NỘI DUNG 1: THIẾT KẾ PRIMERS VÀ KIỂM TRA ĐỘ TIN CẬY CỦA

PRIMERS
Câu hỏi: Thiết kế 3 cặp primers để phát hiện 3 loài vi khuẩn khác nhau có thể gây hư hỏng
sản phẩm hoặc gây bệnh cho người. Mỗi loài vi khuẩn 1 cặp.
1. Salmonella
- Bước 1: Tìm bộ gene (1 phần hoặc hoàn toàn) của vi sinh vật muốn tìm trong thực phẩm
tại: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

- Bước 2: Vào mục “All Databases” chọn “Nucleotide”

- Bước 3: Nhập vào thanh “Search” tên vi sinh vật muốn tìm kiếm.
*Chú ý: Khi tìm tên vi sinh vật mong muốn, thêm vào “16S rRNA” ở phía trước tên loài
vi sinh vật đó. Vì để phát hiện sự hiện diện của 1 loài vi sinh vật bất kỳ, ta thường trích ly
và tìm trên đoạn gen 16S rRNA của chúng.
Sau khi nhấn “Search”, ta sẽ thấy xuất hiện một loạt các đoạn gen của vi khuẩn cần tìm

- Bước 4: Chọn đoạn gen mong muốn và nhấn vào “FASTA”

Sau khi nhấn vào “FASTA” sẽ xuất hiện giao diện như hình bên dưới, cho ta biết mã số,
tên gene, đoạn gene.

Mã số Tên gene
gene

Công cụ
phân tích

Đoạn gene

- Bước 5: Khi đã có đoạn gene mong muốn, ta tiến hành thiết kế primers
Truy cập https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi

- Bước 6: Ở khung “Enter accession, gi, or FASTA sequence” copy đoạn gen của vi sinh
vật hoặc FASTA vào:
- Bước 7: Điều chỉnh các thông số để tạo Primers (độ dài, nhiệt độ, độ đặc hiệu,…)

- Bước 8: Check “Show results in a new window” để xuất kết quả qua một trang mới.

- Bước 9: Click vào thanh “Get Primers”

- Chọn một cặp primer:

- Độ dài cặp mồi: 504

 Đoạn mồi xuôi (Forward Đoạn mồi ngược (Reverse
primer) primers)
Trình tự
GTTGGTGAGGTAACGGCTCA GTCAGTCTTTGTCCAGGGGG
nucleotide
Sợi mẫu Dương Âm
Độ dài đoạn mồi 20 20

Đoạn mồi bắt

228 731
đầu từ
Đoạn mồi kết
247 712
thúc
Nhiệt độ nóng
59.97 59.96
chảy

Nồng độ GC% 55.00 60.00

Self
4.00 3.00
complementarity

Self 3’
1.00 0.00
complementarity

- Bước 10: Kiểm tra độ tin cậy của primers:

a. Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software)
+ Vào website: http://insilico.ehu.eus/
+ Chọn công cụ “PCR Amplification”

+ Chọn tên VSV mình muốn kiểm tra bằng đoạn mồi/primers.

+ Nhập đoạn mồi/primers của mình vào thanh công cụ.

+ Ở thanh Microorganism chọn dòng cuối: “Apply to all….”

+ Ở cửa sổ: “Maximum length of bands” không cần điều chỉnh, do 3000 base pairs (đơn vị
chiều dài gene) là đủ lớn.

+ Chọn “Amplify” và chờ xem kết quả.

Kết quả trả ra sẽ cho ta biết đoạn primers/mồi của chúng ta đã thiết kế có công hiệu để xác
định các dòng VSV chúng ta mong muốn không.
Kết quả mô phỏng trước hình ảnh khi chúng ta chạy PCR và gel thành công.

Làm tương tự với 2 loài còn lại.

 2. Shigella
Đoạn gene của vi khuẩn Shigella đã chọn:

Thông tin cặp primers đã chọn:

- Độ dài của cặp mồi: 213

 Đoạn mồi xuôi (Forward Đoạn mồi ngược (Reverse
primer) primers)
Trình tự
GATGACCAGCCACACTGGAA GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT
nucleotide
Sợi mẫu Dương Âm
Độ dài đoạn mồi 20 20
Đoạn mồi bắt đầu
296 508
từ
Đoạn mồi kết
315 489
thúc
Nhiệt độ nóng
59.96 60.04
chảy
Nồng độ GC% 55.00 55.00
Self
4.00 4.00
complementarity
Self 3’
0.00 0.00
complementarity

- Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software):
3. Vibrio
Thông tin cặp primers đã chọn:

- Độ dài của cặp mồi: 323

Đoạn mồi xuôi (Forward Đoạn mồi ngược (Reverse

primer) primers)
Trình tự
AAGAAGCACCGGCTAACTCC GTTTACGGCGTGGACTACCA
nucleotide
Sợi mẫu Dương Âm
Độ dài đoạn mồi 20 20
Đoạn mồi bắt đầu
450 772
từ
Đoạn mồi kết
469 753
thúc
Nhiệt độ nóng
60.04 60.04
chảy
Nồng độ GC% 55.00 55.00
Self
4.00 5.00
complementarity
Self 3’
0.00 3.00
complementarity
- Kiểm tra độ tương thích của đoạn mồi trên phản ứng PCR (software):

Giải thích từng chức năng của các công cụ

1. NCBI website
Ở đầu trang sẽ có hộp tìm kiếm, chúng ta sẽ tìm bộ gene (1 phần hoặc hoàn toàn)
của vi sinh vật muốn tìm trong thực phẩm tại đây

Ở bên trái hộp tìm kiếm là một danh sách của tất cả cơ sở dữ liệu tìm kiếm. Tùy
thuộc vào thứ chúng ta muốn tìm kiếm mà ta chọn vào mục cần tìm.
Ở trung tâm của trang web:
“Submit”: Chúng ta có thể gửi thông tin vào cơ sở dữ liệu của NCBI.
“Download”: Chúng ta có thể tải dữ liệu từ NCBI về máy tính.
“Learn”: Mục này chứa các tài liệu hướng dẫn sử dụng, lớp học, hội thảo hướng dẫn cho
chúng ta cách sử dụng hiệu quả các chức năng của trang web NCBI.
“Research”: Mục này chứa các dự án nghiên cứu của NCBI để chúng ta có thể khám phá.
“Analyze”: Mục này chứa các công cụ phân tích số liệu như Amino Acid Explorer: Khám
phá các đặc tính, sự thay thế và chức năng của axit amin.
“Develop”: Mục này chứa các thư viện, tài nguyên, dữ liệu dành cho các kỹ sư lập trình.
Khi nhập và nhấn tìm kiếm, giao diện sẽ cho ta một loạt các thông tin về vi sinh vật ta cần
tìm: tên gene, mã số gene, định dạng gene.
+ GenBank: sẽ hiển thị tất cả thông tin về vi sinh vật bạn đã chọn.
+ FASTA: hiển thị tên, mã gen và đoạn nucleotide của vi sinh vật bạn đã chọn.

Mã số Tên gene
gene

Công cụ
phân tích

Đoạn gene
 2. Công cụ tạo mồi:
Đầu tiên chúng ta sẽ có 2 lựa chọn tùy vào nhu cầu tìm kiếm:
“Primers for target on one template”: Thiết kế mồi cho mục tiêu trên một mẫu.
“Primers common for a group of sequence”: Thiết kế mồi chung cho một nhóm
trình tự.

Điều chỉnh độ nóng chảy:

Min: nhiệt độ thấp nhất
Opt: nhiệt độ tối ưu
Max: nhiệt độ cao nhất
Max Tm difference: nhiệt độ giữ 2 mồi với nhau
- Có thể giữ nguyên mặc định của hệ thống phần mềm.
- Có thể điều chỉnh trong khoảng Min, Max, Opt trong khoảng 50-65oC
- Max Tm difference < 5oC
*Chú ý: Tm ưu tiên chọn mồi trong khoảng 59-61.

Điều chỉnh thông số độ đặc hiệu của đoạn mồi (Primer Pair Specificity Checking
Parameters)
- Specificity check (Kiểm tra độ đặc hiệu): Bật theo chế độ mặc định để cho phép tìm
kiếm đoạn mồi
- Search mode (Chế độ tìm kiếm): Automatic
- Database (Cơ sở dữ liệu): tùy theo sinh vật
- Organism (Sinh vật): tùy theo sinh vật
- Primer specificity stringency (Giới hạn bổ sung cho đoạn mồi): để theo mặc định của
phần mềm.
- Max target amplicon size (Kích thước khuếch đại của mục tiêu): 4000
* Điều này chỉ định kích thước bộ khuếch đại tối đa cho mục tiêu PCR được phát hiện bởi
Primer-BLAST. Nói chung, các mục tiêu không cụ thể sẽ ít được quan tâm hơn nếu kích
thước của chúng rất lớn do PCR kém hiệu quả hơn nhiều đối với các bộ khuếch đại lớn
hơn.
- Allow splice variants (Cho phép các biến thể của đoạn mồi): không check
* Nếu check sẽ cho phép xử lý các biến thể nối RNA Refseq khác và không ra đúng kết
quả mong muốn.
Phần 4: Trả lời các câu hỏi
4.1. Nhiệt độ tan chảy (melting temperature – Tm) tối ưu của các đoạn mồi chạy
PCR là bao nhiêu? Làm sao tăng hay giảm Tm?
- Tm tối ưu của các đoạn mồi chạy PCR thường nằm trong khoảng từ 50 – 65oC. Nhiệt độ
nóng của mồi trên 65oC dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác. Nhiệt độ quá thấp
thì sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều. Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh
lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm.
- Để có thể tăng giảm Tm:
+ Dựa theo công thức tính Tm , Tm=4 × ( G+C )+ 2× ( A +T ), ta có thể thấy được rằng nhiệt
độ nóng chảy của đoạn mồi phụ thuộc vào số lượng và thành phần các nu. Tăng nu sẽ tăng
Tm và ngược lại.
+ Thay đổi nồng độ muối trong phản ứng PCR để tăng hoặc giảm Tm. Vì các muối như
NaCl có thể giúp các ion tương tác giữa các nucleotide của đoạn mồi và làm tăng nhiệt độ
nóng chảy. Tóm lại, khi tăng nồng độ muối sẽ tăng Tm.
+ Tăng giảm mật độ GC trong chuỗi nucleotide vì một cặp G-C tạo ra ba liên kết hydro so
với A-T chỉ có hai liên kết hydro. Do đó mật độ cặp G-C càng nhiều thì cần càng nhiều
năng lượng hơn để phá vỡ các liên kết đó dẫn đến làm tăng nhiệt độ nóng chảy.
4.2. Ngoài chỉ số Tm thì khi chọn đoạn mồi chúng ta cần phải chú ý tới thông tin
nào? Và ý nghĩa của thông tin đó là gì?
- Độ dài của primer: Độ dài của primer nên nằm trong khoảng 15-30 base và tốt nhất là
trong khoảng 18-22 base. Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và
đủ ngắn để có thể gắn dễ dàng vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi.
- Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi
ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổ
sung. Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra.
+ Mồi xuôi: 3’ - 5’
+ Mồi ngược: 5’ - 3’
- GC%: hàm lượng GC nên nằm trong khoảng từ 50 đến 60%, vì nó ảnh hưởng đến Tm.
- Kẹp GC: Ở đầu 3’ của mồi nên kết thúc bằng G hoặc C để thúc đẩy sự liên kết. Đây được
gọi là “Clamp GC”. Các bazơ G và C có liên kết hydro mạnh hơn và giúp ổn định primer.
Chú ý không nên có quá nhiều G hoặc C lặp lại (ở đầu đoạn mồi 3’ không nên có nhiều
hơn 3 G hoặc 3 C), vì điều này có thể gây ra liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp
không đặc hiệu.
- Độ độc nhất (tính đặc hiệu) của đoạn mồi: Đoạn mồi nên được kiểm tra để đảm bảo rằng
nó không trùng với các chuỗi khác trong bộ gen.
- Độ chênh lệch Tm giữa cặp primers nên chênh nhau tối đa từ 2-5°C. Bởi vì chênh lệch
Tm quá lớn có thể dẫn đến sự không đồng nhất nhiệt độ trong quá trình, dẫn đến sự ưu
tiên của một cặp primer nào đó, do đó làm giảm hiệu quả của các primer còn lại. Nếu độ
chênh lệch Tm quá nhỏ, có thể dẫn đến sự hình thành các sản phẩm phụ.
- Nhiệt độ gắn mồi: Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi. Nhiệt độ gắn mồi
thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng phức
hợp lai giữa mồi và khuôn. Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu
nhiệt độ gắn mồi quá thấp. Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau: Ta
= 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9.
- Cấu trúc bậc 2 trong thiết kế mồi:
+ Hình thành hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiện tượng mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn
vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ và
làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn. Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp.
+ Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi.
Cần tránh điều này vì làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.
 NỘI DUNG 2: THỰC HÀNH TRÍCH LY DNA Ở VI KHUẨN
Sử dụng mô hình thực tế ảo từ website:
https://www.biointeractive.org/classroom-resources/bacterial-identification-virtual-lab
Phần 1: Mô tả cụ thể 3 bước đầu tiên trong quy trình
Chuẩn bị mẫu – Trích ly DNA
- Bước 1: Đeo găng tay cao su

- Bước 2: Lấy mẫu từ đĩa nuôi cấy

- Bước 3: Dùng que cấy vòng để lấy khuẩn lạc vi khuẩn từ mẫu có trong đĩa cho vào ống
ly tâm.

- Bước 4: Dùng micropipette vô trùng hút chất đệm chứa enzyme tiêu hóa phân giải
protein cho vào ống ly tâm chứa mẫu. Bỏ đầu hút vào thùng rác.

- Bước 5: Đậy nắp ống ly tâm. Ủ trong 3 giờ.

- Bước 6: Sau khi ủ chúng ta tiến hành vô hiệu hóa enzyme bằng bể điều nhiệt. Bỏ ống ly
tâm vào bể và đậy nắp bể.
- Bước 7: Sau khi ủ ở 100oC, các enzyme bị biến tính và bất hoạt. Đưa ống ly tâm đã ủ
nhiệt đặt vào máy ly tâm, bắt đầu ly tâm. Máy ly tâm sẽ loại bỏ các mảnh vụn của tế bào
ra khỏi mẫu của mình tạo thành cặn ở đáy ống.

- Bước 8: Lấy ống ly tâm ra khỏi máy. Lúc này phần cặn không mong muốn đã lắng dưới
đáy ống ly tâm, DNA mong muốn nổi phía trên.

- Bước 9: Dùng micropipette vô trùng hút phần chất lỏng có chứa DNA, bỏ phần cặn,
cho vào kit PCR.
 (1) Chạy PCR – PCR Amplification
- Bước 1: Dùng micropipette vô trùng hút dung dịch PCR Master mix vào ống kit có chứa
DNA, ngoài ra còn cho thêm vào ống chứa đối chứng âm (dung dịch khử ion vô trùng) và
đối chứng dương (dung dịch 16S rDNA).

- Bước 2: Cho 3 ống vào chạy PCR, quá trình sao chép DNA tự động sẽ bắt đầu. Thiết lập
chương trình chạy PCR:
* Điều khiển nhiệt độ được thiết lập như sau:
+ Bước ủ ban đầu: 95°C trong 10 phút.
+ 30 chu kỳ của trình tự các bước sau:
Nóng chảy: 95°C 30 giây: tách hai chuỗi DNA trong chuỗi xoắn kép bằng nhiệt độ.
Ủ: 60°C 30 giây: để các đoạn mồi liên kết với DNA sợi đơn. Lý do khiến hai chuỗi DNA
đã tách ra không kết hợp lại là do có quá nhiều đoạn mồi trong dung dịch. Do đó, nhiều
khả năng các chuỗi DNA sẽ liên kết với các đoạn mồi thay vì liên kết với nhau.
Kéo dài: 72°C 45 giây: cho phép DNA polymerase kéo dài chuỗi DNA sao chép bằng cách
tăng nhiệt độ lên.
=> Ba bước - tách các sợi, ủ mồi vào mẫu và tổng hợp các sợi mới—chỉ mất chưa đến hai
phút. Mỗi cái được thực hiện trong cùng một lọ. Khi kết thúc một chu kỳ, từng đoạn DNA
trong lọ đã được nhân đôi. Chu kỳ có thể được lặp lại 30 lần trở lên và mỗi đoạn DNA mới
được tổng hợp hoạt động như một khuôn mẫu mới. Sau 30 chu kỳ, 1 triệu bản sao của
đoạn DNA ban đầu có thể được tạo ra.
+ Bước kéo dài cuối cùng: 72°C 10 phút.
+ Bước cuối cùng: Bảo quản 4°C ở nhiệt độ này.
(2) Tinh sạch PCR – PCR Purification
- Bước 1: Chèn cột vi cô đặc (microconcentrater column) vào ống thu thập. Dùng pipet
hút 400 µL Buffer Solution vào ống thu thập chứa cột vi cô đặc.

- Bước 2: Hút sản phẩm PCR (~100 µL) từ ống đỏ sang cột vi cô đặc. Sau đó đóng
nắp
 - Bước 3: 3 Ống PCR được bảo quản lạnh.
- Bước 4: Ly tâm cột với tốc độ 3.000 vòng/phút trong máy ly tâm góc cố định trong
15 phút.

- Bước 5: Sau khi ly tâm xong. Đổi cột (thao tác đảo ngược) sang một ống mới.

Bước 6: Dùng micropipet hút 50 µL buffer solution

cho vào ống có cột đã đảo ngược và đậy nắp.

- Bước 7: Dùng ống chứa cột đảo ngược cho vào máy ly tâm cùng với counterbalance. Ly
với tốc độ 3.000 vòng/phút tâm trong 2p phút để thu mẫu vào ống thu. Bỏ cột.
Phần 2: So sánh cụ thể các bước làm với bộ kit trích ly trong phòng LAB sau đó
Quy trình định tính vi sinh vật bằng phương pháp PCR thực hiện trong phòng LAB:
(1) Chuẩn bị mẫu: Dùng 25g mẫu cho vào 225 ml Peptone water đã được tiệt trùng và
đem ủ trong vòng 12-24h.
(2) Trích ly DNA:
- Bước 1:
+ Hút 1 ml mẫu cho vào ống Eppendorf 1.5ml và ly tâm ở 13000 rpm trong 5 phút.
+ Bỏ phần dịch lỏng và cho vào ông ly tâm 200 µL PBS và 20 µL Pro.K
- Bước 2:
+ Hút thêm 200 µL CL vào ống Eppendorf
+ Vortex
+ Ủ ở 72oC trong 10 phút.
- Bước 3:
+ Hút thêm 200 µL Ethanol
+ Hút sang ống Silicagel
+ Ly tâm 13000 rpm trong 1 phút
+ Giữ cột
- Bước 4:
+ Hút thêm 500 µL WB1
+ Ly tâm ở 13000 rpm trong 1 phút
+ Giữ cột
- Bước 5:
+ Hút thêm 500 µL WB2
+ Ly tâm ở 13000 rpm trong 1 phút
+ Giữ cột
- Bước 6: Ly tâm 13000 rpm trong 1 phút
- Bước 7:
+ Chuyển cột Silicagel sang ổng 1.5ml mới và hút thêm 50 µL EB
+ Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng
+ Ly tâm 13000 rpm trong 1 phút
+ Giữ dịch, bỏ ổng silicagel và quan sát DNA
- Bước 8: Có thể sử dụng được ngay hoặc bảo quản dưới -20oC.
So sánh với quy trình định tính vi sinh vật bằng phương pháp PCR thực hiện trên máy
tính:
* Phần chuẩn bị mẫu - trích ly mẫu
- Mẫu trong phòng LAB tăng sinh trong môi trường đệm Pepton Water và ủ 12-24h so với
trên website là ủ trong dung dịch đệm enzyme và ủ trong vòng 3 giờ.
- Mẫu ở phòng LAB được ủ ở 72oC trong vòng 10 phút. Trên website mẫu được ủ ở 100oC
trong 15 phút.
- Mẫu ở phòng LAB được cho thêm các chất đệm khác như PBS, Pro.K, CL, Ethanol và
trải qua 2 lần ly tâm ở 13000rpm
* Chạy PCR
- Ở phòng LAB, tùy thuộc vào từng mẫu có cách điều chỉnh khác nhau cho phù hợp với
từng DNA.
Về mặt thời gian thì phương pháp trên trang web thường nhanh hơn do không cần tiến
hành chuẩn bị thiết bị và hóa chất. Tuy nhiên, độ chính xác của kết quả có thể không cao
bằng phương pháp trên bộ kit trong phòng LAB. Ngoài ra, phương pháp trên trang web
còn tiết kiệm chi phí hơn do không cần đầu tư vào các thiết bị và hóa chất.
Tóm lại, mỗi phương pháp trên đều có những ưu điểm và hạn chế riêng. Tùy vào mục đích
sử dụng và tiêu chí đánh giá, người dùng có thể chọn phương pháp phù hợp.

NỘI DUNG 3: CHẠY ĐIỆN DI

Phương pháp chạy điện di
Mô tả phương pháp chạy điện di agarose:
Phân tích các sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose và gửi mẫu để
tinh chế sản phẩm PCR và sắp xếp trình tự DNA
- Lấy 10μl hỗn hợp phản ứng PCR và thêm vào 2μl thuốc nhuộm tải 6x.
. Thuốc nhuộm tải (độ đậm đặc gấp 6 lần) bao gồm 30% glycerol với 0,25%
bromophenol blue (nghĩa là 25mg bromophenol blue trong 10ml 30% glycerol).
. Glycerol làm cho các mẫu đậm đặc hơn dung dịch đệm đang chạy (để chúng chìm vào
giếng) và màu xanh bromophenol là thuốc nhuộm theo dõi cho phép theo dõi chuyển động
của DNA qua gel.
- Cho mẫu vào các giếng của gel agarose 1% cùng với chất đánh dấu trọng lượng phân tử
DNA để ước tính kích thước.
- Sử dụng điện áp cho gel ở mức 100V và chạy trong khoảng 1 giờ.
- Tắt nguồn điện và lấy gel ra khỏi bình chứa.
- Đặt gel vào tài liệu gel và chụp ảnh các dải DNA. Chúng tôi sử dụng SYBR safe làm
chất nhuộm màu (do đó không cần nhuộm ethidium bromide), được trộn sẵn vào gel
agarose (không cần nhuộm sau).
- Phân tích gel và xác định mẫu phù hợp có thể tinh sạch và giải trình tự.
Trả lời các câu hỏi
a. Sẽ ra sao nếu chúng ta sử dụng hiệu điện thế quá lớn hay thời gian điện di quá
lâu?
Điện di DNA trên gel agarose ở điện thế cao sẽ sinh ra nhiệt. Khi điện di với điện thế cao
hơn 175V nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy
hình chữ S, không thể lấy được kết quả. Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời
gian dài có thể gây chảy miếng gel. Vì vậy, khi chạy điện di DNA trên agarose ở điện thế
cao, tránh dùng các loại agarose có điểm nóng chảy thấp và có thể ảnh hưởng đến các thiết
bị của máy điện di.
b. Yếu tố nào quyết định thời gian điện di?
- Kích thước phân tử: các phân tử DNA có kích thước lớn ( khối lượng phân tử lớn) thì
thời gian điện di càng lâu.
- Nồng độ argarose: Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ
khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
- Cấu hình DNA: Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng
(form-III) có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ
khác nhau.
- Điều kiện điện di: Nhiệt độ, áp suất, pH và các điều kiện khác có thể ảnh hưởng đến thời
gian điện di.
- Điều kiện kỹ thuật: Điều kiện kỹ thuật của thiết bị điện di (như điện cực, độ dày màng,
điện áp) cũng có thể ảnh hưởng đến thời gian điện di.
c. Các thuốc nhuộm nào được sử dụng để nhuộm: (1) DNA và (2) Gel trong chạy điện
di?
- Thuốc nhuộm được sử dụng để nhuộm (1) DNA
+ Ethidium bromide (EtBr)
+ Nhóm chất nhuộm SYBR® ( SYBR®Gold và SYBR®Safe )
+ Bộ đôi chất nhuộm GelRed™ và GelGreen™
- Thuốc nhuộm được sử dụng để nhuộm (2) Gel
+ Polyacrylamide
+ Agarose

NỘI DUNG 4: ĐỊNH DANH VSV

Hướng dẫn sử dụng “BLAST” để định danh vi sinh vật
- Bước 1: Hãy truy cập vào trang website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
- Bước 2: Chọn vào "Nucleotide BLAST".
- Bước 3: Sao chép và dán đoạn mã DNA của bạn vào ô "Enter query sequence"
- Bước 4: Mục "Choose search set", nhấp vào chấm "Others (nr etc.)" (các chấm khác là
để tìm kiếm chỉ đối với các cơ sở dữ liệu chuỗi DNA của con người hoặc chuột).
- Bước 5: Nhấp vào nút "BLAST" màu xanh nhạt ở dưới cùng trang để bắt đầu tìm kiếm.
Khi kết quả của bạn được xử lý, cuộn xuống trang để tìm chuỗi tương tự nhất.
- Bước 6: Nhấp vào "accession number" của chuỗi tương tự nhất để tìm hiểu thêm chi tiết
về nguồn gốc của nó.
Bài tập
Xác định vi khuẩn trong thực phẩm thông qua việc xây dựng chuỗi DNA. Bạn được giao
một dự án nghiên cứu để xác định vi khuẩn có mặt trong pho mát từ nhiều nhà sản xuất
bao gồm các công ty sản xuất pho mát đặc biệt. Bạn đã kiểm tra một số loại pho mát cho
chỉ số bảng chuẩn bằng một số loại agar không lựa chọn và thu được 4 loại vi khuẩn khác
nhau. Bạn thực hiện phản ứng Gram trên vi khuẩn và tìm thấy rằng có 2 loại cầu Gram
dương và 2 loại que Gram dương. Ở điểm này, bạn quyết định lấy một số đoạn mã DNA từ
vi khuẩn để xác định chi và loài của vi sinh vật. Bạn quyết định xác định chuỗi của gen
ribonucleic acid (RNA) 16s ribosomal vì đây là một phương pháp tiêu chuẩn cho việc xác
định. Các đoạn mã của 4 loại vi khuẩn là:
Vi khuẩn 1
cttgcaccatttgaagagcagcgaacgggtgagtaacgcgtgg
ggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataacaac
tttaaacataagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgt
tgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgag
agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta
gggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtt
ttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaa
gtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgtgcc
Vi khuẩn 2
gattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa
cctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaaga
accgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcg
tattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagag
gttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagg
gaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggcttt
cgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtg
acggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgcc

Vi khuẩn 3
gaaaggtgcttgcacctttcaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgga
caacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaactt
agtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggt
gcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgaga
gactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtag
ggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctt
tcgggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagttt
gacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgcc
Vi khuẩn 4
aagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcag
ctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgattttagttgc
cagcatttagttgggcactctaaagtgactgccggtgcaagccggaggaaggtggggatg
acgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatagtaca
aagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggattgt
aggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacg
gtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacc
cgaagtcggtagggtaacctttatggagccagccgccgaaggtgggacagataattggggtgaagtcgtaa
Trả lời câu hỏi
Vi khuẩn 1: Lactococcus cremoris
+ Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là
100%.
+ Lactococcus cremoris thường hiện diện ở những loại sản phẩm như bơ, sữa chua, rượu
và phô mai.
Vi khuẩn 2: Lacticaseibacillus paracasei
+ Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là
100%.
+ Lacticaseibacillus paracasei thường hiện diện ở những loại sản phẩm lên men từ sữa, rau
củ, quả, thịt và các sản phẩm probiotic, sữa chua và pho mát.
Vi khuẩn 3: Leuconostoc mesenteroides
+ Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là
100%.
+ Leuconostoc mesenteroides thường được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm, đặc biệt
là trong các sản phẩm lên men, thực phẩm chứa đường như mứt,… và các sản phẩm đóng
hộp.
Vi khuẩn 4: Listeria monocytogenes
+ Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là
100%.
+ Listeria monocytogens thường hiện diện ở những loại sản phẩm được chế biến ăn sẵn,
thịt gia cầm và thịt, rau củ, hải sản và sữa không xử lý đúng cách hoặc không thanh trùng,
phô mai (đặc biệt là các loại phô mai mềm) và kem.
iv. Nếu kết quả định danh của bạn đạt 90% mức độ giống với 1 loài nào đó thì có
đáng tin cậy không? Tại sao?
Mức độ giống nhau 90% trong kết quả định danh của một mẫu với một loài vi khuẩn cụ
thể thì không đáng tin cậy. Mức độ giống nhau trong phân tích chuỗi DNA được sử dụng
để xác định loài vi khuẩn là từ 97% trở lên.
Mức độ giống 90% có thể được coi là khá cao đối với việc định danh vi sinh vật, nhưng
đáng tin cậy của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả phương pháp
thử nghiệm được sử dụng và mục đích của việc định danh. Mặc dù kết quả định danh ở
90% là khá cao nhưng cần tiếp tục phân tích để định danh vi sinh vật một cách chính xác.