BIOANALYTICKÁ CHEMIE

• Subdílčí disciplína analytické chemie

• Zaměřuje se na analýzu biologických látek:
o Léčiva, metabolity, proteiny, DNA, lipidy, hormony, a další biomolekuly
o Často ve velmi nízkých koncentracích
o Hraje klíčovou roli v různých oblastech
o Farmacie, klinická diagnostika, monitorování životního prostředí, biotechnologie

OMICS
• Využití vysoce sofistikovaných metod pro komplexní analýzu molekul, které tvoří buňky živých organismů
o Jak živočišných, tak rostlinných
• Důležité pro porozumění celkového složení a funkcí molekul v buňkách

PRÁCE BIOANALYTICKÉHO CHEMIKA

• Vyvíjet robustní metody zaměřené na detekování, kvantifikaci a charakterizaci biomolekul v různých biologických vzorcích
• Náročné odvětví analytické chemie díky velmi komplexním matricím a nízkým koncentracím
• Složitá úprava vzorků
o Extrakce, purifikace, derivatizace
• často složitá instrumentace
o LC-MS, NMR
• Nutné interdisciplinární znalosti
o Chemie, biologie, fyzika, biostatistika

BIOMOLEKULY
• Biomolekuly jsou základními složkami živých systémů a jsou nezbytné pro strukturu, funkci a regulaci živých organismů.
• Studium biomolekul a jejich interakcí je zásadní pro obory, jako je biochemie, molekulární biologie a biotechnologie,
protože poskytuje pohled na fungování živých systémů a potenciální aplikace v medicíně, zemědělství a průmyslu.
• Řadí se do několika hlavních kategorií
o Proteiny
o Nukleové kyseliny
o Sacharidy
o Lipidy
o Aminokyseliny
o Nukleotidy
o Vitaminy
o Hormony
o Enzymy

ŽIVÝ SYSTÉM
• Živé systémy mohou zahrnovat širokou škálu organismů, od jednoduchých jednobuněčných bakterií po složité
mnohobuněčné organismy jako jsou rostliny, zvířata a lidé. Tyto systémy jsou propojené a dynamické, s různými složkami,
které spolupracují na udržení života.
o živé systémy, musí splňovat několik kritérií:
- časově a prostorově ohraničené
- otevřené – výměna energie, informací, látek
- vysoká úroveň organizovanosti – nízká entropie
- schopnost samostatné existence a údržby
- schopnost reprodukce
- schopnost vývoje - evoluce
• Pořádek: Živé systémy jsou vysoce organizované struktury s definovaným uspořádáním složek, od molekul a buněk po
tkáně a orgány. Tato organizace je zásadní pro jejich správnou funkci.
• Citlivost nebo Reakce na Prostředí: Živé systémy dokážou detekovat a reagovat na změny ve svém okolí. Mají schopnost
vnímat environmentální signály a přizpůsobovat své chování nebo funkce podle nich.

1
• Reprodukce: Živé systémy mohou produkovat potomstvo prostřednictvím procesů jako je buněčné dělení, sexuální
reprodukce nebo jiné reprodukční mechanismy, což zajišťuje zachování jejich druhu.
• Růst a Vývoj: Živé systémy procházejí růstem a zráním, postupují od jediné buňky k složitějším, mnohobuněčným
organismům. Tento proces zahrnuje změny ve struktuře a funkcích během času.
• Regulace: Živé systémy mají mechanismy, které regulují vnitřní podmínky, udržují stabilitu a rovnováhu prostřednictvím
procesů jako je homeostáza. Tyto regulační mechanismy pomáhají zajišťovat přežití v proměnlivém prostředí.
• Homeostáza: Živé systémy se snaží udržovat stabilní vnitřní prostředí navzdory vnějším fluktuacím. Regulují faktory jako
teplota, pH a hladiny živin, aby udržely optimální podmínky pro životní procesy.
• Zpracování Energie: Živé systémy potřebují energii k provádění různých aktivit. Získávají a využívají energii k růstu, pohybu a
metabolickým reakcím.
• Evoluce: Živé systémy mají schopnost genetického rozmanitosti a evoluce v průběhu času. Dokážou se přizpůsobovat
měnícím se podmínkám prostřednictvím přirozeného výběru a genetické různorodosti.

- VARIABILITA ŽIVÝCH SYSTÉMŮ

o VELIKOST

o BUNĚČNÁ ÚROVEŇ
 Mnohobuněčné organismy – vysoká variabilita buněčných typů v rámci jednoho jedince (všechny buňky
mají totožnou gen. informaci)
 Jednobuněčné organismy – tvarově i velikostně jsou si často velice podobné i když se jedná o „velice
vzdálené“ příbuzné.
o METABOLICKÁ ÚROVEŇ

- CO MAJÍ SPOLEČNÉHO:
o I přes všechny uvedené rozdíly si jsou všechny (nám známé) živé systémy na molekulární úrovni velice podobné.
o Všechny obsahují základní biomolekuly DNA, RNA (informační polymery), PROTEINY (mnoho struktur, mnoho
funkcí), (poly)sacharidy (strukturní a energetický význam), lipidy (hydrofobní povaha, strukturní a energetický
význam) a často i nízkomolekulární metabolity, kofaktory, koenzymy atd., které ve všech živých systémech plní
prakticky stejné (nebo velice podobné funkce).
o Genetický kód je pro všechny (nám známé) živé systémy univerzální.
o Princip realizace genetické informace je pro všechny (nám známé) živé systémy stejný (DNA-RNA-PROTEINY).
o Společný původ
 Podobná podstata biomolekul vyplývá ze společného vývoje všech živých organismů
2
OMICS
- Komplexní charakterizace a kvantifikace biologických
molekul v organismech
- Snaha o porozumění struktury, funkce a dynamiky živých
systémů na molekulární úrovni

PŘÍKLADY OMICS
• Průzkum proteomu rakovinných buněk k identifikaci
potenciálních léčiv
• Sběr vzorků: Výzkumníci odebírají vzorky rakovinných
buněk od pacientů.
• Extrakce proteinů: Proteiny jsou extrahovány ze vzorků
rakovinných buněk pomocí specializovaných technik.

• Hmotnostní spektrometrie: Používá se hmotnostní spektrometrie, výkonná proteomická technika.

o vytváří komplexní datový soubor informací o proteinech.
• Analýza dat: K analýze dat hmotnostní spektrometrie se používají pokročilé bioinformatické nástroje. Tato analýza
identifikuje proteiny přítomné v rakovinných buňkách, jejich hojnost, posttranslační modifikace a interakce.
• Identifikace cílů léků: Porovnáním proteomu rakovinných buněk s normálními buňkami mohou vědci identifikovat proteiny,
které jsou nadměrně exprimovány nebo jedinečně exprimovány v rakovinných buňkách. Tyto proteiny mohou sloužit jako
potenciální lékové cíle pro léčbu rakoviny.
• Tato proteomická studie může vést k objevu nových cílů léků pro léčbu rakoviny. Výzkumníci mohou vyvinout cílené terapie,
které specificky inhibují identifikované proteiny, což může potenciálně zlepšit léčbu pacientů s rakovinou.

1) Stanovení toxicity kovů v myších jako bioindikátor

FOODOMICS
• Foodomics je interdisciplinární obor, který se zabývá studiem potravin a výživy prostřednictvím aplikace a integrace
pokročilých technologií označovaných jako "omics".
• Foodomics se zaměřuje na analýzu potravinových vzorků na molekulární úrovni a umožňuje hlubší porozumění složení
potravin, jejich kvality a bezpečnosti.
• Analýzu složení potravin: Pomocí technik jako je hmotnostní spektrometrie, nukleární magnetická rezonance (NMR) a
chromatografie může Foodomics identifikovat a kvantifikovat různé složky potravin, včetně proteinů, lipidů, sacharidů a
dalších molekul.
• Hodnocení potravinové kvality: Foodomics může poskytnout informace o kvalitě potravin tím, že analyzuje parametry jako
chuť, aroma, texturu a další aspekty, které ovlivňují zážitek z potravin.
• Bezpečnost potravin: Tím, že zkoumá potenciální kontaminanty, alergeny a toxiny v potravinách, může Foodomics přispět k
zajištění bezpečnosti potravinových produktů.
• Studium vlivu potravin na zdraví: Foodomics může zkoumat, jak konzumace potravin ovlivňuje lidské zdraví a jaké
molekulární mechanismy jsou zapojeny do těchto účinků.

PŘ. OMICS při vývoji pivních technologií

o Změny proteinů během vaření piva s cílem vylepšit: Stabilitu, Zákal, Stabilitu pěny, Přepěnování, alergenicita

3
ANALÝZA PROTEINU
- Makromolekuly složené z 20 alfa-AK spojených peptidovou vazbou
- jedná se o amfolyty – obsahují bazickou i kyselou skupinu
- pH média určuje celkový náboj proteinu
o při specifickém pH – izoelektrický bod - navenek neutrální náboj
- pKa – konstanta, pravděpodobnost transferu protonů - tabulkové hodnoty k jednotlivým AK

1 ANALÝZA CELKOVÉHO OBSAHU BÍLKOVIN

Kjeldahl metoda

 stanovení celkového množství N – odečte se množství amoniaku na organický N  proteiny - většinou se násobí faktorem
typickým pro daný organismus (nebo obecně se používá 6,25)
 Některé vzorky ale obsahují i volné AK které nepatří do bílkovin
 Dále nukleotidy a jiné dusík obsahující organické sloučeniny
 Nutné také stanovit amoniak

1. Navážení vzorku (bez přidaného dusíku – N free paper)

2. Převedení vzorku do rozkladové zkumavky
3. Přidaní soli/katalyzátoru pro zvýšení bodu varu – Kjeldahl Cu
4. Přídavek H2SO4
5. Rozklad při bodu varu 60-180 min
a.
6. Přídavek vody – ředěné – zamezení nechtěných reakcí
7. Přídavek Sodného louhu – roztok NaOH → vývoj amoniaku
a.
8. Separace Amoniaku Tryskovou destilacÍ a zachycení v kyselině borité – Amoniak-voda
a.
9. Titrace zapomocí HCl nebo H2SO4 → bod ekvivalence, pH indikator atd… pH 4,6?
a.
10. Kalkulace koncentrace
4
 Prvkové analyzátory

 (CHNS analyzátor [uhlík, vodík, dusík, síra analyzátor])

 Příprava vzorku: Vzorek by měl být ve formě, která se snadno spálí.
Obvykle jsou tuhé vzorky jemně namlety do prášku a v některých
případech se kapalné vzorky mohou vysušit do pevného stavu.
Plynné vzorky jsou obvykle uloženy ve vzorkových nádobách.
 Plyny vzniklé během spalování jsou separovány, aby byly odděleny
oxid uhličitý (CO2), vodní pára (H2O) a oxidy dusíku (NOx) od sebe.
Tyto plyny jsou obvykle separovány za použití různých technik, jako
jsou selektivní permeabilní membrány, detektory termální
vodivosti a plynové chromatografické sloupce.
 Tato technika podobně jako Kjeldahlova měří celkový dusík =
neselektivní metody

Bradfordova metoda

• Metoda je založena na interakci proteinů s barvou Coomassie Brilliant Blue v kyselém prostředí ( komplex
pomocí van der Waalsových sil a H-můstků). Při navázání barvy na protein se mění barva roztoku z červeno-
hnědé na modrou  meření absorbance při 595 nm.
o Kolorimetrická, kvantitativní metoda

2 ANALÝZA AMINOKYSELINOVÉHO PROFILU

 I jediná substituce AK v řetězci může zásadně ovlivnit skládání bílkoviny

 Př. Náhrada kyseliny glutamové za valin na šesté pozici z 146 AK v beta řetězci hemoglobinu (Genetická vada)
• Brání normálnímu průchodu cévami, Zhoršuje okysličení  Buňky mají kratší životnost a to vede k anemii

Extrakce/izolace

• Nejprve izolace bílkovin ze vzorku (homogenizace – rozpouštění proteinu, srážení proteinu), pak derivatizace a
pak analýza
• jedná se o protein exprimovaný intracelulárně či extracelulárně?

5
 • Menší objemy
o Sonifikace
o Frenchpress
o Enzymatické, Chemické rozbíjení buněk
o Lýza detergentem (Triton X-100, NP-40, SDS) - se běžně používají k rozpouštění buněčných membrán a
denaturaci proteinů  narušuje buněčné membrány a umožňuje uvolnění proteinů do roztoku.
o Zmražování/rozmražování buněk
• Větší objemy
o Vysokotlaká homogenizace
o Pomocí kuliček

• Extrakce založená na pufru: Pro extrakci proteinů se používají různé pufry v závislosti na jejich vlastnostech.
Například pufr RIPA je běžně používán pro lýzu savčích buněk, zatímco pufr Tris-HCl se používá pro obecnou
extrakci proteinů.
• Extrakce pomocí iontových kapalin - 1-Dodecyl-3-Methylimidazolium Chloride
• pH shift metoda – okyselení/přidání báze tak, aby se protein nacházel v pH mimo izoelektrický bod  pH se
upraví na pI  srážení  centrifugace  opakování?

3 ROZPUSTNOST BÍLKOVIN
Salting in (zasolování) – koncentrace solí chrání před agregací

Salting out (vysolování) – koncentrace soli podporuje agregaci

 (může vést k denaturaci, využíváno k zkoncentrování)

Obrázek 1 Nativní vzorek Salting in Salting out

1) Dialýza

• není dostatečně selektivní vůči různým proteinům – neefektivní

• využívána k odsolení (problém s teplotou) – střevo propouští malé molekuly (podle cut off hodnoty [Da]), velké
uvnitř

6
 • CENTRIFUGAČNÍ MEMBRÁNY - membrána z polymeru (taky má cut off určité molekulové hmotnosti) – něco
jako filtr se stříkačkou

2) Vylučovací chromatografie (SEC – Size Exclusion Chromatografy)

• Rozdělování na základě velikosti (velké molekuly → první, malé molekuly → záchyt ve stacionární fázi)
• SF: Gel o určité pórovitosti – vytvoření podtlaku - rozdělení
• Rozpouštědlo pro SEC (Fosfátový pufr, Tris-Hcl pufr, Acetátový pufr, Citrátový pufr, HEPES pufr)
o Volí se, aby proteiny zůstaly stále rozpuštěny
o Rozpouštědlo musí být kompatibilní ke stacionární fázi

PŘÍPRAVA VZORKŮ PRO STANOVENÍ AMK – HYDROLÝZA PROTEINŮ

 Před analýzou celkového AK profilu je nutné provést hydrolýzu bílkovin

 Chemická – pro celkové stanovení bílkovin, nejčastěji pomocí 6M HCL

 Enzymatická - Pro selektivní hydrolýzu určitého typu bílkovin jsou vhodné specifické proteázy

7
  Při hydrolýze dochází k ničení některých AMK – tryptofan, cystin, cystein, glutamin a asparagin
 Trypfotan zničen při kyselé hydrolýze
o substituce zásaditou hydrolýzou (NaOH, BaOH, LiOH), 110°C, prodloužené zahřívání 16H
o Tryptofan i tak nestabilní → přídavek vnitřního standardu (známé množství)
 Následným odečtem denaturace části vnitřního standardu zisk zničeného množství ve vzorku
 Při stanovení AMK je potřeba dělat kompromisy a kompenzace pomocí vnitřních standardů
o Cystein a methionin také nejsou stabilní vůči kyselé hydrolýze a tvoří různé produkty oxidace.
 Tento problém lze překonat dokončením oxidace kyselinou permravenčí obsahující fenol na
kyselinu cysteovou a methioninsulfon.
 Tento proces však ničí tyrosin, který pak musí být stanoven v nezoxidovaném vzorku.

Derivatizace – AMK bez aromátu postrádají UV/fluorescenční vlastnosti

• Většina aminokyselin postrádá přirozenou UV nebo fluorescenční absorpci

na funkčních skupinách
• Derivatizace je cestou jak zvýšit citlivost detekce
• Některá činidla jsou problematická
o Phenylisothiokyanát (PITC) může kontaminovat kolonu pokud není
odstraněn z roztoku
o O-phthalaldehyde (OPA) někdy nereaguje se sekundárními AK a
tvoří někdy nestálé deriváty
• Výběr činidla je zásadní pro úspěšnou analýzu:
o Navázání struktury, která dobře absorbuje v UV/VIS
o Třeba když mám HPLC-DAD – tak UV detektor nezjistí jednotlivé AK
(neabsorbují)
o Optimální podmínky, aby se navázalo na všechny – aby seděl výtěžek (třeba že vím, že tam mám mít 10
mg/g, tak je blbý, když mi vyjde 5 tímhle)
o In needle – v autosampleru jsou reagenty – promíchá to – to pošle na kolonu

8
 TLC Analýza AMK (Thin Layer Chromatography)

 Používá se modifikovaný Nynhydrinový reagent

 Colorimetric – barvičková metoda
 kapky standardů a vzorku, mobilní fáze (butanol:kyselina
octová:voda), sušení, sprej reagentem, zahřání na 110 °C
(vypaření rozpouštědla), sprej 2. reagentem (ninhydrin), znovu
sušení – vizualizace
 separace pomocí kapilárních sil

Analýza pomocí netandemová HPLC

 Potřeba derivatizace pro AMK bez UV/fluorescenčních skupin

 Pro primární AMK (?)

High performace TLC (HPTLC)

• Velmi pokročilá metoda charakterizace bílkovin pomocí TLC 

bombardování skrvny na destičce
• Možnost tandemu TLC-MS
• Automatizovaný systém nanášení vzorku
• Nízkonákladová analýza za použití běžného HPLC
• Možné realizovat separaci na starších 300 bar systémech
• Předkolonová derivatizace
o Ortho-phtalaldehyd (OPA) pro primární AK
9
 o 9-Fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) pro sekundární (sekundární je z těch 20 jen prolin)
o možné jímat frakce – UV/VIS detekce – podle toho se rozdělují frakce
o Jde i detektor s jednou vlnovou délkou (na jedno činidlo)

4 STANOVENÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI PROTEINŮ

SEC-MALS

 Size Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering

 Chromatografická metoda pro stanovení Mw a velikosti molekul proteinu

 SEC-MALS určuje molekulovou hmotnost od 200 g/mol do 1 miliardy g/mol. Může také určit velikost molekul –
rms poloměr nebo poloměr gyrace Rg – od 10 nm do 500 nm a dále. Kombinací molární hmotnosti a velikosti
může také posoudit molekulární konformaci.

 MALS je nezbytnou součástí SEC-MALS. Zahrnuje použití laserového paprsku, který je rozptylován molekulami,
když se eluují z kolony SEC. Pro měření intenzity
rozptýleného světla je umístěno více detektorů pod
různými úhly. Analýzou rozptylu pod více úhly lze určit
molekulovou hmotnost a velikost makromolekul v
elučním roztoku.

 Absolutní molekulová hmotnost: MALS poskytuje

měření absolutní molekulové hmotnosti, což
znamená, že se nespoléhá na standardy nebo
předpoklady, což je zvláště cenné při práci s
komplexními směsmi nebo novými sloučeninami.

 Informace o velikosti: Spolu s molekulovou hmotností může SEC-MALS poskytnout informace o velikosti a
konformaci makromolekul. To zahrnuje poloměr otáčení a distribuci velikosti.

 Měření koncentrace: RI detektor v SEC-MALS pomáhá určit koncentraci

makromolekul při jejich eluci z chromatografické kolony. RI detektor poskytuje
kontinuální základní signál, který koreluje s koncentrací složek vzorku.

 Čistota píku a validace: Detektor UV-VIS a RI může pomoci posoudit čistotu

eluovaných píků sledováním přítomnosti absorbujících kontaminantů nebo
nečistot. Může být také použit k validaci dat MALS a ověření přítomnosti
specifických makromolekul v elučním profilu.

 KOLONY

o Dextran: Pryskyřice na bázi dextranu se často používají pro SEC při analýze proteinů a jiných biomolekul.
Dodávají se v různých velikostecsh pórů, aby vyhovovaly široké škále velikostí molekul.

o Agaróza: Pryskyřice na bázi agarózy jsou další volbou pro analýzu proteinů a biomolekul. Přicházejí také
v různých velikostech pórů a jsou známé svou biokompatibilitou.

10
 o Silika: Pryskyřice na bázi oxidu křemičitého se používají pro separaci menších molekul, jako jsou
polymery. Jsou dostupné v různých velikostech pórů a jsou vhodnější pro nebiologické aplikace.

5 STUDIUM TERMICKÉ STABILITY PROTEINŮ

Diferenční skenovací kalorimetrie

 Měření tepelného toku: Při DSC analýze je vzorek proteinu umístěn do speciálně navržené DSC cely spolu s
referenční celou obsahující identický pufr nebo rozpouštědlo. Oba články jsou vystaveny řízeným a
synchronizovaným změnám teploty. Jak se teplota vzorku zvyšuje nebo snižuje, teplo se buď absorbuje nebo
uvolňuje, v závislosti na tepelných událostech, které se vyskytují v proteinu.

 Jak se teplota vzorku proteinu postupně zvyšuje, začíná denaturace proteinu. Denaturace je typicky
endotermický proces, což znamená, že absorbuje teplo z okolí (peak dolů). Tato absorpce tepla je způsobena
rozbitím nekovalentních interakcí uvnitř proteinu, jako jsou vodíkové vazby, iontové vazby a hydrofobní
interakce.

DSC a jeho význam

 Studium tepelné stability: DSC umožňuje výzkumníkům posoudit tepelnou stabilitu proteinů. Stanovení teploty
tání (Tm) a s ní spojené změny tepla (ΔH) během denaturace poskytuje informace o tom, jak odolný je protein
vůči tepelnému rozkladu. Tyto informace jsou zásadní pro různé aplikace, včetně vývoje a optimalizace bioléčiv,
enzymů a jiných produktů.

 Kontrola kvality v bioléčivech: DSC je nezbytným

nástrojem pro kontrolu kvality v bioléčivém průmyslu.
Pomáhá zajistit, že proteinové léky a terapie zachovávají
svou stabilitu během výroby, skladování a přepravy. DSC
dokáže detekovat drobné změny v konformaci proteinu,
agregaci nebo stabilitě, které by mohly ovlivnit účinnost a
bezpečnost produktu.

 Inženýrství proteinů: Analýza DSC pomáhá inženýrům

proteinů navrhovat a optimalizovat proteiny s
požadovanými tepelnými vlastnostmi. Porovnáním

11
 tepelné stability divokého typu a mutovaných proteinů mohou výzkumníci vybrat mutace s vylepšenou
stabilitou nebo upravit proteiny pro konkrétní aplikace.

 Posouzení vlivu environmentálních podmínek: DSC lze použít k prozkoumání toho, jak změny v pH, koncentraci
solí nebo jiných environmentálních faktorech ovlivňují stabilitu proteinu. To je důležité pro porozumění
chování proteinu za různých podmínek.

6 GELOVÉ ELEKTROFORETICKÉ METODY

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis)

 Metoda pro separaci proteinů na základě molekulové hmotnosti

 5 – 250 kDa standardně
 Polyakrylamidový gel síťováný pomocí TEMED
 Význam SDS je denaturace bílkoviny a sjednocení náboje na molekule
 Separace tak bude probíhat pouze dle Mw
 SDS neumí rozbalit proteiny které obsahují disulfidické
můstky  Aplikace beta-mercaptoethanolu (štěpí je)
 Vlevo je ladder – standardy o různé Mw

Western blotting - immunoblotting

 Metoda pro potvrzení přítomnost specifické bílkoviny

 Vše začíná u SDS-PAGE, kde ale zjistíme pouze Mw
o Podobnou Mw může mít více druhů proteinů
 Další fáze je blokování membrány proti nespecifickému vázání
protilátek
o Blokování – bránění nespecifických interakcí protilátek s jinými
frakcemi (mlékem/BSA)

12
  Po blokování je membrána ošetřená primární protilátkou  Tato protilátka se váže pouze na protein našeho
zájmu

 Sekundární antibody je specifické pro primární

 Enzym na antibody konvertuje substrát ze stabilizačního
činidla na produkt který emituje chemiluminiscenci
 Možno detekovat pomocí CCD nebo světlocitlivých papírů
 Kvantifikace pomocí standardů a softwaru
o Software si převede bandy pomocí šířky a intenzity na
peak  plocha – množství podle standardů
o Nebo vyříznutí bandu a jeho další analýza – hydrolýza
na AK – analýza v HPLC nebo Kjeldahl nebo spálení v
cínu
 Analýza dusíku v bendech z SDS-PAGE - Kjeldahl, CHNS analyzátor

7 ANALÝZA METALOPROTEINŮ
Metaloproteiny

 Metaloproteiny jsou třídou proteinů, které obsahují kovové ionty nebo shluky jako nedílnou součást své
struktury. Tyto kovové ionty hrají zásadní role v biologických funkcích proteinu. Kovové ionty v
metaloproteinech mohou plnit různé funkce, včetně katalýzy chemických reakcí, přenosu elektronů, vázání a
transportu kyslíku a strukturální stabilizace. Až třetina proteinů má kovový kofaktor

 Hemoglobin: Hemoglobin je metaloprotein nalezený v erytrocytech a obsahuje železné ionty v jádře. Je

zodpovědný za vázání kyslíku v plicích a jeho transport do tkání po celém těle.
13
  Cytochrom c: Cytochrom c je metaloprotein obsahující heme, který se nachází v mitochondriích. Hraje klíčovou
roli v řetězci elektronového transportu během buněčného dýchání, přenáší elektrony mezi bílkovinnými
komplexy a generuje ATP (adenosintrifosfát).

 Karboanhydráza: Karboanhydráza je metaloprotein obsahující zinek, který katalyzuje přeměnu oxidu uhličitého
na bikarbonátové ionty, což je důležitý proces pro regulaci pH v těle.

 Kataláza: Kataláza je enzym obsahující železné hem skupiny a je zodpovědná za rozklad vodíkového peroxidu
na vodu a kyslík, což chrání buňky před oxidačním poškozením.

 Metalothioneiny: Metalothioneiny jsou rodinou malých, cysteinem bohatých proteinů, které mohou vázat různé
kovové ionty, včetně zinku, mědi a kadmia. Jsou zapojeny do homeostázy kovových iontů a detoxikace.

 Ferritin: Ferritin je protein, který uchovává železo ve formě nontoxického, rozpustného komplexu. Hraje roli v
regulaci koncentrace železa v těle.

 Kobalt-obsahující hydrogenáza: Některé mikroorganismy

obsahují metaloenzymy nazývané hydrogenázy, které
obsahují niklové ionty a jsou zapojeny do reverzibilní
oxidace molekulárního vodíku. Hrají roli v metabolismu
vodíku u určitých bakterií a archeí.

 Rubisco: Ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxygenáza

(Rubisco) je metaloenzym obsahující hořečnaté ionty.
Hraje klíčovou roli v fotosyntéze, kde katalyzuje fixaci
oxidu uhličitého.

 Analýza metaloproteinů pomocí SEC(CE)-ICP-MS

o Nejčastěji zkoumané prvky v metaloproteinech :
Fe, Cu, Zn, I, Co
 Př – analýza Ferritinu (neuroprotektant vůči přebytku
železa – váže ho. Disbalance způsobuje různé
neurodegenerativní choroby)
 Superoxide dismutázy (neuroprotektivní effekt v mozku – rozvoj ALS, Parkinsonovy choroby, Alzheimer,
mozková mrtvice)

8 PROTEINOVÁ KRYSTALOGRAFIE
 Metoda pro stanovení 3D struktury proteinů
 umožňuje určit absolutní strukturu molekul, tj. polohy atomů, vazebné délky a úhly v krystalové mřížce
o Abychom mohli vidět strukturu molekuly, nemůžeme se
dívat pod klasickým mikroskopem
 Velká vlnová délka
 Musíme využívat RTG záření – lambda na úrovni atomů
 Založená na principu difrakce RTG záření molekulami v
krystalickém stavu
 Molekuly v amorfním stavu v roztoku  odrážení záření všemi
14
 směry
 Přesně uspořádané molekuly v jedné orientaci umožnují zaznamenat dostatečně silný a opakovatelný signál
 Měří se elektronová hustota v různých oblastech krystalu
 Rozlišení map elektronové hustoty záleží na kvalitě krystalu
 Krystalizace:
o Velmi komplikované připravit krystal proteinu
o Proteinová krystalizace často zahrnuje vytváření krystalů
proteinu prostřednictvím postupného snižování rozpustnosti
proteinu ve vodě. To se obvykle dosahuje změnou podmínek
proteinového roztoku, jako je pH, teplota nebo přidání
srážecích činidel
o Musí být otestováno velké množství variant pro krystalizaci
o V první fázi stačí zákal roztoku
o Poté se aplikuje metoda hangin nebo sitting drop
o Několik mikrolitrů (1–2 μl) roztoku proteinu se smíchá s víceméně stejným množstvím roztoku v
zásobníku obsahujícím srážedla (předtím vyváženým pH pufrem) a uloží se na krycí sklíčko, které
zakrývá zásobník srážedla.
o Vzhledem k tomu, že směs protein/srážedlo v kapce je méně koncentrovaná než roztok v zásobníku
(normálně mícháme roztok proteinu s roztokem v zásobníku přibližně v poměru 1:1), odpaří se voda z
kapky do zásobníku.
o V důsledku toho se koncentrace proteinu i srážedla v kapce pomalu zvyšuje a mohou se tvořit krystaly

9 KRYO-ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
 Kryo-elektronová mikroskopie (cryo-EM) je výkonná a inovativní technika používaná pro strukturní analýzu
biologických makromolekul, včetně proteinů. Přinesl revoluci do strukturální biologie tím, že umožnil
výzkumníkům vizualizovat trojrozměrné struktury proteinů a dalších biomolekul ve vysokém rozlišení, často v
jejich přirozeném stavu.

 Snímkování pomocí transmisní emisní elektronové mikroskopie (TEM)

 Kryokonzervace: První krok v kryo-EM zahrnuje přípravu vzorku sledovaného proteinu. Aby se zachovala nativní
struktura proteinu, vzorek se rychle zmrazí ve skelném ledu (kryokonzervace) při extrémně nízkých teplotách,
typicky za použití kapalného ethanu nebo kapalného dusíku.

 Zmrazený vzorek je vložen na kryo-EM mřížku. Kryo-EM mřížky jsou tenké, perforované fólie potažené vrstvou
skelné ledu. Mřížka se umístí do elektronového mikroskopu a vzorek se vystaví vysokoenergetickému
elektronovému paprsku. Elektronový paprsek interaguje se vzorkem a rozptýlené elektrony se shromažďují.

15
10 SEQUENCING PROTEIN
 Sekvenování proteinů je praktický proces stanovení
aminokyselinové sekvence celého proteinu nebo peptidu
nebo jeho části. To může sloužit k identifikaci proteinu
nebo k charakterizaci jeho posttranslačních modifikací
 Sekvenování proteinů umožňuje výzkumníkům identifikovat a
charakterizovat specifické proteiny. Znalost přesné
sekvence aminokyselin v proteinu je nezbytná pro pochopení jeho funkce a toho, jak přispívá k různým
biologickým procesům.
 Příklad: sekvenování inzulínu, dobře známého a široce studovaného proteinu. Inzulin je hormon produkovaný
slinivkou břišní, který hraje klíčovou roli při regulaci hladiny cukru v krvi
o Sekvenování inzulínu odhalí jeho úplnou aminokyselinovou sekvenci, která se pro člověka skládá z 51
aminokyselin ve dvou řetězcích: v řetězci A (21 aminokyselin) a v řetězci B (30 aminokyselin). Tato
sekvence je kritická pro pochopení struktury a funkce inzulínu.
o Sekvenování inzulínu je zásadní pro produkci rekombinantního inzulínu používaného při léčbě diabetu.
Tyto informace zajišťují přesnou produkci inzulínu pro terapeutické účely.
o S inzulinovou sekvencí v ruce mohou výzkumníci zkonstruovat modifikované formy inzulinu se
specifickými vlastnostmi, jako je rychlý nebo prodloužený účinek, aby vyhovovaly potřebám různých
pacientů s cukrovkou.
 V první řadě je důležité znát celkové složení aminokyselin
o Hydrolýza + LC
o Iontově výměnná chromatografie
o Reverse phase chromatografie

 Edmanovo odbourávání
o Označování odbourávání N-terminální aminokyseliny (koncové kyseliny v řetězci)
o Obecně se však omezuje na sekvenování prvních 10 až 30 aminokyselin kvůli kumulativním chybám,
které se mohou vyskytnout v každém cyklu. Pro delší sekvence nebo pro sekvenování celého proteinu se
typicky používají jiné metody, jako je hmotnostní spektrometrie nebo enzymatické štěpení následované
hmotnostní spektrometrií.
o Izolace co nejčistšího peptidu
o Označení terminální aminokyseliny pomocí PIC v zásaditém prostředí
o Odtržení terminální AK v kyselém prostředí pomocí TFA
o L-L extrakce pomocí ethyl acetátu (selektivní k derivátu)
o Analýza pomocí HPLC a standardů

16
11 ANALÝZA PEPTIDŮ A PROTEINŮ POMOCÍ HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
 Identifikace struktury bílkovin je na principu fragmentace molekul

 LC-MS kombinuje dvě odlišné analytické metody: kapalinovou chromatografii (LC), která odděluje proteiny na
základě jejich chemických vlastností, a hmotnostní spektrometrii (MS), která měří poměr hmotnosti k náboji
iontů generovaných ze separovaných proteinů

 Extrakce proteinů: Proteiny se typicky extrahují z biologického vzorku, jako jsou buněčné lyzáty, tkáně nebo
biotekutiny, pomocí vhodných extrakčních pufrů nebo technik.

 Štěpení bílkovin: Bílkoviny jsou často štěpeny na menší peptidy, obvykle pomocí enzymů, jako je trypsin. Tento
krok generuje směs peptidů, které lze efektivněji analyzovat pomocí LC-MS.

 MS slouží k získání strukturních informací z fragmentů

molekul
 Dále slouží ke kvantifikaci
 Dva základní způsoby ionizace
 Elektrospray (ESI)
 Koronový výboj (APCI)

17
 MS/MS systém

 Dvoustupňová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) je technika používaná v analýze proteinů, která zahrnuje dva
po sobě jdoucí kroky hmotnostní analýzy pro
charakterizaci struktury a sekvence proteinů.

 V prvním kroku (MS1) jsou vybrány prekurzorní

ionty na základě konkrétních kritérií, jako je rozsah
hmotnosti nebo intenzita. Tyto prekurzory jsou
poté podrobeny druhému kroku (MS2)

 V MS2 dochází k další fragmentaci vybrané

molekuly a na základě další separace drobných
fragmentů jsou skládány strukturní informace

18
Analýza nukleových kyselin
 = dešifrování genetického kódu
 Nukleové kyseliny jsou makromolekuly které hrají zásadní roli v ukládání, přenosu a expresi genetické
informace v živých organismech
 Dva primární typy
o Deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA)
 Analýza nukleových kyselin je zásadní v mnoha oborech:
o Studium genetiky a genomiky
o Výzkum molekulární biologie
o Lékařská diagnostika
o Personalizovaná medicína
o Forenzní věda
o Vývoj farmaceutik
o Biotechnologie a genové inženýrství
o Studium životního prostředí
o Evoluční biologie
o Monitoring rezistence vůči léčivům
o Výzkum virů a vývoj vakcín
o RNA terapie
o Historické a archeologické studie

DNA

 DNA je genetický materiál nacházející se v jádrech eukaryotických buněk a v cytoplazmě prokaryotických

buněk.
 Každý nukleotid obsahuje tři složky: fosfátovou skupinu, molekulu cukru deoxyribózy a jednu ze čtyř dusíkatých
bází: adenin (A), thymin (T), cytosin (C) a guanin (G)
 Adenin (A) se páruje s thyminem (T) a cytosin (C) s guaninem (G). Toto párování je vysoce specifické; to
znamená, že pokud znáte sekvenci jednoho vlákna, můžete odvodit sekvenci druhého.
 Distingované sekce DNA tvoří geny:
o Genetická informace obsažená v genech se přepisuje do messenger RNA (mRNA) během procesu
zvaného transkripce. mRNA pak slouží jako templát pro syntézu proteinů během translace. Tímto
způsobem hrají geny ústřední roli při produkci bílkovin
 Není snadné určit kde jednotlivé geny začínají a končí
 Jediný ribozom v eukaryotické buňce může přidat 2 aminokyseliny do proteinového řetězce každou sekundu,
avšak u prokaryot mohou ribozomy pracovat ještě rychleji, přidáním asi 20 aminokyselin k polypeptidu každou
sekundu.
 Různé metody jako je RNA sequencing nebo Northern blotting
RNA

 RNA se skládá z jednovláknového řetězce nukleotidů. Každý nukleotid RNA se skládá z

fosfátové skupiny, ribózového cukru a jedné ze čtyř dusíkatých zásad: adenin (A), uracil (U),
cytosin (C) nebo guanin (G). Na rozdíl od DNA obsahuje RNA uracil místo thyminu.

 RNA se nachází jak v jádře buňky, tak v cytoplazmě. V jádře se RNA účastní transkripce, při níž
kopíruje genetickou informaci z DNA. V cytoplazmě hraje roli v translaci, kde řídí syntézu
proteinů na ribozomech.
19
  Hlavní funkcí RNA je přepsat a přeložit genetickou informaci uloženou v DNA do funkčních proteinů. Tento
proces zahrnuje převedení kódu DNA do mRNA během transkripce a interpretaci tohoto kódu k syntéze
proteinů během translace.
 RNA také hraje roli v různých buněčných procesech, včetně střižení RNA, posttranskripční modifikace a regulace
exprese genů. Některé molekuly RNA působí jako katalyzátory (ribozymy) v biochemických reakcích.
 Analýza RNA je důležitá z několika důvodů a představuje základní aspekt molekulární biologie a genetiky.
Poskytuje nám poznatky o expresi genů, jejich regulaci a funkci živých organismů.

1 IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

Fenol-chloroformová extrakce

 Homogenizovaný vzorek obsahující DNA (buňky, tělní tekutiny)

 Lyze buněk pomocí dodecyl sulfátu sodného (SDS) a proteináz

 Nukleové kyseliny jsou izolovány pomocí směsi fenolu-chloroformu

 Proteiny a kontaminanty se distribuují do organické fáze
 DNA a RNA zůstane ve vodné fázi
 Část kontaminantů se vysráží
 Centrifugace

 Srážení DNA – ethanolem

 Srážení RNA – isopropanolem
 Vysrážený materiál se promývá rozpouštědlem, suší a poté se může resuspendovat do pufru Tris-EDTA nebo
vody bez nukleáz

Klady

 Vysoká čistota: Extrakt fenolem-chloroformem poskytuje nukleové kyseliny vysoké čistoty, což je vhodné pro
následné aplikace, jako je sekvenování DNA, PCR a analýza exprese genů.

20
 Odstranění kontaminantů: Tato metoda efektivně odstraňuje kontaminanty, jako jsou bílkoviny, lipidy a další
buněčné zbytky, což zajišťuje izolaci relativně čistých nukleových kyselin.

 Široká aplikovatelnost: Extrakce fenolem-chloroformem lze aplikovat na různé typy nukleových kyselin, včetně
DNA a RNA, a je kompatibilní s různými zdroji vzorků, od tkání po pěstované buňky.

 Robustní a spolehlivá: Při správném provedení je extrakce fenolem-chloroformem robustní a spolehlivá metoda
pro izolaci nukleových kyselin.

 Škálovatelnost: Tuto metodu lze škálovat na větší objemy vzorků a je vhodná pro extrakce malého i velkého
měřítka.

 Nízké náklady: Fenol a chloroform jsou poměrně levné chemikálie, což tuto metodu činí ekonomicky výhodnou
pro mnoho laboratoří.

Zápory

 Toxicita: Fenol a chloroform jsou nebezpečné chemikálie. Výzkumníci musí dodržovat opatření při práci s nimi,
jako je použití odsávací kapaliny a nošení vhodné ochranné výstroje.

 Náročná na práci: Tato metoda zahrnuje několik kroků, včetně centrifugace, což může být náročné na práci a
časově náročné.

 Riziko degradace nukleových kyselin: Dlouhodobá expozice fenolu a chloroformu může vést k degradaci
nukleových kyselin. Proto je důležité pečlivé zacházení a včasná extrakce.

 Náchylnost k chybám: Vícekroková povaha postupu znamená vyšší náchylnost k lidským chybám, což může vést
k variabilitě výsledků.

 Nízká efektivita extrakce: V některých případech, zejména pokud jde o malé nebo fragmentované nukleové
kyseliny, nemusí být extrakce fenolem-chloroformem tak efektivní při získávání veškerého materiálu nukleových
kyselin.

 Potřeba specializovaného výcviku: Správné provedení extrakce fenolem-chloroformem vyžaduje specializovaný

výcvik a odborné znalosti pro dosažení optimálních výsledků.

 Není vhodné pro citlivé aplikace: Tato metoda nemusí být vhodná pro velmi citlivé aplikace, protože riziko
kontaminace nebo degradace nukleových kyselin je vyšší ve srovnání s některými modernějšími technikami.

 Jsou dostupné alternativy: Existují alternativní metody izolace nukleových kyselin, jako jsou sloupkové sady
nebo metody s magnetickými kuličkami, které jsou méně pracné a poskytují podobnou nebo lepší čistotu s
menším rizikem kontaminace.

Izolace pomocí CH3COONa a EtOH

 Možno zařadit jako další krok za chloroform nebo i jako samostatnou metodu
 Vysoce efektivní a jednoduchá procedura

21
 Negativně nabitá nukleová kyselina se neutralizuje pomocí sodných solí
 Po neutralizaci již není rozpustná ve vodě, dojde k vysrážení
 Ethanol díky nižší dielektrické konstantě je ideální ke srážení

Postup:

 Připravte roztok DNA: Začněte s roztokem, který obsahuje DNA, kterou chcete izolovat. Může jít o směs DNA z
extrakce nebo vzorek v pufru nebo vodě.

 Přidejte solný roztok: Přidejte odpovídající objem 3M roztoku sodného acetátu do vzorku DNA. Koncentrace soli
je obvykle kolem 1/10 objemu vzorku, ale přesné množství se může lišit v závislosti na protokolu.

 Dobře promíchejte: Jemně promíchejte roztok, aby byla zajištěna důkladná směs soli a DNA.

 Srážení etanolem: Přidejte 2,5 až 2,5krát objem etanolu (ledově studený) k vzorku DNA. Například pokud máte
100 µL vzorku DNA, přidáte 250 až 300 µL ledově studeného etanolu. DNA se začne srážet.

 Inkubace: K podpoře srážení DNA inkubujte vzorek při -20°C nebo -80°C po dobu nejméně 30 minut. Některé
protokoly doporučují přes noc pro maximální srážení.

 Centrifugace: Po inkubaci centrifugujte vzorek při maximální rychlosti (obvykle 12 000-14 000 x g) v
mikrocentrifugové zařízení po dobu 15-30 minut při 4°C. Tímto krokem se vytvoří sraženina DNA.

 Odstraňte supernatant: Opatrně odstraňte supernatant, aniž byste narušili sraženinu DNA. Supernatant může
obsahovat nečistoty a nežádoucí látky

 Promývání etanolem: Sraženinu DNA opláchněte 70% etanolem (ledově studeným) tím, že opatrně přidáte
etanol, trubici obrátíte a znovu provedete centrifugaci po dobu několika minut. Tento krok opakujte k dalšímu
odstranění nečistot.

 Vysušte sraženinu DNA: Po odstranění etanolového oplachování nechte sraženinu DNA vzduchem uschnout
nebo použijte vakuovou odparku k odstranění přebytečného etanolu.

 Znovu rozpusťte v pufru nebo vodě: Jakmile je sraženina suchá, rozpusťte ji v odpovídajícím pufru nebo ve vodě,
abyste získali čistý vzorek DNA.

Izolace a purifikace nukleových kyselin pomocí magnetických částic

 Koloidní částice Fe3O4 – pro separaci pomocí magnetu

 Částice jsou modifikovány různými povlaky
 Silika – pro izolaci DNA a RNA
 vyráběno silanizací a povrch je ještě dále modifikován polárními funkčními skupinami
o Částice potažené materiálem s amino skupinami
 Aminy interagují s COOH skupinami na nukleových kyselinách (na koncích) a vytváří stabilní amidové vazby
 Potahování Sulfhydrylem

22
 o Specifické vazba mezi nukleovými kyselinami pomocí thiolů

 Pro účinné navázání nukleových kyselin na magnetický nosič s karboxylovými funkčními skupinami, které jsou
záporně nabité, je potřeba, aby byla DNA v tzv. kondenzovaném stavu
 správnou koncentrací chaotropní soli a polyethylenu glycolu (PEG)
 PEG a NaCl jsou pro tento účel často využívanými kondenzačními činidly
o Polyethylenglykol slouží ke zvýšení osmotického tlaku
o sůl ke kompenzaci nábojů v molekule DNA
 V případě C je DNA vlivem kondenzačních činidel PEG a NaCl v
kondenzovaném stavu a zaujímá daleko menší prostor, a tak se na
magnetický nosič může navázat více molekul

 Magnetické separatory:
o Isolace nukleových kyselin je většinou realizována batch způsobem a jsou automatizované
o Seprátory používají silné magnety na bázi kovů vzácných zemin
o Částice menší než 1 um (magnetické koloidy ve velikosti stovek nm)
 Magnetické separátory s vysokým gradientem
 Tyto separátory obsahují drobná feromagnetické vlákna a generují silné magnetické
pole a zachycují i nejjemnější částice
o Různé velikosti nádobek od jednotek mikrolitrů do 50 ml
o Po oddělení částic se DNA extrahuje pomocí elučního činidla  Tris-EDTA Buffer

Isolace NK pomocí silikátových částic nebo membrány oxidu křemičitého

 V přítomnosti chaotropních solí se DNA efektivně váže na siliku

 Realizuje se nejčastěji v centrifugačních kolonkách
 Vazebný pufr:
o Smíchejte roztok s DNA s chaotropní solí
o Inkubace a následná centrifugace
 3x propláchout
o Ethanol
 Vymývá soli, sacharidy, proteiny a zbytky chaotropních činidel
 Pro efektivní přečištění od proteinů se také používají slabé roztoky NaCl
 Eluce DNA ze siliky:
o 10 mM Tris-HCl – 1 mM EDTA pufr
o pH cca 8
 Ověření čistoty pomocí spektrofotometru
23
2 OVĚŘENÍ ÚČINNOSTI IZOLACE DNA A RNA

Spektrofotometrické stanovení

 Měření v UV oblasti – Jednoduché a přesné

 Vzorek nesmí obsahovat významné množství nečistot – poměr
absorbancí 260/280
o < 1,75 – kontaminace bílkovinami
o 1,8 - DNA
o 2,0 – RNA
 Lze stanovit I přechod mezi nativním a denaturovaným stavem DNA
měřením UV absorpčního spektra při 260 nm

Fluorescenční stanovení

 Detekce velmi male koncentrace (<25 mg/ml)

 Vhodné I pro vzorek obsahující velké množství nečistot – kalibrace, ethidiumbromid
 Fluorescence s činidly PicoGreen, Quant-iT a dalšími
 Obarvené nukleové kyseliny emitují záření po ozáření UV
 Možné kombinovat s gelovou elektroforézou a obarvit těmito specifickými činidly

Gelová elektroforéza – separace nukleových kyselin

 Nukleové kyseliny jsou negativně nabité díky své fosfátové skupině

 Toho se využívá při separaci v elektrickém poli na gelu kdy molekuly
migrují k anodě (+)
 Rychlost migrace stejně jako při separaci proteinů závisí na velikosti
fragmentu NK
 Malé fragmenty migrují rychleji

 Využívá se agarózových gelů:

o Vhodné pro separaci NK o velikosti 100 pb – 25 kb
o Nad 25 kb je nutné použít pulzní elektroforézu která využívá střídavý proud z více směrů

24
  Příprava gelů:
o Koncentrace agarózy závisí na velikosti fragmentů DNA
 0,5 – 2% rozpuštěné v pufru v MW nebo na vařiči
 Tris-acetate – EDTA
 Tris-borate – EDTA
o Po rozpuštění se přidává Ethidium bromide pro barvení
 Možné naložit až po elektroforéze
 Karcinogenní ale velmi citlivé a levné barvení

 Nalití gelu do elektroforetické vany:

o 1-5 V/cm mezi elektrodami
o Gel musí být zalitý v celé ploše pufrem
 Po dokončení separace gel osvítit UV a zaznamenat kamerou:
o Aromatické jádro je aktivováno a emituje záření

3 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE A JEJÍ HISTORIE

 Pro molekulární vyšetření je často potřebné velké množství určitého úseku DNA
 PCR je technikou která z konkrétního úseku malého množství DNA amplifikuje velké množství vzorku

 Do roku 1983 existovalo pouze klonování

 Zavedení úseku DNA do bakteriálního plasmidu
 Dr. Kary Mullis vyvinul PCR a tím se posunul do in VITRO

 1985 - První publikace o PCR se objevila v časopisu science

 1986
 Přečištěná Taq polymeráza byla použita v PCR
 bakterie Thermus aquaticus
 Termostabilní polymeráza nezbytná pro amplifikaci sekvencí DNA
o Přidávání bází k primeru

 1988 - PerkinElmer představil automatizovaný thermal cycler

 1989 - Taq polymeráza zvolena za „molekulu roku“

 1990
o Amplifikace a detekce specifické DNA sekvence pomocí fluorescenční DNA-vazebného barviva
o Položilo základ „real time“ PCR

 1991
o Real time PCR je vyvinuto
o Základ diagnostických testů pro RNA viry

 1993 - Dr. Karry Mullis sdílel Nobelovu cenu za chemii

25
4 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE - PRINCIP
 Využití v amplifikaci DNA molekul (nebo fragmentů)
o Enzymatická metoda a cyklování
o „xerox“ na DNA
 Principem je opakovaná řízená denaturace dvouřetězcové DNA a následná renaturace osamocených řetězců se
specifickými oligonukleotidy, které jsou v reakční směsi v nadbytku.
 Oligonukleotidy slouží následně jako primery pro syntézu nového řetězce DNA.
 Amplifikace DNA probíhá v opakujících se cyklech, které mají tři kroky:
o DENATURACE
o HYBRIDIZACE
o ELONGACE
 Výhoda IN VITRO, není třeba hostitelské buňky

Průběh:
1. Denaturace
 Zahřátím DNA na teplotu kolem 95 °C se
rozpadnou vodíkové můstky mezi vlákny DNA, čímž
se dsDNA rozdělí na ssDNA.

2. Hybridizace
 V literatuře se tato fáze často označuje anglickým termínem annealing (to anneal = žíhat, kalit kov nebo sklo,
tj. po rozpálení je prudce ochladit).
 Probíhá nejčastěji při teplotách kolem 50–60 °C.
 Navázání primerů na své komplementární sekvence – použití specifického primeru
 pro PCR reakci jsou nutné dva primery:
o Primer, kterým začíná 5‘-konec řetězce genu a v průběhu PCR se elonguje ve směru transkripce, se
označuje jako kódující, forward primer nebo upstream primer
o Druhý primer se pak označuje přívlastky antikódující, reverse nebo downstream.
 Teplota je kritická záležitost PCR:
o Při příliš nízké teplotě mohou primery nasedat i na sekvence, které jsou komplementární jen z
části, a vytvoří se tak nespecifický produkt.
o Při vysoké teplotě budou primery málo hybridizovat = malá výtěžnost
o Výpočet optimální teploty pro přisednutí primeru – Tm Calculator

3. Elongace, extenze, syntetická fáze

 Syntéza nových řetězců probíhá při teplotě 65–75 °C.
 Oligonukleotidy, které dosedly na jednořetězcovou DNA
(templát) v předchozím kroku, slouží v tomto kroku jako
primery pro DNA polymerasu. Od jejich 3´-konce začíná
syntéza nového řetězce komplementárního s templátem.
 Po prvním cyklu PCR se počet řetězců DNA ve směsi
zdvojnásobí.
 Nové molekuly DNA se začínají syntezovat vždy od primeru
z poolu nukleotidů
 V prvním cyklu, kdy jako templát slouží dlouhá molekula původní DNA, vzniknou řetězce, které jsou sice kratší
než templát, ale vždy z jedné strany přesahují úsek vymezený oběma primery (primární produkt).
26
 Z primárního produktu se potom vytváří specifický produkt
o Od jednoho primeru k druhému
o Přibývají exponenciálně
o Podíl primárního produktu je nakonec zanedbatelný

27
Složení směsi pro PCR - Templát
 Templát
o pro reakci často stačí i velmi malé množství nukleové kyseliny
o nutné, aby vzorek nebyl kontaminován žádnou jinou DNA, která by se do něj mohla dostat z
nedostatečně čistých pomůcek, rukou pracovníka a podobně
o I nepatrná příměs kontaminující DNA by se mohla v průběhu reakce namnožit natolik, že by vzniklo
detekovatelné množství produktu a výsledek vyšetření by byl zkreslen
 Kromě toho vzorek s templátovou DNA nesmí obsahovat látky, které by inhibovaly DNA polymerasu

 Inhibitory PCR
 Hemoglobin a immunoglobulin G
o Hlavní PCR inhibitory v krvi
 Přímý efekt na DNA polymerázu
 Vážou se na jednořetězcové DNA a brání efektivní PCR
 DNA je nutné extrahovat z krve například pomocí Fenol-
Chloroformové metody
 Huminové kyseliny jsou problémem při amplifikaci například DNA
půdních mikroorganismů

 Cq hodnota je zásadní ukazatel počtu cyklů které je nutné vykonat pro

zajištění dostatečné koncentrace DNA schopné generovat dostatečný
fluorescenční signál

Primery

 Jako primery se zpravidla používají oligonukleotidy o délce 17 až 28 nukleotidů.

o Krátké řetězce jsou nespecifické
o Dlouhé špatně dosedají
 Aby reakce dobře probíhala, měly by primery splňovat několik požadavků:
 primery musejí být specifické pro amplifikovanou sekvenci a měly by být pokud možno
zcela komplementární k úseku, na který mají dosedat
 primery by spolu neměly být vzájemně komplementární, jinak se samy začnou chovat jako templáty a
během PCR se budou tvořit jejich dimery
 primer by neměl obsahovat vnitřně komplementární sekvence, aby nedocházelo k vnitřní hybridizaci
(tvorbě „smyček“)
 teploty, při kterých dosedají oba použité primery, by se neměly výrazně lišit
 teplota tání primeru alespoň 50 °C a podobná pro přímý i reverzní primer

28
  Výběr vhodného primeru
o Definování cílů PCR
 Amplifikace specifického genu?
 Detekce mutace?
 Studium genové exprese?
 Řeší firmy jako Sigma aldrich a je možné mít primer na míru pro danou aplikaci
 Výroba primerů
o Nutná znalost sekvence
o 3` konec oligonukleotidu je navázán na tuhou fázi a nukleotidy jsou sekvenčně přidávány
 Příklad:
o Pro určení mutací v genu je nutné amplifikovat region který obsahuje mutaci
o BRAF gen který je známý že mutuje v rámci rakovinného onemocnění jako jsou melanomy nebo rakovina
tlustého střeva
o Amplifikace sekvence DNA umožní další sudium, zavádění do testovacích buňek
o Studium mutací vedlo k syntéze BRAF inhibitorů cíleně aplikovatelných při léčbě

DNA polymerázy

 Teoreticky je možné použít jakoukoliv DNA polymerázů

 PCR teplota je ale vysoká a docházelo by k denaturaci
o Bylo by nutné přidávat polymerázu v každém cyklu
 Pro PCR se využívá termostabilních polymeráz
o Původně izolované z bakterií žijících v horkých pramenech
o Taq polymeráza
 Z bakterie Thermus aquaticus
 Optimum 75 °C
 Dokáže k primeru připojit cca 150 bází za sekundu
 Nad 90 °C není aktivní, ale odolává denaturaci
 Lze recyklovat po celé fázi PCR
 Taq polymerasa udělá jednu chybu na 10 až 20 tisíc zařazených bazí
o Další stabilní polymeráza
 Pwo a Pfu DNA polymerázy (Pyrococcus woesei a Pyrococcus furiosus) – enzymy mají kromě
polymerázové aktivity take 3´  5´ exonukleázovou aktivitu, umožňující opravu chybně
inkorporovaných deoxynukleotidů  vyšší přesnost, vhodnější pro přípravu produktů pro
klonování a pro přípravu značených sond
 Tht DNA polymeráza – izolovaná z bakterie Thermus thermophilus – stejné teplotní optimum
jako Taq DNA polymeráza, předností je schopnost působit i jako reverzní transkriptáza a tedy
možnost přípravy cDNA z RNA
 Například pro identifikace RNA z virů

 Polymerasy pro PCR se dnes vyrábějí rekombinantními technologiemi

o Identifikace DNA polymerázového genu
o Klonování zavedením genu do vektoru a dále do organismu
 E. coli
o Purifikace proteinu pomocí separačních technik

29
Základní roztok musí obsahovat kromě primerů a polymeráz
1. Deoxynukleotidtrifosfáty jako základní stavební kameny pro PCR
2. Pufrující složka
o Tris HCl
o Stabilizace pH
 Obvykle pH 8-9
 Optimální efektivita polymerázy (skládání enzymu)
3. Ionty K a Mg2+
+

o Kofaktor polymerázy
o Stabilizuje interakci mezi DNA templátem a primery a katalyzuje polymerizaci
4. BSA (Bovine serum albumin)
o Snižuje efekty inhibitorů
o Váže se například na fenolické složky
o Zlepšuje rozpustnost enzymu v zasoleném roztoku
5. Tween 20 nebo neiontové detergenty
o Snižují povrchové napětí a zlepšují kontakt reakčních komponent
o Zvýšení produktivity procesu

Zařízení a modifikace PCR

 Termocyklery:
o Programovatelný termostat
o Rychlé zahřívání a chlazení
o Přesné nastavování teploty
o Široce využitelné pro různé PCR
o Často vysoká kapacita
o Zkumavky nebo destičky

Kvantitativní Real time PCR

 Metoda amplifikace DNA spojená s kvantifikací vyrobené DNA
 Technika monitoruje akumulaci DNA během každého cyklu PCR
reakce
 Konvenční PCR si ověřujeme koncentraci DNA až po skončení reakce
(gely, SEC-MALS HPLC)
 Do reakční směsi je přidáno DNA specifické barvivo
o Nespecifické k produktům
 SYBR green
 V systému je fluorescenčně označený oligonukleotid (PRIMER)
 Hledá se Ct hodnota – cycle threshold
o Počet cyklů k dosažení dostatečně velké fluorescenčního signálu

30
5 HISTORIE SEKVENOVÁNÍ DNA
 1953 – Objev struktury DNA
o James Watson a Francis Crick s významným přispěním Rosalind Franklin a Maurice Wilkinse objasňují
dvoušroubovicovou strukturu DNA. Tento objev pokládá základ pro pochopení toho, jak se genetická
informace uchovává a přenáší.

 1965 – Robert Holley jako první sekvenoval nukleovou kyselinu

o tRNA pro transfer alaninu do ribozomu
o Enzymatické štěpení tRNA po izolaci (ribonukleázy)
o Metoda sequencingu štěpením
o Analýza fragmentů pomocí gelové elektroforézy
o Ruční rekonstrukce sekvence – roky

 1970 – Wu
o Sekvenace syntézou
o Sekvenace se realizovala na LAMBDA DNA
o Tato DNA má 5` přesah 12 nukleotidů
o Pomocí E.coli DNA polymerázy postupné přidávání značených izotopů
o 32P a 3H
o Opravování komplementárního řetězce
o Identifikace produktu syntézy DNA pomocí 2d TLC
o Analýza radioaktivního záření TLC chromatogramem

 1972 – Walter Fiers sekvenoval první celý gen pro kódování proteinu v MS2 viru

6 1. GENERACE METOD PRO SEKVENCOVÁNÍ

 Dva základní přístupy - degradační a syntézní byly rozvinuty do 2 moderních metod tzv. 1 generace
o Maxam-Gilbertova metoda – sekvencování degradací
o Sangerova metoda – sekvencování syntézou

Maxam-Gilbertova metoda
 1977
 Syntézní postup vhodný pro sekvenaci DNA o délce cca
stovek nukleotidů
o V první fázi je nutné z dsDNA vyrobit ss DNA
o Označí se 5` konec ssDNA radionuklidem 32P
o Enzym kináza připojí fosfátovou skupinu z
označeného ATP
 Sekvenace probíhá procesem zvaným chemická terminace
 Používají se specifické chemikálie, které odštěpují jisté části
DNA
 Realizuje se ve 4 zkumavkách s různými činidly
 Chemikálie štěpí molekulu DNA ve specifických oblastech
31
 + pyperidin
o Štěpí v oblasti výskytu guaninu
o Produktem je řada fragmentů
 V REÁLU NEZNÁME SEKVENCI
 Fragmenty se identifikují pomocí elektroforézy

 Příprava ssDNA
o Zahřát DNA nad teplotu tání (90-95°C) = denaturace (pozn. jako u PCR)
o Při pomalém ochlazování dochází opět k přilnutí řetězců
o Při šokovém ochlazení se však již oba řetězce nespojí

 Enzymatická syntéza ssDNA

o T7 RNA polymeráza pro přepis RNA z DNA templátu
o Poté následuje přepis RNA pomocí reverzní transkriptázy na DNA = ssDNA
o T7 RNA polymeráza pochází z T7 bakteriofágu, viru který infikuje E.coli bakterie

 Sekvenci čteme od celého SS DNA

o První největší fragment je viditelný ve zkumavce C+T
o Na stejné velikosti nukleotidu už žádný další fragment není a to ani ve zkumavce C
 = první nukleotid je T
o Další fragment s o 1 menší velikostí je patrný ve zkumavkách A+G a G
 = dalším nukleotidem v pořadí je G
o Další fragment je pouze ve zkumavce A+G
 V G není
 =dalším nukleotidem je A

 Proč ztratila časem tato metoda na významu?

o Je vícekroková a tudíž je pomalá
o Označování izotopů
o Jednotlivé degradační reakce
o Příprava gelu
o Elektroforéza
o Vyvolávání RTG film k vizualizaci výsledků
o Velikost gelu značně omezuje počet bází na 200-300

 Používá nebezpečné chemikálie

o 32P je izotop vyzařující intenzivní beta záření
o Hydrazin je potenciální neurotoxin

 Stále se používá na specifické aplikace

o Identifikace DNA modifikací
 Methylace – přidání methylových skupin do DNA brání expresi konkrétního genu
 MG metoda štěpí DNA na předpokládaných místech modifikace a změny se hledají v porovnání
se sérií originálních fragmentů

32
 Sangerovo sekvenování
 Frederick Sanger a jeho kolegové vyvinuli převratnou metodu sekvenování DNA, často označovanou jako
Sangerovo sekvenování nebo sekvenování zakončení řetězce. Tato metoda zahrnuje syntézu řetězců DNA v
přítomnosti nukleotidů ukončujících řetězec, což vede k fragmentům různých délek, které lze oddělit gelovou
elektroforézou. Sekvence je pak odvozena analýzou vzoru ukončených fragmentů.
 Metoda vyžaduje jen komerční DNA polymerázy
 Cutting na fragmenty od 15 do cca 200 nukleotidů
 Separace pomocí gelové elektroforézy
 Detekce na RTG filmu

Komponenty

 ddATP, ddTTP, ddGTP a ddCTP

o Obarvené nebo radiologicky označené
dideoxynukleotidtrifosfáty
o Díky tomu že nemají na sacharidu OH skupinu, tak
neumožňují další navazování nukleotidů na řetezec
 Ukončují řetězec
 Varianty všech čtyř nukleotidů
 Malá koncentrace
 DNA polymeráza
 dNTP
o Deoxynukleotidtriphosphátové molekuly
o Běžné stavební bloky DNA
o Pro sangerovo sekvenování se přidává ve velkém množství
 Primer – specifická krátká sekvence ssDNA

 V případě originální sangerova sekvenování se reakce rozdělují do 4 zkumavek

o Dochází k navázání primeru a postupnému prodlužování řetězce dle pravidel komplementarity
o Pokud dojde k navázání ddNTP, dojde k ukončení polymerázové reakce
o Po reakci se provede opět denaturace
o Po denaturaci gelová elektroforéza

33
 o Historie sekvenování DNA
 1984 – Automatizovaná platforma pro sequencing
o Fragmenty DNA migrují po gelu a otiskávají se do pohybující se membrány
o První pokusy byly s ion Exchange papírem DE81, ale ty praskaly
 Nahrazeno ion-Exchange membránou NA45 s vysokou kapacitou pro DNA (cca 100 ng/mm2)
 DNA může být snadno vymyto pomocí 1-2 M NaCl = membrána se dá použít vícekrát
 1989 – Fritz Pohl vylepšil svou metodu sekvenace bez použití RTG záření
o Kolorimentrická metoda

Sangerovo sekvenování - fluorescence

 1986 – Leroy Hood vyvinul první polo-automatický stroj na sekvenování
o Fluorescenční detekce – místo radiologicky označených nukletidů fluorescenčně
o Zásadní výhoda = nemusí být 4 reakční směsi! Ale jen jedna s různě označenými nukleotidy!
o Ukládání a analýza sekvence pomocí počítače
 Eliminuje potřebu přenášet informaci na film (radiografie)
 Fluorescenční oligonukleotidové primery
 Velmi citlivé (cca 10-15 M na jeden band na gelu)
 Používají se 4 dle nukleotidu
 Bendy jsou skenovány na konci gelu

Kapilární elektroforéza

 Aplikace CE umožňuje sekvenovat delší řetězce až do cca 1000 nukleotidů

 Sangerova metoda je stále zlatým standardem pro sekvenování
 Cílí na menší genomické regiony ve velkém množství vzorků
 Sekvencování variablilních regionů dle použitých primerů
 Vhodná pro validaci výsledků z next generation sekvenování
 Vhodné pro ověřování plasmidových sekvencí, inzertů a mutací

 Aplikace v HLA typingu

o Human leukocyte antigen
 Metoda pro identifikaci specifických variací v HLA genech které kódují hlavní histokompatibilní
protein u lidí
 Tento protein hraje zásadní roli v imunitním systému, aby imunitní systém rozeznal své a cizí
buňky
34
  Zásadní pro transplantace orgánů a tkání
o Čím bližší shoda HLA antigenů, tím vyšší úspěšnost transplantace
 Transfuze krve
 Studium autoimunitních onemocnění
o Nevýhoda je, že metoda optimálně pracuje pouze do velikosti templátové DNA okolo tisíce nukleotidů

7 Alternativní postupy sekvenování

 1990 – Projekt lidského genomu začíná
o Spouští se projekt Human Genome Project (HGP), jehož cílem je zmapovat a sekvenovat celý lidský
genom. Toto mezinárodní společné úsilí zahrnuje několik laboratoří a výzkumných pracovníků.
o Trvalo 13 let a výzkum stál 3 miliardy dolarů
 Sekvenování celého genomu o milionech bází vyžaduje alternativní přístupy

Pyrosekvenování
 Metoda vhodná pro větší úseky DNA
 Proces je na počátku identický s konvenčními metodami sekvenování
 Provede se fragmentace a denaturace DNA na ssDNA
 V případě pyrosekvenování se ssDNA imobilizuje na pevný nosič, kuličky
 Agaróza, paramagnetické částice, silika, polymerní mikrosféry
 Povrch je modifikován krátkou ssDNA
 Templátová DNA je při denaturaci modifikována adaptorovou DNA, která se přichytí na částice
 DNA se distribuuje po celém povrchu částic
 Částice se převedou do sekvencovacích průtočných cel

 Při úspěšném navázání nukleotidu na DNA se uvolní

Pyrofosfátová skupina P-P
 Enzymaticky se produkuje ATP a pomocí luciferinu a luciferázy
generujeme záření
 Každá dNTP ale ale generuje Ppi
 Jak poznáme, který nukleotid se vlastně přidal?
o Přidávání se realizuje v průtočných celách
 Možno mít vícepozicovou konfiguraci
o Možno zaráz studovat více druhů DNA
o Řízeno pomocí PC

35
 ILUMINA – next gen sekvenování
 Metoda díky které je možné sekvenovat celý lidský genom během jednoho dne
 Syntézní metoda
 Fragmentace a ligace krátkých DNA adaptérů
 Možné namnožit fragmenty s adaptéry pomocí PCR
 Fragmenty jsou navázány na čip v průtočné cele
 Vzniknou můstky:
o Můstek je zkopírován pomoci PCR a denaturován
o Tento proces se opakuje
 Reverzní řetězce jsou odštěpeny
 Začíná sekvenování pomocí fluorescenčně značených nukleotidů
 Naváží se nukleotidy a promyje se čip
 Čip se osvítí laserem a zaznačí se kdy s jakým nukleotidem došlo k
navázání
 Čip se promyje roztokem odstraňující chemicky fluorescenční značky
 Výsledky jsou poté zpracovány pomocí PC

FOODOMICS
- Vědní disciplína studující potraviny a výživu skrze integraci a aplikaci pokročilých –omics technik
o Genomics – studium celého genomu jedince
o Proteomics – analýza proteinů v buňkách, tkáních nebo
celých organismech
o Metabolomics – studium metabolických drah
o Lipodomics – analýza kompletního setu lipidů v
biologickém vzorku
- Aplikací těchto metod získáváme komplexní informace o
molekulovém složení potravin, nutričním obsahu a potenciálních
efektech potravy na zdraví
o Zásadní pro zlepšování kvality, bezpečnosti a nutriční hodnoty potravin
o Pochopení evoluce složek potravy během trávení, absorbce a interakce s organismem
o Relevantní převážně v kontextu personalizované výživy
 kompozice diety specificky postavené pro jedince s unikátním genetickým a metabolickým profilem
- Vývoj funkčních potravin např. potravina jako protektant proti rakovině
- Díky vysoké analytické efektivitě foodomics postupů se také využívají k ověřování autenticity potravin

1 MOLEKULÁRNÍ SLOŽENÍ POTRAVIN

- Foodomics poskytuje komplexní a holistický pohled na molekulární složení potravin
o Přesahuje základní nutriční obsah a odhaluje širokou škálu bioaktivních sloučenin, včetně fytochemikálií,
antioxidantů a dalších funkčních molekul, které přispívají ke zdraví.
- Identifikace bioaktivních sloučenin:
o S Foodomics mohou výzkumníci identifikovat a charakterizovat specifické bioaktivní sloučeniny v potravinách. To
zahrnuje pochopení toho, jak tyto sloučeniny interagují s biologickými systémy a přispívají ke zdravotním
přínosům, jako jsou protizánětlivé, antioxidační nebo protirakovinné vlastnosti.

36
 - Nutrigenomika a personalizovaná výživa:
o podmnožina Foodomics, zkoumá interakci
mezi výživou a genetikou.
o Pochopením toho, jak jednotlivé genetické
variace ovlivňují reakce na různé potraviny,
lze vyvinout personalizované výživové plány.
o Toto přizpůsobení stravy individuálním
genetickým profilům je příslibem optimalizace
zdravotních výsledků a prevence nebo
zvládání chronických onemocnění.
- Dopad na lidské zdraví:
o Odhalení molekulárních aspektů potravin
umožňuje hlubší pochopení toho, jak dietní vzorce ovlivňují fyziologické procesy.
o Tyto znalosti mohou poskytnout informace o strategiích prevence a zvládání různých zdravotních stavů, včetně
obezity, cukrovky, kardiovaskulárních chorob a neurodegenerativních poruch.

2 ZÁKLADNÍ PŘÍSTUPY
- Analýza v potravině něčeho, jehož strukturu známe – třeba jestli nějaká fenolická látka se dostává do bb – identifikace a
kvantifikace toho, jestli to je v té bb = CÍLENÁ
- NECÍLENÁ

HIGH RESOLUTION MS

- Komplexní analýza jen pouze málokdy může vycházet z tzv. cílené analýzy
o Standardy jsou často obtížně syntetizovatelné
- Tímto postupem lze efektivně identifikovat a kvantifikovat toxiny v různých druzích potravin
o Existuje ale velké množství derivátů, které tímto způsobem ve vzorku neidentifikujeme
- Necílená analýza – komplexní rozbor chemického složení spojené s
pokročilým zpracováním dat
o Zásadní pro identifikaci jednotlivých látek na molekulární
úrovní vyžaduje vysoké rozlišení analýzy
o Metody jako je FT-IR produkuje spektra, která spíše popisují
jaké druhy látek ve vzorku jsou, ale strukturní informace vyčíst
nelze
- Hmotnostní spektrum z běžného low resolution MS jako je single quad
o Není možné rozlišit velké množství variant fragmentů a
poskládat tak celou strukturní informaci
o Ionty jsou zachyceny v komoře kde jsou excitovány na
resonanční cyktronovou frekvenci
o Po vypnutí excitačního pole ionty rotují její vlastní
cyklotronovou frekvencí a prochází opakovaně přes pár elektrod. Každý průchod je zachycen a jsou zaznamenány
sinusoidní vlny, které jsou transformovány pomocí fourierovy transformace na hmotnostní spektrum
o Ionty ztrácejí svou energii při srážkách s
ostatními ionty
- Silnější magnet = lepší rozlišení
- Příklad fragmentace pouze jednoho proteinu
- Ionty velmi blízké v hmotnosti, ale stále je možné je
rozlišit

37
Necílená analýza pomcí HR přístrojů
- Př. Necílená analýza mykotoxinů
- Vyhodnocování HR foodomics dat
- Všech 8000 signálů neodpovídá jednotlivým sloučeninám
o Je třeba provést filtrování dat
 Izotopové filtrování
 Mass defect (rozdíl mezi hmotností jádra a individuálních elementárních částic)
 Část hmoty je přeměněna na vazebnou energii
- Hledají se smysluplné kombinace jednotlivých fragmentů
- Je také možné jednotlivé fragmenty propojovat s možnými biochemickými procesy
- Potřeba standardů daných látek – nechají se vyprodukovat cílovým organismem – izolace – dá se jí médium se značeným
izotopem (13C6-glukoza třeba – o jeden C těžší), kultivace na miskách – a pak poznám na spektru mého vzorku, jestli tam je
ten toxin – LC/MS – podle retenčního času (cílená analýza zase)

- Necílená: komplexní přístroje – separace tisíců sloučenin, problém je rozlišení (nerozseparované peaky)
o Rozlišení je vzdálenost mezi středy peaků
 RS < 1  dvojpeak, nebo jeden peak se dvěma látkami: RS = 0
 Prodloužení kolony, jiná mobilní fáze..  změna podmínek, abych to rozseparovalo a dostala se
na RS = 1,5 – funguje je to jen v systému s max desítkami látek, ne víc – když mám víc, tak pomocí
chromatografie to prostě nerozdělím
 Charakterizace analytických zařízení – podíl m/z (? Říkal m/z, v tom vzorci není m/z) děleno šírkou peaku
v polovině jeho výšky
 Příklad výpočtu u ICP-MS
o AMU = 100  R = 100/0,3 = 333 (rozlišení)
o U této metody to ale stačí, protože pracujeme s ionty – je tam rozdíl jednoho protonu u
každého ještě – ale v organice to je málo (velké M, podobné – nerozseparují se na 2
peaky)
o  lepší techniky

- FT-ICR – nějaký cyklotron s Fourierovou transformací

- Kombinace s MS – třeba v chromatogramu mám 2 peaky a každý obsahuje 2 látky  MS mi to rozseparuje tak, že to jde
rozeznat (samotná chromatografie, ani samotné MS by to nezvádlo)
o MS umožňuje práci bez standardů – podle těch fragmentů poznám, co by to mohlo být
o Spektrum MS – jednotku AMU je málo, lepší druhý graf – přes 600  rozlišení 2 000 000
- MS-ICR – rezonanční cela cyklotronu – pomocí elektrospreje se do zařízení (vakua) dají rozfragmentované nabité částice –
urychlí se na cyklotronovou frekvenci – pláty přestaneme nabíjet – fragmenty se furt točí v magnetickém poli – podle toho,
jakou má hmotnost – jinak interaguje s magnetickým polem – hodně oscilací = detailní informace
- Využití necílené analýzy k identifikaci látek v potravině/buňce
- Necílená analýza zase na ty mykotoxiny – 8000 signálů – ne všechny odpovídají sloučeninám
o Statistika na odfiltrování dat – část hmoty se mění na vazebnou energii (hmotnost protonů a neutronů neodpovídá
hmotnosti atomu – tyto rozdíly jdou vidět na tom high res MS)
38
39