GV: Ts.

Nguyễn Minh Thái

• Nắm được các nhu cầu dinh dưỡng và yếu tố tăng
trưởng của vi khuẩn
• Trình bày được biểu đồ tăng trưởng ở vi khuẩn
• Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng trưởng
• Kiểm soát sự tăng trưởng của vi khuẩn

2
 Để tăng trưởng, vk cần được cung cấp đầy đủ năng
lượng, vật liệu xây dựng tb và điều kiện MT thích hợp:
• Năng lượng tạo ra từ
• VK kỵ khí: lên men
• VK hiếu khí: hô hấp
• VK lam: quang tổng hợp
• Chất dinh dưỡng
 Chất “thiết yếu” và chất “có ích”
 Chất đa lượng và chất vi lượng
 Yếu tố tăng trưởng
• Điều kiện nuôi cấy: pH, nhiệt độ, thông khí…
3
1. Carbon
• ½ chất khô tb → Ý nghĩa hàng đầu trong sự sống VSV
• Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp phụ tùy thuộc:
• Thành phần và cấu tạo hóa học nguồn C: mức độ
oxy hóa của nguyên tử C
- C vô cơ thuần: VSV không sử dụng
- C #: sử dụng được
- CO2: nguồn C duy nhất của VSV quang tổng hợp
• Đặc điểm sinh lý VSV: VSV đồng hóa trực tiếp chất
phân tử thấp, thủy phân chất cao phân tử

4
Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon:

Vi sinh vật

Nguồn C: CO2 Nguồn C: hữu cơ

Tự dưỡng Dị dưỡng

NL: Chất vô NL: Chất hữu

NL: Ánh sáng NL: Ánh sáng
cơ cơ
Quang tự Hóa tự Quang dị Hóa dị
dưỡng dưỡng dưỡng dưỡng
Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon:

6
6
2. Nitơ
• Nhu cầu thứ 2 trong tb
• Cấu tạo protein, acid nucleic, peptidoglycan
• VSV sử dụng N không chỉ phụ thuộc nguồn N, còn tùy tỉ
lệ C:N trong môi trường
• Nguồn N ở 2 dạng: vô cơ (muối nitrat, nitrit), hữu cơ
(pepton, nước thịt,…); N không khí: VSV cố định đạm
3. Phospho
• Tổng hợp ADN, ARN, ATP, phospholipid…
• Nguồn P vô cơ dễ sử dụng (KH2PO4). Hữu cơ: phức tạp,
cần enzym thủy phân thành P tự do; đắt tiền
7
4. Lưu huỳnh
Cấu tạo aa và vitamin. Thường dùng MgSO4.7H2O
5. Kali
Cấu tạo enzym tổng hợp protein, thường dùng KH2PO4
6. Magie
Ổn định ribosom, cần cho hoạt động các enzym, thường
dùng MgSO4.7H2O
7. Canxi
Không thiết yếu, ổn định nhiệt nội bào tử, dùng CaCl2
8. Natri: dùng NaCl
9. Sắt: cần cho enzym hô hấp, dùng FeCl3, FeSO4
8
9
9
Cần với lượng nhỏ nhưng không thể thiếu đ/v VSV
• Coban: cấu tạo vitB12
• Kẽm
• Đồng
• Mangan
• Niken
• Tungsteng, selen

10
Need very little amount but
critical to cell function.
Often used as enzyme
cofactors

11
11
 Ferric
enteroba
ctin

Aquachelin

12
• Là chất cần với lượng rất nhỏ, thiết yếu cho sự tăng
trưởng của VK nhưng tb không tự tổng hợp được
• Thường cung cấp dưới dạng
• Vitamin: chức năng coenzym
• Acid amin: cấu tạo protein
• Purin và pyrimidin: tổng hợp acid nucleic
→ Nếu dùng nguyên liệu hữu cơ (pepton, cao men)
thì đa số YTTT đã có sẵn, không cần bổ sung thêm

13
14
14
Dựa vào thành phần, chia thành
• MT tổng hợp: TPHH xác định
• MT tự nhiên: TPHH không xác định*

Dựa vào bản chất MT

• Lỏng: canh thang
• Rắn: thạch
• Bán rắn

15
Dựa vào mục đích sử dụng, chia thành
• MT cơ bản: đầy đủ cdd cho đa số VK tăng trưởng
• MT chuyên chở: rất ít cdd → VK sống mà ko phát triển*
• MT phong phú: MT cơ bản bổ sung thêm máu, dịch nấm
men,… để VK “kén ăn” phát triển*
• MT phân biệt: có đặc tính giúp khuẩn lạc VK cần khảo
sát có hình thức riêng biệt, dễ quan sát*
• MT chọn lọc: ngăn chặn hầu hết VK trừ VK khảo sát*
• MT xác định tính chất sinh hóa: phát hiện hoạt tính
enzym của VK thuần chủng*

16
Một số định nghĩa
• Sự tăng trưởng tb*: gia tăng số lượng tb/ sinh khối tb
• Tốc độ tăng trưởng: sự thay đổi số tb/ sinh khối tb
trong 1 đơn vị thời gian
• Thời gian thế hệ: thời gian để số tế bào nhân đôi
• Tăng trưởng lũy thừa: sự tăng trưởng có số tế bào tăng
gấp đôi ở mỗi giai đoạn → đường biểu diễn logarit 10 là
đường thẳng*

17
Tính thời gian thế hệ trong tăng trưởng lũy thừa*
N = No.2n
logN = logNo + nlog2
n = logN - logNo -P: Số tb cuối cùng
log2 -Po: Số tb ban đầu
n = logN - logNo -t: Thgian tăng trưởng lũy thừa
0.301 -n: Số thế hệ trong gđ lũy thừa
n = 3.3.logN/No -G: Thời gian thế hệ
G = t/n = t
3.3.logN/No

18
Nuôi cấy VK trong môi trường lỏng, bình kín thì Đường
cong tăng trưởng* như hình:

19
1. Pha tiềm ẩn
• VK thích ứng dần với MT mới, tích lũy cdd cho gđ phân
chia; dân số không tăng
• Cấy VK đang tăng trưởng lũy thừa vào cùng loại MT,
trong cùng đk nuôi cấy → bỏ qua pha tiềm ẩn
2. Pha lũy thừa
• Số lượng tb tăng theo cấp số nhân đến khi cạn kiệt cdd
thiết yếu/MT hoặc sản phẩm thải đạt đủ mức kiềm chế
• Tb có trạng thái khỏe mạnh nhất → lý tưởng để nghiên
cứu về enzym hoặc các thành phần khác

20
3. Pha ổn định
• Số tb sinh ra = số tb chết đi
4. Pha suy thoái
• Số tb chết đi > số tb sinh mới
• Sau khi đa số tb chết, tỷ suất chết giảm mạnh: một ít tb
tiếp tục sống sót 1 thời gian dài nhờ cdd từ tb chết thải
ra MT

21
 Tại sao vk lại trải qua pha tiềm ẩn?

 Tại sao ở pha ổn định, số lượng vk không tăng?

 Khi nào vk bước vào pha suy thoái?

 Nên kéo dài pha nào? Rút ngắn pha nào?

 Làm cách nào rút ngắn/ bỏ qua pha tiềm ẩn?

22
 Làm cách nào kéo dài pha lũy thừa?

 Nếu cấy vk đang ở pha ổn định, pha suy thoái vào MT

mới, đường cong tăng trưởng như hình nào? Vì sao?

A B C

23
Xác định toàn phần vi khuẩn
 Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm*
 Đo trọng lượng tế bào*
 Đo độ đục*
 Định lượng nitơ toàn phần
→ Nhược:
(1) Không phân biệt sống – chết
(2) Không chính xác, nhất là mật độ tb thấp
Xác định vk sống
 Đếm sống bằng pp trải đĩa*
 Xác định sản phẩm của vk sống (O2 hấp thu, ATP…)
24
 Nhiệt độ
 pH
 Áp suất thẩm thấu
 Oxy
 Nhiệt độ tối ưu
Tốc độ
Các PƯ enzym
tăng Các PƯ
trưởng
cao nhất
enzym tăng

Nhiệt độ

NĐ tối thiểu
NĐ tối đa
Màng bị tạo gel, quá
Protein biến tính, màng
trình vận chuyển chậm,
tb bị phá hỏng, ly giải
tăng trưởng ko diễn ra

26
•Nhóm ưa lạnh: To~<15oC •Nhóm ưa nhiệt: To~45-60oC
•Nhóm trung bình: To~20-40oC •Nhóm ưa nhiệt cao: To~>80oC

27
 VSV ưa trung tính

2 5 9 11

VSV ưa acid VSV ưa kiềm

(H. pylori) V. cholerae, Bacillus

28
Phân loại VSV theo nhu cầu oxy

Nhóm Mối liên hệ với oxy

Hiếu khí
Bắt buộc Cần
Tùy ý Không cần nhưng tăng trưởng tốt hơn nếu có
oxy
Vi hiếu khí Cần nhưng mới mức thấp hơn trong không khí
Kỵ khí
Bắt buộc Có hại hoặc chết
Chịu đc kk Không cần, tăng trưởng tốt hơn nếu ko có oxy

29
 Sản phẩm của hô hấp là các dạng độc tính cao của oxy
như: superoxid (O2-), hydroxyl (OH*), H2O2 có khả năng
oxy hóa các chất hữu cơ/ tb → VSV có enzym phân hủy
oxy độc: catalase, peroxidase, superoxid dismutase*

Ý nghĩa trong nuôi cấy VSV*

• VSV hiếu khí: lắc, khuấy, sục khí tiệt trùng vào MT
• VSV kỵ khí: khử oxy trong MT như thioglycolat, cho khí
tiêu oxy vào bình

30
31
31
Hydrogen
peroxide

Superoxide

32
32
 Môi trường hoạt tính nước thấp: VSV lấy nước bằng
cách tăng nồng độ chất tan nội bào

33
34
34
35
35
36
Một số khái niệm

 Sự vô trùng (Sterility) / Sự vô khuẩn (Aseptic)

 Tiệt trùng (Sterilisation) / Sát trùng (Antiseptic) / Tẩy
trùng (Disinfection)
 Chất kìm khuẩn (Bacteriostatic agent) / Chất diệt khuẩn
(Bacteriocidal agent)
 Sự nhiễm trùng (Contamination)
 Vệ sinh (Sanitation)

37
 Nhiệt ẩm có áp suất*: 121oC, 1.1 kg/cm2. Dùng cho sản
phẩm y tế, dụng cụ, MT nuôi cấy
 Nhiệt ẩm không áp suất: 62.8oC/30ph hoặc 71.7oC/15ph
(PP Pasteur, Tyndall)*
 Nhiệt khô: 180oC/2h. Thủy tinh, bột, dầu (lò sấy)
 Tia tử ngoại: không khí, bề mặt
 Tia phóng xạ: chỉ khâu, đồ nhựa dùng 1 lần*
 Lọc*: dung dịch (màng cellulose 0.45, 0.22μm) hoặc
không khí (lọc HEPA)

38
 Dung môi hữu cơ
 Kim loại nặng
 Phenol và dẫn xuất
 Halogen
 Chất tẩy
 Chất tác động bề mặt

39
Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tẩy trùng
 Thời gian
 Nhiệt độ
 pH
 Loại VSV
 Nồng độ chất tẩy trùng
 Môi trường xung quanh

40
 Tác nhân chọn lọc trên VSV, ít ảnh hưởng đến tb chủ
 Kháng sinh: chất nguồn gốc tự nhiên/ tổng hợp, tác
động tại chỗ/ hệ thống, hiệu quả kìm khuẩn/ diệt khuẩn

Đích tác động của Kháng sinh

kháng sinh
Ức chế tổng hợp thành β-lactam (penicillin, cephalosporin)
tế bào
Ức chế tổng hợp màng Polymycin
tế bào Kháng nấm (Amphotericin B, Nystatin)
Ức chế tổng hợp acid Quinolon, Rifampicin
nucleic 5-nitroimidazol
Ức chế tổng hợp Aminoglycosid, Tetracyclin, Spectinomycin
protein Chloramphenicol, Erythromycin
41
Sự trao đổi chất nhằm cung cấp:
 Vật liệu để xây dựng cơ thể
 Năng lượng ở dạng thích hợp cho tb. Quan trọng nhất là
NL ở dạng ATP, xem như “tiền tệ năng lượng” cho các
PƯ trao đổi NL của tb

43
 Glucose

Đường phân EM, HMP, ED

Acid pyruvic

CT Krebs
CO2

Chuỗi chuyền
điện tử
Chất nhận điện tử cuối cùng là:

Oxy SO42-, NO32- Chất hữu cơ

H2O S2-, NH3 A. lactic Rượu

HH hiếu khí Hô hấp Lên men

(OXH hoàn toàn) kỵ khí (OXH không hoàn toàn)
 MT có oxy O2 Hô hấp
Chuỗi chuyền hiếu khí
Đường phân CT Krebs
điện tử (OXH hoàn
H2O
toàn)
MT ko có oxy
NO3
Carbohydrat

N2 Hô hấp
SO4 kỵ khí

H2S

MT ko có oxy CHC
Hỗn hợp acid Lên men
(OXH không
hoàn toàn)
Hỗn hợp acetoin
 What is the generation time of a bacterial population
that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in
four hours of growth?

52
 What is the generation time of a bacterial population
that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in
four hours of growth?

G= t____
3.3.logN/No
G = 240 minutes
3.3.log107/104
G = 240 minutes
3.3 x 3
G = 24 minutes
53
 A single yeast cell that has the generation time of 30
minutes is introduced into a broth medium,
approximately how many cells would be in a culture
after 10 hours ?

A. 15
B. 1 million
C. 45 thousand
D. 330
E. 60 million

54
56
57
58
59