16-Apr-24

Lịch sử 1906

Chương 10 Kỹ
thuật Ete dầu hỏa

SẮC KÝ LỎNG
sắc
ký

Th.s Nguyễn Thị Thùy Linh CaCO3

16-Apr-24 1 16-Apr-24 2

1 2

Mục tiêu học tập

1. Trình bày được sơ đồ hệ thống HPLC và vai trò
của từng bộ phận.
2. Trình bày được cơ chế tách và các pha dùng
trong Sắc ký phân bố( Sắc ký phân bố pha
thuận và sắc ký phân bố pha đảo), sắc ký hấp
phụ.
3. Trình bày được ứng dụng của HPLC.
4. Mô tả được cơ chế tách và các thao tác tiến
hành sắc ký lớp mỏng.
5.Trình bày được ứng dụng và đánh giá được ưu,
nhược điểm của Sắc ký lớp mỏng.
16-Apr-24 3 16-Apr-24 4

3 4

Sắc ký lỏng hiệu năng cao-HPLC

(High Perfomance Liquid Chromatography)
Khái niệm:
 HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các
chất phân tích di chuyển qua cột chứa các
hạt pha tĩnh dưới tác động của Pha động
là chất lỏng.
Tốc độ di chuyển liên quan tới Hằng số
phân bố K của chúng giữa 2 pha và quyết
định rửa giải các chất ra khỏi cột.

16-Apr-24 5 16-Apr-24 6

5 6

1
 16-Apr-24

1. Hệ thống HPLC
 Hệ thống cấp pha động
 Bơm cao áp
 Bộ phận tiêm mẫu
 Cột và pha tĩnh
 Detector
 Bộ phận xử lý dữ liệu
 Bình đựng thải

16-Apr-24 7 16-Apr-24 8

7 8

Có bọt khí Giảm hiệu lực cột

1.1 Hệ thống cấp pha động Biến dạng pic
- Pha động trong HPLC thường là các dung Nhiễu đường nền
dịch đệm, nước tinh khiết.
- MP là hỗn hợp các dung môi hòa tan vào Hai chế độ dung môi:
nhau các thành phần được đong theo thể • Chế độ đẳng dòng(isocratic)
tích, trộn kĩ và lọc bỏ các tiểu phân > • Chế độ Gradient
0,45µm.
??? Tại sao phải loại bỏ khí hòa tan trong
pha động?

16-Apr-24 9 16-Apr-24 10

9 10

isocratic

Gradient

16-Apr-24 11 16-Apr-24 12

11 12

2
 16-Apr-24

Hai kiểu thực hiện chương trình dung môi

Chương trình dung môi ở áp suất thấp

Dung môi 1

Bộ phận Bơm Van mẫu

Dung môi 2
hòa trộn

Dung môi 3

16-Apr-24 13 16-Apr-24 14

13 14

Hai kiểu thực hiện chương trình dung môi 1.2 Hệ thống bơm
Tạo áp suất cao để đẩy pha động đi với tốc
Chương trình dung môi ở áp suất cao
độ dòng hằng định.
Dung môi 1 Bơm 1  Yêu cầu:
• Hoạt động ở áp suất cao >5000 psi
Bộ phận
Dung môi 2 Bơm 2
hòa trộn
Van mẫu • Đảm bảo lưu lượng lặp lại
• Không bị ăn mòn
Dung môi 3 Bơm 3

16-Apr-24 15 16-Apr-24 16

15 16

Các loại bơm 1.3 Hệ tiêm mẫu

• Bơm đẩy một pittông - Dùng van tiêm mẫu
• Bơm làm đầy nhanh - Tiêm mẫu tự động
• Bơm kép đẩy kéo

16-Apr-24 17 16-Apr-24 18

17 18

3
 16-Apr-24

1.3 Hệ tiêm mẫu 1.4 Cột sắc ký và pha tĩnh

• Cột nhồi: 3, 5, 10 µm
• Cột bảo vệ
• Pha tĩnh
1. Mẫu vào
2. Ra
3. Vòng chứa mẫu
4. Dung môi vào
5. Cột
6. Tiêm

16-Apr-24 19 16-Apr-24 20

19 20

1.5 Detector
• Dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân
tích: Detector UV-ViS, huỳnh quang
• Dựa vào tính chất chung của chất pt trong
pha động: Detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn
điện.

16-Apr-24 21 16-Apr-24 22

21 22

Yêu cầu đối với Detector Một số loại detector chủ yếu
 Đáp ứng nhanh và lặp lại
• Detector hấp thụ UV-VIS
 Độ nhạy cao
• Detector huỳnh quang
 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
• Detector chỉ số khúc xạ
 Khoảng tuyến tính rộng
• Detector tán xạ bay hơi
 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
• Detector đo dòng
• Detector độ dẫn

16-Apr-24 23 16-Apr-24 24

23 24

4
 16-Apr-24

Detector hấp thụ UV- VIS Detector hấp thụ UV- VIS
- Detector đo ở bước sóng cố định: sử dụng - Detector đo ở bước sóng thay đổi:
kính lọc để chọn bước sóng Nguồn sáng và thiết bị đơn sắc hóa được nối với
Nguồn sáng: ống nhân quang → chuyển tín hiệu quang thành
đèn thủy ngân và đèn Vonfram chọn 1 số bước tín hiệu điện.
sóng: 254, 280, 334, 436 nm Nguồn sáng: Đèn D2 190 – 380 nm
 Ưu điểm: rẻ tiền Đèn wonfram 400-800 nm
 Nhược điểm: kém linh hoạt (chất phân tích Đèn Deuterium ARC 190-800nm
không hấp thụ các ƛ này thì không phát hiện
được hoặc nếu hấp thụ yếu thì giới hạn phát
hiện thấp.
16-Apr-24 25 16-Apr-24 26

25 26

16-Apr-24 27 16-Apr-24 28

27 28

Detector hấp thụ UV- VIS

- Detector mảng diod:
Nguồn sáng: Đèn D2 190 – 380 nm
Đèn wonfram 400-800 nm
Đèn Deuterium ARC 190-800nm
Sử dụng một hay hai mảng Diod (linh kiện bán dẫn) có rất
nhiều các diod đóng vai trò như đầu dò để nhận tán xạ đã
tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser (cách tử đặt sau
flow cell)
- đo được cả một dải sóng trong 1 thời điểm
- theo dõi đồng thời nhiều thành phần hấp thụ tại nhiều
bước sóng khác nhau.

16-Apr-24 29 16-Apr-24 30

29 30

5
 16-Apr-24

16-Apr-24 31 16-Apr-24 32

31 32

16-Apr-24 33 16-Apr-24 34

33 34

1.6 Bộ phận xử lý số liệu

 Máy ghi ( recorder)
 Máy tích phân ( Integrator)
 Máy tính và phần mềm điều khiển

16-Apr-24 35 16-Apr-24 36

35 36

6
 16-Apr-24

2.Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc
Sắc Sắc Sắc Sắc Sắc
ký
ký Ký Ký Ký Ký
Trao
Phân Hấp Loại Ái Đồng
Đổi
bố phụ cỡ lực Phân
ion

16-Apr-24 37 16-Apr-24 38

37 38

2.1 Sắc ký phân bố hiệu năng cao Pha tĩnh

• Sắc ký lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất
lỏng bao quanh hạt chất mang rắn, đó là
chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân
tích liên quan đến sự phân bố giữa hai
pha lỏng.
Dẫn chất Dẫn chất
• Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh có liên kết Bề mặt silica
Clorosilan Siloxan
với bề mặt chất mang rắn( silica,..)

16-Apr-24 39 16-Apr-24 40

39 40

Phân loại pha tĩnh

Pha tĩnh không Pha tĩnh phân cực:
phân cực: R là R là:

-CH2- (CH2)16- CH3: - CH2- (CH2)2- CN:

Pha tĩnh liên kết
ODS(C18) cyano
-CH2- (CH2)6- CH3: - CH2- (CH2)2 – NH2:
OS( C8) amino
Tính chất phân cực của pha tĩnh phụ thuộc vào gốc R -CH2- (CH2)2- C6H5: -CH2CH2OCH(OH)CH2OH
Phenyl propyl
diol
16-Apr-24 41 16-Apr-24 42

41 42

7
 16-Apr-24

Chất phân tích

F1 F2

Pha tĩnh Pha động

F3

16-Apr-24 43 16-Apr-24 44

43 44

Hai kỹ thuật sắc ký phân bố Để tách sắc ký, chọn 2 nguyên tắc sau:
1. Độ phân cực của chất phân tích hợp
Sắc ký pha thuận: Sắc ký pha đảo:
với độ phân cực của pha tĩnh và khác
- Pha tĩnh( SP): phân - Pha tĩnh (SP): không
xa độ phân cực của pha động
cực ( cyano, amino, phân cực (C18, C8,
diol,…) phenyl propyl,…) 2. Độ phân cực của chất phân tích hợp với
- Pha động( MP): dung - Pha động (MP): dung độ phân cực của Pha động và khác
môi ít phân cực môi phân cực ( nhiều với độ phân cực của pha tĩnh.
(hexan, CHCl3, MeCN, MeOH, THF, → Sắc ký pha đảo phân tích:….
isopropanol,…) hệ đệm,…)
→ Sắc ký pha thuận phân tích:….

16-Apr-24 45 16-Apr-24 46

45 46

Thứ tự rửa giải Thứ tự rửa giải

Sắc ký pha thuận (SP phân cực, MP ít phân cực) Sắc ký pha đảo (SP không phân cực, MP phân cực)
phân cực trung bình
Kém phân cực phân cực phân cực trung bình
kém phân cực
phân cực

Thời gian Thời gian

16-Apr-24 47 16-Apr-24 48

47 48

8
 16-Apr-24

Sắc ký pha thuận: Sắc ký pha đảo:

Thứ tự rửa giải - Pha tĩnh( SP): phân cực
(cyano, amino, diol,…)
Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo - Pha động( MP): dung môi ít
(MP ít phân cực) ( MP phân cực mạnh) phân cực (hexan, CHCl3,
isopropanol,…)
- Chất phân tích: chất phân cực
và phân cực trung bình
- Thứ tự rửa giải:
Chất ít phân cực rửa giải ra
trước, chất phân cực trung
bình, chất phân cực rửa giải
Thời gian Thời gian sau cùng.
- Tăng độ phân cực pha động
Khi tăng độ phân cực của pha động thì thứ tự rửa giải có
tR giảm dần
thay đổi không? Thời gian lưu có thay đổi không? Giải thích?
- Pha tĩnh (SP): không phân
cực (C18, C8, phenyl propyl,…)
- Pha động (MP): dung môi
phân cực ( MeCN, MeOH,
THF, hệ đệm,…)
- Chất phân tích: chất kém
phân cực và phân cực trung
bình
- Thứ tự rửa giải: Chất phân
cực rửa giải ra trước, chất
phân cực trung bình, chất ít
phân cực rửa giải sau cùng.
- Tăng độ phân cực pha động
tR tăng lên

16-Apr-24 49 16-Apr-24 50

49 50

Một số tính chất của dung môi dùng trong sắc ký lỏng
Cách chọn pha tĩnh và pha động:
Giới hạn
Chỉ số Điểm sôi Độ nhớt Độ phân
Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của TT Tên dung môi đo UV
(nm)
khúc xạ (0oC) CP, 25oC cực(P')*

dẫn xuất siloxan 1 n-hexan 190 1,372 69 0,3 0,1

2 Benzen 280 1,498 80 0,60 2,7
Với pha động: Dựa vào trị số P’ 3 Metylen clorid 233 1,421 40 0,41 3,1

Nếu pha động là hỗn hợp của 2 dung môi A 4 n-propanol

5 Tetrahydrofuran
240
212
1,385
1,405
97
66
1,90
0,46
4,0
4,0
và B thì : 6 Ethyl acetat 256 1,370 77 0,43 4,4
7 Cloroform 245 1,443 61 0,53 4,1
P’= P’A. TA + P’B. TB 8 Aceton 330 1,356 56 0,30 5,1
9 Ethanol 210 1,359 78 1,08 4,3
10 Acid acetic - 1,370 118 1,1 6,0
11 Acetonitril 190 1,341 82 0,34 5,8
12 Methanol 205 1,326 65 0,54 5,1
13 Nước 190 1,333 100 0,89 10,2
16-Apr-24 51 16-Apr-24 52

51 52

Chất phân tích:

dựa vào nhóm chức
Hydrocacbon mạch thẳng < olefin <
hydrocacbon thơm < dẫn xuất halogen < Tại sao thường sử
sulfid < ether < dẫn xuất nitro < este = dụng sắc ký phân bố
aldehyd= ceton <ancol = amin< sulfon< pha đảo?
sunfoxid< amid< acid carbonxylic< nước
Dựa vào chỉ số lgP (chỉ số dầu/nước)
C s ( oc tan ol )
lg P ( oc tan ol / nuoc )  lg( )
C s( nuoc )
lgP càng thấp, chất phân tích càng phân cực
16-Apr-24 53 16-Apr-24 54

53 54

9
 16-Apr-24

2.2. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

Triển khai Sắc ký pha đảo:
Là quá trình hấp phụ chất phân tích trên
Dùng để phân tích hỗn hợp chất hữu cơ có bề mặt chất rắn.
M< 2000, trung tính và không phân cực SP: chất rắn phân cực
Xác định mục tiêu của phân tích MP: chất lỏng
 Chọn kỹ thuật xử lý mẫu Chất phân tích tranh chấp với pha động ở
 Chọn Detector thích hợp các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
 Chọn điều kiện Sắc ký Lưu giữ chất phân tích là lực hấp phụ

16-Apr-24 55 16-Apr-24 56

55 56

Pha tĩnh: Pha động

 Silica: nguyên liệu chất nhồi cho sắc ký
pha thuận.Trên bề mặt có nhóm silanol ở
dạng tự do (có ái lực hấp phụ mạnh nhất)
SP ổn định ở pH = 2-8.
 Alumina: ổn định ở pH =2 – 12. Ứng dụng
tách các bazo hữu cơ.
 Hiện nay đang nghiên cứu sử dụng
titanoxyd và zirconi oxyd, ổn định được
môi trường acid đến pH=1.
16-Apr-24
 Thành phần pha động ảnh hưởng rõ rệt
đến hệ số phân bố của chất phân tích.
 Dùng pha động có sức rửa giải ε0
 Nếu pha động gồm nhiều dung môi:
ε = ε0A* TA + ε0B*TB
57 16-Apr-24 58

57 58

Thứ tự rửa giải trên cột hấp phụ

Chất phân tích

F1 F2 Chất phân cực hơn có tR

dài hơn

Chất phân cực trung bình

Pha tĩnh Pha động Chất kém phân cực có tR

ngắn nhất
Pha tĩnh Silicagel trần Pha động có độ phân cực
có chứa các nhóm –OH giống chất phân tích Muốn làm giảm tR của chất phân
cực: Tăng sức rửa giải MP
phân cực -Tăng tỉ lệ dung môi phân cực
16-Apr-24 59 16-Apr-24 -Thêm dung môi phân cực 60

59 60

10
 16-Apr-24

Sức rửa giải của một số dung môi

trong sắc ký hấp phụ Ứng dụng:
TT Tên dung môi o silica o alumina Phân tích chất có khối lượng phân tử
1 n - hexan 0 0,01
2 n - heptan 0 0,01 dưới 5000, ít tan trong nước hoặc tan
3 Cyclohexan - 0,04
4 Carbon tetraclorid 0,11 0,17 trong hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ
5
6
Isopropyl ether
Cloroform
0,32
0,26
0,28
0,36
không thích hợp với sắc ký pha đảo.
7
8
1,2 dicloroethan
Tetrahydrofuran
0,34
0,53
0,44
0,51
+ Tách các đồng phân vị trí của các HCHC
9
10
Ethyl acetat
Acetonitril
0,48
0,52
0,60
0,55
+ Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực
11 Dioxan 0,51 0,61 phẩm, dược phẩm.
12 Tert - butanol - 0,70
13 n - butanol - 0,82
14 i - propanol 0,60 0,82
15 Ethanol - 0,88
16 Methanol 0,70 0,95
16-Apr-24 17 Nước - > 0,95 61 16-Apr-24 62

61 62

3.Ứng dụng của HPLC

Những loại sắc ký khác
• Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao Thử tinh khiết
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel
• Sắc ký ái lực  Định tính
• Sắc ký lỏng siêu tới hạn
Tài liệu Định lượng

16-Apr-24 63 16-Apr-24 64

63 64

Chuẩn
 Định tính: Định lượng
- Dựa vào tR Thử

- Kết hợp Detector DAD chồng phổ

chất chuẩn và chất thử.

16-Apr-24 65 16-Apr-24 66

65 66

11
 16-Apr-24

Phương pháp ngoại chuẩn 3.1 Phương pháp ngoại chuẩn

- Chuẩn ngoại 1 điểm (so sánh) - Mẫu chuẩn và mẫu thử sắc ký cùng điều kiện
- Chuẩn ngoại nhiều điểm (đường chuẩn) - So sánh diện tích hoặc chiều cao của chất phân
 Phương pháp nội chuẩn tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng đã
biết
- Chuẩn nội 1 điểm
Yêu cầu:
- Chuẩn nội nhiều điểm
 Chất chuẩn ngoại có cùng bản chất với chất
 Phương pháp thêm phân tích
- Thêm 1 điểm  Đạt yêu cầu là chất chuẩn tinh khiết
- Thêm đường chuẩn
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
16-Apr-24 67 16-Apr-24 68

67 68

3.1 Phương pháp ngoại chuẩn

3.1 Phương pháp ngoại chuẩn
Ngoại chuẩn 1 điểm Chuẩn ngoại nhiều điểm
Mẫu thử (Cx) Mẫu chuẩn (Cc) Chuẩn bị mẫu:
Xử lý mẫu cùng điều kiện
dd mẫu thử: mẫu thử Cx
dd mẫu chuẩn: 1. mẫu chuẩn C1
Dung dịch thử (Cx ) Dung dịch chuẩn (Cc)
2. mẫu chuẩn C2 i. Xử lý mẫu
Chạy sắc ký cùng điều kiện Sắc
3. mẫu chuẩn C3 ii. Chạy sắc ký
ký đồ
Diện tích pic thử (Sx) Diện tích pic chuẩn (Sc) 4. mẫu chuẩn C4 cùng điều kiện

5. mẫu chuẩn C5
Cx Sx Lưu ý: C1 ≤ Cx ≤ C5

16-Apr-24 Cc Sc 69 16-Apr-24 70

69 70

3.1 Phương pháp ngoại chuẩn

S5
S4
S

S3 S5
S= a.C + b
Sx
R≥ 0,99
S2 S4
Sx
S1
S3
Sx= a.Cx +b
S2

Mẫu chuẩn 1 Mẫu chuẩn 2 Mẫu chuẩn 3 Mẫu thử Cx S1

Mẫu chuẩn 4 Mẫu chuẩn 5
Cx= (Sx –b)/a

C1 C2 C3 Cx C4 C5 C

16-Apr-24 71 16-Apr-24 72

71 72

12
 16-Apr-24

Ví dụ 1: Xây dựng đường chuẩn của 5-HMF 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Nồng độ ban
Diện tích Thêm lượng giống nhau của chất chuẩn thứ 2 ( chuẩn
đầu (µg/ml)
pic nội (Internal Standard - IS) vào mẫu chuẩn và mẫu thử
(mAU.s) rồi tiến hành Sắc ký.
5,0 7,329
Chuẩn bị mẫu:
10,0 13,52
50,0 71,48 Sx dd mẫu thử: mẫu thử Cx + Cis
80,0 113,1 dd mẫu chuẩn: mẫu chuẩn Cc + Cis
100,0 135,4
Chất chuẩn nội:
150,0 210,0
200,0 276,9
+ Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử
Phương trình hồi quy Cx + Có nồng độ ~ nồng độ chất thử
y = 1,3847x +0,5464 (R2 = 0,9996) + Không có phản ứng với bất cứ thành phần nào của mẫu
thử
Mẫu thử + Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

16-Apr-24 73 16-Apr-24 74

73 74

3.2 Phương pháp nội chuẩn

3.2 Phương pháp nội chuẩn
• Yêu cầu của chất chuẩn nội: Nội chuẩn 1 điểm
+ Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic Mẫu thử (Cx) Mẫu chuẩn ngoại (Cc)
Thêm chuẩn CIS
của các thành phần khác( Rs >1,25) Thêm chuẩn CIS

+ Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic Dung dịch thử (Cx + CIS) Dung dịch chuẩn (Cc+ CIS )
của chất phân tích. i. Xử lý mẫu

→ Sai số do tiêm mẫu được loại bỏ ii. Chạy sắc ký cùng điều kiện

Diện tích pic mẫu thử (Sx , Sis) Diện tích pic mẫu chuẩn (Sc , Sis)

16-Apr-24 75 16-Apr-24 76

75 76

3.2 Phương pháp nội chuẩn

3.2 Phương pháp nội chuẩn
Phương pháp nội chuẩn 1 điểm
Sis
Sc Sis
Sx
Phương pháp nội chuẩn nhiều điểm
Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx + Cis
dd mẫu chuẩn: 1. mẫu chuẩn C1 + Cis
Dd mẫu chuẩn Dd mẫu thử 2. mẫu chuẩn C2 + Cis
SC SX
RC  RX  3. mẫu chuẩn C3 + Cis
S IS S IS 4. mẫu chuẩn C4 + Cis
CC SC RC
  5. mẫu chuẩn C5 + Cis
Cx SX RX
16-Apr-24 77 16-Apr-24 78

77 78

13
 16-Apr-24

3.2 Phương pháp nội chuẩn 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Sis Sis
S3 Tính các hệ số R tương ứng:
S2 R1 = S1/ Sis
S1
R2 = S2/ Sis
R3 = S3/ Sis
Phương trình tuyến tính R(C)
Sis
R4 = S4/ Sis
Sis S4 S5 Sis
R5 = S5/ Sis
Rx = Sx/ Sis
Sx

16-Apr-24 79 16-Apr-24 80

79 80

3.2 Phương pháp nội chuẩn

R
3.3 Phương pháp thêm chuẩn
R5
R= a.C + b Nguyên tắc: Xác định hàm lượng chất phân
R≥ 0,99
R4
Rx
tích trên nền dung dịch cần định lượng, sử
R3 dụng chất chuẩn ngoại (chất chuẩn của
Rx= a.Cx +b
R2 chính chất cần phân tích)
R1
Cx= (Rx –b)/a
Thêm một điểm
Thêm đường chuẩn
C1 C2 C3 Cx C4 C5 C

16-Apr-24 81 16-Apr-24 82

81 82

3.3 Phương pháp thêm chuẩn 3.3 Phương pháp thêm chuẩn
Thêm chuẩn 1 điểm Thêm chuẩn nhiều điểm (thêm đường chuẩn)
Mẫu thử (Cx) Mẫu thử (Cx) Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx
Không thêm Cc Thêm chuẩn Cc
dd mẫu thử thêm chuẩn: 1. mẫu thử CX + thêm chuẩn C1
Dung dịch thử (Cx ) Dung dịch thử thêm chuẩn 2. mẫu thử CX + thêm chuẩn C2
i. Xử lý mẫu
(Cx + Cc ) 3. mẫu thử CX + thêm chuẩn C3
4. mẫu thử CX + thêm chuẩn C4
ii. Chạy sắc ký cùng điều kiện
5. mẫu thử CX + thêm chuẩn C5
Diện tích pic thử (Sx)
Diện tích pic thử thêm chuẩn (Sc+x) Xử lý mẫu và chạy sắc ký mẫu thử và mẫu thêm chuẩn
Cx Sx ngoại cùng điều kiện.

Cx  Cc Sc  x
16-Apr-24 83 16-Apr-24 84

83 84

14
 16-Apr-24

3.3 Phương pháp thêm 3.3 Phương pháp thêm chuẩn

Thêm chuẩn nhiều điểm (thêm đường chuẩn) S

Sx S5 S= a.C + b
mẫu thử: mẫu thử Cx R≥ 0,99
S4
1. mẫu thử CX + thêm chuẩn C1 S1 S3
2. mẫu thử CX + thêm chuẩn C2 S2 S2
3. mẫu thử CX + thêm chuẩn C3 S3 S1
4. mẫu thử CX + thêm chuẩn C4 S4 Sx
5. mẫu thử CX + thêm chuẩn C5 S5

Cx C 1 C2 C 3 C4 C 5 Nồng độ chuẩn thêm vào

Nồng độ dd thử

16-Apr-24 85 16-Apr-24 86

85 86

3.4 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Hàm lượng% chất A trong mẫu phân tích có
n thành phần:

SA S .100
%A  100 An
S1  S2  ...  Sn
Si
i 1
Yêu cầu:
- Tất cả các thành phần được rửa giải
-Tất cả các thành phần được phát hiện và có hệ số đáp ứng
trên Detector như nhau
16-Apr-24 87 16-Apr-24 88

87 88

3.4 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
 Trường hợp các chất có hệ số đáp ứng
khác nhau thi f được xác định bằng cách:
f= Cc/ Sc
Bài tập 7
Phân tích thuốc tiêm chứa methyl prednisolonbằng sắc ký lỏng như
sau:
Chuẩn bị mẫu:
+ mẫu chuẩn: hút 1 ml dung dịch chuẩn methyl prednisolon nồng độ
402,0 ppm và 1 ml dung dịch chuẩnprednisolon nồng độ 400,0 ppm vào
bình định mức 10 ml, định mức vừa đủ bằng dung môi, xử lý mẫu bằng chiết
lỏng – lỏng được dung dịch A.
+ mẫu thử: hút 1 ml dung dịch thuốc tiêm cần định lượng vào bình định
mức 100 ml, làm đầy bằng dung môi. Sau đó hút 1 ml dung dịch trên vào bình
định mức 10 ml, thêm 1 ml dung dịch chuẩn prednisolon nồng độ 400,0 pm,
định mức vừa đủ bằng dung môi, xử lý mẫu này bằng chiết lỏng - lỏng tương

SA .fA tự mẫu chuẩn được dung dịch B.

%A 
Chương trình sắc ký:
+ Pha động: hỗn hợp dung môi methylen clorid – isopropanol = 85:15

S1f1  S2f2  ... Sn fn

(v/v).
+ Pha tĩnh: cột SUPELCOSIL LC-NH2 250x4,6 mm; 5 m.
a) Phân loại loại hình sắc ký và dự đoán thứ tự rửa giải của hai chất trên
(công thức cấu tạo như hình 1; lgP của prednisolone và methylprednisolone
lần lượt là 1,62 và 1,82).

16-Apr-24 89 16-Apr-24 90

89 90

15
 16-Apr-24

Bài tập 7
b) Phân loại phương pháp định lượng trên và tính nồng độ của 3. Sắc ký lớp mỏng
methylprednisolon trong thuốc tiêm (mg/ml) biết kết quả sắc ký dung
dịch A và B được trình bày trong bảng sau

Diện tích pic Prednisolon Methyl prednisolon

Dung dịch
A 999,2 3048,9
B 1000,6 3094,9

a) b)

a) Prednisolon và b) Methyl prednisolon

16-Apr-24 91 16-Apr-24 92

91 92

3. Sắc ký lớp mỏng

(Thin- Layer Chromatography :TLC)
3.1. Nguyên tắc
• Là hệ sắc ký lỏng - rắn
- pha tĩnh là chất rắn
- pha động là chất lỏng
• Một dung dịch mẫu thử được đưa lên một lớp
pha tĩnh tráng trên nền phẳng( thủy tinh, giấy
nhôm, polymer). Quá trình tách các hợp chất
xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển
dọc theo bản mỏng.
16-Apr-24 93 16-Apr-24 94

93 94

Một số chất làm pha tĩnh cho TLC

Pha tĩnh Cơ chế sắc Ứng dụng phân tích
ký
* Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon,
alcaloid, vitamin
* Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực
* Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat,
nucleotid
* Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất
màu thực phẩm, lipid
* Cát biển Phân bố Đường, acid béo
* Cellulose trao đổi Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim
ion loại, halogenid
* Gel sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại
Pha tĩnh thông dụng nhất là Silica gel (chiếm 90%)
16-Apr-24 95 16-Apr-24 96

95 96

16
 16-Apr-24

• Hệ số lưu giữ:
3.2. Pha tĩnh
d
Rf  R • Kích thước hạt : 10-30µm
dM • Bề dày : 250 µm
• Kích thước bản mỏng: 5-20 cm
dR: khoảng cách từ điểm • Hoạt tính hấp phụ do –OH trên bề mặt quyết
xuất phát đến tâm vết định.
phân tích
dM: khoảng cách từ điểm
xuất phát tới mức dung
môi pha động

Rf = (0 – 1)
16-Apr-24 97 16-Apr-24 98

97 98

3.2. Pha tĩnh - Phân cực

- Phân cực trung
Một số loại pha tĩnh silica hay được sử dụng
- Silica gel G: bản mỏng Silica và chất kết dính thạch cao
Chất phân tích bình
- Kém phân cực
(Gymsum- 13% CaSO4)
- Silica gel H: bản mỏng Silica và không chất kết dính F1 F2
thạch cao (dùng Al2O3 làm chất kết dính)
- Silica gel GF254: bản mỏng Silica và chất kết dính thạch
cao (Gymsum) trộn chất phát huỳnh quang ở bước sóng
254 nm ( Fluorescence –ƛex 254nm )
- Silica gel HF254: bản mỏng Silica và trộn chất phát huỳnh Pha tĩnh Pha động
quang ở bước sóng 254 nm ( Fluorescence –ƛex 254nm )
Pha tĩnh Silica gel trần Pha động có độ phân cực
có chứa các nhóm –OH giống chất phân tích
phân cực
16-Apr-24 99 16-Apr-24 100

99 100

3.3. Pha động Sức rửa giải của một số dung môi trong sắc ký hấp phụ
TT Tên dung môi o silica o alumina
 Dung môi cần có độ tinh khiết cao 1 n - hexan 0 0,01
2 n - heptan 0 0,01
 Cần điều chỉnh sức rửa giải của MP sao cho 3 Cyclohexan - 0,04
0,2 < Rf < 0,8. 4 Carbon tetraclorid 0,11 0,17
5 Isopropyl ether 0,32 0,28
 Chất phân tích dạng ion hay phân cực được 6 Cloroform 0,26 0,36
7 1,2 dicloroethan 0,34 0,44
rửa giải tốt bằng dung môi phân cực. Thêm một 8 Tetrahydrofuran 0,53 0,51
ít acid acetic hoặc amoniac sẽ làm tăng độ tan 9 Ethyl acetat 0,48 0,60
10 Acetonitril 0,52 0,55
của base hoặc acid tương ứng. 11 Dioxan 0,51 0,61
 Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân 12 Tert - butanol - 0,70
13 n - butanol - 0,82
cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết 14 i - propanol 0,60 0,82
định tốc độ di chuyển của chất phân tích và vị trí 15 Ethanol - 0,88
16 Methanol 0,70 0,95
Rf của chúng. 17 Nước - > 0,95
16-Apr-24 101 16-Apr-24 102

101 102

17
 16-Apr-24

0,2 ≤ Rf ≤ 0,8
*Nếu Rf < 0,2 ?? Cần tăng Rf → Tăng sức rửa giải của pha động
-Tăng tỉ lệ của dung môi phân cực hơn.
- Thêm dung môi phân cực hơn vào hệ pha động
- Thêm dung môi giúp hòa tan chất (chuyển dạng chất pt, ví dụ NH3, CH3COOH)
*Nếu Rf > 0,8 ?? Cần giảm Rf → Giảm sức rửa giải của pha động : làm ngược
lại như trên.
16-Apr-24 103 16-Apr-24 104

103 104

3.4.Các bước tiến hành

3.4.1. Chuẩn bị bản mỏng và bình dung môi
3.4.2. Đưa mẫu lên bản mỏng
3.4.3. Khai triển
3.4.4. Phát hiện vết
3.4.5. Xử lý kết quả

16-Apr-24 105 16-Apr-24 106

105 106

3.4.1. Chuẩn bị bản mỏng và bình dung môi Ảnh hưởng của độ ẩm lên độ hấp phụ của pha tĩnh
- Chọn bản mỏng có kích
- Nếu bản mỏng càng ẩm
thước phù hợp (độ ẩm cao) thì càng có
- Hoạt hóa bản mỏng ( nếu nhiều nước trên bề mặt
cần) silica gel làm cho hoạt
- Kiểm soát độ ẩm của bản tính hấp phụ của silica gel
mỏng (nếu cần) bị giảm.

- Nếu bản mỏng được

hoạt hóa cao độ (độ ẩm
thấp) thì khả năng hấp
phụ chất phân tích rất
mạnh, các chất di chuyển
khó khăn, Rf thấp.
16-Apr-24 107 16-Apr-24 108

107 108

18
 16-Apr-24

Chuẩn bị dung môi pha động

-Bình thủy tinh đáy phẳng, có nắp đậy, sạch, khô
- Bình có kích thước phù hợp với bản mỏng, cao hơn bản mỏng
4-5 cm.
- Bão hòa dung môi pha động( nhất là dung môi có độ nhớt cao
và khó bay hơi) bằng cách đặt 1 tờ giấy lọc áp sát thành bình,
thời gian bão hòa dung môi nên cố định để kết quả dễ lặp lại.
-Mức dung môi không được ngập vạch xuất phát trên bản
mỏng.

16-Apr-24 109 16-Apr-24 110

109 110

Ảnh hưởng của bão hòa dung môi 3.4.2. Đưa mẫu lên bản mỏng

16-Apr-24 111 16-Apr-24 112

111 112

- Lượng mẫu: 0,1- 50µg Tiền tuyến dung môi

- Thể tích dung dịch chấm: 1- 5µl

- Dung môi phải hòa tan tốt mẫu thử, dễ bay hơi, càng kém
phân cực càng tốt.
- Không nên dùng nồng độ quá cao hoặc quá loãng.
- Đừng gây bong tróc pha tĩnh trong khi chấm sắc ký.
- Thiết bị chấm mẫu

Vạch xuất phát

Hỗn hợp PT

Chuẩn A Chuẩn B

16-Apr-24 113 16-Apr-24 Dung môi ngập vạch xuất phát 114

113 114

19
 16-Apr-24

Cách khắc phục:

Đưa vết dạng - Mao quản nhỏ
vạch thường - Vết chấm trước
cho độ phân chờ dung môi khô
mới chấm tiếp lần
giải giữa các sau.
vết cao hơn - Dung môi pha mẫu
vết dạng tròn. thử càng ít phân
cực càng tốt, càng
dễ bay hơi càng
tốt.
- Thao tác sử dụng
mao quản: chấm
thật nhanh rồi nhấc
lên.
16-Apr-24 115 16-Apr-24 116

115 116

Ảnh hưởng của lượng mẫu đưa lên bản mỏng 3.4.3. Khai triển

• Sắc ký lên
• Sắc ký ngang
• Sắc ký hai chiều

16-Apr-24 117 16-Apr-24 118

117 118

Sắc ký hai
chiều

Sắc ký lên Sắc ký

ngang
16-Apr-24 119 16-Apr-24 120

119 120

20
 16-Apr-24

3.4.4. Phát hiện vết Chất phân tích có màu (hấp thụ ViS)
quan sát bằng mắt thường
• Chất phân tích có màu
• Phun thuốc thử hiện màu
• Soi UV : soi dưới đèn 254 nm hoặc 365 nm
+ quan sát ở 254 nm vệt tối trên nền sáng (với
bản mỏng GF254)
+ Chất phân tích phát huỳnh quang: soi đèn UV
thấy vệt sáng trên nền tối.
• Dùng máy đo mật độ vết: đo cường độ tia phản
xạ từ bản mỏng khi soi dưới đèn UV-ViS, chất
phân tích hấp thụ ghi lại thành pic sắc ký.

16-Apr-24 121 16-Apr-24 Sự tách biệt của mực đen bởi sắc kí lớp mỏng 122

121 122

Một số thuốc thử tạo màu trong TLC

Phun thuốc thử hiện màu Thuốc thử Màu của vết Ứng dụng phân tích
1. Thuốc thử chung
* Acid phosphomolypdic Xanh tối Nhiều chất hữu cơ

* Acid sulfuric đặc Nâu- đen Tất cả các chất hữu cơ

* Hơi iod Nâu Nhiều chất hữu cơ

2. Thuốc thử chọn lọc
* Ninhydrin Hồng- tím Acid amin, các nhóm chức
amin
* 2,4 - dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ Các hợp chất carbonyl

* Xanh hoặc lục bromocrezol Vàng Các acid hữu cơ

* 2,7 fluorescein Vàng –lục Nhiều chất hữu cơ
* Vanilin/acid sulfuric Xanh – lục- hồng Alcol, ceton

* Rhodamin B Huỳnh quang đỏ Các chất lipid

* Anisaldehyd/ SbCl3 Nhiều màu Các chất steroid
* Diphenylamin/Zn2+ Nhiều màu Các chất bảo vệ thực vật

16-Apr-24 123 16-Apr-24 124

123 124

Soi UV Soi UV
Bản mỏng Silica gel
Bản mỏng Silica gel G,
GF254 ,chất phân tích hấp chất phân tích phát huỳnh
thụ UV quan sát vệt tối quang quan sát thấy vệt
trên nền sáng sáng trên nền tối

16-Apr-24 125 16-Apr-24 126

125 126

21
 16-Apr-24

Dùng máy đo mật độ vết

3.5. Một vài thông số đặc trưng của TLC

1- R f
k' 
Rf
2
d 
N  16  R 
W
Đo cường độ tia phản xạ từ bản mỏng khi soi dưới đèn UV-ViS, dR W2
chất phân tích hấp thụ ghi lại thành pic sắc ký. H 
N 16dR
16-Apr-24 127 16-Apr-24 128

127 128

3.6. Ứng dụng của TLC 3.6. Ứng dụng của TLC
TLC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
- Hóa học  Định tính
+ theo dõi phản ứng tổng hợp hữu cơ (1 trong các Thử tinh khiết
chất tham gia hết, hoặc sản phẩm tạo thành không Định lượng
thay đổi nữa)
+ kiểm tra hai chất có đồng nhất (3 hệ dung môi
Rf~ 0,2; 0,5; 0,7)
- Dược học ( thực vật, dược liệu, kiểm tra tạp
chất, độ tinh khiết của các chất,…)
- Mỹ phẩm, thực phẩm, môi trường, pháp y, lâm
sàng…
16-Apr-24 129 16-Apr-24 130

129 130

3.6. Ứng dụng của TLC 3.6. Ứng dụng của TLC
3.6.1. Thử tinh khiết 3.6.2. Định tính
So sánh mẫu thử và mẫu
Kiểm tra tạp chất có mặt trong Dược chất chuẩn chạy sắc ký trong
thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ. cùng điều kiện:
- Dựa vào trị số Rf
- Màu sắc vết sắc ký.
- Hình dáng vết sắc ký. Mao lương hoa vàng

1 2
Ethyl acetat- formic acid- nước(8:1:1)

Sắc ký đồ định tính Berberin trong dịch chiết mao

lương hoa vàng
1. Berberin chuẩn
2. Dịch chiết mao lương hoa vàng
16-Apr-24 131 16-Apr-24 132

131 132

22
 16-Apr-24

3.6. Ứng dụng của TLC 3.6. Ứng dụng của TLC
3.6.2. Định tính 3.6.3. Định lượng
- So sánh hệ số Rr: hệ số lưu giữ tương đối - Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng
Rr càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn dung môi thích hợp
càng đồng nhất - Định lượng trực tiếp trên bản mỏng : Đo diện
tích hay cường độ màu của vết sắc ký.
+ Máy đo mật độ vết: chiếu chùm tia vào vết sk
dR, x
R r  và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang
dR,c + Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản
dR,x: đường đi của chất phân tích (cm) mỏng để thu nhận hình ảnh của vết sk.
dR,c: đường đi của chất chuẩn (cm)
16-Apr-24 133 16-Apr-24 134

133 134

3.7. Đánh giá TLC

Ưu điểm: Nhược điểm:
- Thiết bị đơn giản, chi phí - Độ lặp lại của Rf thấp do
thấp, thực hiện nhanh thành phần pha động
- Phát hiện được tất cả các thay đổi trong quá trình
chất, kể cả các chất khai triển sắc ký.
không di chuyển theo pha - Tăng giãn rộng pic do
động. khuếch tán vì tốc độ
- Thực hiện tách dễ dàng dòng pha động thấp.
các mẫu có nhiều thành
phần.

16-Apr-24 135 16-Apr-24 136

135 136

23