TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÍ NGHIỆM

TPHCM CÁC PHƯƠNG PHÁP

KHOA CN HOÁ HỌC-THỰC PHẨM PHÂN TÍCH CÔNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC CỤ

BÁO CÁO THỰC NGHIỆM

BÀI 5 PHÂN TÍCH CAFFEIN + PARACETAMOL BẰNG HPLC-UV

Ngày thí nghiệm: 19/04/2023 Điểm Chữ ký GVHD

Tên: Phan Thị Thúy Vy MSSV:21128274

Lớp: 211282B

I.GIỚI THIỆU VÀ NGUYÊN TẮC

1.Giới thiệu về caffeine, paracetamol, lý do tại sao phải xác định chúng trong
thuốc
Công thức cấu tạo Tác dụng Lưu ý khi sử
dụng
Caffein Tăng sự tỉnh Nếu sử dụng
táo quá nhiều sẽ
Ngăn ngừa gây ra: mất
một số bệnh ngủ, tăng
lý: động kinh, nhịp tim,
Alzheimer, tăng huyết
Parkinson áp, ảnh
Phục hồi cơ hưởng hệ
thể sau thời tiêu hóa, gây
gian luyện tập hại cho cơ
thể thao và xương,..
 Paracetamol Giảm đau, hạ Nếu sử dụng
sốt nhanh. quá liều có
Được dùng để thể gây ra
điều trị các ngộ độc gan,
chứng đau và huyết áp
sốt nhẹ như: không ổn
cảm cúm, đau định, hôn
đầu, đau mê,..
nhức,..
Bảng 1: giới thiệu Caffein và Paracetamol
Phải xác định hàm lượng của caffein và paracetamol trong thuốc vì khi bệnh nhân
bị bệnh, cơ thể sẽ mệt mỏi, việc sử dụng paracetamol có tác dụng giảm đau, caffein
có tác dụng giúp bệnh nhân tỉnh táo hơn giảm mệt mỏi, vì vậy người ta thường kết
hợp thêm cafffein và paracetamol trong thuốc giảm đau. Nhưng nếu sử dụng quá
nhiều và lạm dụng 2 chất này có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe con người vì vậy
phải xác định hàm lượng của của chúng trong thuốc, đồng thời với tỷ lệ thích hợp sẽ
đem lại hiệu quả cao cho bệnh nhân và tránh được các tác dụng phụ không mong
muốn.
2. Nguyên tắc
Để tách và xác định Cafein và paracetamol trong một mẫu thuốc bằng HPLC người
ta thường sử dụng nguyên tắc sau:
+ Chuẩn bị mẫu: mẫu thuốc được cân chính xác và hòa tan vào dung môi phù hợp
+ Chuẩn bị hệ thống HPLC: hệ thống hPLC được thiết lập với cột sắc ký phù hợp
và bơm dung môi vào cột sắc ký với lưu lượng và tỷ lệ phù hợp
+ Điều kiện sắc ký: Pha động là hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường là
acetonitrile hoặc methanol, tỷ lệ pha động/ pha tĩnh, lưu lượng dòng chảy, nhiệt độ
và áp suất điều chỉnh sao cho tốt nhất.
+ Phát hiện và xác định: sử dụng UV- Vis tín hiệu được ghi nhận và xử lý bằng phần
mềm HPLC bằng cách so sánh tính hiệu phát hiện với các tiêu chuẩn chuẩn bị sẵn
ta có thể xác định được 2 chất này.
+ Kiểm tra chất lượng: kết quả phân tích được, được sử dụng để kiểm tra chất lượng
và đảm bảo rằng mẫu thuốc đáp ứng nhu cầu tiêu chuẩn và an toàn.

3. Cấu tạo máy HPLC

Hình 1: Hệ thống máy HPLC

1. Bình chứa mẫu.
2. Bộ phận khử khí.
3. Máy bơm cao áp.
4. Van tiêm mẫu.
5. Cột bảo vệ.
6. Côt phân tích.
7. Detector.
8. Bộ phận xử lý dữ liệu.

II.THỰC NGHIỆM
 STT Hóa chất STT Dụng cụ
1 Chuẩn Caffein 1 Bình định mức
2 Chuẩn Paracetamol 2 Pipet 2ml
3 Methanol cho HPLC 3 Pipet 5ml
4 Nước cất 2 lần đã đề ion 4 Pipet 10ml
hóa
Bảng 2: Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
1.Khảo sát pha động
Cho máy HPLC chạy ở bước sóng 263nm với các hệ dung môi khác
nhau và thu được kết quả sau:
STT Tỷ lệ Methanol- Thời gian lưu tR Thời gian lưu tR
Nước của peak A (phút) của peak B (phút)
1 100:0 - -
2 50:50 3.150 4.000
3 30:70 4.142 7.525
Bảng 3: Bảng kết quả khảo sát pha động

Từ số liệu ở bảng trên ta tối ưu quá trình tách bằng cách chọn pha động với tỷ lệ
Methanol- nước là 50:50
2.Tiến hành định danh Caffein
-Pha 100ml dung dịch chuẩn đơn Caffein 10 ppm từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm bằng nước cất
2 lần như sau:
+Dùng pipet 10ml lấy 10ml dung dịch Caffein cho vào bình định mức 100 ml.
+Cho nước cất 2 lần vào bình định mức và định mức 100ml.
+Lắc đều.
-Lọc dung dịch bằng màng lọc, tiêm dung dịch vào van tiêm đo ở bước sóng 272 nm với tỷ lệ
pha động là 30:70 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính – Xác định LOD, LOQ.
Pha đường chuẩn sau bằng bình định mức 100ml với thể tích Caffein và Paracetamol như sau:
 STD 1 STD 2 STD 3 STD 4 STD 5
V Caffein 0.50 1.00 2.50 5.00 10.00
100ppm(ml)
V 0.25 0.50 1.25 2.50 5.00
Paracetamol
100pm(ml)
Bảng 4: Thành phần các dung dịch để xác định đường chuẩn
Tiến hành tiêm dung dịch vào hệ thống HPLC. Đầu tiên là mẫu blank ròi đến các
dung dịch có nồng độ từ thấp đến cao
3.Xử lý mẫu và phân tích
3.1 Thông tin về mẫu
Khối lượng viên thuốc là 0.5g. Có hàm lượng Paracetamol là 500mg/viên, không có
Caffein
3.2 Xử lý mẫu
 Cân 1 viên thuốc panadol vỉ màu xanh.
 Nghiền nhuyễn viên thuốc vừa cân bằng chén sứ.
 Dùng cân phân tích lấy chính xác 0.2500g thuốc đã nghiền cho vào becher
sau đó thêm khoảng 20ml Methanol vào.
 Cho becher trên vào máy siêu âm, bật chế độ đuổi bọt khí, để becher trong
máy siêu âm 10 phút.
 Sau 10 phút lấy becher ra khỏi máy siêu âm, dùng phễu và giấy lọc, lọc lấy
phần dung dịch cho vào bình định mức 100ml, trán rửa vài lần bằng HCl
6M.
 Thêm nước đề ion đã đuổi bọt khí vào định mức đến 100ml sau đó lắc đều.
 Lấy 0.20 ml mẫu vừa chuẩn bị ở trên, cho vào bình định mức 100ml sau đó
dùng nước cất 2 lần để định mức dung dịch chạm vạch sau đó lắc đều => Ta
được dung dịch mẫu.

III.Kết quả phân tích

1. Khảo sát thành phần pha động
Chọn bước sóng 263nm để khảo sát sơ bộ quá trình tách. Dùng chuẩn
hỗn hợp A để khảo sát thành phần pha động.
 STT Tỷ lệ MeOH- nước tR1 (CH1) tR2 (CH2) Ghi chú

1. 100:0 - - Không xác định được

thời gian lưu do có
các peak chồng vào
nhau, không xác định
được thời gian lưu

2. 50:50 3.150 4.000 Tách tốt

3. 80: 20 4.142 7.525 Tách tốt

Bảng 5: kết quả khảo sát pha động

Kết luận: Tỷ lệ dung môi lựa chọn là: MeOH: H2O = MeOH: H2O = 50:50 do ở tỷ
lệ này Paracetamol và Caffein cho peak tách hoàn toàn, thời gian lưu của pha động
50:50 ngắn hơn 70:30.

2. Định danh peak

Chon thành phần pha động phù hợp, tiến hành tiêm chuẩn đơn B và C để định danh
peak (tR) của từng chất.

STT Sample tR (phút) Ghi chú

1. DD chuẩn B: chuẩn đơn 3.842

Caffein 10 ppm

Bảng 7: Định danh Caffein

Kết luận: Thời gian lưu tR của caffeine là: 3.842

 CH1 là paracetamol, CH2 là Caffein.

3. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính – Xác định LOD, LOQ
– Tiến hành tiêm các dung dịch vào hệ thống HPLC. Đầu tiên là mẫu trắng rồi đến
các dung dịch chuẩn có nồng độ từ thấp đến cao của hai dãy chuẩn caffeine và
Paracetamol.

*Dãy chuẩn hỗn hợp

Paracetamol Caffein

STT Sample Nồng độ C Area 1 Nồng độ C Area 2

(ppm) (ppm)

1 Blank1 - - - -

2 STD1 0.25 6070 0.50 30197

3 STD2 0.50 11531 1.00 54040

4 STD3 1.25 28546 2.50 157261

5 STS4 2.50 58918 5.00 285048

6 STD5 5.00 123043 10.0 593644

Bảng 8: Diện tích các peak Paracetamol và Caffein ở các nồng độ khác nhau
 Biểu đồ hồi quy tuyến tính của Paracetamol và Caffein
700000

600000 y = 59158x - 763.76

R² = 0.9989
500000
Diện tích peak

400000 Paracetamol
300000 Caffein

200000 Linear (Paracetamol)

y = 24681x - 1272.8 Linear (Caffein)
100000
R² = 0.9994
0
0 2 4 6 8 10 12
Nồng độ C (ppm)

Paracetamol Caffein
Phương trình hồi quy y= 24681x -1272.8 y= 59158x-763.76
tuyến tính
R2 0.9994 0.9989
Độ lệch chuẩn s 1386.87 8775.77
Bảng 9: phương trình hồi quy tuyến tính cả Paracetamol và Caffein

*Xác định LOD, LOQ

Paracetamol
3𝑆 3 ×1386.87
LOD = = = 0.168 ppm
𝑚 24681

10𝑆 10 ×1386.87
LOQ = = = 0.562 ppm
𝑚 24681

Caffein
3𝑆 3 ×8775.77
LOD = = = 0.445 𝑝𝑝𝑚
𝑚 59158

10𝑆 10 ×8775.77
LOD = = = 1.483 ppm
𝑚 59158

4. Phân tích mẫu thuốc

 Khối Thể tính
Hệ số pha
STT Sample lượng cân định mức Area1 Area2
loãng (F)
(g) (mL)

1. Thuốc panadol 0.2501 100 500 90844 0

xanh

Bảng 10: Kết quả đo của mẫu

90844
 Nồng độ của mẫu 0.2501g là = × 500 =1840.36 (ppm)
24681
 Hàm lượng Paracetamol có chứa trong 1 viên thuốc 0.586g là
1840.36 ×0.586 100
× = 431.21 mg/viên
0.2501 1000

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

-Phương trình hồi quy có R2 =0.994 và R2= 09988 (R2 > 0.995) → phương trình
hồi quy có độ chính xác cao, tin cậy được về sự tuyến tính của S và C.
-Kết quả tính toán được không sai lệch quá nhiều so với tuyên bố của nhà sản xuất.
Sự sai lệch có thể do:
 Các viên thuốc có thành phần chênh lệch nhau trong quá trình phối trộn.
 Lượng cân lấy không chính xác
 Thao tác hòa tan mẫu vào dung môi chưa tách hoàn toàn paracetamol ra khỏi
dung dịch, quá trình rửa mẫu còn sót lại mẫu trên phễu.
 Thao tác đánh dấu tại chân peak để tính nồng độ chưa chính xác.
Từ đó đưa ra chế độ tách caffeine, paracetamol trên hệ HPLC-UV;
- Để tách và xác định Cafein và paracetamol trong một mẫu thuốc bằng HPLC người
ta thường sử dụng nguyên tắc sau:
+ Chuẩn bị mẫu : mẫu thuốc được cân chính xác và hòa tan vào dung môi phù hợp
+ Chuẩn bị hệ thống HPLC : hệ thống HPLC được thiết lập với cột sắc ký phù hợp
và bơm dung môi vào cột sắc ký với lưu lượng và tỷ lệ phù hợp
+ Điều kiện sắc ký: Pha động là hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường là
acetonitrile hoặc methanol, tỷ lệ pha động/ pha tĩnh , lưu lượng dòng chảy, nhiệt độ
và áp suất điều chỉnh sao cho tốt nhất.
+ Phát hiện và xác định: sử dụng UV- Vis tín hiệu được ghi nhận và xử lý bằng phần
mềm HPLC bằng cách so sánh tính hiệu phát hiện với các tiêu chuẩn chuẩn bị sẵn
ta có thể xác định được 2 chất này.
+ Kiểm tra chất lượng: kết quả phân tích được , được sử dụng để kiểm tra chất lượng
và đảm bảo rằng mẫu thuốc đáp ứng nhu cầu tiêu chuẩn và an toàn
Trả lời câu hỏi
Câu 1: Trình bày cấu tạo của một hệ thống sắc ký hiệu năng cao

Hình 2: sơ đồ hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC gồm các bộ phần chính sau:
1. Các bình chứa dung môi: dùng để chứa dung dịch pha động, hệ thống có thể gồm
các màn lọc để đảm bảo dung dịch pha động được tinh khiết.
2. Bộ phận khử khí: dùng để loại bỏ các bọt khí có trong dung môi pha động để tránh
ảnh hưởng đến áp suất, lưu lượng dung môi vào máy => tránh ảnh hưởng đến độ
chính xác và hiệu suất của máy
3.Bơm: dùng máy bơm cao áp, có áp suất có thể lên tới 250-600 bar dùng để hút
dung dịch pha động và bơm pha động vào cột, duy trì dòng liên tục, ổn định.
4. Van tiêm mẫu: là bộ phận để đưa chất phân tích vào, có 2 cách đưa mẫu bằng cột
đó là tiêm mẫu bằng tay hoặc dùng bộ phận tiêm mẫu tự động, có hai chế độ là Load
và Inject
5. Cột bảo vệ: được làm bằng thép không gỉ, có kích thước nhỏ hơn so với cột sắc
ký, hạt nhồi vào cột bảo vệ giống với hạt nhồi của cột sắc ký nhưng có kích thước
lớn hơn. Chức năng của cột bảo vệ là loại bỏ tạp chất có trong pha động, giúp bảo
vệ cột sắc ký
6. Cột sắc ký: Là bộ phận quan trọng nhất trong hệ thống HPLC, được làm bằng thép
không gỉ, chiều dài cooth từ 5-25cm, đường kính tròn 1-10mm, hạt nhồi phải đồng
nhất về kích thước( <80%) hạt nhồi có kích thước 0.3-5m.
7. Detector: có tác dụng phát hiện các tín hiệu của các thành phần được rửa giải ra
khỏi cột (tín hiệu quang, cường độ phát xạ, chiết suất, độ dẫn điện,..)chuyển cách
tính hiệu này thành các tín hiệu điện
8. Bộ phận xử lý dữ liệu: ở đây các tính hiệu điện sẽ được chuyển thành các peak có
thời gian lưu, diện tích peak, độ cao peak,… từ đây ta có thể xác định tính và định
lượng được các chất.

Câu 2: Trình bày cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc ký lỏng:

Ở chế độ LOAD: khi bơm hoạt động, dung môi sẽ đi từ (4) → (3) dung môi được
bơm vào cột.
Khi tiêm mẫu vào (1) mẫu sẽ đi từ (1)-(2) rồi đi qua vòng lặp, mẫu phân tích sẽ phủ
đầy vòng lặp, phần dư sẽ được thải bỏ.
Ở chế độ INJECT: cổng (1)-(2) sẽ được khóa lại, (1) sẽ nối với (6), lúc này nếu mẫu
được tiêm vào sẽ được thải ra ngoài. (4)-(3) sẽ bị khóa lại, (4) nối với (5), dung môi
được máy bơm bơm vào ở (4) đi qua vòng lặp, từ đó mang theo chất phân tích chạy
vào cột.
Câu 3: Trình bày nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV/Vis.
Đầu dò Detector bao gồm một bóng đèn phát ra ánh sáng vùng UV/Vis, một hệ thống
quang phổ để phân tích các tia UV bị hấp thụ, một bộ dò để chuyển tính hiệu quang
phổ thành tín hiệu điện.
Trong quá trình mẫu chạy qua cột, chất phân tích sẽ được tách ra khỏi cột dựa trên
độ phân cực và tương tác của chất phân tích và pha tĩnh. Khi chất phân tích đi qua
đầu dò, chúng sẽ hấp thu một phần hoặc toàn bộ tia UV, làm giảm cường độ của tia
UV, xác định cường độ tia UV bị chất phân tích hấp thu.
Đầu dò UV sử dụng đường nền để so sánh sự hấp thu tia UV của các chất phân tích
với tia UV được phát ra mà không đi qua chất phân tích. Độ hấp thụ tia UV của các
chất phân tích được tính bằng sự chênh lệch của cường độ tia UV đi qua chất phân
tích và cường độ tia UV không đi qua chất phân tích.
Câu 4: Trình bày cách xác định LOD và LOQ trong bài
Trong bài này ta sử dụng phương pháp đường chuẩn để xác định độ lệch chuẩn và
đáp ứng với độ dốc.
Tiến hành đo 5 mẫu nó nồng độ khác nhau để xây dựng phương trình đường hồi quy
tuyến tính.
Từ phương trình hồi quy y=mx + b ta xác định được độ dốc m
Từ diện tích peak, nồng độ mẫu chuẩn ta tính toán được sai số chuẩn S.
Có được m và S ta áp dụng công thức để xác định LOD và LOQ:
3𝑆
𝐿𝑂𝐷 =
𝑚
10𝑆
𝐿𝑂𝑄 =
𝑚
Câu 5: Trình bày cách xác định phương trình hồi quy tuyến tính
Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống HPLC theo nồng độ từ thấp tới cao, ở mỗi nồng
độ ghi lại diện tích của các peak, từ đó lập thành bảng thống kê nồng độ-diện tích
peak. Sử dụng Excel/ máy tính bỏ túi để xác định phương trình hồi quy tuyến tính.
Câu 6: Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số nào của sắc ký đồ? Giải
thích?
Thời gian lưu, độ rộng peak, độ phân giải.
-Thời gian lưu càng nhanh, quá trình tách diễn ra càng nhanh, tăng tốc độ, hiệu qủa
của quá trình tách.
-Độ rộng peak: peak càng rộng, độ tách càng kém, độ rộng của peak càng nhỏ, độ
chính xác càng cao.
-Độ phân giải: đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau, độ phân giải
càng cao thì hiệu số tách càng tốt.