HET IN VITRO KWEKEN VAN DIERLIJKE CELLEN

INLEIDING

De belangstelling voor weefselkweek dateert uit het begin van de vorige eeuw. Deze belangstelling is
terug te voeren tot de algemene acceptatie van de celtheorie. De celtheorie houdt in dat de cel de
kleinste functionele eenheid van een organisme is. De Amerikaan Harrison was de eerste die er in
slaagde embryonaal zenuwweefsel van een kikker in kweek te houden. Harrison gebruikte echter een
bewerkelijke methode, de zgn. hangende druppel, waardoor het moeilijk was om op grote schaal cellen te
kweken en om aseptisch te werken. De Amerikaan Carrel introduceerde in 1912 het kweken van cellen in
kweekflessen. Op deze manier was het eenvoudiger om aseptisch te werken en om grote hoeveelheden
cellen te kweken. Van groot belang is ook geweest dat Carrel ontdekte dat door regelmatig het
kweekmedium te verversen de cellen lange tijd in leven zijn te houden. Zo slaagde hij er in om
bindweefselcellen van de kip 34 jaar in leven te houden.
In het algemeen spreken we van weefselkweek wanneer cellen, weefsels en (delen van) organen langer
dan 24 in vitro in leven gehouden kunnen worden en kunnen groeien. Hoe lang een kweek wordt
aangehouden is afhankelijk van het type cel en het doel van de kweek. Een lymfocytenkweek, met het
doel om chromosoomonderzoek te doen, kan maar 3 à 4 dagen in leven worden gehouden. Andere
celtypen kunnen langer in vitro in leven worden gehouden, variërend van enkele weken tot enkele maan-
den. Ook deze cellen blijven maar een beperkt aantal generaties in leven. Daarnaast zijn er cellen die
geïmmortaliseerd kunnen raken, d.w.z. dat ze in vitro onbeperkt in leven zullen blijven.

Enkele voordelen van weefselkweek zijn:

1) Het bestuderen van basale cellulaire processen zoals celdeling, celdifferentiatie,

celmetabolisme, interactie tussen cellen en invloeden van het milieu op cellen.
2) Een complex systeem (in vivo) teruggebracht tot een minder complex systeem (in vitro) is
eenvoudiger experimenteel te benaderen.
3) De mogelijkheid om de levensprocessen van een bepaald type cel te bestuderen zonder dat
de omringende weefsels of organen de cellen beïnvloeden.
4) Er is een veel grotere uniformiteit tussen de verschillende monsters genomen uit een
celkweek vergeleken met verschillende stukjes genomen uit een hoeveelheid weefsel.
5) Een schaalreductie: van een stof, bijv. een therapeuticum, waarvan de invloed op cellen wordt
bestudeerd, is maar weinig nodig.
6) Genetisch getransformeerde cellen kunnen op grote schaal worden gekweekt voor de productie van
allerlei stoffen.
7) Veel experimenten kunnen in eerste instantie m.b.v. celkweken worden uitgevoerd, zodat er minder
proefdieren nodig zijn. In veel gevallen zullen echter toch experimenten met proefdieren nodig zijn,
omdat een compleet organisme nu eenmaal anders reageert dan cellen en weefsels in vitro.

Afhankelijk van het materiaal dat wordt gekweekt kunnen we 3 typen kweek onderscheiden:
Orgaankweek:
Hierbij worden organen of delen van organen gekweekt waarbij de driedimensionale structuur en de
functies van het orgaan behouden blijven. Meestal gaat het om het kweken van embryonale orgaantjes.
Primaire explantaat kweek:
Kleine (< 0,5 mm) stukjes weefsel worden gekweekt. Meestal gaat het om materiaal dat maar in zeer
geringe hoeveelheden verkregen kan worden, bijv. door biopsie van humane organen.
Celkweek:
Bij dit type kweek gaat het om het kweken van losse cellen. Van het explantaat wordt eerst, mechanisch
of enzymatisch, een celsuspensie gemaakt en vervolgens in kweek gebracht. Celkweek kan op 2
manieren worden uitgevoerd: 1) 'monolayer' kweek, waarbij de cellen uitgroeien tot een laag die ca. 1
cel dik is, en 2) suspensie kweek, waarbij de cellen in suspensie in het medium blijven. Het kweken in
suspensie lukt in het algemeen alleen met lymfocyten en cellen van enkele type maligne tumoren.
DE KWEEKRUIMTE

Eén van de eerste vereisten van een weefselkweeklaboratorium is dat er uiterst hygiënisch gewerkt
wordt. Dit is noodzakelijk om contaminatie van de kweek met bacteriën, schimmels en virussen
te voorkomen. Micro-organismen vinden in het kweekmedium een uitstekende voedingsbodem. Bij het
niet tijdig ontdekken van een infectie kan deze, door het manipuleren met de cellen, over de hele
kweek verspreid worden. Het schoonmaken van een geïnfecteerde kweek is duur, tijdrovend en heeft
lang niet altijd succes, zodat de kweek alsnog weggegooid moet worden.
Hygiënisch werken is eveneens nodig om te voorkomen dat de mensen worden besmet. Dit kan
bijv. gebeuren bij het werken met pathogeen materiaal. Ook het werken met humane cellen en
cellen van andere primaten geven altijd een zeker risico, omdat ze geïnfecteerd kunnen zijn met
virussen.
In vitro kunnen cellen getransformeerd, eventueel tumorigeen, worden of geïnfecteerd raken met
virussen. Als deze cellen op de een of andere manier weer in het lichaam komen dan worden zij niet
als lichaamsvreemd herkend en worden dus niet vernietigd door het immuunsysteem.
Het weefselkweeklaboratorium moet een ruimte zijn die goed schoon te houden is en waar geen
doorgaand geloop is i.v.m. het opdwarrelen van stof. Vanzelfsprekend mag in de weefselkweekruimte
geen microbiologisch werk worden gedaan en mogen er geen proefdieren worden gehouden.
Men werkt veel in zgn. 'laminar air flow' kasten (Fig. 1). Het principe van een 'laminar air flow' kast is
dat door een stabiele, gefilterde luchtstroom (snelheid van 0,4 m/sec.) het werkgebied vrij wordt
gehouden van stof en andere verontreinigingen. De lucht wordt gefilterd door een zgn. Hepa ('high
efficiency particulate air') filter. Dit Hepa filter houdt 99,997% van alle partikels > 0,3 m tegen. Bij
een horizontale 'laminar air flow' kast is de luchtstroom stabiel en is het materiaal in de kast goed
beschermd. Degene die aan de kast werkt is echter niet beschermd. Bij de verticale 'laminar air flow'
kast is degene die aan de kast werkt ook goed beschermd.

Fig. 2. Horizontale (a) en verticale (b) 'laminar air flow' kast. Zwarte pijlen: niet-steriele lucht; witte pijlen:
steriele lucht. HEPA: 'high efficiency particulate air'.

2
Een speciaal type 'laminair air flow' kast is de 'biohazard' kast ('biological hazard' = biologisch gevaar)
(Fig. 2). Dit type kast bevat naast de Hepa filters voor de instromende lucht ook specialefilters om de
afgevoerde lucht te filtreren, zodat gevaarlijk materiaal niet in de omgeving kan komen. Er zijn
verschillende typen 'biohazard' kasten.
'Biohazard' kast klasse II wordt gebruikt bij het werken met:
- humane cellen en cellen van andere primaten (zijn mogelijk besmet met virussen).
- hybriden van humane cellen en dierlijke tumorcellen.
- carcinogeen materiaal.
'Biohazard' kast klasse III wordt gebruikt bij het werken met:
- pathogeen materiaal, bijv. materiaal verkregen door biopsie van patiënten met hepatitis B of AIDS.
- met virus geïnfecteerde humane cellen. Ook met andere cellen dan humane cellen die met virus
zijn geïnfecteerd moet men voorzichtig zijn: virussen kunnen interspecifiek zijn.

In de weefselkweekruimte kunnen zich ook de incubatiestoven en de werktafels voor het controleren

van de kweken bevinden. Opslagruimten voor gesteriliseerd materiaal, media e.d. moeten bij voorkeur
buiten de weefselkweekruimte liggen. Het schoonmaken en steriliseren van materiaal mag nooit in de
weefsel- kweekruimte gebeuren i.v.m. het gevaar van contaminatie en het produceren van veel
waterdamp bij het schoonmaken en nat steriliseren.
Verder mogen in een weefselkweekruimte geen proefdieren worden gehouden en mag er niet met
micro- organismen worden gewerkt.
Van belang is ook de persoonlijke hygiëne. Voor en na het werken met weefselkweek moeten altijd
de handen worden gewassen. Uiteraard niet eten en drinken tijdens het werk. Soms worden plastic
handschoenen, een mondmasker en een petje gedragen.

Fig. 2. 'Biohazard' kasten. a: Klasse II. Verticale 'laminar air flow', 70-80% van de lucht wordt
gerecirculeerd. De lucht die de kast verlaat wordt gefilterd door een Hepa-filter en een pathogeen-filter.
b en c: Klasse III. Afgesloten kast met handschoenen. De lucht wordt niet gerecirculeerd, maar verlaat
via filters de kast. Materiaal wordt via sluizen de kast in en uit gebracht.

3
KWEEKMEDIA

In vivo zijn cellen omgeven door een laagje weefselvloeistof dat allerlei stoffen bevat die van essentieel
belang zijn voor het leven van de cellen. Deze stoffen zijn o.a. water, ionen, aminozuren, eiwitten,
koolhydraten, lipiden, hormonen, vitaminen en zuurstof. De door de cellen uitgescheiden producten
van het metabolisme worden via de weefselvloeistof afgevoerd. Het milieu waarin de cellen in vivo
leven varieert binnen zeer nauwe grenzen. De zuurgraad varieert van pH 7,35 tot pH 7,45. De
osmotische waarde ligt tussen de 260 en 320 mOsm/kg en de temperatuur is vrijwel constant.
Bovendien is het milieu van de cellen steriel.
In vivo zijn de cellen sterk afhankelijk van andere weefsels en organen. De lever regelt de temperatuur,
de hoeveelheid glucose en vormt de bloedeiwitten. De nieren regelen de osmotische waarde en
de hoeveelheid metabolieten. Het bloed regelt de pH en geeft bescherming tegen infecties. De
longen regelen de hoeveelheid O2 en CO2.
Cellen die in vitro in leven gehouden moeten worden, moeten een milieu hebben dat het milieu in vivo
zo dicht mogelijk benadert.

Kunstmatige kweekmedia
Tegenwoordig gebruikt men vrijwel alleen kunstmatige kweekmedia, de zgn. 'defined media', waarvan
de samenstelling precies bekend is, dit in tegenstelling tot natuurlijke media. Tabel 1 geeft een overzicht
van de samenstelling van verschillende soorten 'defined media'.
'Defined medium' bevat o.a.:
Anorganische zouten, vooral NaCl, voor het verkrijgen van de juiste osmotische waarde. Ca2+- en Mg2+-
ionen dienen ook als co-factoren bij enzymatische reacties.
NaHCO3 en één of enkele fosfaten dienen als buffer. De pH van het medium moet stabiel zijn omdat
bij geringe afwijkingen de cellen niet groeien of zelfs dood gaan. De meeste cellen groeien goed bij
een pH 7,4. Omdat de cellen voornamelijk zure metabolieten produceren zal het medium vrij snel
verzuren.
Het NaHCO3 is een natuurlijke buffer en komt als zodanig voor in het bloed. Er is een evenwicht tussen
de HCO- 3 -ionen en het CO2 in het bloed, dat op zijn beurt weer in evenwicht is met het CO2 in de lucht
-
in de longblaasjes (Fig. 3). De concentratie HCO 3 -ionen in het bloed is 24 mM, wat overeenkomt met
2 mg NaHCO3 per ml. De CO2 druk in de longblaasjes is 40 mm Hg, wat overeenkomt met 5% CO2.
Deze concentratie - HCO3 en pCO2 zorgen er voor dat de pH van het bloed 7,4 is. In vitro wordt dan ook

meestal gekweekt in medium dat ca. 2 mg NaHCO3 per ml bevat en lucht met 5% CO2.

gas fase (longen; lucht boven het medium)

CO2 + H2O + O2 + N2

CO2 + H2O 
HCO3 - + H+

vloeistof fase (bloed; medium)

Fig. 3. Het bicarbonaat buffer systeem.

Sommige cellen hebben een lagere of hogere pCO2 nodig. Om een pH van 7,4 te handhaven moet
het medium een aangepaste hoeveelheid NaHCO3 bevatten (Tabel 1).
Tegenwoordig gebruikt men als buffer ook vaak het organische -glycerolfosfaat of het N-2-
hydroxy- ethylpiperazine-N-2-ethaansulfonylzuur, kortweg HEPES.
Fenolrood dient als indicator en heeft een duidelijk kleuromslag in het fysiologisch belangrijke gebied:
pH 7,4 rood, pH 7,0 oranje en pH 6,5 geel.
Glucose dient als energiebron. Glucose wordt ook wel vervangen door galactose. Het voordeel is
dat galactose langzamer door de cellen wordt verbruikt en er dus minder snel zure metabolieten
in het medium ophopen.

4
Aminozuren. Meestal wordt volstaan met het toevoegen van de 13 essentiële aminozuren t.w.
arginine, cysteïne of cystine, glutamine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine,
threonine, tryptofaan, tyrosine en valine. Andere, meer samengestelde, media bevatten ook een aantal
niet-essenti- ële aminozuren. Dit kan nodig zijn omdat cellen in vitro soms de capaciteit om bepaalde
aminozuren zelf te maken verliezen. Van de aminozuren wordt altijd de L-isomeer gebruikt, omdat de
D-isomeer niet door dierlijke cellen kan worden verwerkt. Media bevatten altijd een relatief grote
hoeveelheid glutamine. Dit is nodig omdat het vaak voorkomt dat de citroenzuurcyclus niet meer
voldoende functioneert en de cellen geen glucose kunnen gebruiken. Glutamine kan dan als
energiebron dienen. Een probleem is dat glutamine boven de 4oC niet stabiel. is en over zal gaan
in een cyclische verbinding waarbij het toxische NH3 wordt gevormd. Om dit te voorkomen zijn er
media ontwikkeld die het glutamine als dipeptide (Glu- Glu, Ala-Glu of Gly-Glu) bevatten. Deze
dipeptiden zijn ook bij kamertemperatuur gedurende een lange tijd stabiel. De cellen kunnen het
glutamine gebruiken door de peptide binding van het dipeptide te splitsen.

Tabel 2. De overeenkomstige fysiologische waarden van de bicarbonaat en CO2

concentraties.
NaHCO3 CO2
mM mg/ml %
MEM w. Hank’s salts 4 0.35 1
MEM w. Earle’s salts 24 2.0 5
Dulbecco’s mod MEM 44 3.7 10

Vitaminen. Meestal 8 tot 12 verschillende vitaminen B en vitamine C.

Behalve bovenstaande componenten bevatten de meer samengestelde media ook nog
nucleïnezuurderivaten, lipiden, cholesterol en co-enzym A.

Serum
Voor de meeste cellen is het nodig om aan het 'defined medium' serum toe te voegen (het
'defined medium' is dan niet meer 'defined'!). Serum bevat groeifactoren, die nodig zijn voor de
celdelingen. Verder bevat serum het transferrine, een eiwit dat ijzerionen bindt, waardoor deze
minder toxisch worden en door de cellen opgenomen kunnen worden. Een belangrijk component
van serum zijn de hormonen, o.a. insuline, dat de opname van glucose bevordert, groeihormoon,
dat de celdelingen stimuleert en cortisol, dat het vasthechten van de cellen aan het substraat
bevordert. Verder bevat serum sporenelementen en intermediaire metabolieten, die door de cellen
worden opgenomen.
Serum bevat echter ook stoffen die cytotoxisch kunnen werken zoals enzymen, immuunglobulinen
(antilichamen) en complementfactoren. Daarom moet serum voor gebruik worden geïnactiveerd door
het gedurende 30 minuten in een waterbad van 56oC te laten staan. Veel enzymen worden zo
gedenatureerd, evenals sommige complementfactoren.
Een veel gebruikt serum is het foetaal kalfsserum (fetal calf serum; FCS). Voordeel van dit serum
is dat het veel groeifactoren bevat en weinig of geen immuunglobulinen. Het is echter duur,
zodat in veel gevallen andere sera zoals 'newborn bovine' serum (NBS), runder-, paarden- of
kippenserum wordt gebruikt en in speciale gevallen ook wel humaan serum.
De concentratie van het serum in het medium is meestal 7 - 10% voor een primaire kweek en 1-3% voor
subkweken.

Serum-vrij medium
Het toevoegen van serum betekent dat aan het medium een niet gedefinieerde component
wordt toegevoegd. Enkele cellijnen kunnen in serumvrij medium worden gekweekt. Dit zijn o.a.:
HeLa-cellen: humaan cellen oorspronkelijk afkomstig van een cervix carcinoom. CHO-cellen: cellen
afkomstig van ovarium van de Chinese hamster. L-cellen: cellen afkomstig van muis. Ook andere
cellen kunnen wel in serumvrij medium worden gekweekt, maar dan moet het medium worden
gesupplementeerd met o.a. insuline, cortisol, transferrine en diverse groei- factoren.

5
Antibiotica
Kweekmedium dat geschikt is voor de groei van dierlijke cellen is ook geschikt voor micro-organismen.
Om de groei van micro-organisme tegen te gaan wordt aan het medium antibiotica toegevoegd. Meestal
wordt een combinatie van penicilline (100.000 E/l medium) en streptomycine (100.000 g/l medium)
gebruikt. Tegenwoordig wordt ook veel gebruikt gemaakt van gentamycine in een concentratie
van
20.000 g/l medium. Verder gebruikt men tylosine tegen mycoplasma en nystatine tegen
schimmelinfecties.
Toevoegen van antibiotica aan het medium betekent echter niet dat men nu minder zorgvuldig
met de kweken om kan gaan. Antibiotica zijn geen desinfectantia, maar hebben een specifieke
werking. Micro-organismen die voor een bepaald antibioticum niet gevoelig of resistent zijn kunnen
zonder meer in het medium met dat antibioticum groeien.

Substraat
De meeste cellen moeten aan een substraat hechten om te kunnen groeien. Er zijn maar weinig typen
cellen die in suspensie kunnen groeien. De kweekflessen die worden gebruikt zijn meestal van plastic en
vormen over het algemeen een goed substraat voor cellen. Aanhechting en groei van cellen kan echter
worden bevorderd door de kweekflessen te 'coaten' met een substraat.

'MULTIWELL PLATES', KWEEKFLESSEN E.D.

Het kweken van cellen op kleine schaal, d.w.z. in kweekflessen met een substraatoppervlak van
max. 175 cm2 en een mediumvolume van 50 tot 100 ml, is de beste methode voor het aanhouden
van cellen, het bestuderen van de morfologie, groei of stofwisseling van cellen. De opbrengst aan
cellen is dan maximaal 250.000 cellen per cm2. Voor het testen van het effect van stoffen op cellen
maakt men meestal gebruik van microtiter platen en 'multiwell plates'. Tabel I geeft een overzicht
van veel gebruikte kweekflessen en multiwell plates.

Tabel 1. Een overzicht van veel gebruikte kweekflessen en multiwell plates

Plastic no of Approx
Culture vessel or glass replicates Vol surface area yield (vero cells)

Microtest (Terasaki) P 60 , 72 0.01 ml 0,78 mm2 2.5 x 103

Microtitration plate P 96 ,144 0.1 ml 32 mm2 105
Multiwell plate P 4 round 1.0 ml 2 cm2 5 x 105
Multiwell plate P 12 round 2.0 ml 4,5 cm2 105
Multiwell plate P 24 round 1.0 ml 2 cm2 5 x 105
Multiwell plate P 8 rectangular 2.0 ml 7, 8 cm2 2 x 106
Multiwell plate P 4 rectangular 3.0 ml 16,1 cm2 4 x 106
Multiwell plate P 6 round 2.5 ml 9,6 cm2 2.5 x 106
Multiwell plate P 4 round 5.0 ml 28 cm2 7 x 106
Flasks
25 P 5.0 ml 25 cm2 5 x 10 6
50 G 10 – 20 ml 50 cm2
10 7
75 P /G 15 – 30 ml 75 cm2 2 x 10 7
120 G 40 – 100ml 120 cm2 5 x 10 7
150 P 75 ml 150 cm2 6 x 10 7
175 P 50 – 100 ml 175 cm2 7 x 10 7

6
CONTAMINATIE VAN DE CELKWEEK

De meest voorkomende verontreinigingen van de celkweek zijn verontreiniging met bacteriën, gist
en andere schimmels en mycoplasma. Een aantal criteria om microbiële contaminatie van de
celkweek te herkennen zijn:
- plotselinge verandering van de pH. Bacteriële infecties geven gewoonlijk een verlaging van de
pH, terwijl een schimmelinfectie vaak een verhoging van de pH geeft. Een uitzondering hierop is
gist, dat de pH maar weinig doet veranderen.
- het medium wordt troebel en bij schudden vormt zich vaak een laagje schuim op het medium.
Macroscopisch zijn bacterie- en schimmelinfecties gemakkelijk te herkennen. Dit is echter niet het
geval bij een mycoplasma-infectie. Mycoplasma leeft niet alleen in het medium, maar ook in de
cellen. Een mycoplasma-infectie leidt niet tot de dood van de cellen, maar de eigenschappen van de
geïnfecteerde cellen kunnen wel veranderen. Voor het aantonen van mycoplasma gebruikt men vaak
de fluorescentie methode met Hoechst 33258. Hoechst 33258 is een fluorescerende kleurstof
dat zich specifiek bindt aan DNA. Cellen worden gefixeerd in methanol-azijnzuur en vervolgens
gekleurd met Hoechst 33258. Met de fluorescentiemicroscoop is het DNA duidelijk te zien. Bij
een mycoplasma-infectie zal er ook fluorescentie te zien zijn buiten de nucleus. Omdat een
mycoplasma-infectie moeilijk (macroscopisch) te ontdekken is, is het goed om elke 2 à 3 maanden de
celkweek te testen op mycoplasma; bij een primaire kweek zelfs elke 2 à 3 weken.

Een geïnfecteerde celkweek kan worden schoongemaakt door de cellen een aantal keren te wassen
met een hoge concentratie antibioticum en gedurende 2x 48 uur (tussentijds 1x verversen) te incuberen
in een medium met een therapeutische concentratie antibioticum. Deze therapeutische
concentratie is bijv. voor penicilline 250 eenheden/ml medium en voor streptomycine 250 g/ml
medium. Ter vergelijking: normaal bevat medium 100 eenheden penicilline per ml en/of 100 g
streptomycine per ml. Dit is de zgn. onderhoudsdosis. Na incubatie in antibioticumhoudend medium
wordt het medium ververst en worden de cellen geïncubeerd in antibioticumvrij medium om te
controleren of de infectie verdwenen is.
Het schoonmaken van een geïnfecteerde kweek is duur en tijdrovend, terwijl het lang niet altijd succes
heeft. Meestal wordt een geïnfecteerde kweek dan ook vernietigd.

HET BEWAREN VAN CELLEN

Wanneer cellen niet meer nodig zijn dan is het niet raadzaam om de cellen in kweek te houden. Cellen
verouderen, waardoor bepaalde functies verloren kunnen gaan en veranderingen in het aantal
chromosomen kunnen optreden. Bovendien hebben de meeste celtypen maar een beperkte
levensduur. Ook kost het aanhouden van een kweek tijd, materiaal (medium verversen) en ruimte.
Cellen die bewaard moeten worden, worden daarom ingevroren in vloeibaar stikstof en daarin bewaard
bij een temperatuur van -196oC. Na het invriezen in vloeibaar stikstof kunnen de cellen ook bewaard
worden in een diepvries bij -70oC. Echter bij deze temperatuur zullen op den duur toch veranderingen in
de cellen optreden.

Voor het invriezen wordt een kweek in de late log-fase gebruikt. De cellen worden getrypsiniseerd,
gewassen en het aantal cellen wordt bepaald. In het algemeen worden 5 x 106 tot 2 x 107 cellen/ml
ingevroren. Dit grote aantal cellen is nodig i.v.m. de sterfte als gevolg van het invriezen. Aan
de celsuspensie in kweekmedium wordt dimethyl-sulfoxide (DMSO) of een andere stabilisator, bijv.
glycerol, toegevoegd. De uiteindelijke concentratie van stabilisator kan 5 - 20 % bedragen,
afhankelijk van de celsoort en de gewenste invriessnelheid. De stabilisator wordt toegevoegd om
celdestructie te voorkomen. Stoffen als DMSO en glycerol dringen snel de cellen binnen en voorkomen
de vorming van ijskristallen in de cellen.
Wees uiterst voorzichtig met geconcentreerd DMSO, het dringt snel door de huid.
Invriesbuisjes worden gevuld met 1 à 2 ml celsuspensie in invriesmedium. De buisjes moeten goed
worden gesloten zodat er geen vloeibaar stikstof in de buisjes kan komen. De cellen worden langzaam
ingevroren met een temperatuurdaling van 1oC per minuut tot -70oC. Daarna worden de buisjes

7
snel overgebracht in vloeibaar stikstof, waarin de cellen onbeperkt bewaard kunnen blijven.
Hoewel geen exacte temperatuurgrens kan worden vastgelegd waaronder biologisch materiaal moet
worden bewaard, opdat de levensvatbaarheid zo lang mogelijk wordt behouden, nemen de meeste
onderzoekers een temperatuurgrens van -100oC. Niet alleen omdat beneden deze temperatuur
het celmetabolisme bijna geheel is stilgelegd, maar vooral omdat boven de -100oC ijskristalvorming
kan optreden, waardoor de cellen beschadigen.
Het ontdooien gebeurt door de buisjes in water van 37oC te leggen. Als de cellen zijn ontdooid dan wordt
het buisje afgenomen met alcohol 70%, voorzichtig geopend en wordt de celsuspensie in een kweekfles
gedaan. Druppelsgewijs wordt medium toegevoegd. Het toevoegen van medium moet langzaam
gebeuren om het DMSO of glycerol geleidelijk te verdunnen zodat een osmotische shock wordt
voorkomen. Na het toevoegen van medium wordt het aantal levende cellen bepaald en wordt
de celsuspensie eventueel verder verdund en in kweek gebracht.