KỸ THUẬT

XÉT NGHIỆM
CƠ BẢN
-

VI SINH

Nội dung

› Phương pháp khử khuẩn áp dụng trong phòng

xét nghiệm vi sinh.

› Thao tác vô trùng.

› Hướng dẫn sử dụng các thiết bị thông dụng

trong phòng xét nghiệm vi sinh.

› Kỹ thuật cơ bản trong xét nghiệm vi sinh

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 PHƯƠNG PHÁP

KHỬ KHUẨN
ÁP DỤNG TRONG
PHÒNG XÉT
NGHIỆM VI SINH

Một số khái niệm

Khử trùng (Decontamination, Thông số Khử trùng Sát trùng

disinfection) và Sát trùng Phương pháp Nhiệt, bức xạ, Hóa chất
lọc, hóa chất
(Antisepsis): tiêu diệt, ức chế,
Tiêu diệt vi sinh Không Có
loại bỏ hoặc làm giảm hàm
vật trên bề mặt da
lượng vi sinh đến mức gần như hoặc màng nhầy
hoàn toàn (một số vi sinh vật Tiêu diệt vi sinh Có không

hoặc bào tử có thể sống sót). vật trên vật chất

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Một số khái niệm

• Làm sạch (Sanitization): loại bỏ

những “chất bẩn”.

• Tiệt trùng (Sterilization): tiêu diệt

hoặc loại bỏ hoàn toàn tất cả vi
sinh vật, kể cả bào tử.

• Vô trùng (Aspetic): quá trình ngăn

chặn hoặc dự phòng sự xâm nhập
của vi sinh vật.

Các phương pháp khử khuẩn

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng tia cực tím

• Bước sóng 210 – 328nm

nhưng khả năng diệt khuẩn
cao ở 240 – 280nm (UV-C).

• Tiêu diệt vi khuẩn bằng cách

phá hủy DNA của vi khuẩn.

• Tác động trên virus và vi

khuẩn và ít tác động trên bào
tử và vi nấm.

Khử trùng bằng tia cực tím

• Không có tính xuyên thấm.

• Khử trùng không khí, bề mặt,

nguồn nước.

• Hiệu quả khử trùng phụ thuộc:

• Loại vi sinh vật

• Cường độ tia chiếu

• Khoảng cách

• Chất hữu cơ, chất bẩn

• ....

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng lọc

• Làm giảm hàm lượng hoặc loại bỏ vi sinh

có trong không khí.

• Khẩu trang:
• Y tế / Phẩu thuật

• N95:  95% (0.1 - 0.3m);  99.5% ( 0.75m)

• Màng lọc HEPA (High-efficiency particulate air):

• H 10:  95% (0.3m)

• H 13:  99.99% (0.3m)

• H 14:  99.999% (0.3m)

Khử trùng bằng lọc

› Ứng dụng của màng lọc HEPA:
• Tủ thổi khí (laminar flow cabinet / clean beanch)

• Tủ an toàn sinh học (biosafety cabinet)

• Phòng sạch (clean room)

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng hóa chất

› Yếu tố ảnh hưởng đến khử trùng của hóa chất:

• Nồng độ: nồng độ cao khả năng khử trùng mạnh (ngoại trừ cồn);

• Thời gian: thời gian tiếp xúc lâu, khả năng khử trùng tốt;

• Nhiệt độ: nhiệt độ cao, tốc độ phản ứng nhanh;

• Tính chất môi trường xung quanh: pH, sự hiện diện của các vật liệu
không liên quan;

• Tính chất của vi sinh vật: khả năng sinh bào tử, hàm lượng...

Khử trùng bằng hóa chất

› Hóa chất dùng khử trùng cần:

• Hiệu quả trên nhiều tác nhân;

• Hiệu quả nhanh chóng, thời gian tiếp xúc ngắn;

• Độc tính chọn lọc (không độc hại với người,không ăn mòn hoặc gây hại đến vật liệu
được khử trùng);

• Hiệu quả ngay cả khi có sự hiện diện của chất hữu cơ;

• Nên để lại một lớp kháng khuẩn trên bề mặt sau khi khử trùng.

• Hòa tan trong nước và dễ sử dụng;

• Ít tốn kém và dễ chuẩn bị

• Ổn định trong bảo quản, lưu trữ và các điều kiện vận chuyển;

• Không mùi

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng hóa chất

Khử trùng bằng hóa chất

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng nhiệt độ

› Yếu tố ảnh hưởng đến khử trùng của nhiệt độ:

• Tính chất của vi sinh vật: khả năng sinh bào tử, hàm lượng...

• Nhiệt độ: nhiệt độ cao, khả năng khử trùng tốt;

• Thời gian: thời gian tiếp xúc lâu, khả năng khử trùng tốt;

• Tính chất môi trường xung quanh: sự hiện diện của các vật
liệu không liên quan;

Khử trùng bằng nhiệt độ

› Khử trùng bằng sức nóng khô:

• Đèn cồn, đèn bunsen;

• Tủ sấy.

Nhiệt độ và thời gian khử trùng bằng tủ sấy

120oC 8 giờ

140oC 3 giờ

160oC 1 giờ

180oC 30 phút

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng nhiệt độ

› Khử trùng bằng sức nóng ướt:

• Khử trùng dụng cụ;

• Đun sôi trong nước từ 30 – 60 phút;

• Không tiêu diệt bào tử

Khử trùng bằng nhiệt độ

› Khử trùng bằng sức nóng ướt:

• Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp
(phương pháp Pasteur);
• Khử trùng thực phẩm;
• Đun nóng 60 -75oC / 15 – 30 phút,
80oC / 10 – 15 phút;
• Không tiêu diệt bào tử.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Khử trùng bằng nhiệt độ

› Khử trùng bằng sức nóng ướt:

• Đun sôi ngắt quãnh (phương pháp

Tyndall);

• Khử trùng một số loại môi trường;

• Đun sôi 100oC / 30 – 40 phút, để

nguội và lặp lại 3 – 4 lần.

Khử trùng bằng nhiệt độ

› Khử trùng bằng hơi nước bão hòa:

• Thiết bị: nồi hấp tiệt trùng (autoclave); Mối tương quan giữa

• Tiêu diệt tất cả vi sinh vật: 121oC/30 phút nhiệt độ & áp suất
0 atm 100oC

0,5 atm 110oC

1,0 atm 115oC

1,5 atm 121oC

2,0 atm 126oC

3,0 atm 134oC

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 THAO TÁC
VÔ TRÙNG

Mục đích

› Thao tác vô trùng nhằm không để vi sinh vật từ môi

trường hoặc người nhiễm vào vật liệu xét nghiệm
(bệnh phẩm, nguyên vật liệu) và ngược lại.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Tầm quan trọng của thao tác vô trùng

› Làm hư hỏng nguyên vật liệu dùng cho xét nghiệm.

› Không đánh giá được hoặc làm sai kết quả xét nghiệm.

› Làm mất hoặc biến đổi vi sinh vật lưu trữ.

› Làm ô nhiễm môi trường.

› Gây nhiễm trùng cho nhân viên y tế, bệnh nhân….

Tiệt trùng que cấy

› Que cấy tiệt trùng trước và sau

khi sử dụng.

› Cách thực hiện:

– Đưa que cấy vào ngọn lửa và để
vòng tròn đầu kim loại chìm trong
nửa trên ngọn lửa;

– Khi vòng tròn nóng đỏ thì đẩy từ từ

lên phía trên để tiệt trùng phần thân
que cấy.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Thao tác với ống nghiệm

› Khử trùng miệng ống nghiệm bằng

cách hơ trên ngọn lửa trước khi mở
nắp và đóng nắp.

› Ống nghiệm phải được cầm nghiêng

một góc nhỏ hơn 45o so với mặt
phẳng ngang.

› Nắp ống nghiệm được giữ bằng ngón

tay út, cùng với tay cầm que cấy.

Thao tác với đĩa petri

› Cách để đĩa petri:

– Trên bàn: nắp ở trên để hạn chế vi

sinh vật trong không khí rơi vào khe
giữa nắp và đĩa.

– Trong tủ ấm, tủ lạnh: nắp ở dưới để

hạn chế sự bốc hơi nước từ môi
trường thạch.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Thao tác với đĩa petri

› Thao tác khi cấy hoặc lấy

khúm khuẩn từ đĩa thạch:

– Trong tủ ATSH: mở hẳn nắp

để thao tác.

– Không có tủ ATSH: mở hé
nắp để thao tác.

› Thao tác khi đổ môi trường

vào petri.

HƯỚNG DẪN
SỬ DỤNG
THIẾT BỊ
THÔNG DỤNG
PHÒNG XÉT
NGHIỆM VI SINH

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 ĐÈN CỒN

Sử dụng đèn cồn

› Nhiệt độ của đèn cồn 500 – 900oF (260 – 480oC)

› Vị trí nóng nhất: 2/3 ngọn lửa (kể từ dưới lên)

› Lưu ý khi dùng đèn cồn:

– Không cho cồn quá 2/3;

– Không nghiêng hai đèn cồn để châm lửa cho

nhau;

– Tắt đèn bằng cách dùng nắp đậy, không dùng

miệng thổi để tắt đèn;

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

Sử dụng kính hiển vi với vật kính dầu

› Điều chỉnh khoảng cách giữa hai thị kính;

› Mở hết khe chắn sáng;

› Nếu tiếp tục quan sát tiêu bản khác thì

chuyển sang vật kính 10X để lấy tiêu bản
ra và cho tiêu bản khác vào. Khi đó chỉ
cần chỉnh ốc vi cấp;

› Lau sạch dầu sau khi sử dụng.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 TỦ AN TOÀN SINH HỌC
(BSC: Biological Safety Cabinet)

Vai trò của tủ ATSH

› Tủ ATSH là hàng rào ngăn chặn sơ cấp.

› Tủ ATSH nhằm bảo vệ:

– Tác nhân lây nhiễm cho người;

– Mẫu bệnh phẩm không bị nhiễm chéo hoặc

nhiễm từ môi trường;

– Tác nhân lây nhiễm cho môi trường.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Phân loại tủ ATSH

Tủ ATSH cấp I
Tủ ATSH cấp II
Tủ ATSH cấp II / A1

Tủ ATSH cấp II / A2 (B3)

Tủ ATSH cấp II / B1

Tủ ATSH cấp II / B2

Tủ ATSH cấp III

Tủ ATSH cấp I
Đặc điểm Thông số
Bảo vệ người: Có

Bảo vệ môi trường: Có

Bảo vệ mẫu: Không

Tốc độ gió: 0,36m/s

Khí thải: Trong phòng

Tỷ lệ thu hồi / thải khí: Không

Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Có

Làm việc với hóa chất độc hại: Không

Sử dụng khi không có yêu cầu bảo vệ mẫu.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Tủ ATSH cấp II

Đặc điểm A1 A2 B1 B2
Bảo vệ người: Có Có Có Có

Bảo vệ môi trường: Có Có Có Có

Bảo vệ mẫu: Có Có Có Có

Tốc độ gió: 0,36 – 0,51m/s 0,51m/s 0,51m/s 0,51m/s

Khí thải: Trong phòng Trong phòng Ra ngoài Ra ngoài

/ Ra ngoài / Ra ngoài

Tỷ lệ thu hồi / thải khí: 70 / 30 70 / 30 30 / 70 0 / 100

Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Có Không Không Không

Làm việc với hóa chất độc hại: Không Lượng thấp Lượng thấp Lượng thấp

Tủ ATSH cấp II / A1 & A2

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Tủ ATSH cấp II / A1 & A2

Tủ ATSH cấp II / B1 & B2

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Tủ ATSH cấp III

Đặc điểm Thông số

Bảo vệ người: Có

Bảo vệ môi trường: Có

Bảo vệ mẫu: Có

Tốc độ gió:

Khí thải: Ra ngoài

Tỷ lệ thu hồi / thải khí: 0 / 100

Nguy cơ nhiễm bẩn phòng: Không

Làm việc với hóa chất độc: Lượng thấp

Dùng cho cấp độ an toàn 4

Lưu ý khi làm việc với tủ ATSH cấp II

› Vị trí đặt tủ: xa cửa ra vào,

xa nơi thường xuyên đi lại,
xa ngõ cấp gió của điều hòa
không khí.

› Không dùng đèn cồn và các

loại hóa chất dễ bay hơi,
cháy nổ.

› Không để vật liệu ngay trên

ngõ lấy và thoát khí.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Lưu ý khi làm việc với tủ ATSH cấp II

Bố trí vật liệu, dụng cụ từ “vùng sạch” và “vùng nhiễm”

TỦ ẤM

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Sử dụng tủ ấm

› Thường xuyên vệ sinh tủ ấm;

› Theo dõi nhiệt độ hàng ngày;

› Không để quá nhiều vật dụng

trong tủ ấm;

› Không để cao quá 5 đĩa petri.

NỒI HẤP

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Sử dụng nồi hấp

› Kiểm tra các van và nước cấp

trước khi vận hành;

› Không để quá nhiều vật dụng

cho mỗi lần hấp thanh trùng;

› Theo dõi bằng chỉ thị nhiệt;

› Kiểm tra định kỳ bằng chỉ thị

sinh học.

KỸ THUẬT
CƠ BẢN
TRONG
XÉT NGHIỆM
VI SINH

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TIÊU BẢN

Mục đích

Cố định tiêu bản trên lame để

thực hiện các kỹ thuật soi nhuộm
(Gram, Ziehl Neelsen…)

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Cách thực hiện

› Cố định tiêu bản trên lame

nhờ sức nóng của ngọn lửa;

› Chỉ hơ nhẹ lame, không

“nướng” lame trên ngọn lửa.

KỸ THUẬT CẤY

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Mục đích

Thực hiện cấy trên các loại môi trường khác nhau:

› Môi trường trong ống nghiệm (lỏng, thạch nghiêng, thạch

đứng và thạch nghiêng sâu);

› Môi trường đĩa thạch (cấy phân lập, cấy một chiều, cấy
định lượng)

Kỹ thuật cấy vào môi trường ống nghiệm

› Môi trường lỏng;

› Thạch nghiêng;

› Thạch đứng;

› Thạch nghiêng sâu.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Kỹ thuật cấy phân lập

› Mục đích: phân tách

các vi khuẩn có trong
bệnh phẩm thành từng
khúm khuẩn rời.

› Nguyên tắc: pha loãng

mầm cấy trên môi
trường thạch.

Kỹ thuật cấy phân lập

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH

 Kỹ thuật một chiều

› Mục đích: phát hiện

tác nhân gây bệnh từ
dịch não tủy hoặc cấy
tăng sinh vi khuẩn trên
bề mặt thạch.

› Nguyên tắc: cấy trãi

một chiều mẫu thử
trên bề mặt thạch.

Kỹ thuật định lượng

› Mục đích: xác định

hàm lượng vi khuẩn
có trong nước tiểu.

› Nguyên tắc: cấy trãi

đều một lượng mẫu
thử trên mặt thạch.

XÉT NGHIỆM CƠ BẢN – VI SINH