäkään ruumiiseen lähti Mateo talollensa päin

hakemaan lapiota haudatakseen poikansa. Tuskin oli hän ehtinyt
astua muutamia askeleita, kun tapasi Giuseppan, joka laukauksesta
säikähtyneenä juoksi murhapaikalle.

— Mitä sinä olet tehnyt? huusi hän.

— Oikeutta.

— Ja missä hän on?

— Laaksossa. Aion juuri haudata hänet. Hän kuoli kristittynä, ja

minä luetan hänelle messun. Käy sano vävylleni Tiodoro Bianchille,
että hän muuttaa meille asumaan.

Etuvarustuksen valloitus.

Eräs ystäväni, upseeri, joka joitakuita vuosia sitten kuoli

kuumetautiin Kreikassa, kertoi minulle muutamana päivänä
ensimäisestä ottelusta, jossa hän oli ollut mukana. Hänen
kertomuksensa vaikutti minuun niin voimakkaasti, että heti
lomahetken saatuani kirjoitin sen muististani paperille. Tässä se nyt
on:

Saavuin rykmenttiin syyskuun 4:nnen päivän iltana. Everstin

tapasin leirikentällä. Ensin hän otti minut jotenkin tylysti vastaan;
mutta kenraali B:n antaman suosituskirjeeni luettuansa hän muutti
käytöstänsä ja lausui muutamia kohteliaita sanoja.

Hän esitti minut kapteenilleni, joka juuri palasi eräältä

partioretkeltä. Tämä kapteeni, jota minulla tuskin oli aikaa tarkastaa
tunteakseni, oli kookas, tummaverinen ja ulkomuodoltaan ankaran ja
tylyn näköinen mies. Tavallisena sotamiehenä hän oli alkanut uransa
ja voittanut sekä olkalippunsa että kunniamerkkinsä
taistelutantereella. Hänen äänensä oli käheä ja heikko ollen
omituisesti vastakkainen hänen melkein jättiläismäiselle vartalolleen.
Syynä tähän outoon äänenkäheyteen sanottiin olevan erään luodin,
joka oli kerrassaan lävistänyt hänet Jenan tappelussa.

Kuultuaan, että minä olin juuri päässyt Fontainebleaun

sotakoulusta, hän väänsi kasvonsa irvistykseen sanoen:

— Luutnanttini kaatui eilen…

Minä ymmärsin hänen tällä tahtovan sanoa: »Teidän pitäisi muka

täyttää hänen sijansa, mutta siihen ette kykene.» Huulillani pyöri jo
pisteliäs vastaus, mutta minä hillitsin itseni.

Kuu nousi Cheverinon etuvarustuksen takaa, joka sijaitsi kahden

kanuunanhan tämän päässä leirituliltamme. Suuri ja punainen se oli,
kuten tavallisesti noustessaan. Mutta tuona iltana se näytti
tavallistaan suuremmalta. Hetken ajan häämötti koko varustus vallan
synkkänä kuun heleässä hohteessa. Se muistutti purkautumaisillaan
olevan tulivuoren kartiomaista huippua.

Vierelläni oleva vanha sotamieskin huomasi kuun värin.

 — Onpa se punainen, sanoi hän. Se merkitsee, että tuon
kuuluisan varustuksen valloitus käy meille kalliiksi!

Minä olen aina ollut taikauskoinen, ja varsinkin tällä hetkellä teki

tuo ennustus minuun syvän vaikutuksen. Laskeusin levolle, mutta en
saanut unta. Nousin makuulta ja kävelin jonkun aikaa katsellen
tavatonta tulijuovaa, joka kultasi Cheverinon kylän takaiset kukkulat.

Kun arvelin yön raittiin ja virkistävän ilman tarpeeksi vilvoittaneen

veriäni, palasin nuotiolle; kietoutuen huolellisesti päällystakkiini suljin
silmäni toivossa, etten avaisi niitä ennen päivän nousua. Mutta uni
vain ei tullut. Tahtomattani kävivät ajatukseni surullisiksi. Tuumin
itsekseni, ettei minulla noiden kentällä makaavien sadantuhannen
miehen joukossa ollut ainoatakaan ystävää. Jos haavoittuisin, niin
joutuisin sairashuoneeseen, missä tietämättömät välskärit minua
armotta kohtelisivat. Mieleeni johtui kaikki, mitä olin kirurgisista
leikkauksista kuullut. Ankarasti tykytti sydämeni, ja koneellisesti minä
asettelin nenäliinan ja lompakon rinnalleni jonkinlaiseksi panssariksi.
Väsymys valtasi minut, nukahdin aina hetkeksi, mutta samassa sai
joku surullisempi ajatus suuremman voiman, niin että hytkähtäen
heräsin. Väsymys voitti kuitenkin vihdoin, ja kun herätysrumpu soi,
nukuin minä makeinta untani. Asetuimme rintamaan, aamuhuuto
tapahtui, sitten pantiin aseet takaisin ristikoilleen ja kaikki näytti siltä,
kuin olisi meillä ollut aikomus viettää päivä aivan levollisesti.

Noin kolmen aikaan saapui ajutantti tuoden käskyn. Meidät

kutsuttiin uudelleen aseihin, jääkärimme hajoitettiin ympäri kenttää,
me seurasimme heitä verkalleen, ja kahdenkymmenen minuutin
kuluttua näimme venäläisten etuvartijoiden järjestäytyvän ja
palaavan varustukseen takaisin.
 Eräs tykkipatteri asettui oikealle, toinen vasemmalle meistä, mutta
molemmat jotenkin kauas edellemme. Ne alkoivat sangen kiivaan
tulen vihollista kohti, joka yhtä tuimasti vastasi, ja pian peittyi
Cheverinon varustus paksuihin savupilviin.

Eräs ylänkö melkein suojasi rykmenttimme venäläisten tulelta.

Kuulat, joita meitä kohti ei monta tullutkaan (vihollinen kun
etupäässä ahdisti tykkiväkeämme), lensivät ylitsemme tai viskelivät
meitä vastaan multaa ja pieniä kiviä.

Niin pian kuin käsky marssia eteenpäin oli annettu, katsoi kapteeni
minuun niin tutkivasti, että minun täytyi pyyhkäistä pari kertaa nuoria
viiksiäni näyttääkseni niin huolettomalta kuin mahdollista. Muuten ei
minua pelottanutkaan, ja ainoa huoleni oli se, että muut ehkä luulivat
minun pelkäävän. Nuo vaarattomat kuulat vaikuttivat nekin siihen,
että pysyin sankarillisen kylmäverisenä. Itserakkauteni taas toisti,
että todellakin olin vaarassa, koskapa kuitenkin olin patteritulen alla.
Tunsin itseni vallan iloiseksi hyvinvoinnistani ja mietiskelin, kuinka
hauskaa on kertoa Cheverinon varustuksen valloituksesta rouva B:n
salongissa Provencen-kadun varrella.

Eversti kulki juuri komppaniamme ohitse virkahtaen minulle: »Kas

nyt te saatte jo alkajaisiksenne totuuden tuntea.»

Minä hymyilin kuin sodan jumala ja pyyhkäisin hihaltani pois

multaa, jota eräs kolmenkymmenen askeleen päähän pudonnut
kanuunankuula oli viskannut päälleni.

Venäläiset näyttivät huomaavan luotiensa huonon menestyksen,

sillä he rupesivat nyt ampumaan räjähdyskuulilla, jotka paremmin
yllättivät meidät notkelmassamme. Eräs suurehko kranaatinsirpale
pyyhkäisi lakin päästäni ja tappoi miehen sivultani.
 — Onnittelen teitä, sanoi kapteeni minulle, juuri kun olin saanut
lakkini maasta; kas nyt te olette turvattuna täksi päiväksi.

Minä olen usein huomannut tämän taikauskon sotamiehissä, jotka

uskovat, että selviö non bis in idem pitää paikkansa yhtä hyvin
taistelutantereella kuin oikeussalissa. Panin ylpeästi lakin jälleen
päähäni.

— Kas sepä oli suora tapa tervehtiä ihmisiä, sanoin niin iloisesti
kuin voin. Oloihin nähden pidettiin tätä huonoa sukkeluutta vallan
mainiona.

— Onnittelen teitä, toisti kapteeni vielä, muuta vahinkoa ei teille

tule tapahtumaan, ja vielä tänä iltana on teillä komppania
komennettavana, sillä kovin minun korviani tänään kuumennetaan.
Joka kerta kun olen haavoittunut, on vierelläni seisova upseeri
saanut kuolettavan luodin ja — lisäsi hän hiljempää ja melkein
häpeissään — heidän nimensä ovat aina alkaneet P:llä.

Tekeysin urhoolliseksi, ja useat olisivat kai tehneet minun tavallani;

moneen olisivat nämä ennustavat sanat vaikuttaneet niinkuin
minuunkin. Ensikertalaisena minä tunsin, etten voinut uskoa
ajatuksiani kenellekään, vaan että minun aina tuli näyttää
kylmäveriseltä ja urhoolliselta.

Puolen tunnin kuluttua venäläisten tuli hiljeni tuntuvasti; silloin

astuimme mekin esille suojapaikastamme marssiaksemme
varustusta kohti.

Rykmenttiimme kuului kolme pataljoonaa. Toinen pataljoona sai

tehtäväkseen käydä varustuksen kimppuun kiertämällä laakson
puolelta; molemmat toiset määrättiin rynnäkköä varten. Minä olin
kolmannessa pataljoonassa.

Tultuamme ulos rintavarustusten takaa, missä olimme olleet

suojattuina, kohtasi meitä moneen kertaan jalkaväen linjatuli
voimatta kuitenkaan suuria aukkoja riveihimme tuottaa. Kuulain
vinkuminen oudostutti minua: usein käänsin päätäni sinnepäin
saaden vain leikkisanoja vastaani tähän ääneen tottuneemmilta
tovereiltani.

— Tappelu ei lopulta olekaan niin hirvittävä asia, arvelin itsekseni.

Rientoaskelin astuimme eteenpäin, jääkärit etunenässä; yhtäkkiä

venäläiset kiljaisivat kolme hurraata, kolme eri kertaa, pysyen sitten
vallan hiljaa ja ampumatta.

— En pidä tuosta hiljaisuudesta, sanoi kapteeni, se ei ennusta

hyvää.

Mielestäni meikäläiset melusivat liian kovasti, enkä voinut olla

sisässäni vertaamatta heidän rähiseviä huutojansa vihollisen
juhlalliseen äänettömyyteen.

Jouduimme pian varustuksen juurelle, vallisuojukset olivat

kuulamme rikkoneet ja mullistelleet. Sotamiehet ryntäsivät näille
uusille raunioille huutaen eläköön keisari! kovemmin kuin olisi voinut
odottaakaan ihmisiltä, jotka jo olivat niin paljon kirkuneet.

Loin katseeni ylöspäin enkä ikinä unohda silloista näkyä. Enin osa
savua oli kohonnut ilmaan ja riippui kuin telttakatos noin
kahdenkymmenen jalan korkealla varustuksen yllä. Sinertävän
usvan läpi näkyivät puoleksi hajonneen rintasuojuksensa takana
venäläiset krenatöörit, jotka seisoivat pyssyt koholla ja
liikkumattomina kuin patsaat. Olen vieläkin näkevinäni jokaisen
sotamiehen, vasen silmä meihin luotuna ja oikea kohotetun pyssyn
peitossa. Eräässä ampumareiässä muutamia askeleita meistä seisoi
mies tulisoihtu kädessä kanuunansa vieressä.

Minua värisytti, ja luulin jo viimeisen hetkeni tulleen.

— Kas nyt alkaa tanssi, pojat, huusi kapteeni. Hyvästi!

Ne olivat viimeiset sanat, mitkä kuulin hänen lausuvan.

Rummunpärinää kuului varustuksesta. Näin kaikkien pyssyjen

laskeutuvan. Ummistin silmäni ja kuulin hirmuisen paukkeen, jota
seurasi huudot ja voihkaukset. Avasin jälleen silmäni kummastellen,
että vielä olin hengissä. Varustus oli taas savun peitossa. Ympärilläni
haavoitettuja ja kuolleita. Kapteenini makasi jaloissani: hänen
päänsä oli eräs kuula murskannut, ja hänen aivojansa sekä vertansa
oli hulmahtanut vaatteilleni. Koko komppaniastani ei ollut pystyssä
enää kuin kuusi sotamiestä ja minä.

Tämän verisaunan saatuamme olimme hetken aikaa kuin

ällistyksissä. Asettaen lakkinsa miekkansa kärkeen kapusi eversti
ensimäisenä rintasuojukselle huutaen: eläköön keisari! ja hänen
jäljessään heti kaikki muut eloon jääneet. En paljon muista mitä
sitten seurasi. Me jouduimme varustuksen sisään, en tiedä millä
tavoin. Taisteltiin käsikähmässä niin paksussa savussa, ettei voitu
nähdä toisiaan. Luulen lyöneenikin, koskapahan sapelini oli vallan
verinen. Vihdoin kuulin huudettavan: »voitto on meidän!» ja savun
hälvetessä näin koko varustuksen kentän verta ja kuolleita täynnä.
Varsinkin kanuunat olivat vallan haudattuina ruumiskasojen alle.
Noin kaksisataa miestä ranskalaisissa univormuissa seisoi ryhmässä
ilman järjestystä, toiset ladaten pyssyjänsä, toiset puhdistaen
pistimiänsä. Yksitoista venäläistä vankia oli heidän keskessään.

Eversti lepäsi vallan verisenä särkyneiden vaunujen päällä linnan

portin suulla. Muutamia sotamiehiä tunkeili hänen ympärillään;
minäkin lähestyin häntä.

— Missä on vanhin kapteeni? kysyi hän eräältä kersantilta.

Kersantti kohautti olkapäitään sangen merkitsevällä tavalla.

— Entä vanhin luutnantti?

— Tämä eilen saapunut herra tässä, sanoi kersantti vallan tyynellä

äänellä.

Eversti hymyili happamesti.

— No niin, hyvä herra, te siis komennatte päällikkönä; varustakaa

heti linnoituksen portti näillä muonavaunuilla, sillä vihollinen on vielä
voimakas, mutta kenraali C… tulee avuksenne.

— Eversti, sanoin minä, te olette kai pahoin haavoittunut?

— Yks'kaikki, ystäväni, mutta varustus on valloitettu!

Arpapeli.

Liikkumattomina riippuivat purjeet mastoja vasten; meren pinta oli

kirkas kuin peili, ilma tukahuttavan kuuma ja tyven vallan toivoton.