ENZYME TRONG KỸ THUẬT

DI TRUYỀN

TS. Nguyễn Thị Minh Huyền

nmhuyen09@gmail.com
Điện thoại: 0947479978
Enzyme là gì?
• Là một chất hoạt động như một chất xúc tác trong các cơ thể sống, điều hòa tốc
độ của các phản ứng hóa học diễn ra mà không bị biến đổi trong quá trình đó.

Kỹ thuật di truyền (KTDT) là gì?

• Sự sửa đổi có chủ ý một hoặc một số đặc tính cụ thể của một sinh vật.
• Gồm:
✓ Loại bỏ một hoặc các gen của một sinh vật
✓ Chuyển một gene (đặc tính) mong muốn từ sinh vật này sang sinh vật khác nơi
gene đó được biểu hiện.
Các enzyme thông dụng trong KTDT
1. Nuclease và Restriction endonucleases (RE) – Enzyme cắt giới hạn

2. Reverse transcriptase – Enzyme phiên mã ngược

3. DNA polymerase – Enzyme tổng hợp DNA

4. DNA ligase – Enzyme lai DNA

5. DNA modifying enzyme – Enzyme biến đổi DNA

 1. Nuclease và Restriction endonucleases (RE)– Enzyme cắt giới hạn
• Nuclease – là nhóm enzyme phân hủy phân tử nucleic acid bằng cách phá vỡ
các liên kết phosphodiester của nucleic acid, làm nucleic acid bị phân giải thành
các đơn vị nhỏ hơn
• Góp vai trò trong cơ chế chống lại DNA ngoại lai, phân hủy DNA vật chủ sau khi
nhiễm virus, sửa chữa DNA, DNA tái tổ hợp, tổng hợp DNA, bao gói DNA trong
nhiễm sắc thể và khoang virus, sự trưởng thành của RNA hoặc nối RNA
• Có nhiều loại khác nhau, có loại chỉ phân giải một mạch hoặc cả hai mạch của
DNA, hoặc chỉ phân giải RNA
• Cần năng lương để hoàn thành chức năng xúc tác (ATP)

• Phân loại thành exonuclease và endonuclease

 1. Nuclease và Restriction endonucleases (RE)– Enzyme cắt giới hạn
• Exonuclease: Phân cắt nucleic acid từ đầu chuỗi

• Endonuclease: Phân cắt nucleic acid trên các vùng ở giữa phân tử

• Còn phân loại thêm nữa là deoxyribonuclease (DNase - cắt DNA) và

ribonuclease (RNase - Cắt RNA)
DNase I

• Enzyme có nguồn gốc từ tụy tạng bò và xúc tác phản ứng thủy giải liên kết nằm
ngay sau một pyrimidine trên chuỗi DNA mạch đơn hay mạch đôi. Trong trường hợp
của DNA mạch đôi, chỗ cắt có thể xảy ra trên một hay trên cả hai mạch.
• Các ứng dụng chính:
• Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein.
• Tạo các "chỗ đứt" (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấu mẫu dò kiểu Nick translation.
• Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc thể. DNase ở nồng độ thấp có khả năng phân hủy các
gen đang hay đã từng hoạt động, đặc biệt là các vị trí siêu nhạy cảm nằm trong các phần được phiên
mã mạnh nhất của nhiễm sắc thể.
Nuclease S1

• Enzyme được li trích từ Aspergillus oryzae, có khả năng phân hủy các DNA mạch
đơn. DNA mạch đôi, phân tử lai DNA:RNA không bị enzyme phân cắt, trừ những
đoạn mạch đơn trên các phân tử này.
• Ứng dụng:
• Phân tích cấu trúc của các phân tử lai DNA:RNA.
• Loại bỏ các phần mạch đơn của một đầu so le trên phân tử DNA (sau khi được cắt bởi một RE
tạo đầu so le) để tạo đầu bằng.
• Loại bỏ các cấu trúc bậc hai (các nút vòng) trên phân tử RNA trong quá trình phiên mã ngược tạo
cDNA.
• Một enzyme có hoạt tính tương tự là Mung bean nuclease (được trích từ mầm đậu).
Exonuclease III
• Enzyme được tách chiết từ E. coli, xúc tác phản ứng thủy giải tuần tự các
nucleotide từ đầu 3'OH tự do của một DNA, theo chiều 3'→5'. Kết quả là hình thành
nên một vùng mạch đơn dài trên một DNA mạch đôi. Enzyme còn có các hoạt tính
3'phosphatase, RNase H.
• Các ứng dụng:
• Tạo các cấu trúc mạch đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow
của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng mạch).
• Tạo ra những đột biến "mất đoạn" tại những vùng đặc biệt trên DNA khi phối hợp với nuclease
S1.
• Một exonuclease có hoạt tính tương tự là nuclease BAL31,có hoạt tính exonuclease
5→3' và 3→5', có khả năng tạo các DNA mạch đôi đầu bằng không cần sự hiện diện
của nuclease S1.
RNase A

• Đây là một enzyme có hoạt tính rất cao, hiện diện ở mọi nơi và cực kì bền vững
(không mất hoạt tính khi bị xử lí ở 900C trong một giờ). Enzyme thương mại hóa được
li trích từ tụy bò.
• RNase A cắt một cách đặc trưng liên kết phosphodiester nằm ngay sau một
pyrimidine của một RNA mạch đơn.
• Ứng dụng:
• Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein
• Loại bỏ các vùng không bất cặp trên RNA trong phân tử lai RNA:DNA.
RNase H

• Enzyme này có khả năng loại bỏ RNA trong một phân tử lai RNA:DNA và thường
được dùng để loại bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch
thứ hai của cDNA hình thành một DNA mạch đôi.
• Ngoài ra, người ta còn sử dụng một số RNase khác vào những phản ứng đặc trưng
như: RNase III và VI cắt RNA mạch đôi, RNase T1 cắt ngay sau G, RNase U2 đặc
trưng cho A, Rnase T2 đặc trưng cho AGCU, . . .
Restriction endonucleases (RE)
• RE nằm trong nhóm Nuclease – và là các endonuclease

• Khám phá về RE đưa đến giải Nobel vào năm 1978 cho W. Arber, H. Smith và
D. Nathans
• RE được tổng hợp hầu hết các loài vi khuẩn, có hơn 2500 RE khác nhau và
hơn 300 RE sử dụng trong phòng thí nghiệm
• Phân loại thành 5 nhóm chính bởi sự sai khác một chút trong phương thức
hoạt động
 Restriction endonucleases (RE)
• Vai trò của RE trong quá trình chuyển gen vào cơ thể sinh vật:
• Cô lập gen mong muốn

• Tách các chuỗi DNA (cùng trình tự) trong một vectơ để có thể chèn gen mong muốn

• Có nhiều loại RE khác nhau vì chúng liên kết với một vị trí giới hạn cụ thể (các trình
tự bazơ cụ thể) trên DNA. Ví dụ: HindIII sẽ luôn liên kết với chuỗi cơ sở AAGCTT
• Các RE sẽ phân tách hai chuỗi DNA ở trình tự bazơ cụ thể bằng cách ‘cắt’ khung
đường-phốt phát một cách không đồng đều để tạo ra các đầu dính (sticky ends)
hoặc cắt thẳng ở giữa để tạo ra các đầu bằng (blunt ends).
• Các đầu dính dẫn đến một sợi của đoạn DNA dài hơn sợi kia

• Các đầu dính giúp việc chèn gen mong muốn vào DNA của sinh vật khác hoặc vào
vectơ dễ dàng hơn vì chúng có thể dễ dàng hình thành liên kết hydro với các trình
tự bazơ bổ sung trên các đoạn DNA khác đã được cắt bằng cùng RE.
RE Loại I
• Là loại được phát hiện đầu tiên

• Thấy ban đầu ở 2 chủng E.coli khác nhau (K-12 và B). Ví dụ EcoK

• Cắt ở một vị trí khác và cách xa vị trí nhận biết của chúng ở khoảng cách ngẫu nhiên
(ít nhất 1000 bp)
• Việc phân cắt ở các vị trí ngẫu nhiên này theo sau quá trình chuyển vị DNA, cho thấy
các enzyme này cũng là các động cơ phân tử
• Cần có các đồng yếu tố S-Adenosyl methionine (AdoMet), thủy phân ATP, và Mg2+ để
chúng có đầy đủ hoạt tính
 RE Loại II
• Là nhóm enzyme cắt quan trọng trong tách dòng gene

• Đặc điểm chính của RE loại II là mỗi enzyme có một trình tự nhận biết đặc hiệu mà tại đó nó
cắt phân tử DNA
• Trình tự nhận biết có thể từ 4-8 nu (thường là 4 hoặc 6 nu)

• Isoschizomer: là các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết

• Đặc trưng của RE loại II là trình tự nhận biết có cấu trúc đối xứng bổ sung (palindromic)
 Trình tự nhận biết của một số endonuclease giới hạn

G AATTC CAGCTG CAG CTG

E.coRI P.vuII
CTTAA C GTCGAC GTC GAC
RE Loại III
• Nhận biết hai trình tự không lặp lại (non-palindromic) khác nhau có chiều ngược nhau

• Cắt DNA ở khoảng cách 20 ~ 30 bp sau vị trí nhận biết

 RE Loại IV
• Enzyme loại IV nhận biết các biến đổi, điển hình là DNA methyl hóa; ví dụ như hệ thống
McrBC và Mrr của E.coli
• Cần GTP để cắt DNA

• Có hoạt tính methyltransferase (MTase) và endonuclease (ENase), được kết hợp với nhau
trong một chuỗi polypeptide
• Hoạt tính ENase ảnh hưởng lớn bởi S-adenosine-L-methionine (AdoMet) nhưng ATP không
có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
RE Loại V
• RE loại V (ví dụ: Phức hệ cas9-gRNA từ CRISPRs) sử dụng các RNA hướng dẫn để
nhắm mục tiêu vào các trình tự không lặp lại (non-palindromic) được tìm thấy trên các
sinh vật xâm nhập.
• Chúng có thể cắt các đoạn DNA có độ dài thay đổi, miễn là được cung cấp RNA
hướng dẫn phù hợp
• Sự dễ dàng và linh hoạt của việc dùng các enzyme này khiến chúng có triển vọng
trong các ứng dụng của kỹ thuật di truyền trong tương lai
2. Reverse transcriptase – Enzyme phiên mã ngược

• Được công bố năm 1970 bởi Temin và Satoshi Mizutani

(Nhật Bản) và nhóm của David Baltimore (Mỹ) về enzyme
có thể tổng hợp DNA tiền virus (proviral DNA) từ RNA hệ
gene
• Nguồn gốc: từ retrovirus, xúc tác cho phản ứng phiên mã
ngược, cần thiết để chèn DNA tiền virus vào DNA vật
chủ. mRNA (với mã di truyền của gen mong muốn) được
sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp một chuỗi sợi đơn
DNA bổ sung (cDNA)
2. Reverse transcriptase – Enzyme phiên mã ngược

• Vai trò: Tạo ra phân tử DNA bổ sung chuỗi đơn (cDNA) chứa mã cho đặc tính
mong muốn, mã này sau đó sẽ được chèn vào một vectơ (sau khi được chuyển đổi
thành một phân tử DNA sợi đôi)
• Thường được sử dụng vì các nhà khoa học dễ dàng tìm thấy mRNA có đặc tính cụ
thể hơn vì các tế bào chuyên biệt tạo ra các loại mRNA rất đặc hiệu (ví dụ: tế bào β
của tuyến tụy sản xuất nhiều mRNA insulin) và mRNA không chứa intron
• Là thành phần cơ bản của kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription PCR), trong đó
RNA được phiên mã ngược thành cDNA (Complementary DNA) và sử dụng làm
khuôn cho khuếch đại với PCR
3. DNA polymerase

• Tổng hợp chuỗi đơn DNA bổ sung mới (cDNA) từ một khuôn DNA hoặc
RNA đã có thành phân tử DNA chuỗi kép chứa mã mong muốn cho gene
• Tạo chuỗi đơn thứ hai bằng cách ghép các nucleotide tự do với các bazơ
bổ sung trên chuỗi cDNA
• Hầu hết các polymerase chỉ có thể hoạt động khi khuôn có vùng sợi kép
hoạt động như một mồi để bắt đầu quá trình tổng hợp chuỗi
• Ứng dụng thường dùng: Là enzyme chính trong phản ứng tổng hợp chuỗi
polymerase (PCR-Polymerase Chain Reaction)
3. DNA polymerase
• Có 4 loại DNA polymerase được sử dụng thường xuyên trong KTDT:
1. DNA polymerase I (thường từ E.coli):
- Enzyme này gắn vào một vùng chuỗi đơn ngắn (hoặc nick – đoạn ngắn hở) trong phân
tử DNA chuỗi kép chính, và tổng hợp một chuỗi mới hoàn chỉnh, phân hủy chuỗi hiện có khi nó
tiếp tục chức năng
- Là ví dụ của enzyme với hoạt tính kép – tổng hợp DNA và phân hủy DNA
- Hoạt tính tổng hợp (polymerase) hoặc phân cắt (nuclease) được điều khiển bởi các
phần khác nhau của phân tử enzyme
- Hoạt tính nuclease nằm ở 323 amino acid đầu tiên của chuỗi polypeptide, vì vậy nếu
loại bỏ đoạn này sẽ tạo ra một enzyme cải tiến và giữ nguyên chức năng tổng hợp DNA mà
không phân hủy DNA
- Còn gọi là Đoạn Klenow (Klenow fragment), vẫn có thể tổng hợp một choỗi DNA bổ
sung trên khuôn chuỗi đơn, nhưng không thể tiếp tục tổng hợp nếu các phần hở được điền vào
3. DNA polymerase
• Có 4 loại DNA polymerase được sử dụng thường xuyên trong KTDT:
2. Taq DNA polymerase (từ vi khuẩn Thermus aquaticus):
- Dùng trong PCR
3. Reverse Transcriptase (enzyme phiên mã ngược)
- Enzyme quan trọng trong KTDT
- Tham gia vào quá trình nhân lên của một số virus
- Sử dụng khuôn là RNA
- Có khả năng tổng hợp chuỗi DNA bổ sung từ một khuôn RNA, là cốt lõi của
kỹ thuật gọi là tách dòng DNA bổ sung (cDNA)
 4. DNA ligase
• Xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester trong khung đường-phosphate của DNA.
• Đóng vai trò sửa chữa các đứt gãy chuỗi đơn trong chuỗi kép DNA, hoặc chuỗi kép DNA ở
sinh vật sống. Ví dụ: Sao chép DNA
• Enzyme này cho phép gene mong muốn phân lập được ghép vào một vectơ (thường là một
plasmid) để nó có thể được chuyển sang sinh vật mới.
• Tất cả các tế bào sống đều tạo ra DNA ligase, nhưng enzyme dùng trong KTDT thường
được tinh sạch từ E.coli đã bị nhiễm với T4 phage (T4 DNA ligase)
 4. DNA ligase
• Cơ chế:
• Nối 2 đoạn DNA để tạo thành chuỗi DNA dài hơn bằng cách “dán” chúng lại với nhau, dựa trên sự
hình thành 2 liên kết cộng hóa trị phosphodiester giữa đầu 3’-hydroxyl của một nucleotide (chất
nhận) với đầu 5’-phosphate của một nucleotide khác (chất nhận).
• 2 ATP được tiêu thụ cho mỗi liên kết phosphodiester được hình thành.

• AMP cần thiết cho phản ứng ligase, được xảy ra theo 4 bước:

1. Tổ chức lại vị trí hoạt động ví dụ như các vết cắt trên đoạn DNA hoặc đoạn Okazaki, v.v.
2. Adenyl hóa (bổ sung AMP) của phân tử lysine ở trung tâm hoạt động của enzyme,
pyrophosphate được giải phóng;
3. Chuyển AMP sang vị trí 5' photphat của chất cho, hình thành liên kết pyrophotphat;
4. Sự hình thành liên kết phosphodiester giữa 5‘-photphat của chất cho và 3‘-hydroxyl của chất
nhận.
5. Enzyme biến đổi DNA (DNA modifying enzyme)
Biến đổi bằng cách thêm hoặc loại bỏ các nhóm hóa học đặc biệt
1. Alkaline phosphatase (nguồn từ E.coli, mô ruột của bê, tôm Bắc cực): loại nhóm
phosphate có ở đầu 5’ của phân tử DNA
2. Polynucleotide kinase (từ E.coli bị nhiễm phage T4): Thêm nhóm phosphate vào đầu
5’ tự do của DNA (ngược với Alkaline phosphatase)
3. Terminal deoxynucleotidyl transferase (từ mô tuyến ức của bê): thêm 1 hoặc nhiều
deoxyribonucleotide vào đầu 3’ của phân tử DNA
 CRISPR/Cas9

• Phát hiện năm 1987 nhờ Yoshizumi Ishino và cs, đại học Osaka, Nhật Bản

• Dựa trên cơ chế “miễn dịch” của vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm phân tử DNA
ngoại lai từ virus hoặc DNA plasmid
• Dựa trên phân tử RNA để nhận diện và phá hủy DNA ngoại lai

• Để bảo vệ mình khỏi vi khuẩn ngoại lai, vi khuẩn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại
lai vào DNA bộ gene tại vùng trình tự lặp lại CRISPR (Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeat).
• Vùng trình tự này sau đó được phiên mã và được xử lý thành các đoạn RNA ngắn
(crRNA_CRISPR-derived RNA). Các crRNA sẽ liên kết với endonuclease Cas để
nhận diện và cắt phân tử DNA mục tiêu (qua liên kết bổ sung của DNA mục tiêu)

http://www.vjsonline.org/science-technology-pulse/1467559425
Sơ đồ hoạt động của
CRISPR/Cas9
 Ứng dụng CRISPR/Cas9

• Là bước đột phá của kỹ thuật thao tác trên DNA bộ gene

• Ứng dụng để thiết kế hệ thống biến đổi DNA bộ gene trên tế bào động vật có vú (gồm có
người)
• Cấu tạo gồm: enzyme Cas9 và phân tử RNA dẫn đường (gRNA)
• Cas9 có vai trò cắt DNA mục tiêu

• gRNA thường dài khoảng 20 nucleotide, có vai trò nhận diện DNA mục tiêu chứa trình tự bổ sung với
gRNA. gRNA còn có thêm trình tự PAM (Protospacer-Adjacent Motif); có vai trò quan trọng trong quá
trình nhận diện và gắn chuyên biệt của Cas9 vào trình tự mục tiêu.
• PAM ở Cas9 gồm 3 nucleotide NGG; N là nucleotide bất kỳ

• Có thể ứng dụng trong liệu pháp gene, nghiên cứu tế bào gốc, tạo ra động/thực vật biến đổi
gene, điều trị HIV/AIDS…
http://www.vjsonline.org/science-technology-pulse/1467559425
Enzyme khác - Ribozyme
• Ribozyme hay RNA enzyme là những phân tử RNA có khả năng xúc tác một
phản ứng hóa học (trong khi các enzyme đã biết có cấu tạo từ protein)
• Trong tự nhiên, nhiều ribozyme xúc tác cho sự phân cắt của chính nó hoặc của
các RNA khác
• Ví dụ: RNase P, ribozyme đầu búa (hammerhead), hairpin ribozyme…
• Ribosome cũng là một loại ribozyme xúc tác phản ứng như một
aminotransferase
Enzyme khác - Ribozyme
• Ứng dụng trong lĩnh vực sinh học tổng hợp, gồm:
• Điều hòa biểu hiện gene
• Hệ thống phát hiện (Detecting system)
• Kiểm soát hoạt động Ribozyme
• Thiết kế mạch logic (logic circuit design)
• Chỉnh sửa gene
• Dựa vào đặc điểm chức năng, có thể phân loại thành 3 nhóm:
• Phân cắt
• Ghép nối
• Chức năng khác
Ribozyme phân cắt
1. Ribozyme tự phân cắt: Vai trò thường thấy của các ribozyme xảy ra trong tự
nhiên. Có thể tự cắt liên kết phosphodiester của chính nó. Việc phân cắt này
đóng vai trò cần thiết trong cơ thể sống (tạo ra nhiều bản sao của RNA virus
trong quá trình sao chép vòng tròn; ức chế đáp ứng chất chuyển hóa của sự
biểu hiện gene)
2. Ribozyme cắt ngang (trans-cleaving ribozyme): Cần bổ sung cơ chất RNA
để cắt. Có tiềm năng cắt trình tự đặc hiệu của tế bào hoặc RNA virus. Ví dụ:
ribonuclease P của vi khuẩn (RNase P) cắt trình tự dẫn đầu 5’ của tiền chất
RNA vận chuyển để tạo ra RNA vận chuyển trưởng thành
Ribozyme ghép nối
• Nối là một quá trình sau phiên mã để loại bỏ các intron khỏi bản phiên mã
RNA. Trong nhiều tế bào nhân chuẩn, quá trình ghép nối do spliceosome, một
enzyme ribonucleoprotein. Một số RNA chức năng cũng có thể tự ghép các
trình tự riêng của chúng (intron nhóm I và nhóm II là các ribozyme tự ghép nối
có đặc điểm rõ ràng nhất). Chúng nối các ranh giới intron/exon của mRNA tiền
thân bằng cách cắt bỏ chính xác intron và quá trình liên kết cộng hóa trị tiếp
theo giữa các exon.
• Có thể ứng dụng để sửa chữa các gene khiếm khuyết; phát triển các loại
thuốc mới cho liệu pháp gene
Ribozyme chức năng khác
• Ribosome: xúc tác cho sự hình thành liên kết peptide bằng cách nối các aminoacid để
tổng hợp chuỗi polypeptide
• Ribozyme nhân tạo: xúc tác cho các phản ứng sinh hóa mà các ribozyme tự nhiên
không thực hiện được. Ví dụ: ribozyme ligase lớp I, xúc tác cho sự hình thành liên kết
phosphodiester trong cơ chất RNA mà không cần ATP; ribozyme xúc tác cho quá trình
aminoacyl hóa ở coenzyme A
 Enzyme khác
• Còn một số loại enzyme thường dùng trong các kỹ thuật di truyền khác như
protease, lysozyme…
• Protease: là nhóm enzyme thủy phân polypeptide (protein), có khả năng cắt liên
kết peptide tạo ra các đoạn peptide nhỏ hơn hoặc amino acid tự do
• Ứng dụng trong KTDT: bổ sung vào dung dịch ly giải tế bào trong quá trình tách nucleic acid để
giúp thủy phân protein
• Ứng dụng trong đời sống: Làm chất tẩy rửa, thuộc da, nước mắm…
• Lysozyme: còn gọi là muramidase là enzyme kháng khuẩn, được sản xuất bởi
động vật, là một phần của hệ miễn dịch bẩm sinh. Có trong nhiều chất tiết như
nước mắt, nước bọt, sữa mẹ và các dịch nhầy…
• Xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết 1,4-beta giữa axit N-acetylmuramic và chuỗi bên N-acetyl-
D-glucosamine trong peptidoglycan, thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn gram dương
• Ứng dụng trong KTDT: bổ sung vào dung dịch ly giải tế bào vi khuẩn khi tách nucleic acid để giúp
ly giải tốt hơn