PDF Cell Culture Bioprocess Engineering Second Edition Wei Shou Hu Author Ebook Full Chapter

Cell Culture Bioprocess Engineering,
Second Edition Wei-Shou Hu (Author)

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Cell Culture
Bioprocess Engineering
Second Edition
Cell Culture
Second Edition
Wei-Shou Hu
CRC Press
Taylor & Francis Group
6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300
Boca Raton, FL 33487-2742
© 2020 by Wei-Shou Hu
CRC Press is an imprint of Taylor & Francis Group, an Informa business
No claim to original U.S. Government works
International Standard Book Number-13: 978-1-4987-6285-4 (Paperback)
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Trademark Notice: Product or corporate names may be trademarks or registered trademarks, and are used only for
identification and explanation without intent to infringe.
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
Names: Hu, Wei-Shou, 1951- author.

Title: Cell culture bioprocess engineering / by Wei-Shou Hu.
Description: Second edition. | Boca Raton : CRC Press, [2020] | Includes
bibliographical references and index.
Identifiers: LCCN 2019047451 (print) | LCCN 2019047452 (ebook) | ISBN
9781498762854 (paperback ; alk. paper) | ISBN 9780429162770 (ebook) |
ISBN 9781498762861 (adobe pdf ) | ISBN 9780429546594 (mobi)
Subjects: MESH: Cell Engineering--methods
Classification: LCC QH585.2 (print) | LCC QH585.2 (ebook) | NLM QU 300 |
DDC 616.02/77--dc23
LC record available at https://lccn.loc.gov/2019047451
LC ebook record available at https://lccn.loc.gov/2019047452
Visit the Taylor & Francis Web site at

http://www.taylorandfrancis.com
and the CRC Press Web site at

http://www.crcpress.com
Contents
Preface ix
1 Overview of Cell Culture Processes

An Introduction to Cell Culture: A Historical Perspective 2
Cell Culture as Process Technology 6
Industrial Cell Lines 16
Other Production Systems 19
Manufacturing 21
Upstream Process 21
Product Quality in Cell Culture Processing 25
Quality of the Product 25
From Discovery to Clinical Products 30
2 Cell Biology for Bioprocessing

Introduction 38
Tissue Cells and Their Isolation 39
Cell Membrane 45
Cytoplasm and Organelles 50
Protein Secretion through the ER and Golgi Apparatus 57
Transport across Cellular Membranes 62
Cell Shape, Mechanics, and Movement 68
Growth Control 75
Concluding Remarks 83
3 Cell Physiology
Introduction 86
Glucose and Energy Metabolism 87
Regulation of Glucose Metabolism 101
Transport and Transporters 108
Metabolic Homeostasis and Lactate Consumption 112
Amino Acid Metabolism 119
v
vi Contents
Lipid Metabolism 122

Glycan Biosynthesis and Protein Glycosylation 126
4 Product Quality and Process

Introduction 142
Quality of Protein Product 145
Structural Homogeneity of the Product 150
Biological Activities 158
Quality by Design (QbD) of Cell Culture Products 160
QTPP and CQAs 162
Quality Risk Management 168
Design Space and Control Strategy 172
QbD in Different Stages of the Product’s Life Cycle 177
5 Stoichiometry and the Kinetics of Cell Cultivation

Introduction 184
Material Conversion in Cell Culture 185
Material Balance on Cell Growth 190
Kinetic Description of Cell Growth & Product Formation 193
Kinetic Model of Cell Growth 198
Modeling Productivity 200
Modeling a Cell Culture System 201
6 Cell Line Development

Introduction 208
Transient Production vs. Stable Expression Cell Line 209
Host Cells 210
Generating a Recombinant Protein High-Producing Cell Line 213
Concluding Remarks: Genomic Technology &
Cell Line Development 235
7 Medium Design for Cell Culture Processing

Introduction 240
Types of Media and Classes of Medium Components 243
Process Medium Design: Kinetics, Stoichiometry,
Omics & Optimization 248
Components of Basal Medium 254
High Molecular Weight and Complex Supplements 272
Contents vii
viii Contents
Appendix A: Cell Culture Process Data Analysis

Overview of Process Data 410
Data Processing Pipeline 413
Metabolic Flux Analysis 418
Time Series Data Analysis 424
Aggregation and Analysis of Process Data 427
Index 437
Preface
T his book draws its content from the Cellular Bioprocess Technology
short course that has been offered at the University of Minnesota
for over three decades. Each year, a number of prominent academics and
industry leaders come to the course to share their knowledge and best
practices. This book is distilled from the topics and materials developed
for those lectures. This second edition reflects the developments in cell
technology since the publication of the first edition in 2012.
This book, like the short course, aims to serve practitioners of mam-
malian cell-based biologics production. A major goal of this book is to
present the fundamentals of process technology and biology to industrial
practitioners of diverse backgrounds and to students from different aca-
demic disciplines in a succinct and easy-to-grasp way. Another goal is to
bring new knowledge from cutting-edge research and practice into the
very practical setting of today’s industrial laboratories. Over the course
of developing a new therapy—from the discovery in a laboratory to de-
veloping a production process, successfully commercializing the product,
and manufacturing the product with consistently high quality and effi-
ciency—scientists and engineers of different disciplines and in different
functional roles must effectively communicate in order to develop, ad-
vance, and innovate.
The first chapter in this book gives a historical overview of the evo-
lution of the science and technology of cell culture and the trends of
process technology in recent years. The second part of the book covers
fundamental knowledge of cell biology, metabolism, cells’ nutrition-
al needs, the determinants of product quality, and the means to create
cell lines as the workhorse for product manufacturing. The third group
of chapters delves into the process engineering principles of stoichiom-
etry, reactor kinetics, and scale-up. Since this book is written for read-
ers of diverse backgrounds, the aim is to help engineers understand the
key biological features of cells without requiring an extensive prior back-
ground in biology, and also to help non-engineers grasp basic engineering
ix
x Preface
principles without a prior two years of college math. This book was writ-
ten to allow scientists to gain a process perspective while reading through
biology-related topics, and to allow engineers to appreciate biological
considerations while perusing engineering topics.
As a second edition, this book is based on and extended from its first
edition, except for the addition of Chapter 4. Some chapters, especially
those regarding engineering subjects (Chapters 5, 8, 11, and 12), bear
a higher degree of resemblance to their counterparts in the first edition,
reflecting that fundamental principles do not change over time. Some
figures (including 1.3, 2.1, 2.3, 2.6, 2.7, 2.11–15, 3.2, 3.9, 3.11, 3.19,
3.21, 3.23, 5.3, 8.9–14, 11.3, 12.1, 12.2, 12.4, and 12.8) are also adopt-
ed from the first edition.
The content of the course and this book has been shaped by many
who participated in teaching the course over the years since 1986. The
delivery of the materials in this book has been polished through lectur-
ing the more than three thousand biotechnologists who have attended
the course in the past. I thank them sincerely for their participation. For
this second edition, I would like to thank Susan Abu-Absi, Nitya M.
Jacob, Rashmi Kshirsagar, Bhanu Chandra Mulukutla, Gargi Seth, and
Weichang Zhou in particular. Susan prepared the draft of the second half
of Chapter 4 and is acknowledged as a contributor to that chapter.
Many former and current members of my research laboratory at the
University of Minnesota contributed to the preparation of course materi-
als. For this edition I thank Tung Le, Sofie O’Brien, and Conor O’Brien
in particular.
Many skillful hands have worked on this book. Kimberly Durand
first took the notes to digital form two decades ago and continues to sup-
port the effort. For this edition, Victoria Roberts single-handedly took
the book from a draft Word document and hand-sketched graphics to
the laid-out and typeset product. She even learned some biology and en-
gineering along the way. The dedication of both is remarkable.
Like its first edition, this book is dedicated to the students, fellows,
and staff formerly and currently in my research group at the University
of Minnesota. Without this group of individuals to help advance the
content of the course, this book would not have been in the shape that it
is today. Finally, I wish for my lovely family, Jenny, Kenny, Lauren, two
granddaughters, Ya-Ling and Wen-Li, and my wife, Sheau-Ping, to share
the joy of the book’s completion.
Wei-Shou Hu
Department of Chemical Engineering and Materials Science
University of Minnesota
Cell Culture
Second Edition
Contents
An Introduction to Cell Culture: Insect Cell Culture 19
A Historical Perspective 2 Yeasts 20
Early Enabling Innovations in Transgenic Animals 21
Cell Culture 2 Manufacturing 21
Differentiated Cell Lines 4 Upstream Process 21
Differentiated Cells in Culture 4 Single-Use Systems and Continuous
Stem Cells 5 Process 22
Guiding Cell Differentiation in Vitro 5 Product Recovery 24
Cell Culture as Process Technology 6 Product Quality in Cell Culture
Viral Vaccines 7 Processing 25
Protein Molecules as Therapeutics 8 Quality of the Product 25
Biosimilars and the Expanded Reach Glycosylation Profile 27
of Protein Therapeutics 13 Protein Structural Variants 28
Gene Therapy 14 Process Control and Product Quality 29
Cell Therapy 15 From Discovery to Clinical Products 30
Industrial Cell Lines 16 References 33
Other Production Systems 19
1
Overview of Cell
Culture Processes
An Introduction to Cell Culture:
A Historical Perspective
Early Enabling Innovations in Cell Culture
C ultured mammalian cells are the workhorse for the manufactur-

ing of the class of pharmaceuticals known as biologics, including
viral vaccines and many protein medicines. What may not be known to
many is the art-like nature of growing cells at the dawn of cell culture, a
skill that required a great deal of creativity, inquisitiveness, passion, and
perseverance, in addition to all the good traits of a scientist. Around the
turn of the twentieth century, explants of animal tissues began to be cul-
tured on glass surfaces that were submerged in an animal’s tissue fluid.
Cells grew from the tissue clumps and remained viable and observable
for a few days.1 From the outgrowth of tissue clumps, some cells could
be isolated and eventually dissected out and expanded to new glass sur-
faces. The capability of passaging or expanding cell population was an
important step towards genuine cell culture. Among the first cell lines
established that could be continuously expanded in culture was the
mouse L cell.2 The early cell lines could be sustained in the lab only by
continuous passaging; they could not be frozen, stored away, and lat-
er thawed to resume growth. In that era, the complex nutrient mixture
could not be sterilized by heat. Rather, serum, ascetic fluids, or chicken
embryo extract were carefully isolated from animals in order to maintain
sterility for cell cultivation (Figure 1.1).3 Imagine the amount of work
involved in maintaining cultured cells!
Overview of Cell Culture Processes 3
The discovery of cryopreservation for freezing animal sperm and lat-

er other cells allowed cell growth to be paused and resumed in the lab.4
Another important advance was the use of trypsin for cell passaging, in-
stead of relying on dissection to dissociate cells from the surface. The first
human cell line, HeLa, derived from human cervical cancer, fully took
advantage of this.3, 5
Critical to cell culture advances was the arrival of membrane-filtra-

tion-based medium sterilization, first by ultrafiltration with a nitrocel-
lulose membrane and later by microfiltration. While saline and media
for microorganisms could be autoclaved for sterilization, the complex
nutrients needed by animal cells are destroyed at high temperatures.
Membrane sterilization accelerated the development of a chemical nutri-
ent medium consisting of glucose, amino acids, vitamins, and balanced
salts.6 This not only advanced our knowledge of the nutritional needs of
cells, but also greatly simplified the logistics of growing cells, leading to
the establishment of many important cell
Panel 1.1. Cell Substrate Example
lines and eventually to the industrializa-
tion of cell culture. Primary Cells
The early cell lines that could be con- • Tissue explant, limited cell expansion
tinuously passaged, including mouse L and
Cell Lines
HeLa, were derived from cancerous tissues
• e.g., Mouse L, HeLa, BHK, CHO
(Panel 1.1). Morphologically, they looked
abnormal and were distinct from primary Differentiated Cell Lines
cells first grown from normal tissues. Lat- • e.g., HepG2 (liver), PC12 (neuronal)
er continuous cell lines were isolated from
Stem Cells
various animal tissues, including baby • Multipotent, pluripotent
hamster kidney (BHK) from the Syrian • Capable of directed differentiation
hamster,7 Vero from green monkey kidney,8 in vitro
and Chinese hamster ovary (CHO) from
Large stirred tank Immune (T, NK) cells,

Microcarrier
bioreactor for hematopoietic cells
culture Human
cell culture
Cells
Frog embryo Mouse Kinetic model ES cells

tissue grown CHO MRC5 ES cells for cell growth
Mouse L WI38
in vitro HeLa 3T3 FS4 iPS cells
cell line
1900 1910 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010
CAR-T cells
Product
Polio vaccine FMD vaccine EPO

production in Recombinant
production in tPA MAb Glybera, Strimvelis
Vero cells BHK cells
OKT3 (gene therapy)
Ham’s F12 Bovine spongiform

Technology
encephalopathy: QbD,
Process,
Ultrafiltration Eagle Medium Continuous,

animal-component- PAT
membrane Medium rDNA integrated
free medium process
Fed-batch culture, Genome
DHFR for gene amplification perfusion culture engineering
Figure 1.1. Milestones in cell culture technology.
Large stirred tank Immune (T, NK) cells,

Microcarrier
bioreactor for hematopoietic cells
culture Human
cell culture
ells
Frog embryo Mouse Kinetic model ES cells

Chinese hamster ovary.9 These cell lines carried mutations that allowed
them to bypass their cells’ internal growth control mechanisms. These
cells were not phenotypically normal. They often did not exhibit con-
tact inhibition. With abundant nutrient supply, they grew into multi-
ple layers of cells on a surface. Later, 3T3, a cell line which is adhesion
dependent, exhibits contact inhibition, and does not undergo senes-
cence, was established.10 But the karyotype (or chromosome composi-
tion) of 3T3 cells, as well as other continuous cell lines, was aneuploid,
not diploid. Around the same time, phenotypically normal human fi-
broblastic cell strains, such as WI-38 and later MRC-5 and FS-4, were
isolated.11, 12, 13 These cells were diploid and exhibited contact inhibi-
tion but were not continuous cell lines like 3T3. They senesced after
repeated passaging in culture. For many decades, these cell lines and
cell strains served important roles in biological science and medical
research, and many were used in the industrial production of viral vac-
cines and other biologics.
Differentiated Cell Lines

The early cell lines were important tools for the in vitro study of
cell physiology, biochemical mechanisms, and cancers. However, those
cell lines didn’t possess the differentiated functions that tissues do. Later,
cells of various differentiated tissues would be isolated, including HepG2
from hepatocellular carcinoma,14 Jurkat from human T cell leukemia,15
and PC12 from rat pheochromocytoma.16 Most of those differentiated
cell lines were isolated from cancerous tissues instead of normal ones.
Compared to their normal counterparts, they were easier to isolate due to
their reduced dependence on various growth factors and cytokines need-
ed for in vitro growth. Nevertheless, they carried the phenotypic charac-
teristics of the tissue that they were derived from, and these differentiated
cell lines became valuable tools for biomedical research.
Differentiated Cells in Culture

The arrival of rDNA technology in the 1970s made the production
of various protein reagents a simpler task. It expanded the repertoire of
biochemical reagents and greatly increased our ability to culture cells that
require growth factors and cytokines. Primary cells, such as endothelial
cells, keratinocytes, chondrocytes, and hepatocytes, began to be isolated
from normal human tissues and cultured in vitro. Primary tissue cells
isolated from tissues typically retain many tissue-specific activities, and
thus may be exploited for tissue engineering applications such as repair-
ing tissues or augmenting tissue functions. However, most differentiated
cells have very limited proliferative potential and show phenotypic insta-
bility in culture.
Stem Cells
The quest for cells with differentiated properties soon extended from
isolating terminally differentiated cells to stem cells that could be differ-
entiated to specific lineages. Stem cells are classified by their differentia-
tion potential: totipotent, pluripotent, and multipotent. Totipotent cells
can become any type of cell, including extraembryonic tissues. Plurip-
otent cells (embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells) can
become any type of cell found in any of the three germ layers of ecto-
derm, mesoderm, and endoderm.17 Multipotent cells can differentiate
into different cell types of the same lineage. For example, hematopoietic
stem cells (HSCs) can differentiate into any type of blood cell by expo-
sure to different combinations of growth factors, such as stem cell fac-

tor (SCF), thrombopoietin (TPO), and granulocyte colony-stimulating
factor (G-CSF). Multipotent HSCs have been isolated from bone mar-
row, peripheral blood, and umbilical cord blood. Mesenchymal stem cells
(MSCs), also multipotent, were first isolated from adult bone marrow18
but are now found in almost all tissues. They have the ability to differen-
tiate mainly into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic cells.19 They
also have the capacity to produce a large number of bioactive molecules
and are being explored as signaling cells for possible immunomodulatory
and trophic effects.
Pluripotent stem cells
Stable mouse embryonic stem cells (mESCs) were first derived from
the inner cell mass (ICM) of early mouse embryos.20 Nearly twenty years
elapsed before two laboratories derived human embryonic stem cell lines
(hESCs).21, 22 These embryonic stem cells were pluripotent and capable of
differentiating into cell types of all three germ layers. They were karyo-
typically normal when grown under the appropriate culture conditions.
However, hESCs were derived from fertilized human eggs, making their
use ethically controversial. In contrast, induced pluripotent stem cells
(iPSCs) are derived by introducing four exogenous genes (OCT4, SOX2,
KLF4, and c-Myc (OSKM)) into adult somatic cells. They can be read-
ily derived from different individuals and are therefore free of ethical
controversy. After the introduction of these genes, a small fraction of
the transfected cells proliferated, bypassed apoptosis and cell senescence,
lost somatic cell characteristics, and were reprogrammed into pluripotent
cells.23–25 Since then, the reprogramming of adult somatic cells to iPSCs
has been accomplished with some modifications of gene combinations,
or even with cocktails of small molecules that induce epigenetic changes.
Guiding Cell Differentiation in Vitro

Some cell lines can undergo differentiation in vitro when they are
exposed to the appropriate signals. For example, a subclone of 3T3 cells,
designated 3T3-L1, can be induced to differentiate into adipocytes.26

PC12 cells, upon exposure to nerve growth factor or dexamethasone,
can terminally differentiate into neuron-like cells. The potential of using
cell lines capable of differentiation for in vitro drug testing—even for
therapy—has been long recognized.
Most primary cells isolated from tissues have a very limited prolif-
eration capacity. Primary hepatocytes, chondrocytes, and neuronal cells
all proliferate to a very limited extent in cultures and cannot be cultured
for a long period. In some cases, it is possible to enrich a subpopulation
of cells from a cell mixture isolated from tissues using chemical cues that
preferentially stimulate their proliferation. For example, T lymphocytes
and natural killer (NK) cells isolated from peripheral blood can be cul-
tured and expanded into larger populations. The isolation and culture of
those cells from the immune system two decades ago paved the way for
cell therapy today.
Adult stem cells isolated from tissues, like HSC and MSC, can also
be guided to differentiate into cells of related lineages (MSC to bone
and muscle lineages and HSC to lymphoid lineage). These adult stem
cells are multipotent and can only be directed to differentiate into their
respective related lineage. With pluripotent stem cells, directed differen-
tiation to lineages of all three germ layers is now possible, although most
differentiation protocols still generate only tissue-like cells with an insuf-
ficient extent of maturation.
It is also possible to directly reprogram adult somatic cells from one
lineage to another.27 Instead of ascending to the ESC-like state, the cells
are transduced with a combination of gene factors and reprogrammed
directly into the target differentiation state upon culturing in a differen-
tiation medium.28 Beta cells, cardiac cells, neurons, and hepatocytes have
all been derived directly from somatic cells.29–33
Cell Culture as Process Technology
E arly cell culture explorations aspired to establish a biological

platform for scientific research, but even then the potential appli-
cations of cell culture were never far from the minds of the scientists in-
volved. Soon after primary cells became culturable, viruses were produced
in primary cell culture. Cell culture quickly began to take the place of
animals and embryonated chicken eggs as the production vehicle of viral
vaccines. Notably, foot and mouth disease (FMD) viruses were produced
in primary calf kidney cells34 and polio vaccines were produced in pri-
mary monkey kidney cells in the 1950s.35 Subsequently, continuous cell
lines became the production vehicle of viruses, including BHK cells for
FMD virus36 and Vero cells for polio virus.37 Human fibroblasts MRC-5
were used in human vaccine production, while interferon was produced

by FS-4 cells.13 However, as we have witnessed in the past two decades, it
was recombinant DNA (rDNA) technology and the use of mammalian
cells for the production of therapeutic proteins that propelled cell cul-
ture to its place as a major manufacturing workhorse. Recent advances in
T cell therapy offer hope that therapeutic cells will become a new class of
product of cell culture processes.
Viral Vaccines
The most effective way to fight viral diseases has been widespread im-
munization by vaccines. The majority of viral vaccines are now produced
in cell culture. While animal tissues are no longer used, embryonated
eggs are still part of the production of many viruses, including influenza
virus. Because of their prophylactic nature and impact on public health,
vaccines do not command the same price as therapeutic proteins. The
combined commercial value of vaccines is substantially lower than the
total of pharmaceuticals, with total annual sales worldwide in the order
of ~30 billion US dollars in 2015. Influenza virus vaccines, among the
few viral vaccines with an annual sales value of more than 1 billion US
dollars, have only about 10% of their doses produced in cell cultures. The
rest are still produced in chicken eggs. Table 1.1 lists a number of viral
vaccines for human use. Although viral vaccines have made major strides
in advancing health care, many viral diseases, such as HIV, are still in
need of vaccines.
The majority of viral vaccines employ whole viruses, either live atten-
uated viruses or virus particles that have been inactivated by formalin or
another chemical treatment to render the virus incapable of infection but
still capable of eliciting the immune re- Table 1.1. Viruses Produced in Cell Culture
sponse. Live attenuated viruses used in
Virus Cell substrate
immunization have been adapted, of-
ten by a long serial passaging in a non- Poliomyelitis Vero
human host, to reduce their virulence Rabies Vero, MRC-5
to humans. The attenuated virus is still Measles Chicken embryo fibroblasts
capable of replication, but often at a Mumps Chicken embryo fibroblasts
slower rate. They continue to replicate Rubella WI-38, MRC-5
after being administered, thus requir- Adenovirus (vaccine) MRC-5
ing a smaller amount for immuniza-
Adenovirus (gene
tion than if an inactivated virus had therapy vector)
HEK293
been used. Rotavirus Vero
Viral vaccines may also be subunit
Chicken embryo fibroblasts,
vaccines consisting of protein subunits Smallpox (vaccinia)
BHK
produced in microbial or insect cell sys- Varicella MRC-5, 2BS
tems that retain antigenicity for immu-
Influenza MDCK, Vero
nization. Another type of vaccine, VLP,
consists of proteins that are produced by recombinant DNA technology

in microbial or cell systems but assembled into viral particles without the
virus genome. A prominent example is the VLP vaccine against human
papillomavirus virus, which is produced in yeast or insect cells.
The dose of viral vaccine for each immunization is low. Cell culture
facilities for viral vaccine manufacturing are therefore relatively small in
comparison to those for protein biologics. Nevertheless, the cell culture
technologies established for vaccine production in the 1960s and 1970s
laid the foundation for subsequent large-scale bioprocessing for thera-
peutic protein production. The basic cell culture processes of cell bank-
ing, medium design, process control, suspension culture, and adherent
growth on microcarriers in stirred tank bioreactors were all first estab-
lished for the manufacturing of vaccines and later adopted for recombi-
nant protein production.
Many viral diseases in the industrialized world have all but vanished
in the past few decades because of the availability of vaccines. However,
many basic vaccines that are routinely administered to the general pop-
ulation in industrialized countries are out of reach for a large fraction of
the world’s population. Reducing the cost of those vaccines and improv-
ing their distribution to make this basic human necessity available to ev-
eryone is still a major challenge. Nowadays, an outbreak of an infectious
disease in any part of the world has the potential to quickly become a
worldwide pandemic. Establishing manufacturing technology capable of
quickly producing vaccines for new strains of viruses and providing a
rapid response to affected regions during a pandemic remains a challenge.
Protein Molecules as Therapeutics

Proteins derived from blood, tissues, and cell cultures were used
for therapeutic purposes long before the arrival of recombinant DNA
technology. Examples include insulin for treating diabetes, urokinase for
stroke, factor VIII for blood coagulation disorder hemophilia, and inter-
ferons for viral infection. The first wave of recombinant DNA therapeutic
proteins, including human growth hormone and insulin, were produced
in Escherichia coli (Table 1.2). The subsequent products were also of hu-
man origin but required complex post-translational modifications—such
as complex disulfide-bond formation and glycosylation—that could not
be carried out by microbial cells (Table 1.3). Hence, mammalian cells
were employed.
The early development of cell-culture-based therapeutic proteins fo-
cused on monoclonal antibodies produced by hybridoma cells. The hy-
bridoma cells were derived from the fusion of non-antibody-secreting,
but continuously proliferating, myeloma cells and the specific antibody-
secreting, but non-dividing, B lymphocytes. Those fused cells that could
both grow and produce the desired antibody were isolated for production.
Since the B cells were obtained from immunized mice, the method pro-
duced mouse antibodies rather than human or humanized antibodies.
Hybridoma technology thus soon gave way to recombinant DNA-
based methods using Chinese hamster ovary (CHO), mouse myeloma,
and a few other cell lines. By introducing the transgene coding for the
Table 1.2. Therapeutic Protein Biologics Produced in Non-Mammalian Hosts

Product Activity / Use
Granulocyte colony-stimulating factor (Neupogen) White blood cell growth for neutropenia
Insulin (Humulin) Diabetes
α-Interferon (Intron-A) Anticancer, viral infections
Somatropin [human growth hormone]
Growth deficiencies
(Humatrope/Protropin/Nutropin)
Interleukin-2 (Proleukin) Kidney cancer
Human papillomavirus VLP Vaccine
Hepatitis B virus surface antigen Vaccine
Table 1.3. Non-Antibody Products Produced in Mammalian Cells*

Trade name Type Therapeutic use
Aldurazyme Laronidase Mucopolysaccharidosis I
Cerezyme β-glucocerebrosidase Gaucher’s disease
Myozyme α-galactosidase Pompe disease
Fabrazyme α-galactosidase Fabry disease
Naglazyme N-acetylgalactosamine 4-sulfatase Mucopolysaccharidosis VI
Orencia Ig-CTLA4 fusion Rheumatoid arthritis
Luveris Luteinizing hormone Infertility
Activase Tissue plasminogen activator Acute myocardial infarction
Epogen/Procrit EPO Anemia
Aranesp EPO (engineered) Anemia
Pulmozyme Deoxyribonuclease I Cystic fibrosis
Avonex Interferon-β Relapsing multiple sclerosis
Rebif Interferon-β Relapsing multiple sclerosis
Follistim/Gonal-F Follicle stimulating hormone Infertility
Benefix Factor IX Hemophilia A
Enbrel TNF receptor fusion Rheumatoid arthritis
Tenecteplase Tissue plasminogen activator (engineered) Myocardial infarction
ReFacto Factor VIII Hemophilia A
Advate Factor VIII (engineered) Hemophilia A
*all listed produced in CHO cells

Panel 1.2. product and amplifying its copy number, the

Evolution of Therapeutic Proteins transduced CHO cell can be made into a high
producer of the transgene product. Furthermore,
• Native proteins
the transgene can be engineered to increase its
- Factor VIII, tPA, EPO
• Engineered native proteins
binding affinity to the antigen or to humanize its
- B-domain deleted factor protein sequence. After the introduction of tissue
VIII, glycosylation-modified plasminogen activation (tPA) by Genentech in
EPO, recombinant IgG 1987, erythropoietin (EPO) and factor VIII soon
• Fusion proteins followed to reach the market (Figure 1.1).
- TNFR-Fc fusion protein, The early recombinant cell culture products
IL-1R-Fc fusion protein
were native human proteins administered to pa-
• Bispecific antibodies
tients who suffered from deficiency of the protein
• Drug-conjugated antibodies
due to congenic disorders or some disease condi-
tions (Panel 1.2). The second wave of therapeutic
proteins was antibodies. Antibody products make up the bulk of protein
drugs in clinical use today. Early antibody products, called chimeric an-
tibodies, retained the sequence of the immunized species (mostly mouse,
since mouse hybridoma was the primary source of antibody molecules) in
the variable region of the molecule while using a human sequence in the
constant region. Later generations of recombinant antibody molecules
were humanized (retaining only the hypervariable region of the mouse se-
quence) or completely human. Table 1.4 lists some examples of antibody-
based therapeutic proteins. Trastuzumab (trade name Herceptin) binds to
an overexpressed protein, HER2, which is so named because of its struc-
tural similarity to the human epithelial growth factor receptor 1 (HER1),
on the surface of breast cancer cells. About 20% of breast cancer cells
overexpress the HER2 protein and can be treated with the antibody. Its
success in clinics paved the way for subsequent growth in antibody drugs
and antibody Fc-region-based drugs. More recently, antibodies against
PD-L1 (programmed death ligand 1) that has become overexpressed in
many cancer cells have become an important class of medicines. PD-L1
is present in many normal cells, where it binds to PD-1 on T cells to sup-
press the T cell mediated immune response. However, some cancer cells
also express PD-L1 to evade the immune response by T cells. The binding
of an antibody to PD-L1 or PD-1 prevents the suppression of T cell acti-
vation by cancer cells, thus allowing the cancer cells to be killed by T cells.
The success of antibodies as a class of therapeutics was facilitated by
decades of vast investment in biomedical research by the federal govern-
ment and a better understanding of disease mechanisms. Once a bind-
ing target in a disease pathway is identified and the antigen isolated, an
antibody against the antigen can be obtained and its affinity toward the
antigen optimized. The antibody-based drug discovery is thus mecha-
nism-based and design-oriented. This is in contrast to the discovery of
traditional biochemical drugs such as antibiotics, immunosuppressors,
and anticancer drugs, which rely largely on screening using binding as-
says or bioassays. The success rate of a candidate antibody biologic is
much higher than that of a biochemical drug. Nevertheless, it is sober-
ing to recall that some had taken the failure of the 1992 clinical trial of
Centoxin, an antibody against the Staphylococcus aureus toxin for treating
septic shock, as the obituary of antibody therapeutics. The real success of
antibody therapeutics and the rapid increase in the number of FDA-ap-
proved biologics did not truly occur until the second half of 1990s, nearly
twenty years after the arrival of recombinant DNA technology and the
first wave of venture capital-funded biotech companies.
Antibodies are among the most abundant proteins in blood circula-
tion. They are highly soluble and can be secreted by B cells at high levels.
Table 1.4. Therapeutic Antibody Products

Trade name mAb type Therapeutic use Host cell
Orthoclone OKT3 Muromomab CD3 Reversal of acute kidney Hybridoma
transplant rejection
ReoPro Anti-Abciximab Prevention of blood clots SP2/0
Rituxan Anti-CD20 mAb Non-Hodgkin’s lymphoma CHO
Zenapax (Daclizumab) Humanized, anti-α-subunit Prevention of acute kidney NS0
T cell IL-2 receptor transplant rejection
Simulect (Basiliximab) Chimeric, anti-α-chain Prophylaxis of acute organ SP2/0
T cell IL-2 receptor rejection in allogeneic renal
transplantation
Synagis (Palivizumab) Humanized, anti-A antigen Prophylaxis of lower- CHO
of RSV respiratory-tract disease
Remicade Anti-TNF-α mAb Active Crohn’s disease SP2/0
Herceptin Anti-HER2 mAb Metastatic breast cancer CHO
Mylotarg Anti-CD33 Acute myeloid leukemia CHO
Campath Anti-CD52 mAb Chronic lymphocytic leukemia CHO
Zevalin Anti-CD20 murine mAb Non-Hodgkin’s lymphoma CHO
Humira Anti-TNF-α mAb Rheumatoid arthritis CHO
Xolair Humanized, Anti-IgE mAb Moderate/severe asthma CHO
Bexxar Anti-CD20 mAb Follicular non-Hodgkin’s CHO
lymphoma
Raptiva Anti-CD11a mAb Chronic psoriasis CHO
Erbitux Chimeric antibody raised EGF receptor–expressing CHO
against human EGF receptor metastatic colorectal cancer
Avastin Anti-VEGF Metastatic colorectal cancer CHO
and lung cancer
Soliris Antibody binding to C5 Paroxysmal nocturnal NS0
hemoglobinuria
Vectibix Anti-EGFR mAb Metastatic colorectal cancer CHO
Portions of the antibody molecule, namely the Fc region, are major com-
ponents of many therapeutic fusion proteins. In those fusion proteins,
the functional domain (or fragment) of a protein is joined to the carrier
domain through a linker segment (Figure 1.2). The Fc fragment pro-
vides many of the properties of an antibody. A prominent example is
the fusion molecule of the Fc fragment of IgG and the tumor necrosis
factor α (TNFα) binding fragment of the TNFα receptor (TNFRα). The
molecule binds to TNFα and suppresses its inflammatory effect. Such
non-natural proteins are increasingly being explored as medicine. Bispe-
cific antibodies (BsAbs), as the name implies, use antigen-binding sites
from two different antibody molecules to simultaneously target two
components of the cellular pathways and thereby improve clinical ef-
ficacy. Bispecific T-cell engagers (BiTEs) are a special class of bispecific
antibodies which engage the T cells of the host’s immune system in order
to treat cancers. Increasingly, antibodies are being derivatized so as to
contain drugs. These antibody-drug conjugates (ADCs) deliver cytotoxic
agents specifically to diseased cells through their recognition of a partic-
ular antigen on the cell surface. Many biologics in the pipeline include
antibody-drug
conjugates, bispecific antibodies, and bi- or tri-specific
immune cell engagers.
a) Antigen
b) c) Factor X Factor IXa
Heavy chain Fused protein
binding
Fab Fab
Light chain
Fc Fc Fc
d) e)
Toxin
Figure 1.2. Conventional and new generation antibodies. (a) A traditional monoclonal anti-
body (mAb), a tetramer of two heavy and two light chains. (b) A fusion protein where the
a) b) c) Factor X Factor IXa
Fc region Antigen
of the antibody is fused to different
Heavy chain proteins/receptors. (c) A bispecific antibody
Fused protein
binding
which combines two antigen-recognizing elements into a single construct, enabling it to
bind to two or more targets. In this example, one of the antigen-recognizing elements rec-
ognizes blood coagulation factor Factor X, and the other binds to Factor IXa, mimicking
the function of Factor VIII to enable blood coagulation. (d) A bispecific antibody which
Fab Fab
exclusively recruits the TLight
cellchain
activity is called a Bispecific T-cell engager. BiTEs do not
have a Fc region. (e) An antibody covalently linked to a chemical toxin, or an antibody-
drug conjugateFc(ADC). Fc Fc
d) e)
Biosimilars and the Expanded Reach of

Protein Therapeutics
The patent that gives the market exclusivity of a mammalian cell-
based therapeutic protein has a limited life span of 20 years after it is
granted. After the expiration of a patent for a particular protein therapeu-
tic, the generic version of the product, called the biosimilar, can be mar-
keted by other manufacturers without the permission of the innovator of
the original medicine. The availability of the generic version drives down
the price of the drug and makes it more accessible to patients outside of
industrialized countries. The regulation of biosimilars differs from that
of generic drugs. The clinical effectiveness of chemical drugs (such as
cholesterol-controlling statins and pathogen-killing antibiotics), whose
molecular weight is relatively small compared to proteins, is usually
assured once their chemical structure and purity are ascertained. The
generic version of these small molecule drugs, upon verifying its chemi-
cal identity, purity, and drug product quality, can enter the market after
the patent of the original drug expires (Panel 1.3). In contrast, both the
structure and manufacturing process of protein biologics are complex.
The biological activity and clinical efficacy of a biologic medicine is not
readily predictable when a therapeutic protein is produced using a dif-
ferent cell line and a different process by a different manufacturer. The
status of molecular folding, glycan composition, and even the composi-
tion of minute impurities may affect activity and immunogenicity. Bio-
similars thus require regulatory approval and must undergo clinical trials,
although on a smaller scale than the original (innovator) medicine.
A biosimilar must match the same product quality criteria as the
original drug—it must have the same protein sequence, similar post-
translational modification patterns (such as the profile of glycans, phos-
phate, or sulfate), and other quality indexes. However, such information
is not available from the manufacturer of the original innovative medi-
cine. Biosimilar makers thus are obliged to acquire the product from the
market (often at different times and locations to cover a wide range of
variabilities) and perform extensive product characterization to develop a
product quality profile. They must also establish a producing cell line and
Panel 1.3. Biologics, Drugs, and Patents
Original Off-Patent Version

• Drugs (small molecules) → • Generic drugs
- Require clinical trials - No clinical trials needed
prior to market entry
• Biologics (proteins) → • Biosimilars

- Require clinical trials - Limited clinical trials
develop a process that generates a product that meets the same quality
indexes as its counterpart from the innovator. It is possible that a biosim-
ilar may have improved clinical performance compared to the innovator
molecule; these are called “biobetters.”
Producing a biosimilar with an acceptable post-translational glyco-
sylation pattern is a challenging task, but one essential for receiving reg-
ulatory approval. The pathway for glycosylation is very complex. Many
factors can affect the glycosylation pattern of a product, including the
expression of glycosylation genes, the metabolic state of the cell, and the
supply of nucleotide sugars. Controlling the flux, or even just modulat-
ing the flux in the glycosylation pathway, is not an easy task. Coupling
the power of ‘–omics’-based analyses with a systems approach could pos-
sibly create a predictive tool to help steer the glycosylation pattern of the
biosimilar to better match that of the innovator molecule.
Gene Therapy
Gene therapy aims to treat congenic diseases by delivering a correct
copy of the gene to the cell of the patient via the introduction of a DNA
molecule with the correct genetic sequence. The affected tissue can then
be “corrected” to perform its proper function, or, in the case of the affect-
ed gene product being a secreted protein, the correct protein can be pro-
duced in the patient’s body at a functional level. Due to
Panel 1.4. Gene Therapy
the large number of genetic diseases that may benefit
• Viral vectors from gene therapy, there have been numerous ongoing
- Adenovirus, adeno- studies and clinical trials. Most efforts have focused on
associated virus, diseases caused by a single gene mutation. For example,
retrovirus, lentivirus the cystic fibrosis transmembrane conductance regula-
• Non-viral vectors tor (CFTR) gene treats cystic fibrosis, and the factor
- Nanoparticles
VIII gene treats hemophilia. Some approaches seek to
• Treatment
“permanently” incorporate a corrected copy of the gene
- Ex vivo and in vivo
into the cells of the patient, while others aim to tran-
siently express the correct gene to rectify the disease
conditions for a limited period of time. With the advances in genome
engineering technology, the exploration of gene therapy has been extend-
ed from giving a correct copy to the repair or silencing of the incorrect
copy in the host cell.
Gene therapy may be achieved by isolating a patient’s target cells
and performing gene transduction ex vivo before the “corrected” cells are
returned to the patient (Panel 1.4). It may also be accomplished by sus-
pending the replacement gene (or other DNA elements) in nanoparticles
or a plasmid or viral vector, and then injecting them into the patient and
allowing the DNA element to enter a fraction of the cells in the body and
perform its function. Most clinical trials that have been conducted with
viral vectors used adenovirus, lentivirus, or adeno-associated virus.
Producing viruses for gene delivery is similar to producing viruses for

vaccines. However, there are also important differences. While the num-
ber of viruses per dose for vaccines is rather small, that for gene therapy
in most applications is very high (100 to 1000 times higher). For one
dose, the volume of culture fluid needed is thus much larger for gene
therapy than for vaccine applications. This also means that the number
of impurities carried in culture fluid that must be removed from the final
product is much larger in a gene therapy product than a vaccine. In the
manufacturing of live viruses, at the end of production the culture fluid
cannot undergo the same type of extensive purification carried out in the
production of therapeutic proteins. Thus, the purification and concentra-
tion of viruses for gene therapy face greater challenges. In a typical virus
production process, a very large fraction of the virus particles produced
do not contain complete viral genomes and are not infectious. While
empty virus particles are still immunogenic, and can be effective for vac-
cination, these non-infectious particles do not deliver the DNA cargo
needed for gene therapy. Increasing the infectious virus particle content
is thus important in gene therapy virus production.
Recent approval of gene therapy products by regulatory agencies has
been very encouraging for cell culture bioprocessing. However, the cell
culture bioprocess profession still faces major challenges in the manufac-
turing technology required for virus production for gene therapy.
Cell Therapy
Bone marrow transplant, which has been practiced for more than
thirty years, is one of the oldest forms of cell therapy (Panel 1.5). Follow-
ing the discovery of HSC, its expansion and differentiation into separate
lineages for transplantation was long envisioned. Some also predicted
the enrichment and expansion of a particular lineage of cells, such as
platelets, T cells, or NK cells. As the capability of scientists to isolate and
culture various differentiated cells increased, Panel 1.5. Cell Therapy
many also attempted to culture and expand
hepatocytes or beta cells for cell transplan- • Cell transplant (autologous
tation to functionally rectify liver failure or cryopreserved cell)
- e.g., bone marrow transplant
diabetes. Functional differentiated cells were
• Donor cell transplant (heterologous)
also incorporated into scaffolds to construct
- e.g., liver cell transplant, bone
tissue mimicries for implantation. The re- marrow transplant
search field of employing functional cells for • Ex vivo expanded cell transplant
the construction of tissue analogues is more - e.g., stem cell or stem-cell-
frequently referred to as tissue engineering. derived differentiated cell
The emergence of various multipotent transplant
and pluripotent stem cells gives hope to re- • Ex vivo genetically altered cell
transplant
generative medicine. The use of stem cells
- e.g., Car-T cell therapy
as the source of differentiated cells for cell
therapy can potentially alleviate the problem of donor cell procurement

in those applications. PSCs can provide an almost unlimited supply of
liver and NK cells for regenerative applications. Many such applications
would involve the infusion of differentiated cells into regenerated tissues
or organs. Cell therapy thus entails overlapping applications with tissue
engineering, regenerative medicine, etc.
An area of cell therapy that has shown much promise is the treatment
of cancers using cells from immune systems, either the native cells or ge-
netically engineered ones. Cells of immune systems may be cultured ex
vivo and genetically modified to express cytokines, receptors, and chime-
ric tumor-antigen receptors for cancer immune therapy. T cells that have
been engineered to express a chimeric T cell receptor with a single-chain
variable fragment (scFv) and a high affinity for tumor-associated antigen
(TAA), called chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells, have been used
successfully to recognize and kill tumor cells.38
Cell therapy, with its initial clinical success and great promise in can-
cer treatment, still faces major challenges. These are not only in produc-
ing a large number of cells and engrafting them at the target site, but also
in cell isolation, expansion, and final preparation as a drug product. The
challenge is especially acute in the autologous (from patient) applications
that require a large number of cells. Without the economy of scale of pro-
duction, manufacturing a large number of doses runs the cost of goods
for those autologous treatments exceedingly high. Even for allogeneic
(from external donor) applications, many challenges await cell culture bi-
oprocess technologists in bringing the field forward. The manufacturing
process must generate cells of high viability and therapeutic activity. This
is in contrast to the production of protein therapeutics, in which the cell
viability at the end of a fed-batch process is sometimes only somewhat
higher than 50%. The recovery of those highly active cells for cell therapy
poses another challenge. Unlike the production of protein biologics, in
which the product can be subjected to various salts, pHs, and osmolal-
ity conditions that are considered abusive to cells, cells for cell therapy
can only be subjected to a minimal number of steps while achieving the
necessary degree of purification. Therefore, many challenges in process
technology are yet to be overcome in the wide applications of cell therapy.
Industrial Cell Lines
C ell lines have been used for the industrial production of human
and veterinary vaccines for more than half a century. For human vi-
ral vaccine production, human diploid cell strains (MRC-5 in particular)
are the preferred cell substrate. Traditional viral vaccines consist of whole
virus particles where the viral genome is packaged in the virus particle
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Et cet immense os frontal de M. Kurtz !… On dit que le poil parfois
continue de pousser ; mais la calvitie de ce… de ce spécimen était
impressionnante. La sauvagerie l’avait caressé sur la tête, et celle-ci
était devenue pareille à une boule, à une boule d’ivoire… Elle l’avait
caressé, et il s’était flétri ; elle l’avait saisi, aimé, étreint, elle s’était
glissée dans ses veines, elle avait consumé sa chair et avait scellé
son âme à la sienne par les indicibles sacrements de je ne sais
quelle initiation diabolique. Il était son favori, choyé et chéri… De
l’ivoire ! Ah, je pense bien… Des tas, des montagnes d’ivoire… La
vieille baraque de glaise en éclatait !… On eût juré qu’il ne restait
plus une seule défense dans le pays, ni sur le sol ni en dessous… —
Pour la plus grande partie fossile, — avait déclaré le Directeur d’un
ton de dénigrement. Il n’était pas plus fossile que moi, mais on
l’appelle fossile quand il a été déterré. Il paraît que ces nègres
enfouissent parfois leurs défenses ; mais apparemment ils ne les
avaient pas enterrées assez profondément pour épargner à l’habile
M. Kurtz sa destinée. Nous en remplîmes le vapeur et il fallut en
outre en empiler un tas sur le pont. Tant qu’il lui fut donné de voir, il
put ainsi contempler et se congratuler, car le sentiment de sa fortune
persista en lui jusqu’à la fin. Il vous eût fallu l’entendre dire : « Mon
Ivoire ». Oh oui ! je l’ai entendu. Ma Fiancée, mon ivoire, ma station,
mon fleuve, mon… — tout en fait était à lui. J’en retenais ma
respiration, comme si je m’étais attendu à ce que la sauvagerie
éclatât d’un rire prodigieux qui eût secoué sur leur axe les étoiles
immobiles. Tout lui appartenait, — mais ce n’était là qu’un détail.
L’important, c’était de démêler à qui il appartenait, lui ; combien de
puissances ténébreuses étaient en droit de le réclamer. Ce genre de
réflexions vous faisait froid dans le dos. Quant à deviner, c’était
impossible et du reste malsain. Il avait occupé une place si élevée
parmi les démons de ce pays, — et je l’entends au sens littéral. Vous
ne pouvez pas comprendre… Et comment comprendriez-vous, vous
qui sentez le pavé solide sous vos pieds, entourés que vous êtes de
voisins obligeants prêts à vous applaudir ou à vous tomber dessus,
vous qui cheminez délicatement entre le boucher et le policeman,
dans la sainte terreur du scandale, des galères et de l’asile
d’aliénés ; comment imagineriez-vous cette région des premiers
âges où ses pas désentravés peuvent entraîner un homme, à la
faveur de la solitude absolue, de la solitude, sans policeman !…, à
force de silence, de ce silence total où le murmure d’aucun voisin
bien intentionné ne se fait l’écho de ce que les autres pensent de
vous… C’est de ces petites choses-là qu’est faite la grande
différence… Qu’elles disparaissent et vous aurez à faire fond sur
votre propre vertu, sur votre propre aptitude à la fidélité. Bien
entendu, vous pouvez être trop sot pour risquer d’être dévoyé, trop
borné même pour soupçonner que vous êtes assailli par les
puissances des ténèbres. Je tiens que jamais imbécile n’a vendu
son âme au diable ; l’imbécile est trop imbécile ou le diable trop
diable, je ne sais lequel. Ou encore, vous pouvez être une créature
éblouie d’exaltation au point d’en demeurer aveugle et sourd à tout
ce qui n’est pas visions ou harmonies célestes. La terre dès lors
n’est plus pour vous qu’un endroit de passage, et qu’à ce compte, il
y ait perte ou gain, je n’ai pas la prétention d’en décider… La plupart
d’entre nous cependant ne sont ni de ceux-ci ni de ceux-là… Pour
nous, la terre est un endroit où il nous faut vivre, nous accommoder
de visions, d’harmonies et d’odeurs aussi, parbleu !… — respirer de
l’hippopotame crevé et n’en pas être empoisonné !… Et c’est là que
la force personnelle entre en jeu. La confiance où vous êtes d’arriver
à creuser des fosses pas trop voyantes où enfouir des choses…, —
votre faculté de dévouement, non pas à vous-même, mais à quelque
obscure et exténuante besogne… Et c’est assez malaisé. Notez que
je n’essaie ni d’excuser, ni d’expliquer ; je tente seulement de me
rendre compte pour… pour M. Kurtz, pour l’ombre de M. Kurtz. Ce
fantôme initié, surgi du fond du Néant, m’honora d’une confiance
surprenante avant de se dissiper définitivement. Tout simplement
parce qu’il pouvait parler anglais avec moi. Le Kurtz en chair et en
os avait reçu une partie de son éducation en Angleterre, et —
comme il eut la bonté de me le dire, — ses sympathies restaient
fixées au bon endroit. Sa mère était à demi-Anglaise, son père, à
demi-Français… Toute l’Europe avait collaboré à la confection de
Kurtz, et je ne tardai pas à apprendre qu’avec beaucoup d’à-propos,
la Société Internationale pour la Suppression des Coutumes
Barbares l’avait chargé de faire un rapport destiné à l’édification de
cette Compagnie. Et il l’avait écrit, ce rapport ! Je l’ai vu. Je l’ai lu.
C’était éloquent, vibrant d’éloquence, mais je le crains, un peu trop
sublime. Il avait trouvé le temps d’y aller de dix-sept pages d’écriture
serrée. Mais sans doute était-ce avant que sa… — mettons avant
que ses nerfs se fussent détraqués et l’eussent amené à présider
certaines danses nocturnes, se terminant sur je ne sais quels rites
innommables dont ce que j’appris çà et là me fit conclure bien
malgré moi que c’était lui — lui, M. Kurtz — entendez-vous, qui en
était l’objet. Ah ! c’était un fameux morceau, ce rapport. Le
paragraphe de début, pourtant, à la lumière d’informations
ultérieures, m’apparaît à présent terriblement significatif. Il
commençait par déclarer que, nous autres blancs, au point de
développement où nous sommes parvenus, « nous devons
nécessairement leur apparaître (aux sauvages) sous la figure d’êtres
surnaturels, — nous les approchons avec l’appareil d’une force
quasi divine, » et ainsi de suite. « Par le seul exercice de notre
volonté, nous pouvons mettre au service du bien une puissance
presque illimitée, etc., etc. ». C’est de là que, prenant son essor, il
m’entraîna à sa suite. La péroraison était magnifique, bien qu’assez
malaisée à retenir. Elle me donna l’impression d’une exotique
Immensité régie par une auguste Bienveillance. Elle me transporta
d’enthousiasme. J’y retrouvais le prestige sans limite de l’éloquence,
des mots, de nobles mots enflammés. Aucune suggestion pratique
qui rompît le magique courant des phrases, à moins qu’une sorte de
note, au bas de la dernière page, griffonnée évidemment bien plus
tard et d’une main mal assurée, ne dût être considérée comme
l’énoncé d’une méthode. Elle était fort simple et terminant cet
émouvant appel à tous les sentiments altruistes, elle éclatait,
lumineuse et terrifiante, comme le trait d’un éclair dans un ciel
serein : « Exterminer toutes ces brutes ». Le plus curieux, c’est qu’il
avait apparemment perdu de vue ce remarquable post-scriptum,
attendu que plus tard, lorsqu’il revint en quelque sorte à lui, il me pria
à plusieurs reprises de prendre soin de son « opuscule » (c’est ainsi
qu’il l’appelait) tant il était assuré qu’il aurait une heureuse influence
sur sa carrière. J’eus des renseignements complets sur toutes ces
choses ; en outre il advint que c’est moi qui eus à prendre soin de sa
mémoire. Ce que j’ai fait pour elle me donnerait le droit indiscutable
de la vouer, si tel était mon bon plaisir, à l’éternel repos du seau à
ordures du progrès, parmi toutes les balayures et — je parle au
figuré — tous les chiens crevés de la civilisation. Mais, voyez-vous,
je n’ai pas le choix. Il ne veut pas se laisser oublier. Quoi qu’il eût
été, il n’était pas banal. Il avait le don de charmer ou d’épouvanter à
ce point des âmes rudimentaires, qu’elles se lançaient en son
honneur dans je ne sais quelles danses ensorcelées : il avait le don
aussi de remplir les petites âmes des pèlerins d’amères méfiances ;
il avait un ami du moins et il avait fait la conquête d’une âme qui
n’était ni corrompue ni entachée d’égoïsme. Non, je ne puis l’oublier,
bien que je n’aille pas jusqu’à affirmer qu’il valût la vie de l’homme
que nous perdîmes en allant le chercher. Mon timonier me manqua
terriblement. Il commença à me manquer alors que son corps était
encore étendu dans l’abri de pilote. Peut-être trouverez-vous
passablement inattendu ce regret pour un sauvage qui ne comptait
guère plus qu’un grain de sable dans un noir Sahara. Mais, voyez-
vous, il avait servi à quelque chose ; il avait gouverné : pendant des
mois je l’avais eu derrière moi, comme une aide, un instrument. Cela
avait créé une sorte d’association. Il gouvernait pour moi : il me
fallait le surveiller. Je m’irritais de son insuffisance et ainsi un pacte
subtil s’était formé dont je ne m’aperçus qu’au moment où il fut
brusquement rompu. Et l’intime profondeur de ce regard qu’il me
jeta, en recevant sa blessure, est demeurée jusqu’à ce jour dans ma
mémoire, comme si, à l’instant suprême, il eût voulu attester notre
distante parenté.
« Pauvre diable ! Que n’avait-il laissé ce volet en paix ! Mais il
n’avait aucune retenue, aucun contrôle de soi-même — pas plus que
Kurtz ! Il était l’arbre balancé par le vent… Aussitôt que j’eus enfilé
une paire de pantoufles sèches, je le tirai hors de la cabine, après
avoir arraché la lance de son côté : opération que, — je l’avoue, —
j’accomplis les yeux fermés. Ses talons sautèrent sur le pas de la
porte ; ses épaules pesaient sur ma poitrine, je le tirais à reculons
avec une énergie désespérée. Ce qu’il était lourd ! lourd ! Il me
paraissait plus lourd qu’aucun homme ne l’avait jamais été !…
Ensuite, sans autre cérémonie, je le fis basculer par-dessus bord. Le
courant le saisit comme s’il n’eût été qu’une simple touffe d’herbes,
et je vis le corps rouler deux fois sur lui-même avant de disparaître
pour toujours. Tous les pèlerins à ce moment et le Directeur étaient
rassemblés sur l’avant-pont, autour de l’abri du pilote, jacassant
entre eux comme une bande de pies excitées, et ma diligence
impitoyable souleva un murmure scandalisé. J’avoue que je ne vois
pas pourquoi ils tenaient à conserver ce cadavre. Pour l’embaumer
peut-être ! Sur l’entrepont, cependant, un autre murmure avait couru,
fort significatif. Mes amis, les coupeurs de bois, étaient tout aussi
scandalisés et avec plus d’apparence de raison, bien que je n’hésite
pas à reconnaître que leur raison n’était guère admissible. Aucun
doute là-dessus ! Mais j’avais décidé que si mon timonier devait être
mangé, ce seraient les poissons seuls qui l’auraient. Durant sa vie il
n’avait été qu’un pilote médiocre, maintenant qu’il était mort, il
risquait de devenir une tentation sérieuse et, qui sait, de déchaîner
peut-être quelque saisissant incident. Au surplus, j’avais hâte de
reprendre la barre, car l’homme en pyjama rose se révélait
lamentablement en dessous de sa tâche.
« C’est ce que je m’empressai de faire dès que ces funérailles
furent terminées. Nous marchions à vitesse réduite en tenant le
milieu du courant, et je prêtais l’oreille au bavardage autour de moi.
Ils tenaient Kurtz pour perdu et la station aussi : Kurtz était mort, la
station probablement brûlée et ainsi de suite. Le pèlerin à cheveux
rouges s’exaltait à la pensée que ce pauvre Kurtz du moins avait été
dignement vengé. — « Hein ! nous avons dû en faire un fameux
massacre dans le bois. » Il en dansait littéralement, le sanguinaire
petit misérable !… Et il s’était presque évanoui à l’aspect de l’homme
blessé !… Je ne pus m’empêcher de dire : « Vous avez certainement
fait pas mal de fumée !… » Je m’étais aperçu, à la façon dont la cime
des taillis remuait et volait que presque tous les coups avaient porté
trop haut. Le moyen d’atteindre quoi que ce soit si vous ne visez ni
épaulez, et ces gaillards-là tiraient l’arme à la hanche et les yeux
fermés. La débandade, déclarai-je, et j’avais raison, était due
uniquement au bruit strident du sifflet à vapeur. Sur quoi ils
oublièrent Kurtz pour m’accabler de protestations indignées.
« Comme, debout près de la barre, le Directeur murmurait je ne
sais quoi, à voix basse, touchant la nécessité de redescendre un
bon bout du fleuve avant le coucher du soleil, par précaution,
j’aperçus de loin un endroit défriché sur la rive et la silhouette d’une
espèce de bâtiment. — « Qu’est-ce que c’est que ça ? » demandai-
je. De surprise, il se frappa les mains l’une contre l’autre. — La
station ! cria-t-il. Je piquai dessus, tout aussitôt, sans augmenter la
vitesse.
« Au travers de mes jumelles, je découvrais le penchant d’une
colline, garnie d’arbres espacés et dégagée de toute broussaille. Un
long bâtiment délabré apparaissait au sommet, à demi enfoui sous
les hautes herbes ; de grands trous, dans la toiture conique, béaient
tout noirs ; la brousse et la forêt formaient l’arrière-plan. Il n’y avait ni
clôture ni palissade d’aucune sorte, mais sans doute en avait-il
existé une autrefois, car près de la maison, une demi-douzaine de
minces poteaux demeuraient alignés, grossièrement équarris et
ornés à l’extrémité de boules sculptées. Les barreaux ou ce qui avait
dû les réunir, avaient disparu. Bien entendu, la forêt entourait le tout,
mais la berge était dégagée et au bord de l’eau j’aperçus un blanc,
sous un chapeau pareil à une roue de voiture, qui nous faisait signe
avec persistance de toute la longueur de ses bras. En examinant la
lisière de la forêt, j’eus la quasi-certitude d’y discerner des
mouvements ; des formes humaines glissant çà et là. Prudemment
je dépassai l’endroit, ensuite je stoppai les machines et me laissai
dériver. L’homme blanc sur la rive se mit à nous héler et à nous
presser de descendre. — « Nous avons été attaqués, » cria le
Directeur. — « Je sais, je sais, tout va bien ! » hurla l’autre du ton le
plus jovial. « Débarquez ! Tout va bien !… Je suis heureux !… »
« Son aspect me rappelait quelque chose, quelque chose
d’étrange que j’avais déjà vu quelque part. Tout en manœuvrant
pour accoster, je me demandais : à quoi donc ressemble-t-il ? Et tout
à coup je compris. Il avait l’air d’un arlequin… Ses vêtements étaient
faits de ce qui sans doute avait été autrefois de la toile brune, mais
ils étaient entièrement couverts de pièces éclatantes, bleues,
rouges, jaunes, — pièces dans le dos, sur le devant, sur les coudes,
aux genoux ; ganse de couleur au veston, ourlet écarlate au fond de
son pantalon ; et le soleil le faisait paraître extraordinairement gai et
propre en même temps, parce qu’on pouvait voir avec quel soin ce
rapiéçage avait été fait. La face imberbe et enfantine, très blond, pas
de traits pour ainsi dire, un nez qui pelait, de petits yeux bleus, force
sourires et froncements qui se succédaient sur cette physionomie
ouverte, comme l’ombre et la lumière sur une plaine balayée par le
vent. « Attention, capitaine ! » cria-t-il. « Il y a un tronc d’arbre qui
s’est logé ici la nuit dernière… » — « Quoi, encore un !… » J’avoue
que je lâchai un scandaleux juron. Peu s’en fallut que je
n’éventrasse mon rafiau pour finir cette charmante excursion.
L’arlequin sur la rive leva vers moi son petit nez camus : « Anglais,
fit-il, tout illuminé d’un sourire. — Et vous ? » hurlai-je de la barre. Le
sourire s’éteignit et il hocha la tête, comme pour s’excuser d’avoir à
me désappointer. Mais il s’éclaira à nouveau : « Peu importe ! »
continua-t-il d’un ton d’encouragement. Je demandai : « Arrivons-
nous à temps ?… » — « Il est là-haut, » répondit-il avec un geste de
la tête vers le sommet de la colline, et il s’assombrit subitement. Son
visage était pareil au ciel d’automne, tantôt couvert et tantôt éclatant.
« Quand le Directeur, escorté des pèlerins, tous armés jusqu’aux
dents, eut pénétré dans l’habitation, le gaillard monta à bord. « Dites
donc, ça ne me plaît guère. Les indigènes sont dans la brousse, »
fis-je… Il m’assura sérieusement que tout allait bien. — « Ce sont
des âmes simples, ajouta-t-il. Je suis content tout de même que
vous soyez arrivés… Il me fallait passer mon temps à les tenir à
distance… — Mais vous venez de me dire que tout allait bien !… »
m’écriai-je. — « Oh ! ils n’avaient pas de mauvaises intentions, » et
sous mon regard, il se reprit : « Pas de mauvaises intentions à
proprement parler… » Ensuite avec vivacité : « Ma foi, votre abri de
pilote a besoin d’un nettoyage !… » Et sans, reprendre haleine, il me
conseilla de garder assez de vapeur pour faire marcher le sifflet en
cas d’alerte : « Un bon coup de sifflet fera plus d’effet que tous vos
fusils !… Ce sont des âmes simples !… » répéta-t-il. Il s’exprimait
avec tant de volubilité que j’en étais étourdi. Il semblait vouloir
rattraper tout un arriéré de longs silences et, effectivement, il convint
en riant que tel était bien son cas. « Ne parlez-vous donc pas avec
M. Kurtz ? demandai-je. — Oh, on ne parle pas avec un homme
comme lui, on l’écoute… », s’écria-t-il avec une sévère exaltation. —
« Mais maintenant… » — Il agita le bras et en un instant se trouva
enfoncé dans l’abîme du découragement. D’un bond toutefois il en
émergea, prit possession de mes deux mains et les serra sans
arrêter, tout en bredouillant : « Collègue, marin… Honneur…
plaisir… délice… me présente moi-même… Russe… fils d’un
archiprêtre… Gouvernement de Tambov… Quoi ! du tabac ?… Du
tabac anglais ; cet excellent tabac anglais !… Ah, cela, c’est d’un
frère… si je fume ?… Quel est le marin qui ne fume pas… »
« La pipe lui rendit quelque calme, et peu à peu je démêlai que
s’étant échappé du collège, il s’était embarqué sur un navire russe,
s’était enfui à nouveau et avait servi pendant quelque temps sur des
navires anglais : qu’il était maintenant réconcilié avec l’archiprêtre…
Il insistait sur ce point. — « Mais quand on est jeune, on doit voir du
pays, acquérir de l’expérience, des idées, élargir son intelligence… »
« Même ici !…, » fis-je en l’interrompant. — « Sait-on jamais !… C’est
ici que j’ai rencontré M. Kurtz… » me répondit-il d’un ton de reproche
et d’enfantine solennité. Je tins ma langue désormais. Il paraît qu’il
avait amené une maison de commerce hollandaise de la côte à lui
confier des provisions, des marchandises et qu’il s’était enfoncé
dans l’intérieur d’un cœur léger, sans plus se soucier qu’un enfant de
ce qui pouvait lui arriver. Il avait erré sur le fleuve pendant près de
deux ans, seul, séparé de tout le monde et de toutes choses. — « Je
ne suis pas aussi jeune que j’en ai l’air. J’ai vingt-cinq ans,
m’expliqua-t-il. D’abord, le vieux Van Shuyten essaya de m’envoyer
au diable, contait-il avec un sensible amusement, mais je m’obstinai
et parlai, parlai tant et si bien qu’à la fin il eut peur que son chien
favori n’en fît une maladie, de sorte qu’il me donna une pacotille et
quelques fusils en me disant qu’il espérait bien ne plus me revoir.
Brave vieux Hollandais, ce Van Shuyten !… Je lui ai expédié un petit
lot d’ivoire il y a un an, ainsi il ne pourra me traiter de filou lorsque je
rentrerai. J’espère qu’il l’a reçu… Pour le reste, je m’en fiche…
J’avais préparé un tas de bois pour vous… C’était mon ancienne
maison. L’avez-vous vu ?… »
Je lui tendis le livre de Towson. Il faillit se jeter à mon cou, mais
se retint. — « Le seul livre qui me restât et je pensais l’avoir perdu,
fit-il en le considérant avec extase. Il y a tant d’accidents qui vous
guettent quand on circule ici seul… Les canots parfois chavirent, et
parfois aussi, il faut décamper si vite, quand les gens se fâchent… »
Il feuilletait les pages. — « Vous y avez fait des annotations en
russe », dis-je. Il fit oui de la tête. « J’avais cru qu’elles étaient
rédigées en chiffre… » — Il se mit à rire puis, avec sérieux : « J’ai eu
beaucoup de peine à tenir ces gens-là à distance… » — « Est-ce
qu’ils voulaient vous tuer ?… » demandai-je. — « Oh, non ! » fit-il et il
s’interrompit aussitôt. — « Pourquoi vous ont-ils attaqués ?… »
continuai-je. Il hésita ; puis avec une sorte de pudeur : « Ils ne
veulent pas qu’il s’en aille !… » fit-il. — « Pas possible », m’écriai-je
étonné. Il eut un nouveau hochement de tête plein de mystère et de
sagesse. — « Je vous le dis, reprit-il, cet homme a élargi mon
esprit. » Et il ouvrit les bras, tout grand, en me regardant de ses
petits yeux bleus, qui étaient parfaitement ronds.
III
« Je le considérai à mon tour, confondu d’étonnement. Il était là

devant moi, en habit bariolé, comme s’il venait de s’échapper d’une
troupe de baladins, enthousiaste et fabuleux. Le fait seul de son
existence était invraisemblable, inexplicable, complètement
déconcertant. Il était un de ces problèmes qu’on ne résout pas.
Impossible d’imaginer comment il avait vécu, comment il avait pu
parvenir si loin, comment il s’était arrangé pour y rester — pourquoi il
n’avait pas disparu incontinent. — « J’ai poussé un peu plus avant,
disait-il, et puis encore un peu plus, jusqu’au moment où je me suis
trouvé être allé si loin que je ne vois trop comment j’arriverai jamais
à revenir sur mes pas… Tant pis !… J’ai le temps. Je sais me
débrouiller… Mais emmenez vite Kurtz — vite, je vous le dis !… » —
L’enchantement de la jeunesse enveloppait ses haillons bigarrés,
son dénuement, sa solitude, la profonde désolation de ce stérile
vagabondage. Pendant des mois — des années ! — sa vie n’avait
tenu qu’à un cheveu, et il était là vivant, bravement, étourdiment
vivant et selon toute apparence indestructible, par la seule vertu de
ses jeunes années et de son audace irréfléchie. Je me prenais à le
considérer avec quelque chose comme de l’admiration, voire de
l’envie. Un enchantement l’entraînait ; un autre enchantement le
protégeait. Il n’attendait assurément rien de la sauvagerie que des
espaces où respirer, des étendues où s’enfoncer. Son unique besoin
était d’exister et de circuler en courant le plus de risques possibles,
avec le maximum de privations. Si jamais l’esprit d’aventure,
absolument pur, désintéressé et chimérique posséda un homme,
c’était bien cet adolescent tout rapiécé. Je lui enviai presque la
possession de cette claire et modeste flamme. Elle semblait avoir si
bien consumé en lui toute pensée personnelle que même durant
qu’il vous parlait, on oubliait que c’était à lui — cet homme-là,
présent, devant vous — que toutes ces choses étaient arrivées. Je
ne lui enviai pas toutefois sa dévotion pour Kurtz. Il n’avait pas
délibéré sur ce point. Elle était venue à lui, et il l’avait acceptée avec
une sorte d’ardent fatalisme. Je dois ajouter qu’à mes yeux, de
toutes les choses qu’il avait rencontrées, celle-là était bien la plus
dangereuse.
« Ils s’étaient accointés forcément, comme deux vaisseaux en
panne se rapprochent et finissent par frotter leurs coques l’une
contre l’autre… J’imagine que Kurtz éprouvait le besoin d’un
auditoire, attendu qu’une fois, tandis qu’ils étaient campés dans la
forêt, ils avaient passé toute la nuit à parler, — ou plus
vraisemblablement, c’était Kurtz qui avait parlé… — « Nous avons
parlé de tout, me dit-il, encore transporté à ce souvenir. J’en avais
oublié la notion même du sommeil. Cette nuit ne me parut pas durer
plus d’une heure… — De tout, de tout !… Et même d’amour… » « Il
vous parlait d’amour », fis-je fort surpris. — Il eut un cri presque
passionné. — « Oh, ce n’était pas ce que vous pensez !… Il parlait
d’une manière générale… Il m’a fait comprendre des choses, bien
des choses !… »
« Il leva les bras. Nous étions sur le pont à ce moment et le chef
de mes coupeurs de bois, étendu non loin, tourna vers lui son regard
lourd et brillant. Je jetai les yeux autour de moi, et je ne sais
pourquoi, mais je vous assure que jamais cette terre, ce fleuve, cette
brousse, l’arc même de ce ciel enflammé ne m’apparurent plus
sombres et plus désespérés, plus impénétrables à tout sentiment,
plus impitoyables à toute faiblesse humaine. — « Et depuis lors, fis-
je, vous êtes demeuré avec lui, naturellement ?… »
« Point du tout. Il paraît que leurs relations avaient été très
intermittentes pour diverses raisons. Il lui était arrivé, ainsi qu’il me
l’apprit avec orgueil, de soigner Kurtz durant deux maladies de celui-
ci (et il parlait de cela comme on ferait d’un exploit plein de
risques…) mais, généralement, Kurtz errait seul dans les
profondeurs de la forêt. « Souvent, quand je me rendais à cette
station, il m’a fallu passer des jours et des jours à attendre qu’il
revînt », dit-il, « et cela valait la peine d’attendre, parfois !… » —
« Que faisait-il ?… De l’exploration… », demandai-je. — « Bien
sûr ! » Il avait découvert des tas de villages et même un lac. Mon
homme ne savait pas exactement dans quelle direction, car il était
dangereux de poser trop de questions, mais la plupart des
expéditions de Kurtz pourtant avaient l’ivoire pour objet. —
« Toutefois, objectai-je, il ne devait plus avoir de marchandises à
troquer. » Il détourna les yeux : « Oh, même à l’heure actuelle, il
reste pas mal de cartouches !… » — « Appelons les choses par leur
nom, fis-je. Il razziait simplement le pays ?… » Il fit oui de la tête. —
« Il n’était pas seul sûrement… » Il bredouilla quelque chose au sujet
des villages autour de ce lac. — « Kurtz, n’est-ce pas, suggérai-je,
se faisait suivre par la tribu… » Il témoigna quelque embarras. —
« Ils l’adoraient, » fit-il. Le ton de ces paroles était si extraordinaire
que je le considérai avec attention. La répugnance qu’il éprouvait à
parler de Kurtz se mêlait curieusement en lui au besoin de raconter.
L’homme remplissait sa vie, occupait toutes ses pensées,
commandait ses émotions : « Que voulez-vous ! » éclata-t-il. « Il est
arrivé ici avec l’éclair et le tonnerre à la main : jamais ces gens
n’avaient rien vu de pareil, ni d’aussi terrible. Car il pouvait être
terrible !… Impossible de juger M. Kurtz comme on ferait d’un
homme quelconque. Non, mille fois non !… Tenez — rien que pour
vous donner une idée, un jour, je n’hésite pas à vous le dire, il a
voulu me tirer dessus… mais je ne le juge pas !… » — « Tirer sur
vous, m’écriai-je. Et pourquoi ?… » — « Oh, j’avais un petit lot
d’ivoire que m’avait donné le chef du village, près de ma maison.
J’avais l’habitude, voyez-vous, de tirer du gibier pour eux. Eh bien, il
a prétendu l’avoir et rien ne l’en a fait démordre. Il a déclaré qu’il me
fusillerait à moins que je ne lui donnasse l’ivoire et que je ne
déguerpisse ensuite, attendu qu’il en avait le pouvoir et l’envie par
surcroît, et qu’il n’y avait rien au monde qui pût l’empêcher de tuer
qui bon lui semblait. Et c’était vrai… Je lui donnai l’ivoire. Cela
m’était bien égal. Mais je ne déguerpis pas. Non, je n’aurais pu le
quitter… Il me fallut être prudent, bien entendu jusqu’au moment où
nous fûmes amis de nouveau, pour un temps. C’est alors qu’il eut sa
seconde maladie. Ensuite, j’eus à me tenir à l’écart, mais je ne lui en
voulais pas. Il passait la plus grande partie de son temps dans ces
villages sur le lac. Quand il regagnait le fleuve, parfois il s’attachait à
moi ; parfois aussi, il valait mieux pour moi garder mes distances.
Cet homme souffrait trop. Il détestait toutes choses ici, et pour je ne
sais quelle raison, il ne pouvait s’en détacher. Quand j’en eus
l’occasion, je le suppliai encore de s’en aller, alors qu’il en était
temps encore. Je lui offris de rentrer avec lui. Il acceptait et n’en
demeurait pas moins ici. Il partait pour une autre chasse à l’ivoire,
disparaissait pendant des semaines, s’oubliait parmi ces gens —
oui, s’oubliait lui-même, comprenez-vous !… » — « Quoi, il est fou ! »
fis-je. Il protesta avec indignation. M. Kurtz ne pouvait être fou. Si je
l’avais entendu parler, il y a deux jours seulement, je n’aurais osé
risquer une telle supposition… J’avais pris mes jumelles tandis qu’il
parlait, et j’inspectais la rive, fouillant des yeux la lisière de la forêt
de chaque côté de la maison et derrière celle-ci. Le sentiment qu’il y
avait des yeux dans cette brousse — si silencieuse, si tranquille,
aussi silencieuse et tranquille que la maison en ruines, sur le
sommet de la colline — me mettait mal à l’aise. Pas la moindre trace
sur la face des choses de l’extraordinaire histoire qui m’était moins
contée que suggérée par ces exclamations désolées, ces
haussements d’épaules, ces phrases interrompues, ces allusions
finissant sur de profonds soupirs. La forêt demeurait impassible,
comme un masque ; épaisse comme la porte close d’une prison, elle
regardait d’un air de sagesse secrète, de patiente attente,
d’inaccessible silence. Le Russe m’expliquait que Kurtz n’avait
regagné le fleuve que depuis peu, ramenant avec lui tous les
guerriers de cette tribu lacustre. Il était resté absent pendant
plusieurs mois, — à se faire adorer, je suppose !… — et était rentré
à l’improviste, méditant selon toute apparence quelque raid de
l’autre côté du fleuve ou en aval. Évidemment le désir d’avoir un peu
plus d’ivoire l’avait emporté sur — comment dirai-je !… — sur de
moins matérielles aspirations… Cependant son état de santé avait
empiré brusquement. — « J’appris qu’il était couché, privé de tous
soins : aussi j’accourus et risquai le coup…, dit le Russe. Oh, il est
bas, il est très bas !… » Je dirigeai la lorgnette vers la maison. Aucun
signe de vie : je n’apercevais que le toit croulant, la longue muraille
de boue au-dessus des hautes herbes, avec trois trous en guise de
fenêtres et dont aucun n’était pareil à son voisin ; tout m’apparaissait
comme à portée de main, eût-on dit. Et tout à coup un geste
m’échappa, et l’un des derniers poteaux qui subsistassent de la
clôture évanouie disparut subitement du champ de ma vision. J’avais
été frappé de loin, vous vous en souvenez, par certains essais de
décoration que rendait d’autant plus remarquable l’état de
délabrement du lieu. Il venait de m’être donné de les considérer de
plus près et l’effet immédiat avait été de me faire rejeter la tête en
arrière, comme pour éviter un coup ! L’un après l’autre, j’examinai
soigneusement chacun des poteaux avec mes jumelles, et mon
erreur m’apparut. Ces boules rondes étaient non pas ornementales,
mais symboliques ; elles étaient, expressives et déconcertantes à la
fois, saisissantes et troublantes, nourriture pour la pensée, pour les
vautours aussi, s’il y en avait planant dans le ciel, nourriture en tout
cas pour les fourmis assez avisées pour grimper aux montants. Elles
auraient été plus impressionnantes encore, ces têtes fichées sur des
pieux, si le visage n’en avait été tourné du côté de la maison. Une
seule, la première que j’eusse remarquée, me faisait face. Je ne fus
pas aussi écœuré que vous pouvez croire. Le recul que j’avais eu
n’était en réalité qu’un mouvement de surprise. Je m’étais attendu
somme toute à trouver là une boule de bois. Délibérément, je
ramenai mon regard vers la première qui m’était apparue : noire,
sèche et recroquevillée, la tête aux paupières closes était toujours
là, comme endormie au bout de son pieu, et même, avec ses minces
lèvres retroussées, laissant voir l’étroite ligne blanche des dents, elle
avait l’air de sourire, d’un sourire perpétuel, au rêve hilare et sans fin
de l’éternel sommeil.
« Je ne divulgue aucun secret commercial. En fait, le Directeur
me dit plus tard que les méthodes de M. Kurtz avaient ruiné le
district. Je n’ai point d’opinion sur ce point, mais je tiens à marquer
clairement qu’il n’y avait rien d’avantageux dans la présence de ces
têtes. Elles témoignaient simplement que M. Kurtz était dénué de
retenue dans la satisfaction de ses divers appétits, que quelque
chose lui manquait, une pauvre petite chose qui, lorsque le besoin
s’en faisait sentir, se cherchait en vain parmi tant de magnifique
éloquence. Qu’il se rendît compte de cette lacune, je ne saurais le
dire. Je crois qu’il en eut le sentiment vers la fin, presque à son
dernier moment. La sauvagerie, elle, n’avait guère tardé à le percer
à jour et s’était terriblement revanchée de la fantastique invasion. Il
m’apparaît qu’elle lui avait chuchoté à l’oreille certaines choses sur
lui-même qu’il ignorait, dont il n’avait pas le moindre soupçon, avant
d’avoir pris conseil de la grande solitude — et le chuchotement
s’était révélé irrésistiblement fascinateur. L’écho avait été d’autant
plus profond en M. Kurtz qu’il était creux à l’intérieur… J’abaissai la
lorgnette, et la tête qui m’était apparue si proche que j’aurais pu,
pour ainsi dire, lui adresser la parole, disparut loin de moi dans
l’inaccessible distance.
« L’admirateur de M. Kurtz était un peu penaud. D’une voix
rapide et indistincte, il m’assura qu’il n’avait pas osé enlever ces…
ces… — disons, ces symboles… Ce n’est pas qu’il eût peur des
indigènes : ils n’auraient pas bougé, à moins que M. Kurtz ne leur fît
signe. Son ascendant sur eux était extraordinaire. Le campement de
ces gens entourait toute la station et chaque jour, les chefs venaient
le voir. Ils s’avançaient en rampant… « Je ne tiens pas à savoir quoi
que ce soit du cérémonial usité pour approcher M. Kurtz !… » criai-
je. Curieux, j’eus l’impression que ces détails seraient moins
supportables que la vue des têtes qui séchaient sur des pieux en
face des fenêtres de M. Kurtz… Après tout, ce n’était là qu’un
spectacle barbare, et dans cette obscure région de subtiles horreurs,
où d’un bond j’avais été transporté, la simple sauvagerie, affranchie
de toute complication, apportait du moins le réconfort réel d’une
chose qui avait le droit d’exister — notoirement à la lumière du jour.
Le jeune homme me regarda avec surprise. J’imagine qu’il ne lui
était pas venu à l’esprit que M. Kurtz n’était pas une idole pour moi.
Il oubliait que je n’avais entendu aucun de ses splendides
monologues… sur quoi donc !… ah, oui ! sur l’amour, la justice, la
conduite de la vie, que sais-je encore… S’il fallait ramper devant M.
Kurtz, il rampait comme le plus sauvage d’entre ces sauvages. Je ne
me rendais pas compte des circonstances, fit-il. Ces têtes étaient
celles de rebelles. Je le surpris considérablement en me mettant à
rire. Rebelles ! Quelle était la prochaine qualification que j’allais
entendre ? Il y avait déjà eu ennemis, criminels, ouvriers ; ceux-ci
étaient des rebelles. Ces têtes rebelles pourtant avaient un air bien
soumis au bout de leur bâton. — « Vous ne soupçonnez pas à quel
point une telle existence met à l’épreuve un homme comme M.
Kurtz !… », s’écria le dernier disciple de M. Kurtz. — « Eh bien, et
vous ?… » fis-je. — « Moi ! Oh, moi, je ne suis qu’un pauvre
diable !… Je n’ai point d’idées… Je n’attends rien de personne…
Comment pouvez-vous me comparer à… » L’excès de son émotion
l’empêchait de parler ; il s’arrêta court. « Je ne comprends pas,
gémit-il. J’ai fait de mon mieux pour le garder en vie et cela me suffit.
Je n’ai pas eu de part dans tout cela… Je suis une âme simple…
Depuis des mois, ici, il n’y a pas eu le moindre médicament, pas une
bouchée de quoi que ce soit à donner à un malade… Il a été
honteusement abandonné… Un homme comme lui et avec de telles
idées… Honteux, oui, c’est honteux… Et je… je n’ai pas fermé l’œil
ces dix dernières nuits !… »
« Sa voix se perdit dans le calme du soir. Les ombres allongées
de la forêt avaient glissé jusqu’au bas de la colline, tandis que nous
parlions, dépassant la baraque croulante et la rangée symbolique de
poteaux. La pénombre à présent enveloppait tout cela, cependant
que nous étions encore dans la clarté du soleil, et que le fleuve, en
face de là, brillait toujours d’une éclatante et tranquille splendeur que
bordait, au long de la rive et au-dessus d’elle, une bande obscure et
ombragée. Pas une âme sur la berge. La brousse n’avait pas un
frémissement.
« Et tout à coup, tournant l’angle de la maison, un groupe
d’hommes apparut, comme surgi de terre. Ils avançaient enfoncés
jusqu’à mi-corps dans les hautes herbes, formés en bloc compact et
portant au milieu d’eux une civière improvisée. A l’instant, dans le
vide du paysage, une clameur s’éleva, dont l’acuité perça l’air
immobile ainsi qu’une flèche pointue volant droit au cœur du pays, et
comme par enchantement, un torrent d’êtres humains nus, avec des
lances dans leurs mains, avec des arcs, des boucliers, des yeux
féroces et des gestes sauvages, fut lâché dans la clairière par la
sombre et pensive forêt. La brousse trembla. Les hautes herbes un
instant s’inclinèrent, et ensuite tout demeura coi dans une attentive
immobilité.
— « Et maintenant, s’il ne dit pas le mot qu’il faut, nous sommes
tous fichus… » fit le Russe à mon oreille. Le groupe d’hommes avec
la civière s’était arrêté, lui aussi, comme pétrifié, à mi-chemin du
vapeur. Par-dessus les épaules des porteurs, je vis l’homme de la
civière se mettre sur son séant, décharné et un bras levé. —
« Espérons, fis-je, que l’être qui sait si bien parler de l’amour en
général trouvera quelque raison particulière de nous épargner cette
fois !… » J’étais amèrement irrité de l’absurde danger de notre
situation, comme si d’être à la merci de cet affreux fantôme eût été
quelque chose de déshonorant. Je n’entendais pas un son, mais —
au travers de mes jumelles, je distinguais le bras mince
impérieusement tendu, la mâchoire inférieure qui remuait et les yeux
de l’apparition brillant obscurément, enfoncés dans cette tête
osseuse que de grotesques saccades faisaient osciller. Kurtz, Kurtz,
cela signifie court en allemand, n’est-ce pas ?… Eh bien, le nom
était aussi véridique que le reste de sa vie, que sa mort même. Il
paraissait avoir sept pieds de long au moins. Il avait rejeté sa
couverture et son corps atroce et pitoyable en surgissait comme d’un
linceul. Je voyais remuer la cage de son thorax, les os de son bras
qu’il agitait. Il était pareil à une vivante image de la mort, sculptée
dans du vieil ivoire, qui aurait tendu la main, d’un air de menace,
vers une immobile cohue d’hommes faits d’un bronze obscur et
luisant. Je le vis ouvrir la bouche toute grande : il en prit un aspect
extraordinairement vorace, comme s’il eût voulu avaler tout l’air,
toute la terre, tous les hommes devant lui. Une voix profonde en
même temps me parvint faiblement. Il devait crier à tue-tête !… Et
soudain, il s’écroula. La civière vacilla tandis que les porteurs
reprenaient leur marche en titubant, et presque en même temps, je
remarquai que la foule des sauvages se dissipait sans qu’aucun
mouvement de retraite fût nulle part perceptible, comme si la forêt
qui avait si subitement projeté ces créatures les eût absorbées à
nouveau, comme le souffle inhalé d’une longue aspiration.
« Quelques-uns des pèlerins, derrière la civière, portaient les
armes de Kurtz, deux fusils de chasse, Une carabine de gros calibre,
une autre, légère, à répétition, tous les tonnerres de ce vieux Jupiter.
Le Directeur, penché vers lui, tout en marchant, lui parlait bas à
l’oreille. On le déposa dans l’une des petites cabines, une espèce de
réduit où il y avait tout juste la place d’une couchette et d’une ou
deux chaises de camp. Nous lui avions apporté le courrier qui s’était
accumulé pour lui, et un monceau d’enveloppes déchirées, de lettres
ouvertes jonchait son lit. Ses mains fourrageaient faiblement parmi
tous ces papiers. Je fus frappé par le feu de ses yeux et la langueur
compassée de son expression. Ce n’était pas l’épuisement de la
maladie. Il ne semblait pas souffrir. Cette ombre avait l’air satisfait et
calme, comme si, pour le moment, elle se fût sentie rassasiée
d’émotions.
« Il froissa l’une des lettres et me regardant droit dans les yeux :
« Très heureux de vous rencontrer ! » fit-il. Quelqu’un lui avait écrit à
mon sujet. Toujours les recommandations ! Le volume du son qu’il
émettait sans effort, sans presque prendre la peine de remuer les
lèvres, me stupéfia. Quelle voix, quelle voix ! Elle était grave,
profonde, vibrante, et l’on eût juré que cet homme n’était même plus
capable d’un murmure… Pourtant, il lui restait encore assez de force
— factice, sans nul doute — pour risquer de nous mettre tous à deux
doigts de notre perte, comme vous allez le voir dans un instant.
« Le Directeur apparut silencieusement sur le pas de la porte. Je
me retirai incontinent et il tira le rideau derrière moi. Le Russe que
tous les pèlerins dévisageaient avec curiosité, observait fixement le
rivage. Je suivis la direction de son regard.
« D’obscures formes humaines se distinguaient au loin devant la
sombre lisière de la forêt, et au bord du fleuve, deux figures de
bronze, appuyées sur leurs hautes lances, se dressaient au soleil,
portant sur la tête de fantastiques coiffures de peau tachetée,
martiaux et immobiles, dans une attitude de statue. Et de long en
large, sur la berge, lumineuse, une apparition de femme se mouvait,
éclatante et sauvage.
« Elle marchait à pas mesurés, drapée dans une étoffe rayée et
frangée, foulant à peine le sol d’un air d’orgueil, dans le tintement
léger et le scintillement de ses ornements barbares. Elle portait la
tête haute ; ses cheveux étaient coiffés en forme de casque ; elle
avait des molletières de laiton jusqu’aux genoux, des brassards de fil
de laiton jusqu’aux coudes, une tache écarlate sur sa joue basanée,
d’innombrables colliers de perles de verre autour du cou, quantité de
choses bizarres, de charmes, de dons de sorciers suspendus à son
corps et qui étincelaient et remuaient à chacun de ses pas. Elle
devait porter sur elle la valeur de plusieurs défenses d’éléphants !
Elle était sauvage et superbe, les yeux farouches, magnifique ; son
allure délibérée avait quelque chose de sinistre et d’imposant. Et
parmi le silence qui était subitement tombé sur ce mélancolique
pays, l’immense sauvagerie, cette masse colossale de vie féconde
et mystérieuse, semblait pensivement contempler cette femme,
comme si elle y eût vu l’image même de son âme ténébreuse et
passionnée.
« Elle s’avança jusqu’à la hauteur du vapeur, s’arrêta et nous fit
face. Son ombre s’allongea en travers des eaux. Sa désolation, sa
douleur muette mêlée à la peur du dessein qu’elle sentait se
débattre en elle, à demi formulé, prêtait à son visage un aspect
tourmenté et tragique. Elle demeura à nous considérer sans un
geste, avec l’air, — comme la sauvagerie elle-même, — de mûrir on
ne sait quelle insondable intention. Une minute tout entière s’écoula
et puis elle fit un pas en avant. Il y eut un tintement faible, un éclat
de métal jaune, une ondulation dans ses draperies frangées et elle
s’arrêta, comme si le cœur lui eût manqué. Le jeune homme près de
moi grommela. Derrière mon dos les pèlerins chuchotaient. Elle
nous regardait comme si sa vie eût dépendu de l’inflexible tension
de son regard. Soudain elle ouvrit ses bras nus et les éleva, tout
droit, au-dessus de sa tête, comme dans un irrésistible désir de
toucher le ciel et en même temps l’obscurité agile s’élança sur la
terre et se répandant au long du fleuve, enveloppa le vapeur dans
une étreinte sombre. Un silence formidable était suspendu au-
dessus de la scène.
« Elle se détourna lentement, se mit à marcher en suivant la
berge et rentra à gauche dans la brousse. Une fois seulement, avant
de disparaître, elle tourna ses yeux étincelants vers nous.
— « Si elle avait fait mine de monter à bord, fit nerveusement
l’homme rapiécé, je crois bien que j’aurais essayé de l’abattre d’un
coup de fusil !… J’ai risqué ma peau chaque jour, toute cette
quinzaine, pour la tenir à l’écart de la maison. Une fois elle y est
entrée et quelle scène n’a-t-elle pas faite au sujet de ces haillons
que j’avais ramassés dans le magasin pour raccommoder mes
vêtements. Je n’étais pas présentable… Du moins, je pense que
c’est de cela qu’elle parla à Kurtz comme une furie, pendant une
heure, en me désignant de temps en temps… Je ne comprends pas
le dialecte de cette tribu… J’ai quelque idée que Kurtz ce jour-là —
heureusement pour moi — était trop malade pour se soucier de quoi
que ce soit, autrement il y aurait eu du vilain… Je ne comprends
pas… Non, tout cela me dépasse… Enfin, c’est fini, maintenant… »
« A ce moment, j’entendis la voix profonde de Kurtz derrière le
rideau. — « ME sauver !… Vous voulez dire, sauver l’ivoire… Ne
m’en contez pas… ME sauver !… Mais c’est moi qui vous ai
sauvés !… Vous contrariez tous mes projets pour le moment…
Malade, malade !… Pas si malade que vous aimeriez à le croire…
Tant pis… J’arriverai bien malgré tout à réaliser mes idées… Je
reviendrai… Je vous ferai voir ce qu’on peut faire… Avec vos
misérables conceptions d’épicier, vous vous mettez en travers de
mon chemin… Je reviendrai… Je… »
« Le Directeur sortit. Il me fit l’honneur de me prendre par le bras
et de me mener à l’écart. — « Il est très bas, vraiment très bas ! » fit-
il. Il crut nécessaire de pousser un soupir, mais négligea de paraître
affligé en proportion… « Nous avons fait ce que nous pouvions pour
lui, n’est-il pas vrai ?… Mais il n’y a pas à dissimuler le fait : M. Kurtz
a fait plus de tort que de bien à la Société, Il n’a pas compris que les
temps n’étaient pas mûrs pour l’action rigoureuse. Prudemment,
prudemment, — c’est là mon principe. Il nous faut être prudent
encore. Pour quelque temps ce district nous est fermé ; c’est
déplorable… Dans l’ensemble le commerce en souffrira. Je ne nie

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Cell Culture Bioprocess Engineering,

Second Edition Wei-Shou Hu (Author)

Engineering Principles in Biotechnology 1st Edition

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Bioprocess Engineering: Kinetics, Sustainability, and

Bioprocess Engineering for Bioremediation: Valorization

Advances in Bioprocess Engineering and Technology :

Telehealthcare Computing and Engineering Principles and

Advances in Computer Science for Engineering and

Advances in Computer Science for Engineering and

No claim to original U.S. Government works

International Standard Book Number-13: 978-1-4987-6285-4 (Paperback)

Library of Congress Cataloging-in-Publication Data

Names: Hu, Wei-Shou, 1951- author.

Visit the Taylor & Francis Web site at

and the CRC Press Web site at

1 Overview of Cell Culture Processes

2 Cell Biology for Bioprocessing

Lipid Metabolism 122

4 Product Quality and Process

5 Stoichiometry and the Kinetics of Cell Cultivation

6 Cell Line Development

7 Medium Design for Cell Culture Processing

Appendix A: Cell Culture Process Data Analysis

C ultured mammalian cells are the workhorse for the manufactur-

The discovery of cryopreservation for freezing animal sperm and lat-

Large stirred tank Immune (T, NK) cells,

Frog embryo Mouse Kinetic model ES cells

Polio vaccine FMD vaccine EPO

Ham’s F12 Bovine spongiform

Ultrafiltration Eagle Medium Continuous,

Figure 1.1. Milestones in cell culture technology.

Large stirred tank Immune (T, NK) cells,

Frog embryo Mouse Kinetic model ES cells

Differentiated Cell Lines

Differentiated Cells in Culture

Guiding Cell Differentiation in Vitro

designated 3T3-L1, can be induced to differentiate into adipocytes.26

Cell Culture as Process Technology

E arly cell culture explorations aspired to establish a biological

were used in human vaccine production, while interferon was produced

consists of proteins that are produced by recombinant DNA technology

Protein Molecules as Therapeutics

Table 1.2. Therapeutic Protein Biologics Produced in Non-Mammalian Hosts

Table 1.3. Non-Antibody Products Produced in Mammalian Cells*

*all listed produced in CHO cells

Panel 1.2. product and amplifying its copy number, the

Table 1.4. Therapeutic Antibody Products

Biosimilars and the Expanded Reach of

Panel 1.3. Biologics, Drugs, and Patents

Original Off-Patent Version

• Biologics (proteins) → • Biosimilars

Producing viruses for gene delivery is similar to producing viruses for

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Industrial Cell Lines

« Je le considérai à mon tour, confondu d’étonnement. Il était là

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