Koloni-PCR

Koloni-PCR
Metoden er en PCR metode, hvor man fremstiller et mastermix af
dNTP, Taq-polymerase, buffer og primere, og tilsætter lidt af en bak-
teriekoloni, som indeholder template-DNA. Metoden er tidsbespa-
rende, idet man ikke først skal oprense DNA fra bakterien og fordi
mange kolonier hurtigt kan screenes.

Koloni-PCR kan bl.a. anvendes til at bestemme om en E. coli stamme

er rekombinant. Man undersøger, om den indeholder plasmid-DNA
med et insert af donor-DNA i Multiple Cloning Site (MCS), og i så
fald, hvor stort det er, målt i antal basepar.

Template-DNA er plasmidet (vektoren), og metoden fungerer, selv-

om der også er kromosomalt DNA fra bakterierne i PCR røret.

Bakteriecellerne lyseres i PCR programmets Hot Start. Hermed bli-

ver cellernes DNA tilgængeligt, og DNA-området, som primerne af-
grænser kopieres ved PCR.

I det viste eksempel med kloningsvektorer som pUC18/19 er de to

primere komplementære til DNA-sekvenser i yderområderne af
MCS (se figur 1 og 2) i plasmidet. Hermed kan det undersøges om
der er indsat donor-DNA ved kloningen.

På nedenstående figur (figur 1) er vist et rekombinant plasmid.

MCS med insert Figur 1: pUC18/19 med insert

Primernes bindingssteder er
MCS med insert markeret med blå pile.
 MOLEKYLÆRBIOLOGI OG BIOKEMI – EKSTRA MATERIALE

Hvis plasmidet ikke har indsat donor DNA (tom vektor), vil PCR
produktet blive på størrelse med MCS.
Hvis plasmidet indeholder et insert, vil PCR produktets størrelse
blive insertets størrelse plus en del af MCS.

pUC18/19 Vector Map

Her er vist kloningsvektoren pUC 18 (figur 2), med opbygningen
af Multiple Cloning Site og bindingen af primerne M13, forward og
reverse, som bl.a. kan anvendes ved koloni-PCR.

pUC18/19
pUC18/19 Vector
Vector Map
Map

Figur 2: Kloningsvektoren pUC 18

(kilde: www.genscript.com).

Multiple
Multiple
Multiple Cloning
Cloning
Cloning Sites
MCS Sites
– i of
Sites of pUC18:
detaljer
pUC18: of pUC18:
Hincll Hincll
Cfr9I Ecl136I
Hincll Cfr9I Ecl136I Cfr9I E
Sall Eco88I Acc651I Eco241 EcoRI
M13 Hindlll
Hindlll Pael Sdal Bevl Sall SallEco88I
SmaI Acc651I Eco241 EcoRIEco88I Acc651I E
Xapl
M13 M13 Hindlll
Sdal Bevl Xmil XbaI Bevl
XbaI BamHI SmaI Kpnl
SacI
CGASdal
Pael Xapl
CGA ATTSmaI
SacI
5’ G TAA AAC GAC GGC CAG TGC CAA GCT TGC ATG CCT GCA Pael GGT Xmil BamHI Kpnl S
CTC TAG AGG ATC CCC GGGXbaI
Xmil BamHI
TAC CGA GCT C Kpnl
5’ G TAA AAC GAC GGC CAG TGC CAA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TAC CGA GCT CGA ATT C
3’ 5’
C AGTTTAA AACCCG
TTG CTG GAC GGC
G TC ACG CAG TGC
GTT CGA TACGCT
CAA
ACG TGCCCA
GGA CGT ATG GCTCCT
GAGGCA GGT
ATC TCC CGA
TAG GGGCTC TAGGCT
CCC ATG AGGCGAATC CCCGGGG TAC CG
GCT TAA
3’ C A TT TTG CTG CCG G TC ACG GTT CGA ACG TAC GGA CGT CCA GCT GAG ATC TCC TAG GGG CCC ATG GCT CGA GCT TAA G
Ala His CGA ACGThr TACSer
SerGGA
Glu CGT CCAAspGCT
Asp Gly GAG ATCSerTCC
Ser Ser TAG
Ser Ser GGG
3’ C AVal
TT Val
TTGAla
CTGLeuCCG Ser Asn CCC ATG GC
Ala G
Ala LeuTCSer
ACG
LacZ Leu Ser AlaGTT
His Arg Cys Leu Pro Gly Pro Val Asn
LacZ Val Val Ala Leu Arg Cys Thr Glu Leu Pro Pro Val
LacZ Val Val Ala Leu Ala Leu Ser Ala His Arg Cys Thr Ser Glu Leu Pro Asp Gly Pro Val Se
GT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG 3’
GT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG 3’
CA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC 5’
CA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC 5’
ThrGT
Ile AAT
Met CAT GGT
Thr Met CAT AGC TGT TTC CTG 3’
Thr Ile Met Thr Met
M13
CA TTA GTA CCA GTA
M13 TCG ACA AAG GAC 5’
Thr Ile Met Thr Met På figur 2 ses DNA-sekvensen i MCS i begge strenge, og genkendel-
sessites for restriktionsenzymer er vist. M13 er sekvenser fra bakte-
Multiple
Multiple Cloning
Cloning Sites
M13riofag
Sites of
M13,of
som er
pUC19:
pUC19:
indsat i plasmidet. Disse M13 sekvenser kan bl.a.
anvendes til binding af primere ved koloni PCR, så man får kopieret
Cfr9I Hincll
EcoRI hele MCS
Ecl136I
Ecl136I medCfr9I
eller uden donor-DNA.
Eco88I Hincll
SalI
Pstl
Pstl
Acc651I
Eco241 Acc651I Eco88I Pael
Multiple Cloning Sites of pUC19:
M13 EcoRI
Xapl Eco241 Kpnl SmaI SalI Bvel Sdal Pael
M13 Xapl SacI Kpnl
SmaI BamHI XbaI Xmil Bvel Hindlll
SacI
5’ G TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC CCG GGGBamHI
XbaI
ATC CTC TAG AGTXmilCGA CCT GCA
Sdal
GGC ATG CAA Hindlll
GCT TGG
5’ G TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGAEfter
GCTPCR udføres
CGG TAC agarose
CCG GGG ATC CTCgelelektroforese
TAG AGT CGA CCT forGCAat
GGCbestemme størrel-
ATG CAA GCT TGG
3’ C A TT TTG CTG CCG G TC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GGC CCC TAG GAG ATC TCA GAT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC
sen af PCR produktet.
3’ C A TT TTG CTG CCG G TC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GGC CCC TAG GAG ATC TCA GAT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC
LacZ Val Val Ala Leu Ser Asn Ser Ser Pro Val Arg Pro Asp Glu Leu Thr Ser Arg Cys Ala His Hincll
Cfr9I Leu Ser Pro
LacZ Val Val Ala Leu Ser Asn Ser Ser Pro Val Arg Pro Asp Glu Leu Thr Ser Arg Cys Ala His Leu Ser Pro
Ecl136I Eco88I Pstl
EcoRI Eco241 Acc651I SalI Pael
M13
AGC TGT TTC CTG 3’Xapl Kpnl
SmaI
Bvel Sdal
CGT AAT CAT GGT CAT
CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG 3’ SacI BamHI XbaI Xmil
GCA5’ TTA
G TAA AACGTA
GTA CCA GACTCGGGC CAGGAC
ACA AAG TGA5’ ATT CGA GCT CGG TAC CCG GGG ATC CTC TAG AGT CGA CCT GCA GGC AT
GCA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC 5’