NHUỘM NHÂN TẾ BÀO BẰNG HOECHST 33342

1. Mục tiêu thí nghiệm

 Nhuộm nhân tế bào ung thư bằng Hoechst 33342 để quan sát hình thái và cấu trúc
nhân tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
 So sánh hình thái và cấu trúc nhân tế bào A549 được xử lý bằng tinh dầu với tế bào
không được xử lý.
 Đánh giá tác động của tinh dầu đối với hình thái và cấu trúc nhân tế bào ung thư,
từ đó đánh giá khả năng chống ung thư của tinh dầu.

2 Phương pháp thực hiện

2.1 Chuẩn bị vật liệu

Tế bào:
Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
1640 hoặc trong môi trường Modified Eagle's Medium (DMEM) của Dulbecco được bổ
sung Huyết thanh bào thai bò bất hoạt do nhiệt (FBS, 10%) và penicillin 100 U/mL với
100 µg/mL streptomycin, và ủ ở 37°C với môi trường 5% CO 2.
Rửa tế bào với dung dịch đệm để loại bỏ trypsin hoặc môi trường nuôi cấy.
Tinh dầu : Pha loãng tinh dầu trong dung dịch DMSO với nồng độ lần lượt là 0, 1 và
10μ g/mL

Dung dịch Hoechst 33342: Chuẩn bị dung dịch nhuộm Hoechst bằng cách pha loãng
dung dịch gốc Hoechst theo tỷ lệ 1:2 trong PBS

Dung dịch PBS: Dùng để rửa tế bào và pha loãng dung dịch Hoechst 33342.

Kính hiển vi huỳnh quang:

2.2 Phương pháp thực hiện

Bước 1: Gieo tế bào A549 vào các đĩa 6 giếng với mật độ 2,5 × 105 tế bào/mL.

 Nuôi cấy tế bào trong điều kiện phù hợp (ví dụ: 37°C, 5% CO2) trong 24 giờ.

Bước 2 : Xử lý tế bào:
 o Chia các đĩa 6 giếng thành 3 nhóm:
 Nhóm 1: Nhóm kiểm soát (không xử lý tinh dầu tràm trà).
 Nhóm 2: Xử lý với tinh dầu ở nồng độ 0,5 μg/mL.
 Nhóm 3: Xử lý với tinh dầu ở nồng độ 10 μg/mL.
o Thêm dung 25μl/ml dịch tinh dầu đã pha loãng vào các nhóm tương ứng.
o Nuôi cấy tế bào trong 48 giờ.

Bước 3 : Nhuộm tế bào:

Rửa tế bào nhẹ nhàng bằng dung dịch PBS để loại bỏ môi trường nuôi cấy và các tạp chất.

Thêm dung dịch Hoechst 33342 pha loãng vào các giếng

Ủ tế bào trong dung dịch Hoechst 33342 trong 30 phút ở 37°C trong bóng tối.

Bước 4 : Rửa tế bào:

Rửa tế bào nhẹ nhàng bằng dung dịch PBS để loại bỏ dung dịch nhuộm màu

Bước 5 : Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

2.4 Tiêu chí đánh giá

 Hình thái và cấu trúc nhân tế bào được nhuộm rõ ràng và đồng đều.
 Nhân tế bào có kích thước và hình dạng bình thường.
 Tế bào không xử lý tinh dầu: Nhân tế bào có cấu trúc bình thường, không có dấu
hiệu apoptotic.
 Tế bào xử lý tinh dầu:
o Có thể xuất hiện các dấu hiệu apoptotic như:
 Tế bào co lại.
 Nhân tế bào co lại và phân mảnh.
 Nhuộm màu đậm hơn.
 Hình thành các thể apoptotic.
o Mức độ apoptotic tăng dần theo nồng độ tinh dầu tràm trà.

2.5 Phân tích dữ liệu

 Sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh để đếm số lượng tế bào có hình thái và cấu
trúc nhân tế bào bình thường và số lượng tế bào có dấu hiệu apoptotic.

Phân tích thống kê để xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm.
3. Tài liệu tham khảo

 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7201560/
 https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-
analysis/protocols/hoechst-33342-imaging-protocol.html