MTT assay

Hoạt tính độc tính tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5
dimethylthiazol2 - yl)- 2, 5 - diphenyltetrazolium). Đây là phương pháp đánh giá khả
năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp
formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể
I. Các bước tiến hành
1 Chuẩn bị
- Tinh dầu : có sẵn
- Tết bào ung thư : tế bào được nuôi cấy trong môi trường Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) hoặc trong môi trường Modified Eagle's
Medium (DMEM) của Dulbecco được bổ sung Huyết thanh bào thai bò
bất hoạt do nhiệt (FBS, 10%) và penicillin 100 U/mL với 100 µg/mL
streptomycin, và ủ ở 37°C với môi trường 5% CO 2
Bước 1 : Chuẩn bị mẫu thử : Tinh dầu được hòa tan bằng dung môi dimethyl
sulfoxid (DMSO) với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL.
Bước 2 : Gieo tế bào vào các đĩa 96 giếng (2 × 104 tế bào/mL trong 200 µL môi
trường)
- Xác định số tế bào ban đầu bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng tế bào bằng trypan blue ( 1:1)
Nhỏ mẫu lên buồng đêm rồi đếm
Tính được số lượng tế bào ban đầu
Bước 3: Chuẩn bị dãy nồng độ tinh dầu
Nồng độ tinh dầu trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128; 32; 8; 2 và 0,5 µg/mL.
Cách pha với nồng độ dung dịch gốc là 20mg/ml
Thể tích nồng độ tinh dầu thêm vào mỗi giếng : (25 µg/mL)
Nồng độ 128 32 8 2 0,5
tinh dầu
(µg/mL)
Thể tích 0.16 0.04 0.01 0.025 0.625
Dung dịch
chuẩn gốc
(µg/ml)
Thể tích 25 25 25 25 25
Môi trường
(DMSO)
(µg/ml)

Bước 4 : Thêm lần lượt các dẫy nồng độ tinh dầu đã được pha ở bước ba vào từng
dãy giếng rồi ủ trong 24h.
Bước 5 : Thêm 200 µL MTT (5 mg/mL trong PBS) được thêm vào từng giếng và ủ
tiếp trong 3 giờ sau đó.
Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 150 µL DMSO
100%.
Ellipticine hoặc Paclitaxel (Taxol) trong DMSO được dùng làm chất chuẩn dương
tính (+).
Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 570 nm trên
máy quang phổ Biotek. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị IC50 được xác định
thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata.
% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)- ODchứng (-))
x 100%
Giá trị IC50 của mẫu được tính dựa theo đồ thị nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm
ức chế (%I).