ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROSKOPIE

- příklad spektrálních a optických metod instrumentální analýzy

- měření propustnosti (transmitance, resp. veličiny odvozené – absorbance)
monochromatického záření sledovanou soustavou částic
- kvantitativní metoda
- vyznačuje se vysokou citlivostí
- pro každý prvek specifická – tzn. že lze stanovit prvek i v přítomnosti velkého přebytku
doprovodných látek, bez předchozích složitějších separací a úprav
- využití:
 detekce kovových prvků
 těžkých kovů Pb, Cd (zbytky střeliva)
- pracuje se metodou kalibrační křivky nebo standardního přídavku
- princip – měření absorpce monochromatického elektromagnetického záření volnými atomy
v plynném stavu
- záření, které vychází ze zdroje a prochází absorpčním prostředím, vstupuje do
monochromátoru
- záření neabsorbované vzorkem pak dopadá na detektor, který přeměňuje zářivou energii na
elektrický proud → ten je dále zesílen a měřen na odečítacím přístroji (mikroampérmetr nebo
digitální voltmetr)

- atomová absorpční spektra jsou v rozpětí 190-900nm

- transmitance – τ – poměr toku záření soustavou propuštěného (Φ) k toku vstupujícímu (Φ0)
τ = Φ/Φ0
- tok vstupující je větší, protože část záření je pohlcena
- míra intenzity absorpce
- mění se s vlnovou délkou záření a závisí na počtu absorbujících částic
v prostředí dráhy paprsku, tedy na koncentraci částic a na tloušťce vrstvy,
kterou paprsek prochází
- absorbance – A
A = -log τ = log Φ0/Φ
- úměrná tloušťce absorbující vrstvy (b) a počtu atomů v základním stavu (N)
- při absorpčním měření se sleduje úbytek toku záření určité vlnové délky po průchodu
absorpčním prostředím
- matematickým vyjádřením je rovnice spojená se zákonem Lambert-Beerovým ve tvaru:
A = log Φ0/Φ = η*b*N
η…atomový absorpční koeficient
b…tloušťka vrstvy (cm)
N…počet absorbujících částic v základním stavu v objemové jednotce (cm3)
- atomový absorpční koeficient – η – při dané vlnové délce je charakteristický pro absorbující
prvek
- má rozměr plochy, jejíž velikost odpovídá účinnému průřezu
atomu pro absorpci fotonu
- příprava vzorku:
 očištění
 homogenizace
 mineralizace – rozklad veškeré organické hmoty

VLASTNÍ MĚŘENÍ
- vzorek se převede z ʘ na aerosol (kapalina nebo pevná látka v plynu)
- v rozstřikovači se smísí s plynným palivem
- proudí do hořáku se štěrbinovým ústím
- plamenem se látka převede z ʘ na atomový plyn (atomizace – 2000-3000 K)
- výbojka s dutou katodou – paprsek – absorpční prostředí (část záření pohlcena atomovým
plynem, zbytek prochází na monochromátor)
- monochromátor (selektuje záření o jedné vlnové délce)
- detektor – fotoelektrický násobič – přeměňuje dopadající záření na fotoelektrický proud
- zesilovač signálů
- vyhodnocení – PC

INSTRUMENTACE
- zdroj záření – výbojka s dutou katodou (nejčastěji naplněná Ne)
- atomizátor – absorpční prostředí, kde vznikají volné atomy analysu
a. hořák – přivedena směs acetylen-vzduch nebo acetylen-NO2, kde probíhá atomizace
b. zmlžovač – přeměňuje vzorek do formy aerosolu, takto přiveden do plamene
c. plamenem se látka převede z aerosolu na atomový plyn
- monochromátor – izoluje záření o zvolené vlnové délce
- detektor – proud fotonů se přeměňuje na proud elektronů
- zesilovač signálu
- odečítací přístroj – mikroampérmetr, digitální voltmetr
- vyhodnocení – pomocí kalibrační křivky

IMUNOCHEMICKÉ METODY
- založeny na interakci antigen-protilátka
- pomocí těchto metod stanovujeme přítomnost patogen nebo prokazujeme, zda vzorek
obsahuje specifické protilátky vůči danému antigenu
- využití – stanovení mykotoxiny, reziduí biologicky aktivních látek nebo pesticidů
- princip – stanovovaným analytem je látka, která má schopnost vyvolat v organismu tvorbu
protilátek
- antigen = taková molekula, kterou organismus vyhodnotí jako cizí látku (BK, peptidy,
nukleoproteiny, polypeptidové bakteriální toxiny,…)

PROTILÁTKY
- protilátka = reaguje s daným antigenem a vytvoří s ní komplex, který pak analyzujeme
- specifické BK – Ig – obrana organismu při vniknutí virů a bakterií (B-lymfocyty)
- každá molekula protilátky je složena ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců
- klidový B-lymfocyt má na svém povrchu určitý typ protilátky, která slouží jako receptor pro
vazbu specifického antigenu – navázáním antigenu na receptor je B-lymfocyt stimulován ke
tvorbě protilátek
- každý jedinec vytváří miliardy protilátek

- vazební místo je variabilní oblast, jinak je

zbytek konstantní oblast

- vazba antigen-protilátka velmi specifická

- rozdělení:
 polyklonální – proti více epitopům určitého antigenu
 monoklonální – namířeny proti jednomu epitopu antigenu; nejvýhodnější pro
analytické použití
 rekombinantní – kombinace obou předchozích

PRODUKCE PROTILÁTEK V LABORATORNÍCH ZVÍŘATECH

(IMUNIZACE ZVÍŘAT)

POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY
- zvířeti se aplikuje v několikatýdenních intervalech antigen → který stimuluje B-lymfocyty
k produkci velkého množství protilátek → poté se odebere sérum ze zvířete a získají se
protilátky
- jsou produktem více klonů B-lmyfocytů a jsou namířeny na více epitopů určitého antigenu

MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY
- zvířeti se vstříkne antigen → izolují se příslušné B-lymfocyty → provede se fúze B-
lymfocytů s nádorovým B-lymfocytem → hybridní buňka se pak neomezeně dělí
- vylučuje velké množství protilátky jediného typu

IMUNOANALYTICKÉ METODY SE ZNAČENÝMI REAKTANTY

- metody založeny na značení antigenu nebo protilátky takovou látkou, která je citlivější než
průkaz imunoprecipitátu
- značkou může být enzym (enzymová imunoanalýza), radioizotop, fluorescenční nebo
chemická látka
- metody:
 heterogenní kompetitivní enzymová imunoanalýza (ELISA – enzymed-linked-
immunosorbent-assay)
 heterogenní nekompetitivní imunoanalýza (sandwich)

ELISA
- princip – enzymem značený antigen soutěží (proto kompetitivní) s antigenem ve vzorku o
vazebná místa na specifické protilátce → po navázání antigenu s protilátkou se odmyjí zbytky
nenavázaného antigenu a v jamce zůstane komplex antigen-protilátka (proto heterogenní)

- postup – v jamkách destičky protilátky, přidáme vzorek s antigenem a značený antigen

(známá koncentrace) → antigeny se naváží na protilátky → vymytí toho, co se nenavázalo →
přidáme substrát a proběhne reakce enzym-substrát (barevná reakce) → sledujeme intenzitu
barevné změny
- platí nepřímá úměrnost – čím barevná změna intenzivnější, tím nižší je koncentrace
sledovaného antigenu
- reakce vždy probíhá v nadbytku antigenu
- neznačený antigen a značený antigen se vyskytují v určitém poměru, ve kterém se i navážou
na protilátky

SANDWICH
- použití – indetifikace polyvalentních antigenů – tzn. antigeny, které na sebe váží 2 a více
protilátek
- postup – protilátka proti hledanému antigenu je imobilizovaná na stěně jamek mikrotitrační
destičky → nanese se vzorek → dojde k navázání antigenu ze vzorku k protilátce → odmyjí
se nenavázané zbytky → nanese se další protilátka proti hledanému antigenu značená
enzymem → naváže se protilátka → promytí → vnese se substrát pro enzym, kterým je
značená protilátka → měříme intenzitu barevné změny
- intenzita barevné změny je přímo úměrná koncentraci analytu
- nadbytek protilátky → všechny molekuly antigenu mají možnost se navázat
- v nadbytku je přidána druhá protilátka značená enzymem (odlišná od první protilátky)

VYUŽITÍ IMUNOCHEMICKÝCH METOD V RYCHLÉ DIAGNOSTICE

- testy určené k rychlé orientační diagnostice v terénu nebo u lůžka nemocného na principu
tzv. suché chemie
- reagencie jsou zakotveny v porézním materiálu, který je připevněn na podložce z plastu
nebo je vložen do plastového rámečku s otvory pro nanášení vzorku a odečítání výsledků
- např. stanovení lidského choriového gonadotropinu (hCG) k průkazu těhotenství nebo
troponinu T v diagnostice infarktu myokardu či průkaz drog v biologickém materiálu
- výsledek – pozitivní nebo negativní → stanovení přítomnosti

STANOVENÍ PŘÍTOMNOSTI DROG V MOČI NEBO SLINÁCH

- kompetitivní metoda
- soutěž mezi drogou ve vyšetřovaném vzorku a konjugátem drogy, který je imobizován
v indikační zóně proužku, o omezené množství specifické protilátky
- vzorek nanesený v aplikační zóně putuje reakční zónou obsahující specifické protilátky
navázané na barevné mikročástice, které se v průběhu reakce mobilizují
- moč i rehydratované značené protilátky postupují reakčním proužkem a v indikační zóně se
setkají se zakotvenými konjugáty drog
- pokud vyšetřovaný vzorek obsahuje drogu, vazebná místa barevně označených protilátek
jsou jimi saturována a nemohou se tedy navázat na imobilizované konjugáty drog
- barva indikační zóny zůstane nezměněna a výsledek je odečítán jako pozitivní
- v nepřítomnosti drogy ve vyšetřovaném vzorku jsou značené protilátky zachyceny
imobilizovaným konjugátem drogy
- v indikační zóně se vytvoří barevný proužek, který znamená negativní výsledek