Vrste bojenja - standardna bojenja

Suzana Harabajsa, Silvana Smojver-Ježek

U standardna tj. osnovna bojenja u citodijagnostici ubrajamo May Grünwald Giemsa bojenje
po Pappenheimu (MGG), Papanicolaou te Kwik Diff bojenje. Primjena ovih bojenja ovisi o
vrsti uzorka, ali se često primjenjuje kombinacija istih kako bi se dobio što bolji uvid u
karakteristične morfološke promjene stanica (Tablica 1). MGG i Kwik Diff bojenju citoloških
uzoraka prethodi fiksacija sušenjem preparata na zraku u trajanju od 2 sata. Papanicolaou
bojenju prethodi fiksacija u 96% etilnom alkoholu. Minimalno potrebno vrijeme fiksacije u
96% etilnom alkoholu je 20 min, a u dobro zatvorenoj posudi, preparati mogu stajati i
nekoliko tjedana. Karakteristike dobrog standardnog bojenja su jasni nuklearni detalji, dobro
očuvana transparencija citoplazme, te jasna mogućnost razlikovanja pojedinih tipova stanica.

Tablica 1. Usporedba MGG i Papanicolaou bojenja

May- Grünwald Giemsa bojenje Bojenje po Papanicolaou

Fiksacija – sušenje “na zraku” Alkoholna fiksacija

May- Grünwald otopina Hematoxilin

Otopina eozin-metilenskog modrila
Giemsa otopina Orange G otopina
Otopina azur-eozin-metilenskog modrila
Polikromatska otopina
Otopina eozina, light green SF i Bismark
brown

Bojenje po Pappenheimu - MGG bojenje

May-Grünwald Giemsa bojenje po Pappenheimu se temelji na kombinaciji kiselih i bazičnih

boja. Reagensi, Giemsa i May-Grünwald izvedeni su iz bojanja Romanowsky tipa. Otopina
Giemse sadrži 50% alkohola metanola i azur eozin metilensko plavilo, dok May Grünwald
sadrži 85% alkohola metanola i eozin metilensko plavilo. MGG boji jezgre bogate s DNK i
RNK koje imaju negativno nabijene fosfatne skupine. Ovim bojenjem se jezgre stanica boje
crvenkasto ljubičasto (plavo), a citoplazme crvenkasto-narandžasto/sivo-plavo/svijetlo-plavo,
ovisno o vrsti stanica. Nakon sušenja na zraku razmazi se boje pomoću aparata tako da se
preparati urone u kadice s reagensima koje su sastavni dio aparata. Vremenska izloženost
reagensima je jednaka kod automatiziranog i ručnog MGG bojenja. Postupak MGG bojenja
je prikazan na Tablici 2.
Tablica 2. Postupak bojenja citoloških preparata May-Grünwald Giemsa metodom po
Pappenheimu

Redosljed Naziv reagensa Vrijeme izloženosti

reagensa
1. May – Grünwald 4 min
2. Giemsa 20 min
3. Deionizirana voda 1 min + 1 miks
4. Deionizirana voda 1 min + 1 miks

Kod automatiziranog bojenja, otopina Giemse se svježe priprema nakon svakih 80 obojenih
preparata. Razrijeđuje se u omjeru 1:9 sa mješavinom deionizirane vode i pufera pH 6,8. Kod
modificiranog brzog MGG bojenja koji se koristi za intraoperativne uzorke primjenjuje se
ručno bojenje uz skraćeno vrijeme sušenja na zraku (5 min) i izlaganja reagensima. Kod
brzog bojenja, otopina Giemse se svježe priprema, nakon svakog bojenja, sa puferiranom
deioniziranom vodom u razrijeđenju 50:50. Postupak brzog bojenja citoloških preparata May-
Grünwald Giemsa metodom po Pappenheimu je prikazan na Tablici 3.

Tablica 3. Postupak brzog modificiranog bojenja citoloških preparata metodom May-

Grünwald Giemsa po Pappenheimu

Redosljed Naziv reagensa Vrijeme izloženosti

reagensa
1. May – Grünwald 3 min
2. Deionizirana voda 2 min
3. Giemsa 5 min
4. Deionizirana voda Isprati

Bojenje po Kwik Diff-u

Kwik Diff bojenje se koristi za diferencirano bojenje preparata (krvnih razmaza, punktata,
ostalih citoloških materijala). Najsličnije je MGG bojenju. Prednost Kwik Diff bojenja je
jednostavnost primjene i kratko vrijeme trajanja postupka bojenja. Postupak bojenja staničnih
preparata Kwik – Diff metodom prikazan je na Tablici 4.
Tablica 4. Postupak bojenja Kwik – Diff metodom.

Redosljed Naziv reagensa Vrijeme izloženosti

reagensa
1. Metini alkohol 5 urona / 1 sek.
2. Xanthen 10 urona / 1 sek.
3. Tyazin 10 urona / 1 sek.
4. Deionizirana voda 5 urona / 1 sek.

Bojenje po Papanicolaou
Predmetno staklo s uzorkom je potrebno u cijelosti uroniti u 96% etilni alkohol kako bi se
sačuvala stanična svojstva potrebna za citomorfološku analizu. Kada zbog transporta nije
moguće preparate dopremiti uronjene u 96%-om etilnom alkoholu, može se koristiti “spray
fiksativ” kao fiksacijsko sredstvo izbora. Međutim, čim preparati stignu u laboratorij
potrebno ih je fiksirati u 96%-om etilnom alkoholu kroz dva urona. Krvavi uzorci se mogu
fiksirati “lysin solution” fiksativom tako da ih se direktno stavlja u ovo fiksacijsko sredstvo.
Prije početka bojenja potrebno je uzorak temeljito isprati kako bi se spriječilo djelovanje
tekućine za liziranje na stanice. Od lysing fiksativa najčešće se koriste Carnoy i Clark
fiksativ. Kod metode bojenja po Papanicolaou koriste se tri osnovne boje i razne
koncentracije alkohola od 50%-og do 96%-og. Osnovne boje su Hematoxilin, Orange i
Polikrom. Hematoxilin boji jezgru, Orange boji citoplazmu, a Polikrom boji citoplazmu i
nukleole. Postupak bojenja uzoraka metodom po Papanicolau (ručno i uz pomoć aparata)
prikazan je na Tablici 5.

Tablica 5. Postupak bojenja uzoraka metodom po Papanicolaou

Redosljed Naziv reagensa Vrijeme izloženosti

reagensa
1. 80% alkohol 1 min
2. 70% alkohol 0,5 min
3. 50% alkohol 0,5 min
4. Destilirana voda 0,5 min
5. Hematoxilin 5 min
6. Destilirana voda 0,5 min
7. 0,025% HCl 1 min
8. Tekuća voda 6 min
9. Destilirana voda 0,5 min
10. 50% alkohol 0,5 min
11. 70% alkohol 0,5 min
12. 80% alkohol 0,5 min
 13. 96% alkohol 0,5 min
14. Orange 0,5 min
15. 96% alkohol 0,5 min
16. 96% alkohol 0,5 min
17. EA 2 min
18. 96% alkohol 0,5 min
19. 96% alkohol 0,5 min
20. 96% alkohol 0,5 min
21. Apsolutni alkohol 0,5 min
22. Xylol-alkohol 0,5 min
23. Xylol

Kod intraoperativnog bojenja po Papanicolau (Rapid Papa) skraćuje se vrijeme tretiranja s

reagensima, tako da u Hematoxilinu stakla ostaju uronjena 1 min, u Orangu 30 sek., i u
Polikromu 1 min. Postupak bojenja po Papanicolaou završava ksilolom i uklapanjem
neposredno obojenih preparata uklopnim sredstvom. Za uklapanje se najčešće primjenjuju
sintetička ljepila (npr. Shandon syntetic mountat ljepilo), a rijeđe Canada balsam. Dovoljna je
jedna kap uklopnog sredstva za prekrivanje cijelog preparata i pokrivanje pokrovnim
stakalcem. Ukoliko se preparati uklapaju Canada balzamom potrebno je primjeniti tzv.
metodu kuhanja tj. preparate je potrebno zagrijati na porculanskoj ploči s postignutom
temperaturom od 50◦C kako bi se balzam ravnomjerno razlio po predmetnom staklu.
Preparate je potrebno uklopiti u što tanjem sloju kako bi se očuvala trajnost i spriječila
oksidacija. Mjehuriće zraka i višak uklopnog sredstva je potrebno istisnuti te preparate
očistiti pomoću ksilola. Usporedba morfoloških karakteristika stanica kod MGG i
Papanicolaou bojenja je prikazana na Tablici 6.

Tablica 6. Morfološke karakteristike stanica kod MGG i Papanicolaou bojenja

Stanični elementi MGG bojenje Bojenje po

Papanicolaou
Jezgra – kromatin Svijetlo do tamno Plavo, tamno ljubičasto,
ljubičasto crno
Jezgra – nukleol Svijetlo do tamno plavo Crvenkasto
Citoplazma – bazofilna Svijetlo do tamno plavo Plavo – zeleno
(bazofilna) (Cijanofilno)
Citoplazma – acidofilna Ružičasto do blijedo crveno Ružičasto
Acidofilna granula Tanmo crveno Narančasto - ružičasto
Bazofilna granula Tamno plavo do crno
Neutrofilna granula Nježna, smeđkasta
Hemalaun-eozin bojenje
Hemalaun-eozin je standardno bojenje u patohistologiji, a u citologiji se primjenjuje za
prikazivanje morfologije stanica u preparatima staničnih blokova. Hematoksilin tj. njegova
oksidirana forma hematein boji kromatin stanične jezgre i dijelove citoplazme s mnogo RNA
što se mikroskopski prikazuje plavom bojom. Eozin boji acidofilne sastojke kao što su
citoplazma, eritrociti, mitohondriji i sekretorna zrnca nijansama crvene boje.