Professional Documents
Culture Documents
Thí nghiệm hóa học và hóa sinh thực phẩm BKU - Bài 06. Enzyme - FINAL
Thí nghiệm hóa học và hóa sinh thực phẩm BKU - Bài 06. Enzyme - FINAL
Thí nghiệm hóa học và hóa sinh thực phẩm BKU - Bài 06. Enzyme - FINAL
ENZYME
Độ pha loãng
2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
(F)
n/ n/ n/ n/ n/ n/ n/ n/ n/ n/
Nồng độ enzyme
2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Bảng 1. Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase
Khi dùng ống chuẩn để so sánh màu, nhằm chọn lựa ống làm chuẩn để tính các giá
trị bên dưới thì ống nghiệm 1 cho ra màu tương đối giống với ống chuẩn. Do đó, nhóm
chọn ống số 1 để thực hiện tính toán các giá trị liên quan đến phương pháp
Wohlgemuth.
2. Tính toán kết quả
m. V 1 10000.1
– Lượng enzyme cho vào ống nghiệm [1] (n): n¿ ¿ ¿ 100
V2 100
với: V1 = 1 : thể tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống [1], mL
V2 = 100 : thể tích dịch chiết enzyme amylase, mL
m = 10g = 10000 mg : khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mg
n 100
– Một đơn vị Wohlgemuth (W): W ¿ ¿ ¿ 0,625
5. F 5× 32
,Với: F: độ pha loãng chọn được trên bảng trên (ống 5: 32)
– Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzyme (Nw):
n 100
Nw= = =16 0 ( Nw)
V 1 .W 1 ×0,625
V. Giải thích hiện tượng và biện luận so sánh kết quả
1. Giải thích hiện tượng
Enzyme amlase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bột, còn thuốc thử Liugol để
nhận biết sự có mặt của tinh bột trong dung dịch.
Cho amylase vào dung dịch NaCl 0,5% để hoạt hóa amylase. Sau đó cho các ống
nghiệm vào tủ sấy ở 37ºC thì ở nhiệt độ này enzyme amlylase sẽ hoạt động tốt nhất,
cho nên phản ứng sẽ diễn ra nhanh chóng để có kết quả rõ hơn. Sau khi lấy khỏi tủ sấy
thì nhỏ dung dịch H2SO4 10% để quá trình thủy phân ngừng hoạt động (tăng pH môi
trường dẫn đến enzyme bị bất hoạt).
⇒ Ở cả 10 ống trong thí nghiệm trên đều xảy ra phản ứng thủy phân tinh bột thành các
phân tử đường đơn, đường đôi và dextrin nhờ xúc tác là enzyme amylase theo phương
trình sau:
Tuy đều có cùng một cơ chế phản ứng, tuy nhiên lượng cơ chất và lượng enzyme
cho vào ở mỗi ống là khác nhau. Ở thí nghiệm này, lượng enzyme cho vào từ ống [1]
đến ống [10] giảm dần theo cấp số nhân, ứng với độ pha loãng enzyme đi từ 2 đến 2 10.
Do đó, sự chênh lệch về lượng giữa nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất càng về sau
sẽ càng lớn.
Tinh bột Liugol
→
phức xanh tím
Ống nghiệm số [1], [2], [3], [4] sau khi nhỏ Liugol vào thi có màu vàng. Điều này
chứng tỏ tinh bột ở cả 4 ống này đều được thủy phân hoàn toàn. Ống [5] có màu nâu
cam chứng tỏ tinh bột bì thủy phân gần hết nên màu đậm hơn so với các ống trên. Từ
ống [6] tới ống [10] thì màu dung dịch chuyển dần từ màu tím → xanh tím → xanh →
xanh đen. Điều này chứng tỏ tinh bột ở các ống này bị thủy phân rất ít, ở 2 ống cuối thì
gần như không bị thủy phân.
+ Từ ống [5] sang ống [6] có sự chuyển màu từ vàng cam sang màu tím cho thấy
ống [5] là ống có nồng độ enzyme tối thiểu để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột có
trong ống nghiệm.
2. Biện luận kết quả
Có thể thấy kết quả của lớp đều có sự khác biệt nhỏ về cường độ màu nhưng nói
chung vẫn khá tương đồng với nhau về kết quả: ống nghiệm bắt đầu chuyển màu ở ống
số 5 (W = 0,625). Nguyên nhân của sự khác biệt có thể là do:
– Trong quá trình cho vào tủ sấy, nhóm không lắc đều ống nghiệm dẫn đến lượng
tinh bột còn bát vào thành → lượng tinh bột bị thủy phân ít hơn lượng tinh bột cho
vào.
– Trong quá trình trích 1 mL từ ống này sang ống khác, nhóm lắc ống nghiệm chưa
đều, thao tác hút dung dịch và rửa pipette không kỹ dẫn đến lượng enzyme có trong
mỗi ống không hoàn toàn giống như trong lý thuyết tính toán.
– Sau khi lấy ra khỏi tủ sấy, việc cho H2SO4 để kết thúc quá trình thủy phân có sự
sai lệch về thời gian. Do đó, lượng tinh bột có thể được thủy phân tiếp nên dẫn đến sự
khác nhau về ống nghiệm có lượng enzyme tối thiểu để thủy phân hoàn toàn tinh bột.
B. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
TINH BỘT CỦA ENZYME AMYLASE
I. Nguyên tắc thí nghiệm
Enzyme là xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzyme
bị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme.
Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin,
maltose và glucose. Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt
đầu thủy phân tinh bột đã hồ hóa trong thức ăn, và các enzyme còn lại sẽ kết thúc quá
trình thủy phân tạo glucose thấm qua thành ruột.
Nhiệt độ là tác nhân vật lí ảnh hưởng đến vận tốc hóa học cũng như phản ứng
enzyme. Amylase, cũng như các loại enzyme khác là đều có khoảng nhiệt độ tối ưu để
xúc tác, cho ra hiệu suất phản ứng được cao và trong một khoảng thời gian cần thiết.
Trong những điều kiện sinh lý nhất định, khi tăng nhiệt độ thì vận tốc phản ứng cũng
tăng lên. Tuy nhiên, khi qua ngưỡng nhiệt tối ưu (T opt) thì vận tốc enzyme bắt đầu
giảm xuống. Đa số các enzyme có nhiệt độ tối ưu (T opt) vào khoảng 40 – 60ºC, ở nhiệt
độ này vận tốc phản ứng rất lớn. Khi nhiệt độ lên 80ºC hầu hết các enzyme đều bị biến
tính không thuận nghịch dẫn cấu trúc không gian bị thay đổi, làm cho enzyme không
còn khả năng kết hợp được với cơ chất.
Do đó, mục đích bài thí nghiệm này là kiểm tra ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt
độ và nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase.
II. Chuẩn bị thí nghiệm
1. Dụng cụ
– Ống nghiệm – Đĩa thủy tinh
– Pipette 5mL, 1mL
2. Hóa chất
– Dung dịch đệm pH = 6,0
– Dung dịch tinh bột 0,5%
– Dịch chiết enzyme amylase
– Thuốc thử Liugol
Do kết quả thí nghiệm thu được ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau sau 15 phút là
giống nhau nên nhóm không thể kết luận được nhiệt độ tối ưu của enzyme termamyl.
Vì vậy, nhóm đã tiến hành tham khảo kết quả với các nhóm khác và nhận thấy rằng kết
quả của đa số các nhóm đều có sự tương đồng với kết quả của nhóm trong việc xác
định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme.
Do đó, sau khi tìm hiểu một số bảo cáo và tham khảo các nhóm khác, nhóm rút ra
một số giải thích cho việc không thu được kết quả không mong muốn như sau:
– Termamyl có khoảng nhiệt độ hoạt động rộng (30ºC – 100ºC) 1 nên nhiệt độ của
bài thí nghiệm là chưa đủ để có thấy rõ sự khác biệt. Điều này gần đúng so với lý
thuyết, phụ thuộc vào nguồn và bản chất của enzyme amylase.
– Thao tác tay chưa được chuẩn của sinh viên trong việc chuyển từ malt đã nghiền
qua bình định mức.
– Quá trình thực hiện thí nghiệm trong tủ sấy không đảm bảo được nhiệt độ chúnh
xác do sự đóng mở cửa nhiều lần của nhiều nhóm.
1
Tanyolaç, Deniz, Belma Işık Yürüksoy, and Ahmet R. Özdural. "Immobilization of a thermostable α-amylase, Termamyl®,
onto nitrocellulose membrane by Cibacron Blue F3GA dye binding." Biochemical engineering journal 2.3 (1998): 179-186.
– Lượng hồ tinh bột có thể đã bị thủy phân một phần trước nên khi thêm xúc tác là
enzyme termamyl vào thì tinh bột sẽ bị thủy phân hoàn toàn trong khoảng thời gian
nhanh chóng.
– Lượng termamyl mỗi nhóm lấy là chưa thực sự giống nhau mà chỉ xấp xỉ 0,5ml
dẫn đến thời gian thủy phân tinh bột không giống nhau.
C. TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME
I. Cơ sở lý thuyết
Do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme và đặc biệt là của trung tâm hoạt
động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường
khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất
nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Đặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là
tính đặc hiệu của enzyme. Bài thí nghiệm này sẽ tiến hành nghiên cứu tính đặc hiệu
của enzyme invertaza và α–amylase là termamyl trên 2 cơ chất là saccharose và tinh
bột.
II. Chuẩn bị thí nghiệm
1. Dụng cụ thí nghiệm
– 4 ống nghiệm Φ12 – Tủ ấm
– Pipette 10ml – Nồi cách thủy
2. Hóa chất
– Dung dịch enzyme termamyl, enzyme investaza.
– Thuốc thử Liugol, hồ tinh bột 1%, saccharose 5%
– Thuốc thử Fehling.
III. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ đã được rửa sạch, sấy khô. Đánh số các ống
nghiệm từ 1 đến 4
Bước 1: Sử dụng pipet 10ml rút các dung dịch cho vào 4 ống nghiệm theo hướng
dẫn sau: ống [1] và [2] 5ml dung dịch saccharose 5%, ống [3] và [4] 5ml dung dịch hồ
tinh bột 1%.
Bước 2: Thêm vào ống [1] và ống [3] mỗi ống 1ml dung dịch enzyme invertaza,
ống [2] và [4] mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme termamyl.
Bước 3: Lắc đều, để ống nghiệm vào tủ sấy ở 37ºC trong 15 phút (lưu ý luôn điều
chỉnh nhiệt độ của tủ sấy ở khoảng này)
Bước 4: Lấy 4 ống nghiệm ra, cho vào ống [1] và [2] mỗi ống 5ml dung dịch
Fehling và đặt ở bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút (ống 3 và 4 vẫn ở nhiệt độ phòng).
Sau 2 phút, lấy ống [1] và [2] ra làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Cho vào ống [3] và [4] mỗi ống 2 giọt thuốc thử Liugol. Quan sát kết quả
và giải thích.
IV. Hiện tượng và phương trình phản ứng
1. Hiện tượng
Sau khi hoàn tất các bước thí nghiệm, dung dịch trong suốt ban đầu của các ống
nghiệm đã có những biến đổi như sau:
+ Ống 1: dung dịch thu được có màu nâu đỏ đậm và lượng lớn kết tủa.
+ Ống 2: dung dịch thu được trong suốt, có ánh đỏ gạch và có lượng ít kết tủa ở
đáy.
+ Ống 3: dung dịch thu được màu xanh đen đậm.
+ Ống 4: dung dịch thu được có màu xanh lam đậm, nhạt màu hơn so với ống [3].
2. Giải thích hiện tượng và phương trình phản ứng
– Bản chất của 2 phép thử với Fehling và Liugol:
+ Phép thử với Fehling: phép thử này là cách sử dụng dung dịch Fehling A có chứa
CuSO4 và dung dịch Fehling B chứa tartrat kép trong môi trường kiềm để khử đường
đơn có chứa gốc andehit trong dung dịch phân tích tạo thành Cu 2O kết tủa màu đỏ
gạch.
+ Phép thử với Liugol: Dung dịch Liugol, hay còn được gọi là nước iod hoặc dung
dịch iod mạnh, là một dung dịch có chứa KI cùng I 2 tan trong nước. Mà I2 tác dụng với
tinh bột sẽ cho ra phức màu xanh tím do ở nhiệt độ thường tinh bột có cấu trúc lò xo
xoắn, cấu trúc này sẽ hấp phụ các phân tử I2 lại.
– Giải thích và phương trình:
+ Ống 1: enzyme invertase thuỷ phân lượng lớn saccharose thành glucose và
fructose. Dung dịch đường sau đó có chứa glucose sẽ có tính khử cao, khử Cu 2+ thành
Cu2O sau khi cho dung dịch Fehling vào. Ở nhiệt độ cao, hầu hết saccharose bị thủy
phân tạo nên một lượng lớn kết tủa, làm cho dung dịch có màu nâu đỏ đậm. Vì vậy, có
thể kết luận, enzyme invertaza đặc hiệu cho phản ứng thủy phân saccharose thành
glucose và fructose. Phương trình phản ứng:
C12H22O11 (saccharose) + H2O Invertaza , 37 ℃ C6H12O6 (glucose) + C6H12O6 (fructose)
→