Chương 10 HPLC 2024

Mục tiêu
1. Trình bày được cơ chế tách và các pha dùng trong Sắc
ký Phân bố; phân biệt được sắc ký phân bố pha thuận và
pha đảo, dự đoán thứ tự rửa giải, vận dụng làm được bài
tập.
2. Vẽ được sơ đồ hệ thống HPLC và vai trò của từng bộ
phận; phân tích ưu nhược điểm của các loại detector UV-
VIS.
3. Trình bày, phân tích được cách tiến hành, cách tính kết quả
và vận dụng làm được bài tập về ứng dụng của HPLC.
119
Nội dung
1. Sắc ký phân bố (10.1.2)
2. Hệ thống HPLC (10.1.1)
3. Ứng dụng HPLC
120
Nội dung
121
1. Sắc ký phân bố
1.1. Giới thiệu
Sắc ký cổ điển: pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ
trọng lực ETE DẦU
HỎA/CS2
Dịch chiết lá
cây /EtOH
CỘT
NHỒI
CaCO3
–
122
1.1. Giới thiệu
Sắc ký hiện đại:
giảm kích thước pha tĩnh
Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất cao
High Pressure/Performance
Liquid Chromatography 123
(HPLC)
1.1. Giới thiệu
ETE DẦU HỎA –
Sắc ký hấp phụ Pha động
CỘT
NHỒI
CaCO3 –
Pha tĩnh
Pha tĩnh
CPT được hấp phụ
trên bề mặt pha tĩnh rắn
Hệ Lỏng –Rắn
Hệ Khí – Rắn
124
1.1. Giới thiệu
Sắc ký hấp phụ
Pha tĩnh: Chất rắn (Silicagel, Nhôm oxyd…)

Lưu giữ chất phân tích do lực hấp phụ
O OH OH OH OH
Al Al Al Al Al
O O O O O O
OH
OH
OH
OH
OH Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si Si
O O
Si
Si O O O
Si O O
O
O O
O
Si 125
Si O
O
O O
O
1.1. Giới thiệu
Hấp phụ Phân bố
(adsorption chromatography) (partition chromatography)
Pha tĩnh
CPT được hấp phụ CPT phân bố giữa hai pha
trên bề mặt pha tĩnh rắn Hệ Lỏng –Lỏng
Hệ Lỏng –Rắn Hệ Khí – Lỏng
Hệ Khí – Rắn 126
1.1. Giới thiệu
Sắc ký lỏng – lỏng
Pha tĩnh là lớp chất lỏng
bao quanh các hạt mang rắn
Sắc ký pha liên kết

Pha tĩnh có liên kết hóa học
với bề mặt chất mang
à Hiện nay hay được

sử dụng hơn
127
1.2. Pha tĩnh
§ Chế tạo từ silic dioxyd (silica) (SiO2.nH2O)
§ Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫn chất
clorosilan tạo
dẫn chất siloxan
bề mặt silica dẫn chất siloxan

128
1.2. Pha tĩnh
CH3
CH2
CH3 17 CH3
Si
CH2 SiCH3)3 CH3
17 CH3
SiCH3)3
SiCH3)3
O
Si O
CH3 O
O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O Si
Si O
Si O
Si O O
Si O O
O O
O O
O
Si
Si O
O
O O
O
129
1.2. Pha tĩnh
R - Pha tĩnh phân cực R - Pha tĩnh không phân cực

Amino -(CH2)2- NH2 ODS (C18) - (CH2)17-CH3
Cyano -(CH2)2- CN OS (C8) - (CH2)7-CH3
Diol - (CH2)2-O-CH(OH)-CH2OH Phenyl - (CH2)3- C6H5
Hay dùng trong Hay dùng trong

Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo
(Normal Phase) (Reverse Phase) 130
(SP phân cực giống thí nghiệm của Mikhail Tswett) (SP không phân cực, khác thí nghiệm củaTswett/Martin-Synge)
1.3. Pha động TT Tên dung môi Chỉ số UV cut-off
phân cực (nm)
Hỗn hợp các dung môi, P’
dung dịch muối, acid…
1 n-hexan 0,1 210
Chỉ số phân cực P’ 2 benzen 2,7 280

3 Methylen clorid 3,1 233
Dung môi kém phân cực 4 n-propanol 4,0 240
dùng cho sắc ký
5 THF 4,0 220
pha thuận 6 Ethyl acetat 4,4 255
7 cloroform 4,1 245
8 ethanol 4,3 210
9 Acid acetic 6,0 330
10 Acetonitril 5,8 190
Dung môi phân cực 11 Methanol 5,1 210
dùng cho sắc ký
pha đảo 12 Nước 10,2 205131
1.3. Pha động
Phân loại Sắc ký phân bố pha thuận Sắc ký phân bố pha đảo
Đặc điểm (Normal Phase) (Reverse Phase)
Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực
Pha động Kém phân cực Phân cực

(kém phân cực hơn pha tĩnh) (phân cực hơn pha tĩnh)
132
1.3. Pha động

Phân tích PAR và IBU trong chế phẩm bằng sắc ký

- Pha tĩnh: Cột ODS (C18) (250x4,6 mm; 5um)
- Pha động: hỗn hợp acetonitril – dd đệm phosphat 10 mM (50:50 v/v)
Phân loại loại hình sắc ký trên?
133
1.3. Pha động

Phân tích corticosteron, hydrocortison bằng sắc ký

- Pha tĩnh: cyanopropyl (250x4,6 mm; 5um)
- Pha động: n-hexan/methanol/dicloromethan (75/20/5)
Phân loại loại hình sắc ký trên?
134
1.4. Thứ tự rửa giải
Thứ tự Chất kém phân cực hơn Chất phân cực hơn
rửa giải ra trước ra trước
135
Độ phân cực CPT:
- Nhóm chức:
HC < HC thơm < dc halogen <
< ether < dc nitro < este < alcol ~ amin <
< amid < acid carboxylic
- Chỉ số lg P:
CS octanol
càng lớn à càng kém pc lg P(octanol/H2O)=lg
CS H2O
136
- Sắp xếp theo độ phân cực giảm dần:
1> 2 > 3
- SK PB pha thuận: chất kém PC hơn ra trước
à thứ tự rửa giải: 3, 2, 1
- SKPB pha đảo: chất PC hơn ra trước
à thứ tự rửa giải : 1, 2, 3
SK Phân bố pha thuận SK Phân bố pha đảo 137

Thứ tự Chất kém phân cực hơn Chất phân cực hơn
rửa giải ra trước ra trước
Tăng độ
phân cực
pha động tR giảm tR tăng
(tăng tỷ lệ
thành phần
PC hơn) 138
Phân tích Paracetamol- Codein
Pha tĩnh: C8
Pha động: (H2O:MeOH = 80:20)
1. Phân loại SK: Pha đảo

2. Khi thay đổi tỷ lệ MP
(H2O:MeOH = 90:10)
tR thay đổi thế nào? Tăng
139
Phân cực hơn ra trước
CPT Nước,
(A&B) dung dịch đệm/acid
Acetonitril (ACN),
C18, PHA ĐẢO Methanol (MeOH)
C8,
Phenyl Pha tĩnh Pha động Tăng dung môi PC
Kém PC Phân cực à Tăng tR
Pha tĩnh Pha động Hexan,

Amino Phân cực Kém phân cực cloroform
Cyano methylen clorid
Diol PHA THUẬN
CPT Tăng dung môi PC

(A&B) à Giảm tR
140
Kém phân cực hơn ra trước
1.5. Lựa chọn pha tĩnh và pha động
Xem xét độ phân cực CPT:
- Nhóm chức:
HC < HC thơm < dc halogen <
< ether < dc nitro < este < alcol ~ amin <
< amid < acid carboxylic
- Chỉ số lg P: CS octanol
càng lớn à càng kém pc
lg P(octanol/H2O)=lg
CS H2O
141
Hai cách chọn pha tĩnh và pha động
- Chọn pha động có độ phân cực gần với chất PT;
Pha tĩnh có độ phân cực khác xa với pha động
- Chọn pha tĩnh có độ phân cực gần với chất PT;
Pha động có độ phân cực khác xa với pha tĩnh
(hay dùng hơn)

142
Chất kém Chất phân cực

Ion
Phân Cực trung bình
SK SK
Hấp SK phân bố SK phân bố trao
pha đảo pha thuận
phụ đổi
ion
143
Nội dung
144
Thiết bị HPLC
145
Sơ đồ máy HPLC
Bộ phận Detector Hệ thu nhận,
tiêm mẫu xử lý dữ liệu
Bơm
Cột/
Lò
cột Bình đựng thải
Hệ thống
cấp dung môi
146
2.1. Hệ thống cấp dung môi
§ Dung môi được đựng trong 1 hoặc nhiều
bình thuỷ tinh, được hút qua dây dẫn vào hệ
thống bằng bơm
§ Trước khi dùng thường phải lọc (hay dùng

màng lọc 0,45 μm), siêu âm đuổi bọt khí (trừ
trường hợp có hướng dẫn khác của NSX)
147
2.1. Hệ thống cấp dung môi
Hai cách dùng pha động
Đẳng dòng Chương trình dung môi

(isocratic) (gradient)
pha động không thay đổi Thay đổi pha động trong
quá trình SK
trong quá trình SK
• Thành phần
• Tỷ lệ
• Tốc độ… 148
2.2. Bơm
§ Đẩy pha động từ bình chứa dung môi đi
qua cột bằng áp suất cao (250-500 at).
§ Bền với nhiều loại dung môi và áp suất
cao.
§ Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng

0,01 – 5 ml/phút
149
2.2. Bơm
§ Hai loại bơm:
§ Trộn áp suất cao
§ Trộn áp suất thấp
Bơm trộn áp suất cao Bơm trộn áp suất thấp

(Bơm đôi – Binary Pump) (Bơm bốn – Quartenary Pump)
150
2.3. Hệ tiêm mẫu
§ Mẫu lỏng được tiêm thẳng vào pha động cao áp ở
ngay đầu cột mà không cần dừng dòng
§ Van tiêm và vòng chứa mẫu kích thước khác nhau
151
§ Tiêm mẫu bằng tay
§ Vòng chứa mẫu
có thể tích xác định
§ Dùng tay hút mẫu vào xylanh
và tiêm vào hệ tiêm mẫu
1. Mẫu vào
2. Ra
3. Vòng chứa mẫu
4. Dung môi vào
5. Cột
6. Tiêm
152
Thiết bị đo thể tích
§ Tiêm mẫu bằng tay
(1) Từ bơm
§ Tiêm mẫu tự động
Đến cột
(phổ biến hiện nay)
Tiêm thể tích mẫu khác nhau
không cần thay vòng chứa mẫu
(2) Từ bơm
(điều chỉnh bằng piston)
Đến cột
(1) Chưa có mẫu
(2) Hút mẫu
(3) Tiêm vào hệ thống
(3) Từ bơm
Đến cột
153
2.4. Cột và pha tĩnh
§ Chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc
chất dẻo
§ Trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao
§ Nhồi các hạt pha tĩnh
§ Trên cột ghi kích thước cột, loại pha tĩnh,

kích thước hạt nhồi
§ Ví dụ: ZORBAX SB C18 (4,6x150 mm, 5 μm)
154
2.4. Cột và pha tĩnh
§ Cột bảo vệ
§ Ngắn hơn cột sắc ký, nhồi cùng loại hạt
và kích thước hạt lớn hơn.
§ Đặt trước cột nhằm loại tạp chất
§ Hệ thống điều nhiệt cột
155
2.5. Detector
§ Phát hiện các chất PT dựa vào:
§ Đáp ứng chọn lọc với chất PT (VD đo độ hấp thụ)
§ Tính chất chung của chất PT trong MP (VD đo độ dẫn
điện)
§ Các yêu cầu
§ Đáp ứng nhanh và lặp lại
§ Độ nhạy cao
§ Vận hành ổn định, dễ sử dụng
§ Khoảng hoạt động tuyến tính rộng
§ Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
156
2.5. Detector
§ 6 loại detector hay gặp
§ Hấp thụ UV-VIS
§ Huỳnh quang
§ Chỉ số khúc xạ
§ Tán xạ bay bay hơi
§ Đo dòng
§ Độ dẫn
157
2.5.1. Detector hấp thụ UV-VIS
§ Nguyên tắc
§ Thực chất là một thiết bị đo quang phổ UV-VIS
§ Liên tục đo tín hiệu, độ hấp thụ của dung dịch
chảy qua 1 tế bào đo
à Phát hiện các chất có khả năng hấp thụ UV-
VIS khác pha động ở bước sóng đo
158
Dung dịch ra khỏi tế bào đo,
§ TB đo: ống hình trụ vào bình đựng thải
d = 1 mm, L = 10 mm
§ Có hai mặt bằng thạch anh,
Tế bào đo
trong suốt để ánh sáng từ
nguồn sáng đi qua
§ Dung dịch đo: chảy liên tục
qua buồng chứa mẫu (pha
động + CPT)
§ Ghi độ hấp thụ của dd đo
trong cả quá trình phân tích
Dung dịch ra khỏi cột,
vào tế bào đo
159
§ 3 cấu hình:
§ Detector đo ở bước sóng cố định (fixed
wavelength)
§ Detector đo ở bước sóng thay đổi (variable
wavelength)
§ Detector mảng diod (Diod Array Detector - DAD)
(Photo Diod array – PDA)
160
§ Detector đo ở bước sóng cố định
§ Nguồn sáng: đèn Hg (254 nm);
đèn Wonfram (W) (436 nm)
§ Ưu điểm:
§ rẻ tiền
§ phù hợp với CPT hấp thụ mạnh ở l
đo (VD: chất có nhân thơm – đèn Hg)
§ Nhược điểm:
§ Với CPT không hấp thụ tại l này
à không phát hiện
§ Với chất hấp thụ yếu tại l này
à chỉ phát hiện ở nồng độ cao
161
§ Detector đo ở bước sóng thay đổi
§ Nguồn sáng:
§ Đèn D2 (vùng UV),
đèn W (vùng VIS)
§ Bộ phân đơn sắc hoá đặt trước
tế bào đo
§ Ưu điểm: Đo được ở l vùng UV-VIS
à chọn được bước sóng phù hợp
§ Nhược điểm:
§ Chỉ chọn được 1 l
Các CPT có phổ hấp thụ khác nhau
à khó chọn được l tối ưu
162
§ Detector mảng diod (DAD - PDA)
§ Nguồn sáng:
§ Đèn D2 (vùng UV),
đèn W (vùng VIS)
§ Bộ phận đơn sắc hoá đặt sau
tế bào đo
§ Ưu điểm:
§ Đo được ở nhiều l vùng UV-VIS
cùng một lúc à chọn được các l
phù hợp cho nhiều CPT
§ Quét phổ, phổ 3D, so sánh phổ để
định tính, thử tinh khiết pic sắc ký...
§ Nhược điểm?? 163
Phổ 3D
- Độ hấp thụ
- Thời gian
- Bước sóng
164
Định tính:
chồng phổ hấp thụ
thu từ pic thử trong
SKD mẫu thử
với pic chuẩn trong
SKD mẫu chuẩn
165
Nội dung
166
§ Tách các chất
§ Định tính
§ Định lượng
167
tR
Định tính Định lượng
• tR h
• S
• Vị trí • h
trên
SKD
168
3.1. Định tính
§ Mẫu thử có chứa chất A, B, C… hay không?

§ Mẫu thử có chứa chất gì?
Định tính
169
3.1. Định tính

§ Sử dụng chất chuẩn đối chiếu (chuẩn ngoại)
Chất chuẩn Mẫu thử

Xử lí mẫu
DD chuẩn DD thử
Chạy sắc ký
cùng điều kiện
Sắc ký đồ dd chuẩn Sắc ký đồ thử
So sánh thời gian lưu của các pic trên

170
SKĐ của mẫu thử với SKD mẫu chuẩn
3.1. Định tính
tRC
Sắc ký đồ dd chuẩn
Đáp ứng
tRC
Thời gian
Sắc ký đồ dd thử
tRT
171
3.1. Định tính
Sắc ký cột:
So sánh tR các pic trong SKĐ dd thử
với pic chất chuẩn trong SKĐ dd chuẩn

Nếu xuất hiện pic có tRT ≈ tRC
à Mẫu thử có chất phân tích
Chú ý: Dương tính giả?
Sử dụng thêm thông tin khác (VD: chồng phổ)
172
Chồng phổ
173
3.1. Định tính
Sắc ký cột:
So sánh tR các pic trong SKĐ dd thử
với pic chất chuẩn trong SKĐ dd chuẩn

Nếu xuất hiện pic có tRT ≈ tRC
à Mẫu thử có chất phân tích
Chú ý: Dương tính giả?
Sử dụng thêm thông tin khác (tuỳ detector)
174
3.1. Định tính

§ Mẫu thử có chứa chất gì?
Mẫu thử
Xử lí mẫu
DD thử
Chạy sắc ký
Sắc ký đồ mẫu thử Tách lấy phân đoạn

Detector - Xác định cấu trúc Xác định cấu trúc
(NMR, MS phân giải cao…) (IR, NMR, MS …)
175
3.2. Định lượng
§ Nồng độ/ hàm lượng chất A,B,C… là bao nhiêu?
C = ????
Đáp Diện tích pic (S),
ứng
Chiều cao pic (h)
Thời gian
176
3.2.1. Phương pháp ngoại chuẩn

(external standard – ES)
3.2.2. Phương pháp nội chuẩn
(internal standard – IS)
3.2.3. Phương pháp thêm chuẩn
3.2.4. Phương pháp chuẩn hoá diện tích
177
§ Chất chuẩn ngoại có BẢN CHẤT là CHẤT

CẦN PHÂN TÍCH
§ Đạt yêu cầu chất chuẩn, TINH KHIẾT
178
3.2.1.1. Ngoại chuẩn một điểm (So sánh)
3.2.1.2. Ngoại chuẩn nhiều điểm (Đường chuẩn)
179
Chất chuẩn ngoại Mẫu thử

Xử lí mẫu
DD chuẩn DD thử
CC (đã biết) CX
Sắc ký
Xác định pic Xác định pic

SC SX
180

§ Chuẩn bị
Dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết CC
Dung dịch thử có nồng độ chưa biết CX
§ Phân tích
Dung dịch chuẩnà xác định pic, SC
Dung dịch thử à định tính, SX
§ Tính CX
181

- Xác định đúng pic CPT trong SKD mẫu thử và
chuẩn (Định tính)
- Lấy các số liệu
Dung dich Nồng độ S pic
Chuẩn CC SC
Thử CX = ? SX
- Tính CX
C x Sx C X = CC
SX
=
Cc Sc SS 182
Mẫu chuẩn
Mẫu thử
183

Xử lí mẫu
Nhiều DD chuẩn DD thử
CC1 à CCn (đã biết) CX
Sắc ký

SC1 à SCn SX
Lập PT SC theo CC 184

§ Chuẩn bị
Các dd chuẩn có nồng độ đã biết CC1à CCn
Dung dịch thử có nồng độ chưa biết CX
§ Phân tích
Các dd chuẩnà xác định pic, SC1 à SCn
Dung dịch thử à định tính, SX
§ Lập phương trình: diện tích SC theo CC

§ Tính CX 185
SX
CX
186
- Xác định đúng pic CPT trong SKD mẫu thử và chuẩn
(Định tính) Dung dich Nồng độ S pic
- Lấy các số liệu Chuẩn 1 CC1 SC1
Chuẩn 2 CC2 SC2
Chuẩn 3 CC3 SC3
Chuẩn 4 CC4 SC4
Chuẩn n CCn SCn
Thử CX = ?? SX
- Xây dựng đường chuẩn SC = aCC + b
(hệ số tương quan r)

- Tính CX = (SX – b)/a 187
Ví dụ 1:
Phân tích paracetamol (PAR) trong dung dịch X
bằng HPLC. Chạy sắc ký các dung dịch sau trong
cùng điều kiện:
- Dung dịch PAR chuẩn (50,0 ppm)
- Dung dịch X
Thời gian lưu và diện tích pic chính thu được trong
các SKD như sau:
Mẫu tR (ph) S (mAU*s)
Hỏi:
Chuẩn 8,32 2000
- Phương pháp định lượng?
X 8,35 2020
- CPAR trong dd X?
188
Ví dụ 2:
Phân tích paracetamol (PAR) và ibuprofen (IBU) trong
dung dịch Y bằng HPLC. Chạy sắc ký các dung dịch sau
trong cùng điều kiện:
- Dung dịch PAR chuẩn (32,5 ppm)
- Dung dịch IBU chuẩn (20 ppm)
- Dung dịch hỗn hợp PAR chuẩn (32,5 ppm) và IBU chuẩn
(20 ppm)
- Dung dịch Y Mẫu tR1 (ph) S tR2 (ph) S
Thời gian lưu và diện tích pic
Chuẩn 8,32
chính trong các SKD như sau: PAR
Hỏi Chuẩn 10,34
- Vai trò dung dịch PAR chuẩn IBU
và dung dịch IBU chuẩn? Chuẩn 8,34 1000 10,36 990
- Phương pháp định lượng? HH
189
- CPAR và CIBU trong dd Y? Y 8,36 990 10,34 1000
Ví dụ 3:
Phân tích paracetamol (PAR) trong dung dịch Z
bằng HPLC. Chạy sắc ký các dung dịch sau trong
cùng điều kiện:
- 5 dung dịch PAR chuẩn có nồng độ 10, 20, 30,
40, 50 (ppm)
Mẫu tR (ph) S (mAU*s)
- Dung dịch Z
Chuẩn 10 8,31 500
Thời gian lưu và diện tích
Chuẩn 20 8,34 1005
pic chính thu được trong
Chuẩn 30 8,32 1525
các SKD như sau
Chuẩn 40 8,33 2086
Hỏi
- Phương pháp định lượng? Chuẩn 50 8,32 2591
- CPAR trong dd Z? Z 8,35 2000 190

Vấn đề:
Khi thể tích tiêm mẫu không lặp lại?
Xử lý mẫu phức tạp, hiệu suất không không lặp lại?
à Ảnh hưởng đến kết quả phân tích
191

192
Thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng như nhau
của một chất chuẩn thứ hai (chuẩn nội – IS)
§ có bản chất hoá học gần giống chất phân tích
§ độ tinh khiết cao
Yêu cầu với IS?
§ Tách hoàn toàn khỏi các pic khác
§ Có tR gần với tR của chất thử
193
Ví dụ
- Phân tích prednisolon trong huyết tương
- Chuẩn ngoại: prednisolon
- Chuẩn nội: betamethason
194
3.2.2.1. Nội chuẩn một điểm (So sánh)
3.2.2.2. Nội chuẩn nhiều điểm (Đường

chuẩn)
195

Thêm cùng một lượng IS
Xử lí mẫu
dd chuẩn dd thử
CC (đã biết), CIS CX, CIS
Sắc ký
Xác định các pic Xác định các pic

SC, SIS(C) SX, SIS(T)
196

§ Chuẩn bị
dd chuẩn có nồng độ đã biết CC, thêm một lượng CIS
dd thử có nồng độ chưa biết CX, thêm cùng một lượng CIS
§ Phân tích
Dung dịch chuẩn, xác định pic CPT, IS, SC, SIS(C)
Dung dịch thử, xác định pic CPT, IS, SX, SIS(X)
§ Tính RC = SC/SIS(C); RX = SX/SIS(X)

§ Tính CX 197
Thử + chuẩn nội Chuẩn ngoại + chuẩn nội

SX SC
SIS SIS
198

- Xác định đúng pic CPT, IS trong SKD mẫu thử và
chuẩn có IS (Định tính)
Dung Nồng độ S CPT SIS Tính R
dich CPT
Chuẩn CC SC SIS(C) R(C)
Thử CX = ? SX SIS(X) R(X)
- Tính RC và RX
!& !!
- Tính CX RC = RX =
!"#(&) !"#(!)
"!
CX = CC 199
"&
3.2.2.2. Nội chuẩn nhiều điểm (Đường chuẩn)

Mẫu thử
Thêm cùng một lượng IS
Xử lí mẫu
Các dd chuẩn DD thử
CC1àCCi (đã biết), CIS Cx, CIS
Sắc ký
Xác định các pic Xác định các pic
SC1, SIS(C1) Sx, SIS(X)
SC2, SIS(C2)
… 200
SCn, SIS(Cn)…

§ Chuẩn bị
Các dd chuẩn có C đã biết CC1à CC5, thêm cùng một lượng CIS
dd thử có nồng độ chưa biết CX, thêm cùng một lượng CIS
§ Phân tích
Các dd chuẩn, xác định pic CPT, IS, SCi, SIS(Ci)
dd thử, xác định pic CPT, IS, SX, SIS(X)
§ Tính RCi = SCi/SIS(Ci); RX = SX/SIS(X)

§ Lập phương trình biểu diễn RCi theo Cci (hoặc CCi/CIS)
201
§ Tính CX
Pic chuẩn nội
RC
Pic chuẩn ngoại
CC
Pic CPT (thử)
202

- Xác định đúng pic CPT, IS trong SKD mẫu thử và
chuẩn có IS (Định tính)
- Lấy các số liệu Dung dich Nồng độ CPT S CPT SIS Tính R
- Tính RCi và RX Chuẩn 1 CC1 SC1 SIS(C1) R(C1)

Chuẩn 2 CC2 SC2 SIS(C2) R(C3)
!! !&' Chuẩn 3 CC3 SC3 SIS(C3) R(C3)
RX = RCi =
!"#(!) !"#(&') Chuẩn 4 CC4 SC4 SIS(C4) R(C4)
Chuẩn n CCn SCn SIS(Cn) R(Cn)
- Lâp phương trình Thử CX = ? SX SIS(X) R(X)
RCi = aCCi + b
- Tính CX = (RX – b)/a
203
🙂 Giảm sai số do quá trình xử lí mẫu phức tạp, do quá
trình tiêm mẫu
204
☹ Khó tìm chất chuẩn nội
☹ Cấu trúc chất chuẩn nội gần giống chất chuẩn ngoại
à Tìm điều kiện tách có thể khó khăn
205
§ Ví dụ
Phân tích methyl prednisolon (MEP) trong dung dịch X
bằng HPLC:
+ mẫu chuẩn: hút 1 ml dung dịch chuẩn MEP 500 ppm
và 1 ml dung dịch chuẩn prednisolon (PRED) 500 ppm
vào bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ bằng dung môi,
xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng được dung dịch A.
+ mẫu thử: 1 ml dung dịch X và 1 ml dung dịch chuẩn
PRED nồng độ 500 pm vào bình định mức 10 ml, định mức
vừa đủ bằng dung môi, xử lý mẫu này bằng chiết lỏng lỏng
tương tự mẫu chuẩn được dung dịch B.
Mẫu tR (MEP) S MEP tR (PRED) SPRED
dd A 15,67 1000 18,57 750
dd B 15,78 1200 18,55 800
- Phân loại pp định lượng trên

- Tính CMEP trong dung dịch X 206

207
3.2.3.1. Thêm chuẩn một điểm
3.2.3.2. Thêm chuẩn nhiều điểm (Thêm đường chuẩn)
208

Mẫu thử Mẫu thử
Thêm một lượng
chuẩn ngoại CC
Xử lí mẫu
dd thử dd thử thêm chuẩn
CX CX + CC
Sắc ký

SX SC
209

§ Chuẩn bị
dd thử có nồng độ chưa biết CX
dd thử có nồng độ chưa biết CX, thêm một lượng chuẩn CC
§ Phân tích
Dung dịch thử, xác định pic CPT, SX
Dung dịch thử thêm chuẩn, xác định pic CPT, SC
§ Tính CX
210
jcblajscbn;ca
211

- Xác định đúng pic CPT trong SKD mẫu thử và thử
thêm chuẩn (Định tính)

Thử thêm chuẩn CX (=?) + CC SC
Thử CX = ? SX
- Tính CX
"! !! "&
= CX = S$
"! #"& !& !& %!!
212
3.2.3.2. Thêm đường chuẩn

Mẫu thử n mẫu thử
Thêm các lượng
khác nhau
Xử lí mẫu chất chuẩn ngoại
C1àCn
dd thử dd thử thêm chuẩn
CX CX + CC1; CX + CC2; CX + CC3; CX + CC4…
Sắc ký

SX SC1 à SCn
213

§ Chuẩn bị
dd thử có nồng độ chưa biết CX
n dd thử có nồng độ chưa biết CX, thêm vào mồi dung dịch
một lượng khác nhau chuẩn ngoại CC1 à CCn
§ Phân tích
Dung dịch thử à xác định pic CPT, SX
Các dung dịch thử thêm chuẩn à xác định pic CPT, SCi
§ Tìm mối quan hệ giữa SCi và lượng chuẩn CCi thêm vào
§ Tính CX 214
215
216

- Xác định đúng pic CPT trong SKD mẫu thử và các
mẫu thử thêm chuẩn (Định tính)
Thử thêm chuẩn CX (=?) + CCi SCi
Thử CX = ? SX
- Vẽ đồ thị SCi theo lượng chuẩn CCi thêm vào
- Tìm giao điểm của đường biểu diễn với trục hoành,
xác định CX
217

218
Nguyên tắc:
Hàm lượng % của một chất/ hỗn hợp bằng tỷ lệ % diện
tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic
trên SKĐ
SA SA
%A= ×100% = n x100%
S1 + S2 +...+ Sn
å Si i=1
219
Phân tích
imipenem (IMI)
và cilastatin (CIL)
Trong hỗn hợp Phổ hấp thụ Phổ hấp thụ
CIL IMI
bằng HPLC
SKD hỗn hợp ghi ở l 226 nm

Hai pic
CIL IMI
SKD hỗn hợp ghi ở l 312 nm

Không thấy pic CIL????
IMI
220
Yêu cầu
§ Tất cả các thành phần được rửa giải
§ Tất cả các thành phần được phát hiện và có hệ số đáp

ứng trên detector như nhau
§ VD: xác định % tạp chất liên quan
221
222
223
Ví dụ:
§ Phân tích mẫu chứa chất A và các tạp chất liên quan
bằng HPLC
§ Tính % từng tạp
§ Tính % tổng các tạp Pic S pic
Tạp 1 200
Tạp 2 250
A 47500
Tạp 3 250
Tạp 4 200
224
Xác định f khi hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành
phần khác nhau:
Chạy SK một dd chuẩn có nồng độ đã biết (CC) và đo diện
tích của nó (SC):
CC
fi =
SC
SA .f A
%A= .100%
S1f1 + S2f 2 +...+ Sn f n 225
Ví dụ:
§ Phân tích mẫu chứa chất A và các tạp chất

Pic S pic
liên quan bằng HPLC
Tạp 1 200
§ Tính % từng tạp Tạp 2 250
A 47500
§ Tính % tổng các tạp Tạp 3 250
Tạp 4 200
Biết hệ số đáp ứng fi
của A và tạp 1,2,3,4 lần lượt là 0,100; 0,102;

226
0,110, 0,095 và 0,105
Mục tiêu
1. Trình bày được cơ chế tách và các pha dùng trong Sắc
ký Phân bố; phân biệt được sắc ký phân bố pha thuận và
pha đảo, dự đoán thứ tự rửa giải, vận dụng làm được bài
tập.
2. Vẽ được sơ đồ hệ thống HPLC và vai trò của từng bộ
phận; phân tích ưu nhược điểm của các loại detector UV-
VIS.
3. Trình bày, phân tích được cách tiến hành, cách tính kết quả
và vận dụng làm được bài tập về ứng dụng của HPLC.
227

Chương 10 HPLC 2024

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Chương 10 HPLC 2024

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Mục tiêu

2. Hệ thống HPLC (10.1.1)

3. Ứng dụng HPLC

2. Hệ thống HPLC (10.1.1)

3. Ứng dụng HPLC

Pha tĩnh: Chất rắn (Silicagel, Nhôm oxyd…)

Sắc ký pha liên kết

à Hiện nay hay được

bề mặt silica dẫn chất siloxan

R - Pha tĩnh phân cực R - Pha tĩnh không phân cực

Cyano -(CH2)2- CN OS (C8) - (CH2)7-CH3

Diol - (CH2)2-O-CH(OH)-CH2OH Phenyl - (CH2)3- C6H5

Hay dùng trong Hay dùng trong

Chỉ số phân cực P’ 2 benzen 2,7 280

Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực

Pha động Kém phân cực Phân cực

Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực

Pha động Kém phân cực Phân cực

Phân tích PAR và IBU trong chế phẩm bằng sắc ký

Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực

Pha động Kém phân cực Phân cực

Phân tích corticosteron, hydrocortison bằng sắc ký

Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực

Pha động Kém phân cực Phân cực

SK Phân bố pha thuận SK Phân bố pha đảo 137

Pha tĩnh Phân cực Kém phân cực

Pha động Kém phân cực Phân cực

1. Phân loại SK: Pha đảo

Pha tĩnh Pha động Hexan,

CPT Tăng dung môi PC

- Chọn pha động có độ phân cực gần với chất PT;

Pha tĩnh có độ phân cực khác xa với pha động

- Chọn pha tĩnh có độ phân cực gần với chất PT;

Pha động có độ phân cực khác xa với pha tĩnh

(hay dùng hơn)

Chất kém Chất phân cực

2. Hệ thống HPLC (10.1.1)

3. Ứng dụng HPLC

§ Trước khi dùng thường phải lọc (hay dùng

Hai cách dùng pha động

Đẳng dòng Chương trình dung môi

§ Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng

Bơm trộn áp suất cao Bơm trộn áp suất thấp

§ Van tiêm và vòng chứa mẫu kích thước khác nhau

§ Nhồi các hạt pha tĩnh

§ Trên cột ghi kích thước cột, loại pha tĩnh,

§ Hệ thống điều nhiệt cột

2. Hệ thống HPLC (10.1.1)

3. Ứng dụng HPLC

§ Mẫu thử có chứa chất A, B, C… hay không?

§ Mẫu thử có chứa chất A, B, C… hay không?

Chất chuẩn Mẫu thử

Sắc ký đồ dd chuẩn Sắc ký đồ thử

So sánh thời gian lưu của các pic trên

So sánh tR các pic trong SKĐ dd thử

với pic chất chuẩn trong SKĐ dd chuẩn

à Mẫu thử có chất phân tích

Chú ý: Dương tính giả?

Sử dụng thêm thông tin khác (VD: chồng phổ)

So sánh tR các pic trong SKĐ dd thử

với pic chất chuẩn trong SKĐ dd chuẩn

à Mẫu thử có chất phân tích

Chú ý: Dương tính giả?