Microcalorimetry of Biological

Molecules Methods and Protocols Eric

Ennifar
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/microcalorimetry-of-biological-molecules-methods-an
d-protocols-eric-ennifar/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Nucleic Acid Crystallography Methods and Protocols 1st

Edition Eric Ennifar (Eds.)

https://textbookfull.com/product/nucleic-acid-crystallography-
methods-and-protocols-1st-edition-eric-ennifar-eds/

Zebrafish Methods and Protocols Koichi Kawakami

https://textbookfull.com/product/zebrafish-methods-and-protocols-
koichi-kawakami/

SNAREs: Methods and Protocols Rutilio Fratti

https://textbookfull.com/product/snares-methods-and-protocols-
rutilio-fratti/

Epitranscriptomics: Methods and Protocols Narendra

Wajapeyee

https://textbookfull.com/product/epitranscriptomics-methods-and-
protocols-narendra-wajapeyee/
Phytoplasmas: Methods and Protocols Rita Musetti

https://textbookfull.com/product/phytoplasmas-methods-and-
protocols-rita-musetti/

Metalloproteins: Methods and Protocols Yilin Hu

https://textbookfull.com/product/metalloproteins-methods-and-
protocols-yilin-hu/

Nanotoxicity: Methods and Protocols Qunwei Zhang

https://textbookfull.com/product/nanotoxicity-methods-and-
protocols-qunwei-zhang/

Autoantibodies: Methods and Protocols Gunnar Houen

https://textbookfull.com/product/autoantibodies-methods-and-
protocols-gunnar-houen/

Oligodendrocytes: Methods and Protocols David Lyons

https://textbookfull.com/product/oligodendrocytes-methods-and-
protocols-david-lyons/
Methods in
Molecular Biology 1964

Eric Ennifar Editor

Microcalorimetry
of Biological
Molecules
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
 Microcalorimetry of Biological
Molecules

Methods and Protocols

Edited by

Eric Ennifar
Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Strasbourg, CNRS, Strasbourg, France
Editor
Eric Ennifar
Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Université de Strasbourg, CNRS
Strasbourg, France

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-9178-5 ISBN 978-1-4939-9179-2 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9179-2
Library of Congress Control Number: 2019935496

© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Humana Press imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of
Springer Nature.
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface

Although structural biology is key to elucidate molecular architecture of biological mole-

cules, thermodynamic and kinetic data are yet an essential and necessary complement to
structural studies for a comprehensive understanding of binding mechanisms and mechan-
isms of action. Structural data alone, even when associated with sophisticated computational
methods, cannot fully define the driving forces for binding interactions or even accurately
predict their binding affinities or kinetics. Thermodynamics and kinetics provide quantita-
tive data required to understand these driving forces, the time in which drug and its target
associate and dissociate, and for evaluating and understanding at a deeper level the effects of
substituent changes on binding affinity. Microcalorimetry is the only direct method yielding
thermodynamic parameters without the use of any label. Among the key advantages, it is
relatively artifacts-free, not limited by the ligand or protein sizes, and offers a precise
determination of affinities among other key data.
The first part of this volume is dedicated to differential scanning calorimetry (DSC), the
technique of choice for evaluation of protein stability, but which can also be valuable for the
study of biofluids as shown here. DSC is a quite well-established technique in the pharma-
ceutical industry but would also benefit to academic research where it is not widely available.
The second part is devoted to isothermal titration calorimetry (ITC). The use of ITC in
biology has considerably grown in the past 10 years, mostly as a consequence of the
availability of high-sensitivity microcalorimeters requiring low sample volume. The inevita-
ble side effect of this rapid dissemination is a frequent misuse of this technique, being
recurrently used to decorate publications in structural biology by providing Kd (dissociation
constant) tables. However, alternative techniques can provide similar data about affinity with
much lower sample requirements. ITC, however, can do much more and can go well beyond
Kds. ITC users and the scientific community would clearly benefit from taking full advantage
of the technique as illustrated in these chapters. The third and last part includes advanced
data processing and is intended to a more experienced audience. It will be useful for readers
dealing with complex molecular systems (most interactions are much more complex than
initially thought!) or for those who are interested into retrieving kinetic data in addition to
thermodynamic data. ITC indeed recently appears as an interesting and reliable technique to
gain insights into kinetic data, similarly to surface plasmon resonance. It is a safe bet that
these kinetic aspects of ITC are likely to grow in the future.
Finally, I would like to thank the authors who participated in the production of this
book, for their contribution and for their patience. I hope this volume will provide new
stimulating ideas for readers in using microcalorimetry for their experiments.

Strasbourg, France Eric Ennifar

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

PART I DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY

1 The Contribution of Differential Scanning Calorimetry for the Study
of Peptide/Lipid Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves
2 Protocols of IATC, DSC, and PPC: The Multistate Structural
Transition of Cytochrome c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Shigeyoshi Nakamura and Shun-ichi Kidokoro
3 Value of DSC in Characterization and Optimization of Protein Stability . . . . . . . 33
Katherine Bowers and Natalia Markova
4 Plasmatic Signature of Disease by Differential Scanning Calorimetry (DSC). . . . 45
Philipp O. Tsvetkov and François Devred

PART II ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY

5 Intrinsic Thermodynamics of Protein-Ligand Binding by Isothermal

Titration Calorimetry as Aid to Drug Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Vaida Paketurytė, Asta Zubrienė, John E. Ladbury,
and Daumantas Matulis
6 Isothermal Titration Calorimetry Measurements of Riboswitch-Ligand
Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Christopher P. Jones, Grzegorz Piszczek, and Adrian R. Ferré-D’Amaré
7 ITC Studies of Ribosome/Antibiotics Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
Emma Schenckbecher, Benoı̂t Meyer, and Eric Ennifar
8 High-Quality Data of Protein/Peptide Interaction by Isothermal
Titration Calorimetry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Juan Ramirez and Yves Nominé
9 ITC Measurement for High-Affinity Aptamers Binding to Their Target
Proteins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Ryo Amano, Tomohisa Furukawa, and Taiichi Sakamoto
10 Thermodynamics of Molecular Machines Using Incremental ITC . . . . . . . . . . . . 129
Benoı̂t Meyer, Cyrielle da Veiga, Philippe Dumas, and Eric Ennifar
11 Measuring the Metabolic Activity of Mature Mycobacterial Biofilms
Using Isothermal Microcalorimetry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Anna Solokhina, Gernot Bonkat, and Olivier Braissant

vii
viii Contents

12 Characterization of Microtubule-Associated Proteins (MAPs)

and Tubulin Interactions by Isothermal Titration Calorimetry (ITC). . . . . . . . . . 151
Philipp O. Tsvetkov, Romain La Rocca, Soazig Malesinski,
and François Devred

PART III ADVANCED DATA PROCESSING AND KINETICS

13 Analysis of Isothermal Titration Calorimetry Data for Complex

Interactions Using I2CITC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Ibrahim Q. Saeed and Niklaas J. Buurma
14 Tinkering with Binding Polynomials in Isothermal Titration Calorimetry . . . . . . 185
Rafael Claveria-Gimeno, Sonia Vega, Olga Abian,
and Adrian Velazquez-Campoy
15 The Use of ITC and the Software AFFINImeter for the Quantification
of the Anticoagulant Pentasaccharide in Low Molecular Weight Heparin . . . . . . 215
Eva Muñoz and Juan Sabı́n
16 Thermodynamic and Kinetic Analysis of Isothermal Titration
Calorimetry Experiments by Using KinITC in AFFINImeter. . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Eva Muñoz, Juan Sabı́n, Javier Rial, Daniel Pérez, Eric Ennifar,
Philippe Dumas, and Ángel Piñeiro
17 Enzyme Kinetics Determined by Single-Injection Isothermal Titration
Calorimetry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Colette F. Quinn and Lee D. Hansen
18 Characterization of Enzymatic Reactions Using ITC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Barbara Zambelli

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267
Contributors

OLGA ABIAN  Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems (BIFI), Joint
Units IQFR-CSIC-BIFI, and GBsC-CSIC-BIFI, Universidad de Zaragoza, Zaragoza,
Spain; Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (IACS), Zaragoza, Spain; Aragon
Institute for Health Research (IIS Aragon), Zaragoza, Spain; Department of Biochemistry
and Molecular and Cell Biology, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain; Centro de
Investigacion Biomédica en Red en el Área Temática de Enfermedades Hepáticas y
Digestivas (CIBERehd), Barcelona, Spain
ISABEL D. ALVES  Chimie et Biologie des Membranes et Nanoobjets, CBMN CNRS UMR
5248, Université Bordeaux 1, Pessac, France
RYO AMANO  Faculty of Advanced Engineering, Department of Life Science, Chiba Institute
of Technology, Narashino-shi, Chiba, Japan
GERNOT BONKAT  alta uro AG, Basel, Switzerland
KATHERINE BOWERS  Principal Scientist/Group Leader Analytical and Formulation
Development, FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U.S.A., Inc., Morrisville, NC, USA
OLIVIER BRAISSANT  Center of Biomechanics and Biocalorimetry, University Basel, c/o
Department of Biomedical Engineering (DBE), Allschwil, Switzerland
NIKLAAS J. BUURMA  Physical Organic Chemistry Centre, School of Chemistry, Cardiff
University, Cardiff, UK
RAFAEL CLAVERIA-GIMENO  Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems
(BIFI), Joint Units IQFR-CSIC-BIFI, and GBsC-CSIC-BIFI, Universidad de Zaragoza,
Zaragoza, Spain; Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (IACS), Zaragoza, Spain;
Aragon Institute for Health Research (IIS Aragon), Zaragoza, Spain
CYRIELLE DA VEIGA  Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Strasbourg,
CNRS, Strasbourg, France
FRANÇOIS DEVRED  Aix-Marseille Univ, CNRS, INP, Inst Neurophysiopathol, Fac Pharm,
Marseille, France
PHILIPPE DUMAS  Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Strasbourg,
CNRS, Strasbourg, France
ERIC ENNIFAR  Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Strasbourg,
CNRS, Strasbourg, France
ADRIAN R. FERRÉ-D’AMARÉ  Biochemistry and Biophysics Center, National Heart, Lung
and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
TOMOHISA FURUKAWA  Faculty of Advanced Engineering, Department of Life Science, Chiba
Institute of Technology, Narashino-shi, Chiba, Japan
LEE D. HANSEN  Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University,
Provo, UT, USA
MARIE-LISE JOBIN  Institute for Pharmacology and Toxicology, Rudolf Virchow Center—Bio-
Imaging Center, University of Würzburg, Würzburg, Germany
CHRISTOPHER P. JONES  Biochemistry and Biophysics Center, National Heart, Lung and
Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
SHUN-ICHI KIDOKORO  Department of Bioengineering, Nagaoka University of Technology,
Nagaoka, Japan

ix
x Contributors

JOHN E. LADBURY  Department of Molecular and Cell Biology and Astbury Centre for
Structural Biology, University of Leeds, Leeds, UK
ROMAIN LA ROCCA  Aix-Marseille Univ, CNRS, INP, Inst Neurophysiopathol, Fac Pharm,
Marseille, France
SOAZIG MALESINSKI  Aix-Marseille Univ, CNRS, INP, Inst Neurophysiopathol, Fac Pharm,
Marseille, France
NATALIA MARKOVA  MicroCal, Malvern Panalytical, Uppsala, Sweden
DAUMANTAS MATULIS  Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of
Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
BENOÎT MEYER  Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Strasbourg,
CNRS, Strasbourg, France
EVA MUÑOZ  AFFINImeter Scientific & Development Team, Software 4 Science
Developments, S. L. Ed. Emprendia, Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
SHIGEYOSHI NAKAMURA  Department of General Education, National Institute of
Technology, Ube College, Ube, Japan
YVES NOMINÉ  Equipe Labelisée Ligue 2015, Department of Integrative Structural Biology,
Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), INSERM U964
UMR 7104 CNRS, Université de Strasbourg, Illkirch, France
VAIDA PAKETURYTĖ  Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of
Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
DANIEL PÉREZ  AFFINImeter Scientific & Development Team, Software 4 Science
Developments, S. L. Ed. Emprendia, Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
ÁNGEL PIÑEIRO  AFFINImeter Scientific & Development Team, Software 4 Science
Developments, S. L. Ed. Emprendia, Santiago de Compostela, A Coruña, Spain; Soft
Matter & Molecular Biophysics Group, Departamento de Fı́sica Aplicada, Facultad de
Fı́sica, Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain
GRZEGORZ PISZCZEK  Biophysics Core Facility, National Heart, Lung and Blood Institute,
National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
COLETTE F. QUINN  Applications Lab, TA Instruments, Lindon, UT, USA
JUAN RAMIREZ  Institute of Nanotechnology (INT), Karlsruhe Institute of Technology (KIT),
Eggenstein-Leopoldshafen, Germany
JAVIER RIAL  AFFINImeter Scientific & Development Team, Software 4 Science
Developments, S. L. Ed. Emprendia, Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
JUAN SABÍN  AFFINImeter Scientific & Development Team, Software 4 Science
Developments, S. L. Ed. Emprendia, Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
IBRAHIM Q. SAEED  Department of Chemistry, College of Science, Salahaddin University,
Erbil, Kurdistan Region, Iraq
TAIICHI SAKAMOTO  Faculty of Advanced Engineering, Department of Life Science, Chiba
Institute of Technology, Narashino-shi, Chiba, Japan
EMMA SCHENCKBECHER  Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Université de
Strasbourg, CNRS, Strasbourg, France
ANNA SOLOKHINA  Center of Biomechanics and Biocalorimetry, University Basel, c/o
Department of Biomedical Engineering (DBE), Allschwil, Switzerland
PHILIPP O. TSVETKOV  Aix-Marseille Univ, CNRS, INP, Inst Neurophysiopathol,
Fac Pharm, Marseille, France
SONIA VEGA  Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems (BIFI), Joint Units
IQFR-CSIC-BIFI, and GBsC-CSIC-BIFI, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, Spain
 Contributors xi

ADRIAN VELAZQUEZ-CAMPOY  Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems

(BIFI), Joint Units IQFR-CSIC-BIFI, and GBsC-CSIC-BIFI, Universidad de Zaragoza,
Zaragoza, Spain; Aragon Institute for Health Research (IIS Aragon), Zaragoza, Spain;
Department of Biochemistry and Molecular and Cell Biology, Universidad de Zaragoza,
Zaragoza, Spain; Centro de Investigacion Biomédica en Red en el Área Temática de
Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Barcelona, Spain; Fundacion ARAID,
Government of Aragon, Zaragoza, Spain
BARBARA ZAMBELLI  Laboratory of Bioinorganic Chemistry, Department of Pharmacy and
Biotechnology, University of Bologna, Bologna, Italy
ASTA ZUBRIENĖ  Department of Biothermodynamics and Drug Design, Institute of
Biotechnology, Vilnius University, Vilnius, Lithuania
 Part I

Differential Scanning Calorimetry

 Chapter 1

The Contribution of Differential Scanning Calorimetry

for the Study of Peptide/Lipid Interactions
Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

Abstract
Membrane-active peptides include a variety of molecules such as antimicrobial (AMP), cell-penetrating
(CPP), viral, and amyloid peptides that are implicated in several pathologies. They constitute important
targets because they are either at the basis of novel therapies (drug delivery for CPPs or antimicrobial
activity for AMPs) or they are the agents causing these pathologies (viral and amyloid peptides). They all
share the common property of interacting with the cellular lipid membrane in their mode of action.
Therefore, a better understanding of the peptide/lipid (P/L) interaction is essential to help decipher
their mechanism of action. Among the different biophysical methods that can be used to fully characterize
P/L interactions, differential scanning calorimetry (DSC) allows determining the peptide effect on the lipid
phase transitions, a property that reflects the P/L interaction mode. A general protocol for classical DSC
experiments for P/L studies will be provided.

Key words Membrane-active peptides, Peptide/lipid interaction, Differential scanning calorimetry,

Lipid phase transition, Thermodynamic behavior

1 Introduction

Membrane lipid properties (fluidity, thickness, ordering, etc.) vary

with temperature. The lipid membrane undergoes transition states
as the temperature increases, and the temperatures at which those
occur are called phase transition temperatures. Lipid phase transi-
tions are totally reversible. As the hydrocarbon length is increased,
van der Waals interactions become stronger requiring more energy
to disrupt the ordered packing and arising to higher transition
phase temperatures. When the number of lipid acyl chain unsatura-
tion increases, the transition temperature decreases due to a disrup-
tion of acyl chain packing.
For lipids forming lamellar phases, at low temperatures, lipids
are in the gel phase (Lβ0 ), a rigid phase where lipids are highly
ordered and closely packed. As the temperature increases, the tilt-
ing of lipid headgroups changes, and lipids enter the rippled phase

Eric Ennifar (ed.), Microcalorimetry of Biological Molecules: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1964,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9179-2_1, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

3
4 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

Fig. 1 Thermogram of a lamellar phase transition showing the three typical lipid phases (gel phase Lβ0 , rippled
phase Pβ0 , and liquid phase Lα) and the corresponding temperature transitions (Tpre and Tm)

(Pβ0 ). In this intermediate phase, the bilayer is still highly ordered

with low degree of fluidity and has a series of ripples along the
surface. The phase transition associated is called the pre-transition,
and the temperature at which it occurs is the pre-transition temper-
ature (Tpre) (Fig. 1). The pre-transition is often only visible for
single-component lipid vesicles and tends to be absent when a
mixture of lipids is studied. At higher temperatures, lipids undergo
the main phase transition to a liquid-disordered phase (Lα) that is
accompanied by an increase in lipid disordering, decrease in bilayer
thickness, and lateral expansion [1]. The main transition is due to a
cooperative melting of the hydrocarbon changes. It includes a
conformational change of the hydrocarbon chains from all trans
in the rigid gel state to a disordered state that allows gauche con-
formations. Accompanying these changes are a lateral expansion
due to increased lipid mobility and a decrease in bilayer thickness.
The main transition occurs at a higher temperature and is faster and
associated with a larger enthalpy change than the pre-transition.
Lipid phase transition properties are modulated by lipid physi-
cochemical properties as fatty acid chain length, degree of unsatura-
tion, and nature and size of their polar headgroup and by the buffer
conditions (ionic strength, type of ions, pH) and external factors as
pressure [2–4].
The lamellar transitions are the most studied since they are the
most common in biological systems as they are adopted, among
others, by phosphatidylcholines (PC), the most abundant phos-
pholipid in eukaryotic cell membranes. An exception are lipids
that form hexagonal phases such as the phosphatidylethanolamines
which, besides the lamellar phase, possess an additional phase tran-
sition between lamellar (Lα) and hexagonal phase (HII, also called
inverted micelle). The temperature phase transition between these
 DSC Studies of P/L Interactions 5

two phases is called TH and occurs at higher temperatures than Tm

[2, 5–7].
One of the biophysical approaches that allow a full characteri-
zation of lipid phase transitions is differential scanning calorimetry
(DSC). DSC can measure phase transition temperatures (Tpre, Tm,
TH) as well as enthalpy (ΔH) and cooperativity of the phase transi-
tions by measuring the difference of temperature needed to com-
pensate between the thermodynamic behaviors of two cells: one
“inert” reference cell filled with aqueous buffer and one sample cell
filled with the sample to be analyzed [5, 8, 9]. In a DSC measure-
ment, the difference in the amount of heat required to increase the
temperature of a sample and reference are measured as a function of
temperature. The basic principle underlying this technique is that,
when the sample undergoes a physical transformation such as phase
transitions, more or less heat will need to flow to it than the
reference to maintain both at the same temperature. Whether less
or more heat must flow to the sample depends on whether the
process is exothermic or endothermic. By observing the difference
in heat flow between the sample and reference, differential scanning
calorimeters are able to measure the amount of heat absorbed or
released during such transitions. This heat is then converted in
specific heat capacity (Cp that is expressed in calories or joules per
mol per  C) that is usually employed in data presentation.
Three parameters of interest can be extracted from DSC ther-
mograms: the area under the transition peak, which is proportional
to the enthalpy of the transition (ΔH) and directly correlates to the
strength of van der Walls forces between the lipid fatty acid chains,
the full width at half maximum (FWHM) of the transition peak
(ΔT1/2) that reflects the cooperativity of the transition related with
the number of molecules that undergo a transition simultaneously,
and the transition temperature itself (Tpre, Tm, TH).
DSC can be used to monitor phase transitions of single, binary,
or simple lipid mixtures allowing to better mimic more physiologi-
cal membrane systems. One should keep in mind that for lipid
samples composed of more than one lipid component, the lipids
must be appropriately chosen to ensure proper miscibility (for
reports on lipid miscibility, see refs. 10–14). Additionally certain
lipids such as cholesterol have a strong impact in the phase transi-
tion due to their natural intercalation between the fatty acid chains.
Cholesterol broadens the endotherm and can even completely
abolish the transition [15, 16]; therefore, their content must be
kept low. At concentrations below 10%, cholesterol induces mini-
mal phase separation. Lipid miscibility will be further discussed
below.
The mode of interaction of peptides with lipids can be accu-
rately studied using DSC since this method is nonintrusive and
doesn’t implicate the use of any probe. As peptides interact with
lipids, they can induce changes in lipid properties as lipid packing,
6 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

membrane fluidity, cooperativity of the transition, and others that

are reflected in the different parameters measured by the DSC
experiment. Very generally, the pre-transition is very sensitive to
all molecules that establish contacts with the lipid headgroups and
tends to disappear when peptides are added. On the other hand,
molecules that affect the main phase transition act at a deeper level
than those that only affect the pre-transition so with insertion
below the headgroup level [5, 17].

2 Materials

1. Lipids for the studies presented here were obtained from the
Avanti Polar Lipids (Alabama, USA).
2. Buffer for DSC studies: 10 mM Tris–HCl, 0.1 M NaCl, 2 mM
EDTA, pH 7.6. Other buffers can be used considering that
they do not undergo heat changes for the temperature ranges
used in the measurements (see Note 1).
3. Peptides were purchased from companies or synthesized by
classical solid-phase peptide chemistry procedures using Fmoc
strategy, purified to 90% purity and lyophilized to a powder.
4. DSC scans were obtained with a Nano DSC (TA Instruments)
equipped with U-shape platinum cells. Other DSC instruments
can be used.

3 Methods

3.1 The Lipid Model The most commonly used lipid model system used for DSC studies
System are multilamellar vesicles (MLVs) because these systems are very
easy to prepare and are the most stable lipid model systems
[18]. Moreover, MLVs also result in a more homogeneous sample
and in a higher and better resolved DSC signal than other types of
liposomes as small and large unilamellar vesicles [5, 19]. Regarding
the composition of the lipid vesicles, one needs to choose lipids that
are the most representatives of the in vivo system that one wants to
mimic but needs to keep in mind the limitations associated with the
method. Some additional considerations about the type and com-
position of the lipid model system are provided in Notes 2 and 3.
1. A lipid film is prepared by dissolving the chosen lipid (1 mg
when a single lipid is used and to investigate gel to fluid phase
transition; for other conditions see Note 3) in minimal amount
of chloroform and methanol (only if not soluble in chloroform
alone, as it occurs often with anionic lipids) necessary to allow
complete dissolution. For lipid mixtures, it is very important
that lipids are thoroughly mixed and dissolved. To this aim the
 DSC Studies of P/L Interactions 7

proportion of chloroform and methanol can be adjusted

depending on the lipid to be dissolved. For example, if choles-
terol is present, the methanol content should be reduced to
avoid crystallization of cholesterol. The same is valid for mix-
tures containing phosphatidylethanolamine. The film is evapo-
rated under a flow of nitrogen and then subjected to total
evaporation under high vacuum to remove all traces of organic
solvent (2 h, depending on the system power).
2. The lipid film is hydrated by adding 1 mL of the chosen buffer
system (see Note 1), and then MLVs are spontaneously formed
by strong vortex. For lipids with a lipid phase transition tem-
perature (Tm) that is considerably above room temperature, the
sample should be warmed to a temperature above Tm to allow
complete hydration and proper formation of MLVs.
3. If unilamellar lipid vesicles (such as large ones, LUVs) are used,
then after step 2, the MLVs are subjected to six steps of totally
freezing/thawing (by immersing samples in liquid nitrogen
followed by sample heating in a water bath at temperatures
above the lipid phase transition). After that, the liposomes size
is homogenized by passing the solution through a mini
extruder equipped with 100 nm pore filter (Whatman). Due
to a slight loss of lipid during the extrusion process (~5%), the
lipid concentration should be determined by the Rouser
method that can accurately quantify phosphate content in
samples [20].

3.2 The DSC The DSC instrument is composed of two cells, a reference and a
Measurement sample cell. In the reference cell, the exact same buffer used for the
sample (blank) must be loaded. In the sample cell, the lipid solution
or the lipid and peptide mixture is loaded. The volume of the cells
varies from one instrument to another (the studies reported here
were performed with a DSC with 300 μL cells).
1. Blank measurement should be performed first. For that the
same buffer should be loaded in both the reference and the
cell sample. Before loading, the buffer solution should be
degassed for about 15 min to remove possible air bubbles.
The same applies for all samples to be loaded in the DSC
cells. Air bubbles displace liquid and therefore reduce the
heat capacity (yielding erroneous results). As air bubbles can
dissolve into solution over time, this will result in aberrant
increase in heat capacity each subsequent cycle as the bubble
dissolves. After loading the DSC cell, the fact that the cell is
kept under pressure (~35 psi) minimizes air bubbles. The
temperature scan measurement should be performed over a
large temperature range (to include the temperature range
that is used for samples to be measured) and at a rate of
8 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

1  C/min with a delay of 10–15 min between sequential scans

in a series that allows for thermal equilibration. The cell has a U
shape, and to load the solution, one should use two 1 mL
pipettes whose tips have been modified to have a 1 cm soft
Teflon ending that whose radius perfectly fits to the DSC cell
sample entrance to allow good sealing. Even if the cell sample
volume is of only 300 μL, it is ideal to use a volume of at least
500 μL for the loading procedure as this will reduce the possi-
bility of introducing air bubbles that can be deleterious for the
measurements. After loading a cap is placed in one of the two
openings of the cell; the other opening is left open. A minimum
of two cycles of heating/cooling should be performed, more if
they differ (no stability reached). A flat line (no heat exchange)
should be observed. If this is not the case, this could arise from
several factors including the cell that is not properly cleaned,
the existence of buffer heat variations with temperature, or
others.
2. After blank measurement, the buffer loaded in the sample cell is
removed with a pipette, and the lipid sample is introduced in
the cell by the same method described above (no need to
change the solution in the reference cell). The same scan para-
meters used for the blank should be applied here. Typically, a
scan rate of 1  C/min is used at the temperature range to be
investigated with several (three to four) alternating heating and
cooling scans to allow the system to reach equilibrium (more
scans can be added if needed). Because the data in the first and
last 5  C of the scan range is often non-exploitable due to
baseline problems, one should keep that in mind and broaden
the temperature scan to take that into account. There is no
need to unload and load the reference cell since the buffer
solution used in this measurement is the same as in the blank.
Indeed the reference cell only needs to be filled once at the
beginning of a series of measurements. If several sets of experi-
ments are being run with the same buffer in the reference cell,
one needs to insure that no evaporation had occurred from that
cell. Even if each cell is capped in one of the two openings, the
other remains uncapped, so evaporation is possible after long
time periods.
3. Then to investigate the effect of the peptide on the lipid phase
transition, the sample containing both the lipid and the peptide
(at the appropriated P/L ratio, see Note 4) is loaded in the
sample cell, and the same parameters (temperature scan range
and number of heating and cooling scans) should be applied. It
is important to test whether the peptide alone undergoes ther-
mal reactions for the temperature range of the measurement.
This is usually not the case for small peptides (contrarily to large
proteins), as their unfolding does not involve high enough
 DSC Studies of P/L Interactions 9

thermal changes to be observed by DSC at the low concentra-

tions used for these experiments (below mM range).
4. After performing a complete set of experiments (blank, lipid
and lipid with peptide sample), the sample cell needs to be
cleaned. The cleaning solution is flowed through the cell by
connecting tubing that establishes a circuit between the cell
entrance and the washing solution through a vacuum system.
This ensures a continuous and fast flow of solution through the
cells. A solution of detergent in water, typically 200 mL of 1%
Hellmanex, is passed first followed by thorough washing with
1 L of Milli-Q water. This cleaning procedure is sufficient for
typical lipid and peptide samples. If this cleaning procedure is
found to be insufficient, harsher cleaning conditions such as
4 M sodium hydroxide followed by 50% formic acid can be
applied.
5. Ideally the cells should never be left empty to minimize hydra-
tion problems that occur when cells are filled after being left
dry for long periods of time. Therefore, one can load either
water or the reference buffer in the cell. The caps can be
cleaned with detergent solution and plenty of water. Be careful
about organic solvents as some cap materials are not compati-
ble with those resulting in changes in the shape and size of the
caps. For troubleshooting, see Note 5.

3.3 Data Analysis Data analysis for data obtained with a DSC TA Instrument is
and Interpretation: performed with the fitting program CPCALC provided by CSC.
Examples Other instruments usually provide their own software with
instrument.
1. The baseline (blank) should be subtracted from the sample
data. To avoid the introduction of different data treatment
from the user between different data sets, it is advisable to use
a flat baseline treatment and to treat the data within similar
temperature scans. It is best to start with the lipid alone for
which thermodynamic phase transition data has been well
reported in the literature, so that data can be compared. After
data subtraction with baseline, the following parameters are
obtained regarding the different lipid phase transitions (pre-
and main phase temperature transition for lamellar lipids):
phase transition temperature, enthalpy, and entropy associated
with the transition.
In the case where a mixture of lipids is used or a peptide is
added to the liposomes, the DSC signal can be broadened or
even splitted in a “two-peak” transition which could corre-
spond to a domain formation (lipid domain or peptide-poor/
peptide-rich domain). Data analysis software can be used to
10 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

perform the deconvolution of the thermogram and identify the

transition parameters of the different domains.
2. The exact same procedure is performed for the thermograms
corresponding to the lipid in presence of peptide.

3.4 Information From the parameters obtained after data analysis presented above,
Obtained from DSC information about the mode of interaction of the peptides with the
Analysis lipid membrane is obtained. Here a short summary is provided
about the different parameters and their meaning:
l Modification of the phase transition temperature. This indicates
that the peptide changes the lipid physicochemical properties
that are responsible for such transition. For example, if the
peptide decreases the Tm of a gel to fluid phase transition, it
means that the peptide favors the transition and thus has a
fluidizing effect on the membrane.
l Changes in the area of the transition peak. Since the area of the
transition peak is directly correlated with the enthalpy of the
transition, a decrease in the area indicates that the peptide per-
turbs the phase transition and decreases the enthalpy. For a gel to
fluid phase transition, this indicates that the peptide perturbs the
fatty acid chain packing and decreases the van der Waals interac-
tion due to intercalation between the fatty acid chains. In certain
cases the phase transition peak is completely abolished which is
very common for the pre-transition that is sensitive to molecular
interactions.
l Changes in the transition peak FWHM. This parameter is a
measure of the cooperativity of the transition; the sharper the
transition is, the more cooperative the transition. This parameter
is directly correlated with the changes in the peak area, and again
an increase of this parameter reflects peptide insertion in
between the fatty acid chains.
l Changes in the shape of the transition peak. Besides reflecting
changes in the cooperativity of the transition, this parameter is
related with homogeneity. The de-doubling of a single transition
peak and/or appearance of new transition peaks is indicative of
species heterogeneity. If the peptide does not distribute homo-
geneously among all lipids, the appearance of two-phase transi-
tion peaks corresponding to peptide-poor and peptide-rich
domains occurs. Usually the sharper transition peak is associated
with the peptide-poor lipid domains, and the broader transition
is attributed to peptide-rich lipid regions.
Alternatively, the appearance of new transition peaks can be due
to peptide-induced appearance of new lipid supramolecular
structures (liposomes of different size, micelles, etc.).
l Relation between main transition ΔH changes upon increasing
concentration of peptide. By plotting this data and extrapolating
 DSC Studies of P/L Interactions 11

the line, at ΔH ¼ 0 one can obtain the number of lipid molecules

removed from the cooperative chain-melting transition by each
molecule of peptide [8].
For more in-depth information, the reader is directed to exten-
sive review articles on the subject [8, 9, 21].

3.5 Unusual While most commonly single-lipid model systems are investigated
Applications/Cases by DSC, the method can be applied to the study of lipid mixtures.
3.5.1 Study of Lipid
Mixtures

3.5.2 Following Lipid In the context of binary lipid mixtures, DSC has been used to
Domain Formation follow domain formation in lipid membranes. It is well-known
and Peptide Partition into that cellular lipid membranes are not laterally homogeneous and
Different Domains that domains exist that either have morphological different struc-
tures or that only differ in their physicochemical properties such as
membrane ordering properties and fluidity, as it is the case for lipid-
ordered and lipid-disordered domains. DSC has been used to study
domain formation, mainly through the construction of phase dia-
grams and their interpretation in terms of phase miscibility. In view
of phase miscibility, DSC can be useful to follow lipid mixtures that
are miscible or not. In the first case, miscible lipid mixtures can
result in single-lipid phase transitions (that can become broader)
when lipids have Tm values that are close. For example, when
mixing lipids with different fatty acid chain lengths, lipids with
chain lengths that differ by less than four carbons are not miscible
[22, 23] and result in very well-separated phase transitions. Both
miscible and nonmiscible lipid mixtures can be interesting tools to
study the mechanism of action of membrane-active peptides: (1) In
the case of miscible lipid mixtures, DSC can be used to follow the
peptide effect in lipid reorganization, namely, the preferential
recruitment of one of the lipids in the mixture; (2) for nonmiscible
lipids that result in well-separated phase transitions observed by
DSC, the preferential interaction of a peptide with one of the two
lipids can be determined by the changes induced in each transition
after peptide addition. Moreover, some peptides have the capacity
to improve lipid miscibility (for details, see refs. 24–27).

4 Notes

1. Ideal buffers for DSC measurements should undergo minimal

heat capacity variation with temperature. Most commonly used
buffers in the laboratory are acceptable as Tris, glycine, phos-
phate, etc. Buffers whose pKa varies considerably with temper-
ature such as HEPES can be problematic. One point that
12 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves

absolutely needs to be considered is that the buffer composi-

tion must be absolutely the same in the reference and in the cell
as very small variations in ion content can greatly affect the heat
capacity and data measurements.
2. The most commonly used lipid model systems for DSC mea-
surements are MLVs, because it is a simple system that can
easily be prepared in all laboratories without the need for
special equipment. Additionally MLVs are very stable in time,
and the phase transitions produced are very sharp and due to
the high cooperativity of the transition. Another possibility is
to use large unilamellar liposomes (LUVs). These systems are
less stable than MLVs but still stable long enough for the time
required for the measurements to be acquired. One advantage
in using LUVs is related with the fact that the P/L ratio can be
properly controlled because in LUVs the ratio of lipid present
in the outer versus inner leaflet is known. For MLVs, since their
size and amount of bilayers per object are heterogeneous, the
P/L ratio cannot be properly determined. The only exception
to that is if the peptides investigated are able to cross all lipid
layers and distribute homogeneously between the different
membranes. Alternatively, it is also common to add peptides
to lipids before formation of liposomes, the peptide is added at
the moment of preparing the lipid film, and therefore the
peptide becomes evenly distributed among the different lipid
layers. This can be advantageous if the peptide is not easily
dissolved in polar solvents. In our laboratory we have privileged
the addition of peptide to lipid after liposome formation
because this procedure resembles best the biological system.
3. Regarding the composition of the lipid model system, one
needs to choose a lipid whose phase transition temperature is
above 0  C (the instrument cannot record below that unless a
special solvent is used that does not freeze at this temperature).
For lipid model systems composed of a single type of lipid and
for the investigation of gel/fluid phase transition, 1 mg of lipid
is enough for a set of experiments. If lipid mixtures are used,
the amount of lipid needed for DSC measurements may have to
be adapted depending on the lipid phase transition and
whether the lipids are miscible or not. Keep in mind that in
DSC one cannot use very complex lipid mixtures because this
will result in very broad and shallow phase transitions. For
lipids that are totally nonmiscible, in principle their phase
transition properties are kept, and thus there is no need to
increase the amount of lipid used. If lipids are miscible, the
resulting phase transition is going to become broader and thus
less well resolved; therefore, lipid concentrations must be
increased so that the transition can be properly followed. Lipids
such as cholesterol when added to phospholipids have the
 DSC Studies of P/L Interactions 13

tendency to greatly broaden the transition, so again higher lipid

concentrations are necessary. Similarly, if one is to investigate
other lipid phase transitions than the gel/fluid, for example,
the transition of lamellar (Lα) to hexagonal (HII) phase transi-
tion, because smaller energy changes are implicated in such
phase transitions (smaller transition peak), then the amount
of lipid must be increased. In the case of the Lα to HII phase
transition of DiPoPe (dipalmitoleoyl phosphatidylethanol-
amine), 10 mg of the lipid was used in reported studies from
our laboratory for a reasonably quantifiable transition to be
monitored [28].
4. DSC studies on P/L interactions have used P/L ratios varying
from 1/500 to 1/10. The P/L ratio at which an effect will be
measurable by DSC depends on the nature and extent of the
peptide-induced lipid perturbation which is related with the
class of membrane-active peptide used. In general when the
appropriated lipid is chosen, considerable peptide effects can be
observed at P/L ratios of 1/50. Care must be taken with the
use of very high peptide concentrations because precipitation
may occur perturbing DSC signal.
5. This is not an exhaustive list but rather a summary of most
common problems that can be encountered during measure-
ments and how to solve them. Some of them have been briefly
mentioned along the protocol.
(a) Buffer/buffer scans are inconsistent. Heat capacity
increases in subsequent scans. This can be due to the
presence of air bubbles in the solution. The solution
should be degassed and reloaded again.
(b) There is an effective Y-offset in the heat capacity data. This
can be caused by pressure variation during data acquisi-
tion. This can result from opening/reclosing the cell to
introduce the sample. The pressure is never exactly the
same after replacing the pressure cap. This can also result
from caps that are getting overused and that do not tightly
close anymore.
(c) Sample scans are not similar between them (when com-
paring among heating or among cooling). This can just be
due to the fact that the sample is not yet equilibrated and
that temperature scans affect sample properties and
homogeneity. The solution is to continue heating/cool-
ing scans until the thermograms are comparable, meaning
that the solution reached thermal equilibrium.
(d) The pressure does not stabilize. This can be due to several
problems: buffer volume in the cells is too low, and the
cap used to close of the apertures is old and does not cap
correctly.
14 Marie-Lise Jobin and Isabel D. Alves
References
1. Cullis PR, Fenske DB, Hope MJ (1996) Physi-
cal properties and functional roles of lipids in
membranes. In: Vance DE, Vance JE (eds)
Biochemistry of lipids, lipoproteins and mem-
branes. Elsevier, Amsterdam, pp 1–32
2. Israelachvili JN, Mitchell DJ, Ninham BW
(1977) Theory of self-assembly of lipid bilayers
and vesicles. Biochim Biophys Acta
470:185–201
3. Lee AG (1977) Lipid phase transitions and
phase diagrams. I. Lipid phase transitions. Bio-
chim Biophys Acta 472:237–281
4. Lee AG (1977) Lipid phase transitions and
phase diagrams. II. Mictures involving lipids.
Biochim Biophys Acta 472:285–344
5. McElhaney RN (1982) The use of differential
scanning calorimetry and differential thermal
analysis in studies of model and biological
membranes. Chem Phys Lipids 30:229–259
6. McIntosh TJ (1996) Hydration properties of
lamellar and non-lamellar phases of phosphati-
dylcholine and phosphatidylethanolamine.
Chem Phys Lipids 81:117–131
7. Epand RM, Bryszewska M (1988) Modulation
of the bilayer to hexagonal phase transition and
solvation of phosphatidylethanolamines in
aqueous salt solutions. Biochemistry
27:8776–8779
8. McElhaney RN (1986) Differential scanning
calorimetric studies of lipid-protein interac-
tions in model membrane systems. Biochim
Biophys Acta 864:361–421
9. Seelig J (2004) Thermodynamics of lipid-
peptide interactions. Biochim Biophys Acta
1666:40–50
10. Heerklotz H (2004) The microcalorimetry of
lipid membranes. J Phys Condens Matter
16:441–467
11. Jimenez-Monreal AM, Villalain J, Aranda FJ,
Gomez-Fernandez JC (1998) The phase
behavior of aqueous dispersions of unsaturated
mixtures of diacylglycerols and phospholipids.
Biochim Biophys Acta 1373:209–219
12. Epand RM, Bach D, Epand RF, Borochov N,
Wachtel E (2001) A new high-temperature
transition of crystalline cholesterol in mixtures
with phosphatidylserine. Biophys J 24. Joanne P, Galanth C, Goasdoue N, Nicolas P,
81:1511–1520
13. Lewis RN, Zhang YP, McElhaney RN (2005)
Calorimetric and spectroscopic studies of the
phase behavior and organization of lipid bilayer
model membranes composed of binary mix-
tures of dimyristoylphosphatidylcholine and
dimyristoylphosphatidylglycerol. Biochim Bio-
phys Acta 1668:203–214
14. Garidel P, Blume A (2000) Miscibility of
phosphatidylethanolamine-
phosphatidylglycerol mixtures as a function of
pH and acyl chain length. Eur Biophys J
28:629–638
15. Raudino A (1995) Lateral inhomogeneous
lipid membranes: theoretical aspects. Adv Col-
loid Interf Sci 57:229–285
16. Almeida PF (2009) Thermodynamics of lipid
interactions in complex bilayers. Biochim Bio-
phys Acta 1788:72–85
17. Riske KA, Barroso RP, Vequi-Suplicy CC,
Germano R, Henriques VB et al (2009) Lipid
bilayer pre-transition as the beginning of the
melting process. Biochim Biophys Acta
1788:954–963
18. Lichtenberg D, Freire E, Schmidt CF,
Barenholz Y, Felgner PL et al (1981) Effect
of surface curvature on stability, thermody-
namic behavior, and osmotic activity of dipal-
mitoylphosphatidylcholine single lamellar
vesicles. Biochemistry 20:3462–3467
19. Mason JT, Huang C, Biltonen RL (1983)
Effect of liposomal size on the calorimetric
behavior of mixed-chain phosphatidylcholine
bilayer dispersions. Biochemistry
22:2013–2018
20. Rouser G, Fkeischer S, Yamamoto A (1970)
Two dimensional then layer chromatographic
separation of polar lipids and determination of
phospholipids by phosphorus analysis of spots.
Lipids 5:494–496
21. Lohner K, Prenner EJ (1999) Differential scan-
ning calorimetry and X-ray diffraction studies
of the specificity of the interaction of antimi-
crobial peptides with membrane-mimetic sys-
tems. Biochim Biophys Acta 1462:141–156
22. Leidy C, Wolkers WF, Jorgensen K, Mouritsen
OG, Crowe JH (2001) Lateral organization
and domain formation in a two-component
lipid membrane system. Biophys J
80:1819–1828
23. Shimshick EJ, Kleemann W, Hubbell WL,
McConnell HM (1973) Lateral phase separa-
tions in membranes. J Supramol Struct
1:285–294
Sagan S et al (2009) Lipid reorganization
induced by membrane-active peptides probed
using differential scanning calorimetry. Bio-
chim Biophys Acta 1788:1772–1781
25. Epand RM (2007) Detecting the presence of
membrane domains using DSC. Biophys Chem
126:197–200

26. Epand RF, Wang G, Berno B, Epand RM
(2009) Lipid segregation explains selective tox-
icity of a series of fragments derived from the
human cathelicidin LL-37. Antimicrob Agents
Chemother 53:3705–3714
27. Polozov IV, Polozova AI, Molotkovsky JG,
Epand RM (1997) Amphipathic peptide affects
DSC Studies of P/L Interactions 15
the lateral domain organization of lipid
bilayers. Biochim Biophys Acta 1328:125–139
28. Alves ID, Goasdoue N, Correia I, Aubry S,
Galanth C et al (2008) Membrane interaction
and perturbation mechanisms induced by two
cationic cell penetrating peptides with distinct
charge distribution. Biochim Biophys Acta
1780:948–959
 Chapter 2

Protocols of IATC, DSC, and PPC: The Multistate Structural

Transition of Cytochrome c
Shigeyoshi Nakamura and Shun-ichi Kidokoro

Abstract
The recent development of high-precision calorimeters allows us to monitor the structural transition of
biomolecules by calorimetry and thereby characterize the thermodynamic property changes accompanying
three-dimensional structure changes. We developed isothermal acid-titration calorimetry (IATC) to evalu-
ate the pH dependence of protein enthalpy. Using the double deconvolution method with precise differ-
ential scanning calorimetry (DSC), we revealed that the MG state is an equilibrium intermediate state of the
reversible thermal three-state transition of the protein, and we successfully determined its volumetric
properties by pressure perturbation calorimetry (PPC). Our findings underscore the importance of a precise
calorimetry and analysis model for protein research.

Key words Differential scanning calorimetry, Pressure perturbation calorimetry, Cytochrome c, Iso-
thermal acid-titration calorimetry

1 Introduction

Calorimetry is the strongest method for evaluating the thermody-

namic parameters in the structural transition of proteins. Over the
last several decades, calorimetry has improved our thermodynamic
knowledge of protein stability by providing a direct method to
measure thermodynamic functions [1–15]. In particular, precise
differential scanning calorimetry (DSC) has enabled us to deter-
mine the enthalpy of a protein molecule as a function of tempera-
ture. The Gibbs free energy, in turn, can be evaluated from the
enthalpy. The heat capacity change is understood to be mainly the
result of a change in the hydration of the protein molecule accom-
panying the structural transition and is important for understand-
ing the mechanism of protein stability [16–18].
Volumetric parameters such as the partial volume and the ther-
mal expansion coefficient are sensitively affected by the hydration
state of protein surfaces. Pressure perturbation calorimetry (PPC) is

Eric Ennifar (ed.), Microcalorimetry of Biological Molecules: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1964,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9179-2_2, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

17
18 Shigeyoshi Nakamura and Shun-ichi Kidokoro

an effective technique for evaluating the thermal expansion coeffi-

cient, αp, of biomaterials [19–22].
Isothermal titration calorimetry (ITC) is also a powerful
method for measuring the dependence of the protein stability on
the solvent composition under a constant temperature [3, 23,
24]. Isothermal acid-titration calorimetry (IATC) was developed
to evaluate the thermodynamic parameters in the pH-induced
structural transition [25, 26].
In this chapter, we introduce the protocols of IATC, DSC, and
PPC in the thermal three-state transition of cytochrome c [27, 28].

2 Materials

2.1 Preparation In this example, an ITC unit of MCS system (MicroCal, North-
for Isothermal Acid- ampton, USA) is used.
Titration Calorimetry 1. Blank solution: 20 mM KCl. Prepare 2 L of blank solution.
(IATC) Add 3.0 g KCl to 1.8 L water (pure Milli-Q water). Adjust the
pH to about 7 by adding NaOH solution (see Note 1). Make
up to 2 L of blank solution with water. Store at 4
C.
2. HCl solution for acid titration: 20 and 400 mM HCl solutions
in 20 mM KCl. Dilute 1 M HCl solution with water to make a
20 mM and a 400 mM HCl solution (see Note 2).
3. Protein solution: Dissolve lyophilized powder of cytochrome
c as 0.5 mg/mL solution with blank solution. Prepare about
30 mL of protein solution for one set of isothermal titration
calorimetry (ITC) measurements (two ITC measurements with
20 mM and 400 mM HCl) and the pH measurements (two pH
measurements with 20 mM and 400 mM HCl) at one temper-
ature. Protein solutions of 3 mL and 10 mL are needed for one
set of ITC and pH measurement, respectively. Store at 4
C.
4. Dialysis: Dialyze the above-described protein solution with a
Spectra/Por dialysis membrane (132,660; cutoff molecular
weight, 6000–8000; Spectrum Laboratories, Rancho Domin-
guez, CA) at 4
C for 1–2 days against a total 2 L of blank
solution. Dialyze 15 mL of protein solution four times against
500 mL of blank solution. The times of dialysis are over 4 h
(first dialysis) and over 8 h (2nd–4th dialysis). After each dialy-
sis, replace 500 mL blank solution with fresh solution for the
next dialysis. Also after final dialysis, collect a protein solution
and store it at 4
C.
5. Subject the protein solution to ultrafiltration with a MolCut
ultra filter unit (USY-20; Advantec, Tokyo, Japan) just before
the IATC measurement (see Note 3).
 Calorimetry of the Cytochrome c 19

2.2 Preparation 1. Blank solution: 50 mM acetate buffer at pH 4.1. Prepare 2 L of

for DSC, PPC, buffer solution. Add 6.0 mL acetic acid to 1.8 L of water (pure
and Density Milli-Q water). Adjust the pH with NaOH to 4.1. Make up to
Measurement 2 L of blank solution with water. Store at 4
C.
2. Protein solution: Dissolve the lyophilized powder of proteins as
a 20 mg/mL solution with blank solution (50 mM acetate
buffer at pH 4.1). Prepare about 6 mL of protein solution.
Store at 4
C.
3. Dialysis: Dialyze the protein solution with a Spectra/Por dialy-
sis membrane (132,660; cutoff molecular weight, 6000–8000;
Spectrum Laboratories) at 4
C for 1–2 days against a total 2 L
of blank solution. Dialyze 6 mL protein solution four times
against 500 mL blank solution. The times of dialysis are over
4 h (first dialysis) and over 8 h (2nd–4th dialysis). After each
dialysis, replace 500 mL blank solution with fresh solution for
the next dialysis. Also after final dialysis, collect a protein solu-
tion and store it at 4
C.
4. Subject the protein solution to ultrafiltration with a MolCut
ultra filter unit (USY-20; Advantec) just before the DSC and
PPC measurements (see Note 3).
5. Determine the concentration of protein solution with a spectro-
photometer by using an extinction coefficient of
ε409 ¼ 9.197  104/M/cm. The concentration of cytochrome
will become about 18 mg/mL after filtering. Use 18 mg/mL
cytochrome c for the PPC and density measurement (see Note 4).
Dilute the cytochrome c solution by adding buffer to adjust to
about 1 mg/mL of cytochrome c for DSC.
6. Perform the complete degassing of the protein solution by
several minutes of aspiration using a membrane pump, and
simultaneously sonicate the solution using a small sonication
device just before the measurements of DSC, PPC, and density.
7. Perform the differential scanning calorimetry (DSC) experi-
ments of cytochrome c with a highly sensitive differential scan-
ning calorimeter, MicroCal VP-DSC (Malvern Instruments
Ltd., Worcestershire, UK).
8. DMA5000 high-precision vibrating tube densitometer (Anton
Paar, Graz, Austria).
9. Perform the pressure perturbation calorimetry (PPC) experi-
ments of cytochrome c with a highly sensitive differential scan-
ning calorimeter, MicroCal VP-DSC, equipped with a PPC
accessory pressurizing system (Malvern Instruments Ltd.).
20 Shigeyoshi Nakamura and Shun-ichi Kidokoro

3 Methods

3.1 IATC IATC is the calorimetric method used to evaluate the thermody-
namic parameters in the acid-induced structural transition of pro-
tein. IATC measurement consists of ITC and pH measurements.
During the IATC measurement, acid titrations of
low-concentration HCl (20 mM HCl) and high-concentration
HCl (400 mM HCl) to the cytochrome c solution are performed
to evaluate the thermodynamic parameters precisely (see Note 2).

3.1.1 ITC for IATC 1. Determine the concentration of the protein solution with a
spectrophotometer by using an extinction coefficient of
ε409 ¼ 9.197  104/M/cm. Use 0.5 mg/mL cytochrome
c in 20 mM KCl as the sample solution (see Subheading 2.1,
item 2).
2. Perform the complete degassing of the protein solution for
several minutes by aspiration with a membrane pump while
simultaneously sonicating the solution with a small sonication
device (see Note 5).
3. ITC measurement for the protein solution with 20 mM HCl:
Perform the 20 mM HCl titration to protein solution using an
isothermal titration calorimetry. First, load the protein solution
in the ITC sample cell. The cell volume is 1.368 mL. Perform
the titration with injections of 2 μL (1st–20th injections), 5 μL
(21th–35th injections), and 10 μL (35th–50th injections) in
each of 20 mM HCl solution in 20 mM KCl using a 250 μL
syringe (see Note 6). Before each experiment, wash the ITC cell
several times with a blank solution. In the present experiments,
the ITC measurements were performed at 40
C.
4. ITC measurement for the blank solution with 20 mM HCl:
Perform the control experiment (20 mM HCl titration to the
blank solution) in the absence of protein solution throughout
the same pH range by using ITC.
5. ITC measurement for protein solution with 400 mM HCl:
Perform the 400 mM HCl titration to protein solution using
a microcalorimeter. Conduct the titration using injections of
2 μL (1st–20th injections), 5 μL (21th–35th injections), and
10 μL (35th–50th injections) in each of 400 mM HCl solution
in 20 mM KCl using a 250 μL syringe. Before each experiment,
wash the ITC cell several times with a blank solution.
6. ITC measurement for the blank solution with 400 mM HCl:
Perform the control experiment (400 mM HCl titration to the
blank solution) in the absence of protein solution throughout
the same pH range of the sample measurement by using ITC.
 Calorimetry of the Cytochrome c 21

3.1.2 pH Measurement 1. Calibration of pH meter: Perform the three-point calibration

for IATC of the pH meter using standard pH solutions of pH 2, pH 4,
and pH 7. Correct the observed pH values of the protein
solution with the second-order polynomial function, the coef-
ficients of which are determined by using the pH values of three
standard solutions at the experimental temperature.
2. pH measurement for the protein solution with 20 mM HCl:
Measure the pH of 20 mM HCl titration with the protein
solution by using a glass electrode and a pH meter. For the
pH measurements, use a solution identical to that used for the
ITC measurements. Use a 10 mL initial volume of the protein
solution and then determine the injection volumes as the ratios
between the initial and the injection volumes became identical
to those of each corresponding injection in the ITC measure-
ments. In the case described in Subheading 3.1.1, step 3, the
ITC conditions were as follows: ITC cell volume, 1.368 mL;
injection volumes, 2 μL (1st–20th injections), 5 μL (21th–35th
injections), and 10 μL; and injection volumes of the pH mea-
surements, 14.6 μL (1st–20th injections), 36.5 μL (21th–35th
injections), and 73 μL (35th–50th injections). Perform these
injections manually by using a pipetman (see Note 7). Keep the
temperature of the titration vessel constant in a handmade glass
bath with circulating water from a thermostat water bath.
Record the pH values after each titration.
3. pH measurement for the blank solution with 20 mM HCl:
Perform the control experiment (20 mM HCl titration to the
blank solution) in the absence of a protein solution throughout
the same pH range by using the ITC measurements of the
blank experiment. Use the same initial volume and injection
volume as under the experimental conditions for the pH mea-
surements of the protein solution. Record the pH values after
each titration.
4. pH measurement for protein solution with 400 mM HCl:
Perform the pH measurement of 400 mM HCl titration with
the protein solution by using a glass electrode and a pH meter
in the same manner as for the pH measurement of the sample
solution with 20 mM HCl (see Subheading 3.1.2, step 2). Use
the same solution for the pH measurements as used for the ITC
measurements. For the pH measurements, the initial volume of
the protein solution is 10 mL, and the injection volumes are
determined as the ratios between the initial and the injection
volumes become identical to those of each corresponding
injection in the ITC measurements. In the case of the experi-
mental conditions for ITC (see Subheading 3.1.1, step 5), the
Another random document with
no related content on Scribd:
häneen… En ole koskaan tullut ajatelleeksi, että sinä häntä siinä
määrin halveksit! Ansaitseeko hän tosiaankin sen?

— Jos käyn hänen luonaan, niin siihen minulla saattaa olla omat
syyni, siinä on kyllin sinulle. Mitä taas sukulaisuuteen tulee, niin
pikemmin hän on veljesi tai itse isäukkosi kautta sukua sinulle kuin
minulle. No, nyt olemme perillä. Mene mieluummin keittiöön. Ai! Mitä
täällä, mitä tämä on? Olemmeko myöhästyneet? Mutta eiväthän he
ole voineet syödä niin pian? Ovatko täällä taas Karamazovit jotakin
rötöstäneet? Varmaankin. Kas tuossahan on isäsikin ja Ivan
Fjodorovitš hänen jäljessään. He ovat syöksyneet ulos igumenin
luota. Kas tuolla isä Isidor huutaa portailta jotakin heidän jälkeensä.
Ja sinun isäsi huutaa myös ja huitoo käsillään, nähtävästi riitelee.
Ohoo, tuollahan on Miusov vaunuissaan menossa pois, näetkö, hän
ajaa! Ja tuossa juoksee tilanomistaja Maksimov — täällähän on
tapahtunut skandaali! ei päivällisiä ole ollut! Kunhan eivät vain olisi
pieksäneet igumenia? Tai ehkäpä he itse ovat saaneet selkäänsä?
Sepä olisi ollut paikallaan!

Rakitin ei huudahdellut suotta. Oli todellakin tapahtunut skandaali,

ennenkuulumaton ja odottamaton. Kaikki oli tapahtunut
»innostuksessa».

8.

Skandaali

Kun Miusov ja Ivan Fjodorovitš jo olivat astumassa sisälle

igumenin luo, niin Pjotr Aleksandrovitšissa, kuten todella
kunnolliselta ja huomaavaiselta mieheltä sopi odottaakin, tapahtui
tavallaan herkkä prosessi: häntä alkoi hävettää vihastumisensa. Hän
tunsi mielessään, että ala-arvoista Fjodor Pavlovitšia hänen
oikeastaan olisi pitänyt pitää niin vähäarvoisena, että hänen tähtensä
ei olisi kannattanut menettää mielentyyneyttään luostarinvanhimman
kammiossa ja siinä määrin kiivastua, kuin hänelle oli tapahtunut.
»Ainakaan munkit eivät tässä ole syypäitä mihinkään», päätti hän
äkkiä igumenin portailla, »ja jos täälläkin on kunnon väkeä (tuo isä
Nikolai, igumeni, lienee myös aatelissukua), niin miksi en olisi heitä
kohtaan ystävällinen, rakastettava ja kohtelias?… En rupea
kiistelemään, vieläpä olen samaa mieltäkin kuin he, kiehdon heidät
rakastettavuudella ja… lopuksi osoitan heille, että minun seuraani ei
ole tuo pilkkakirves, tuo narri, tuo Pierrot, ja että minä olen joutunut
välikäteen aivan samoin kuin hekin kaikki…»

Riidanalaiset hakkuupaikat metsässä ja tuon kalanpyyntipaikan

(missä ne kaikki olivat, sitä hän ei itsekään tietänyt) hän päätti
luovuttaa heille lopullisesti, kerta kaikkiaan, jo tänään, sitäkin
suuremmalla syyllä, kun kaikki tämä maksoi sangen vähän, sekä
antaa kaikkien haasteittensa luostaria vastaan raueta.

Kaikki nämä hyvät aikomukset vielä vahvistuivat, kun he astuivat

igumenin ruokasaliin. Ruokasalia tällä muuten ei ollut, sillä
oikeastaan igumenilla oli koko rakennuksessa vain kaksi huonetta,
jotka tosin olivat paljon isommat ja mukavammat kuin
luostarinvanhimman. Mutta huoneitten kalusto ei ollut erikoisen
mukava: huonekalut olivat nahalla päällystetyt, mahonkiset,
kaksikymmentäluvun vanhaa tyyliä, ja lattiatkin olivat
maalaamattomat. Sen sijaan kaikki hohti puhtautta, ja ikkunoilla oli
paljon kalliita kukkasia. Mutta komeinta oli tällä hetkellä tietenkin
ylellisesti katettu pöytä, vaikka luonnollisesti tämäkin on käsitettävä
suhteellisesti: pöytäliina oli puhdas, astiat kiilsivät. Oivallisesti
paistettua leipää oli kolmea lajia, kaksi pulloa viiniä, kaksi pulloa
luostarin mainiota mettä ja iso lasikannu täynnä luostarin kaljaa, joka
oli kuuluisaa koko paikkakunnalla. Viinaa ei ollut ollenkaan. Rakitin
kertoi myöhemmin, että päivälliseksi oli tällä kertaa laitettu viisi
ruokalajia: sterlettilientä kalapiirakoiden kanssa, sitten pehmeäksi
keitettyä kalaa, joka oli valmistettu jollakin erikoisella ja erinomaisella
tavalla, sitten sampikotlettia, jäätelöä ja hilloketta ja lopuksi
kermahyytelön tapaista kiisseliä. Kaiken tämän Rakitin sai selville,
hän kun ei malttanut olla kurkistamatta igumenin keittiöön, jossa
hänellä myös oli suhteita. Hänellä oli kaikkialla suhteita, ja kaikki tuli
hänen korviinsa. Hänellä oli sangen levoton ja kateellinen sydän.
Huomattavista lahjoistaan hän oli täysin tietoinen, mutta omassa
mielessään hän niitä hermostuneesti yliarvioi. Hän tiesi varmasti,
että hänestä tulee omalla tavallaan huomattava henkilö, mutta
Aljošaa, joka oli häneen hyvin kiintynyt, kiusasi se, että ystävä
Rakitin oli epärehellinen eikä ollenkaan huomannut sitä itse, vaan
päinvastoin piti itseään mitä rehellisimpänä miehenä, koska tiesi
itsestään, että hän ei varastaisi pöydälle jätettyjä rahoja.
Tämmöiselle miehelle ei Aljoša eikä kukaan muukaan voinut mitään.

Rakitinia, joka oli vähäpätöinen henkilö, ei ollut voitu kutsua

päivälliselle, mutta sen sijaan oli kutsuttu isä Josef ja isä Paísi sekä
heidän mukanaan vielä eräs pappismunkki. He odottivat jo igumenin
ruokailuhuoneessa, kun huoneeseen astuivat Pjotr Aleksandrovitš,
Kalganov ja Ivan Fjodorovitš. Syrjemmällä oli odottamassa myös
tilanomistaja Maksimov. Isä igumeni astui vastaanottamaan vieraita
keskelle huonetta. Hän oli pitkä, laiha, mutta vielä vahva vanhus,
jonka mustissa hiuksissa oli paljon harmaata ja jolla oli pitkät,
tekopyhät ja arvokkaat kasvot. Hän kumarsi vieraille ääneti, mutta
nämä lähestyivät tällä kertaa ottamaan vastaan siunausta. Miusov
uskalsi yrittää suudella hänen kättänsäkin, mutta igumeni veti
jotenkin kätensä oikeaan aikaan pois, niin että suutelemisesta ei
tullut mitään. Sen sijaan Ivan Fjodorovitš ja Kalganov tällä kertaa
saivat täydellisen siunauksen, t.s. he suudella mäiskäyttivät aivan
vilpittömästi ja rahvaan tapaan kättä.

— Meidän täytyy suuresti pyytää anteeksi, teidän korkea-

arvoisuutenne, — aloitti Pjotr Aleksandrovitš kohteliaasti hymyillen,
mutta kuitenkin arvokkaasti ja kunnioittavasti, — pyytää anteeksi,
että saavumme yksin, ilman teidän kutsumaanne seuralaistamme
Fjodor Pavlovitšia. Hänen oli pakko kieltäytyä tulemasta pöytäänne
eikä syyttä. Arvoisan isä Zosiman kammiossa hän kiihtyi
onnettomasta perheriidastaan poikansa kanssa ja lausui muutamia
sanoja, jotka eivät ensinkään olleet paikallaan… sanalla sanoen
aivan sopimattomia… josta, niinkuin näyttää (hän katsahti
pappismunkkeihin), teidän korkea-arvoisuudellanne jo on tieto. Sen
vuoksi hän tunnustaen syyllisyytensä ja vilpittömästi katuen tunsi
häpeätä, jota ei voinut voittaa, minkä vuoksi hän pyysi meitä, minua
ja poikaansa Ivan Fjodorovitšia, esiintuomaan teille vilpittömän
valittelunsa, pahan mielensä ja katumuksensa… Sanalla sanoen hän
toivoo voivansa ja tahtoo hyvittää kaiken myöhemmin, mutta nyt hän
pyytäen siunaustanne toivoo teidän unohtavan sen, mikä on
tapahtunut…

Miusov vaikeni. Päästyään sanatulvansa loppuun hän oli itseensä

niin tyytyväinen, että äskeisestä ärtyneisyydestä ei ollut jäänyt
jälkeäkään hänen sieluunsa. Hän rakasti taas ihmiskuntaa
täydelleen ja vilpittömästi. Igumeni, joka oli kuunnellut häntä
arvokkaasti, taivutti hiukan päätään ja lausui vastaukseksi:
 — Valitan sydämestäni poisjäämistä. Kenties poistunut
pöydässämme olisi mieltynyt meihin, samoin kuin me häneen. Terve
tuloa, hyvät herrat, aterialle!

Hän asettui jumalankuvan eteen ja alkoi ääneensä rukoilla. Kaikki

kumartuivat kunnioittavasti, ja tilanomistaja Maksimov asettui
sitäpaitsi erikoisesti eteen ja pani hartaasti kätensä ristiin.

Juuri silloinpa Fjodor Pavlovitš löikin viimeisen valttinsa.

Huomattavaa on, että hän todellakin aikoi lähteä pois ja todellakin
tunsi, että hänen oli viimeisen häpeällisen esiintymisensä jälkeen
luostarinvanhimman kammiossa mahdotonta mennä igumenin luo
päivälliselle aivan kuin ei mitään olisi tapahtunut. Eipä silti, että hän
niin kovin olisi hävennyt ja syyttänyt itseään. Kenties asian laita oli
aivan päinvastoin. Joka tapauksessa hän tunsi kuitenkin, että ei ollut
sopivaa mennä päivälliselle. Mutta heti kun majatalon oven eteen
tuotiin hänen rämisevät rattaansa ja hän jo alkoi nousta niihin, hän
äkkiä pysähtyi. Hänelle muistuivat mieleen hänen omat sanansa
luostarinvanhimman luona: »Niinpä minusta juuri aina tuntuukin, kun
menen ihmisten pariin, että minä olen huonompi kaikkia ja että kaikki
pitävät minua narrina, — ja niinpä: annahan kun tosiaankin
heittäydyn narriksi, sillä te olette jok'ikinen tyhmempiä ja katalampia
kuin minä.» Hänessä virisi halu kostaa kaikille oman
ruokottomuutensa tähden. Hän muisti nyt yht'äkkiä, kuinka häneltä
kerran jo entisinä aikoina oli kysytty: »Miksi te niin vihaatte sitä ja sitä
henkilöä?» Hän oli silloin vastannut narrimaisen
hävyttömyydenpuuskan vallassa: »Seuraavasta syystä: hän ei tosin
ole tehnyt minulle mitään, mutta sen sijaan minä olen tehnyt häntä
kohtaan erään tunnottoman ja ilkeän teon ja heti sen tehtyäni aloin
vihata häntä.» Muistettuaan nyt tämän hän naurahti hiljaa ja ilkeästi
ja mietti hetkisen. Hänen silmänsä välähtivät ja huuletkin alkoivat
vavista. »Kun kerran aloin, niin lopetankin», päätti hän yhtäkkiä.
Hänen salaisimman tunteensa tällä hetkellä olisi voinut ilmaista
seuraavin sanoin: »Enhän nyt enää voi korjata asioitani entiselleen,
annapa kun vielä syljen heidän päälleen häpeämättömästi: näytän,
että en häpeä heitä, siinä kaikki!» Hän käski ajomiehen odottaa ja
palasi itse nopein askelin luostariin suunnaten kulkunsa suoraan
igumenin luo. Vielä hän ei itsekään tietänyt, mitä aikoi tehdä, mutta
hän tiesi, että ei enää voinut hillitä itseään, ja pienikin sysäys sai
hänet samassa menemään iljettävyyden äärimmäisille rajoille, —
muuten vain iljettävyyden eikä ollenkaan rikoksen tai sellaisen
kepposen, josta tuomioistuin voi rangaista. Viimeksimainitun
laatuisessa tapauksessa hän osasi aina hillitä itsensä ja ihmetteli
toisinaan itsekin tätä. Hän ilmestyi igumenin ruokasaliin juuri sillä
hetkellä, kun rukous päättyi ja kaikki siirtyivät pöytää kohti.
Pysähtyen kynnykselle hän silmäili seuraa ja alkoi nauraa pitkää,
julkeata, ilkeätä naurua katsellen kaikkia rohkeasti silmiin.

— Hepä luulivat minun lähteneen pois, mutta tässäpä mies on! —

huudahti hän kuuluvasti.

Hetken ajan olivat kaikkien katseet kiintyneet häneen ja kaikki

olivat vaiti, mutta äkkiä kaikki tunsivat, että kohta tapahtuu jotakin
inhoittavaa, järjetöntä, ehdoton skandaali. Pjotr Aleksandrovitšin mitä
hellin mieliala muuttui äkkiä mitä rajuimmaksi. Kaikki, mikä hänen
sydämessään oli sammunut ja tyyntynyt, heräsi yht'äkkiä eloon ja
nousi pinnalle.

— Ei, minä en voi kestää tätä! — huudahti hän. — En ollenkaan

voi… enkä… mitenkään voi!

Veri tulvahti hänen päähänsä. Hänen puheensakin sekaantui,

mutta nyt ei ollut aika puhua, ja hän tempasi hattunsa.
 — Mitä hän oikein ei voi? — huudahti Fjodor Pavlovitš. — »Ei
mitenkään voi eikä ensinkään voi?» Teidän korkea-arvoisuutenne,
saanko astua sisälle vai enkö? Otatteko vastaan pöytätoverin?

— Terve tuloa kaikesta sydämestä, — vastasi igumeni. — Hyvät

herrat! Uskallanko pyytää, — lisäsi hän äkkiä, — teitä sydämestäni
jättämään tilapäiset riitanne ja yhtymään rakkaudessa ja
sukulaissovussa Jumalaa rukoillen rauhallisessa ruokapöydässäni…

— Ei, ei, se on mahdotonta! — huudahti Pjotr Aleksandrovitš ollen

aivan kuin suunniltaan.

— Jos kerran Pjotr Aleksandrovitšille on mahdotonta, niin

minullekin on mahdotonta enkä minäkään jää. Sillä ehdolla tulinkin.
Olen tästä lähin kaikkialla Pjotr Aleksandrovitšin kanssa: jos te, Pjotr
Aleksandrovitš, menette pois, niin minäkin menen, jos te jäätte —
niin minäkin jään. Sukulaissovulla te, isä igumeni, häntä pahimmin
pistittekin: hän ei tunnusta itseään sukulaisekseni. Eikö niin, von
Sohn? Tässä seisookin von Sohn. Terve, von Sohn!

— Mi… minuako te? — mutisi hämmästyneenä tilanomistaja

Maksimov.

— Tietysti sinua, — huudahti Fjodor Pavlovitš. — Ketä muuta

sitten? Ei suinkaan isä igumeni ole von Sohn.

— Enhän minäkään ole von Sohn, minä olen Maksimov.

— Ei, sinä olet von Sohn. Teidän korkea-arvoisuutenne, tiedättekö,

mikä on von Sohn? Oli semmoinen rikosjuttu: hänet tapettiin
porttolassa, — niin kaiketi noita paikkoja teillä nimitetään, — tapettiin
ja ryöstettiin ja kunnioitettavasta iästään huolimatta tungettiin
laatikkoon ja lähetettiin pakaasivaunussa Pietarista Moskovaan,
numerolappu päällä. Ja samaan aikaan kuin laatikkoa nakuteltiin
kiinni, haureliaat tanssijattaret lauloivat lauluja ja soittivat kanteleita,
toisin sanoen pimputtelivat fortepianoa. Tämä tässä on juuri sama
von Sohn. Hän on noussut kuolleista, eikö niin, von Sohn?

— Mitä tämä oikein on? Kuinka tämä on ymmärrettävä? — kuului

ääniä pappismunkkien ryhmästä.

— Menkäämme! — huudahti Pjotr Aleksandrovitš kääntyen

Kalganovin puoleen.

— Ei, sallikaahan! — keskeytti Fjodor Pavlovitš vinkuvalla äänellä

astuen vielä askelen huoneeseen. — Sallikaa minunkin lopettaa.
Siellä kammiossa minulle toitotettiin, että muka käyttäydyin
epäkunnioittavasti nimenomaan siinä suhteessa, että mainitsin
rantatöröistä. Pjotr Aleksandrovitš Miusov, sukulaiseni, pitää siitä,
että puheessa on plus de noblesse que de sincérité, mutta minä
päinvastoin pidän siitä, että puheessani olisi plus de sincérité que de
noblesse, ja hiiteen koko noblesse! Eikö niin, von Sohn! Sallikaa, isä
igumeni, vaikka minä olenkin narri ja esittäydyn narrina, niin olen
kunnian ritari ja tahdon sen lausua julki. Niin, minä olen kunnian
ritari, mutta Pjotr Aleksandrovitšissa on loukattu itserakkaus eikä
mitään muuta. Ehkäpä minä äsken tulinkin tänne katsomaan ja
puhumaan suuni puhtaaksi. Täällä on poikani Aleksei pelastusta
etsimässä. Minä olen isä, minä huolehdin ja velvollisuuteni on
huolehtia hänen kohtalostaan. Minä kuuntelin ja teeskentelin kaiken
aikaa ja katselin kaikessa hiljaisuudessa, mutta nyt tahdon esittää
teille näytelmän viimeisenkin näytöksen. Millaista onkaan meillä? Jos
meillä mikä lankeaa, niin se jääkin makaamaan. Mikä meillä on
kaatunut, se saakin ikänsä maata. Eipä niinkään! Minä tahdon
nousta. Pyhät isät, te olette saattaneet minut raivoon. Rippi on suuri
sakramentti, jota kohtaan tunnen suurta kunnioitusta ja jonka edessä
olen valmis lankeamaan maahan, mutta täällä kammiossa ovat
yht'äkkiä kaikki polvillaan ja ripittäytyvät kaikkien kuullen. Onko lupa
ripittäytyä toisten kuullen? Pyhät isät ovat määränneet korvaripin,
vain silloin rippinne on sakramentti, ja näin on ollut ammoisista
ajoista. Kuinka minä voin hänelle selittää kaikkien kuullen, että minä,
esimerkiksi, olen sitä ja sitä… no, se on sitä ja sitä, ymmärrättekö?
Toisinaan on säädytöntä sanoakin. Tämähän on skandaali! Ei, isät,
teidän kanssanne täällä kenties joutuu ruoskijain uskonlahkoon…
Minä kirjoitan ensi tilassa synodiin ja otan poikani Aleksein kotiin…

Tässä pieni huomautus. Fjodor Pavlovitš tunsi kielikellojen jutut.

Aikoineen kierteli ilkeämielisiä juoruja, jotka saapuivat piispankin
korviin (ei vain meidän luostaristamme, vaan muistakin luostareista,
joissa oli luostarinvanhin), että luostarinvanhimpia muka liiaksi
kunnioitetaan, niin että igumenin arvokin siitä kärsii, ja että muun
muassa luostarinvanhimmat väärinkäyttävät ripin sakramenttia y.m.,
y.m. Järjettömiä syytöksiä, jotka aikoinaan raukesivat itsestään niin
meillä kuin kaikkialla muuallakin. Mutta typerä piru, joka oli saanut
kynsiinsä Fjodor Pavlovitšin ja kiidätti häntä hänen omilla
hermoillaan jonnekin yhä kauemmaksi ja kauemmaksi häpeälliseen
syvyyteen, kuiskasi hänen korvaansa tämän vanhan syytöksen, josta
Fjodor Pavlovitš itse ei ymmärtänyt luotuista sanaakaan. Eikä hän
edes osannut lausua sitä oikeassa muodossa, varsinkin kun tällä
kertaa ei kukaan vanhuksen kammiossa ollut langennut polvilleen
eikä ripittäytynyt kaikkien kuullen, niin että Fjodor Pavlovitš ei ollut
voinut itse nähdä mitään semmoista, vaan puhui ainoastaan
vanhojen huhujen ja juorujen mukaan, joita sattui jossakin määrin
muistamaan. Lausuttuaan tyhmyytensä hän tunsi lasketelleensa
järjetöntä hölynpölyä, ja silloin hänen mielensä heti teki osoittaa
kuulijoille ja ennen kaikkea itselleen, että hän ei ollut puhunut
ensinkään pötyä. Ja vaikka hän varsin hyvin tiesi, että jokainen uusi
sana lisäisi jo lausuttuun pötyyn yhä uutta ja järjettömämpää, niin
hän ei enää voinut hillitä itseään, vaan syöksyi siihen päistikkaa.

— Millaista halpamaisuutta! — huudahti Pjotr Aleksandrovitš.

— Anteeksi, — sanoi äkkiä igumeni. — On sanottu vanhastaan:

»Ja hän alkoi minua vastaan puhua paljon ja monenlaista ja
saastaisiakin asioita. Mutta minä kuultuani kaiken sanoin itselleni: se
on Jeesuksen lääkitsemistointa ja hän on lähettänyt sen
parantamaan ylpeilevää sieluani.» Ja siksi mekin nyt kiitämme teitä
nöyrästi, kallis vieras!

Ja hän kumarsi syvään Fjodor Pavlovitšille.

— Tö-tö-tö! Teeskentelyä ja vanhoja fraaseja! Vanhoja fraaseja ja

vanhoja eleitä! Vanhoja valheita ja muodollisia kumarruksia maahan
asti! Me tunnemme nämä kumarrukset! »Suudelma suulle ja tikari
sydämeen», kuten Schillerin Rosvoissa. Minä en pidä petkutuksesta,
isät, minä tahdon totuutta! Mutta totuus ei ole rantatöröissä, ja sen
minä olen lausunut julki! Isät ja munkit, miksi te paastoatte? Miksi te
odotatte siitä itsellenne palkintoa taivaissa? Semmoisesta palkasta
minäkin rupean paastoamaan! Ei, pyhä munkki, olepa hyveellinen
elämässä, tuota hyötyä yhteiskunnalle sulkeutumatta luostariin
valmiin leivän ääreen ja odottamatta palkintoa siellä, ylhäällä, — kas
sepä onkin vaikeampaa. Osaanhan, isä igumeni, minäkin kauniisti
puhua. Mitä heillä täällä on varattuna? — hän astui pöydän luo. —
Vanhaa Old factory -portviiniä, Médoc-viiniä, Jelisejevin veljesten
pulloihin panemaa, onpa ne isiä! Eipä tämä näytä rantatöröiltä. Kas
vain, kun isät ovat panneet puteleita pöytään, hehehe! Kuka onkaan
tämän kaiken tänne hankkinut? Sen on tehnyt venäläinen talonpoika,
raataja, hän tuo tänne känsäisillä käsillään ansaitun roponsa, riistää
sen perheeltään ja valtion tarpeilta! Tehän, pyhät isät, imette kansaa!

— Tuo on aivan arvotonta teidän puoleltanne, — lausui isä Josef.

Isä Paísi oli itsepintaisesti vaiti. Miusov syöksyi juoksujalkaa ulos
huoneesta, ja Kalganov seurasi häntä.

— No, isät, minäkin riennän Pjotr Aleksandrovitšin jälkeen! Enää

en tule teille, pyytäkää vaikka polvillanne, niin en tule. Tuhat ruplaa
lähetin teille, siksipä te taaskin odotatte vesissä suin, hehehe! Ei,
ette saa minulta lisää. Kostan menneestä nuoruudestani, kaikesta
nöyryytyksestäni! — hän iski nyrkkiä pöytään valmistamansa
tunteenpuuskan vallassa. — Paljon on merkinnyt tämä
luostaripahanen elämässäni! Paljon katkeria kyyneliä olen sen takia
vuodattanut! Te yllytitte vaimoni, riivatun, minua vastaan. Te olette
senkin seitsemässä kokouksessa minut kironneet, levittäneet
mainettani ylt'ympäri! Riittää jo, isät, nyt on liberaalinen aika,
höyrylaivojen ja rautateitten aikakausi. Ette saa minulta tuhatta
ettekä sataa ruplaa, ette sataa kopeekkaa, ette mitään!

Taas huomautus. Meidän luostarimme ei ollut koskaan mitään

tuommoista merkinnyt hänen elämässään eikä hän ollut sen takia
vuodattanut mitään katkeria kyyneliä. Mutta hän innostui siinä
määrin teeskennellyistä kyynelistään, että hän itsekin eräänä
hetkenä oli vähällä uskoa itseään, vieläpä ruveta itkemään
liikutuksesta. Mutta samalla hetkellä hän tunsi, että oli aika pyörtää
takaisin. Kuultuaan hänen ilkeän valheensa igumeni painoi päätään
alaspäin ja lausui taas vakavasti:

— Jälleen on sanottu: »Kärsi sinuun kohdistettu ansaitsematon

häväistys ilomielin, älä suutu äläkä rupea vihaamaan häpäisijääsi.»
Näin me menettelemme.
 — Tö-tö-tö, pupatusta ja papatusta ja muuta puuta heinää!
Papattakaa, isät, mutta minä lähden. Ja poikani Aleksein otan täältä
isän oikeudella ainiaaksi. Ivan Fjodorovitš, kelpo poikani, sallikaa
minun käskeä teitä seuraamaan itseäni! Von Sohn, mitä sinä tänne
jäisit! Tule heti luokseni kaupunkiin. Minun luonani on hauskaa.
Matkaa on vain virstan verran, paastoöljyn asemesta tarjoan
porsasta puuron kera. Syömme päivällistä, panen pöytään konjakkia,
sitten likööriä, mesimarjalikööriä… Hei, von Sohn, älä päästä onnea
käsistäsi!

Hän lähti ulos huutaen ja huitoen. Juuri sillä hetkellä Rakitin hänet
näki tulemassa ulos ja näytti Aljošalle.

— Aleksei! — huudahti isä hänelle jo kaukaa hänet nähtyään. —

Muuta jo tänään luokseni kokonaan ja tuo mukanasi tyyny ja patja,
älköönkä täällä enää olko hajuakaan sinusta.

Aljoša pysähtyi kuin jähmettyneenä ja katseli ääneti ja

tarkkaavaisesti kohtausta. Sillävälin oli Fjodor Pavlovitš noussut
rattaille ja hänen jäljessään alkoi äänettömänä ja jurona niihin nousta
Ivan Fjodorovitš käännähtämättä Aljošaan edes hyvästelläkseen.
Mutta nyt tapahtui vielä eräs kohtaus, joka oli miltei uskomaton ja
ilveilyn kaltainen ja täydensi episodin. Äkkiä ilmestyi rattaitten
astuimen luo tilanomistaja Maksimov. Hän juoksi hengästyneenä
ennättääkseen mukaan. Rakitin ja Aljoša näkivät, miten hän juoksi.
Hänellä oli niin kiire, että hän malttamattomuudessaan pisti jalkansa
astuimelle, jolla vielä oli Ivan Fjodorovitšin vasen jalka, ja tarttuen
kärrykoriin hän alkoi kiivetä rattaille.

— Minäkin, minäkin tulen kanssanne! — huusi hän hypäten

rattaille ja nauraen hiljaista, iloista naurua autuaan näköisenä ja
valmiina kaikkeen. — Ottakaa minutkin mukaan!
 — No, enkö sanonut, — huudahti Fjodor Pavlovitš
voitonriemuisesti, — että tämä on von Sohn! Sehän on todellinen
kuolleista noussut von Sohn! Miten kykenitkään sieltä irtaantumaan?
Mitä Sohnin sotkua sinä siellä olet saanut aikaan ja miten sinä
saatoit lähteä pois päivälliseltä? Onpa siinä paksunahkainen mies!

Minä olen purrut hävyltä hännän poikki, mutta en toki ole sinun
veroisesi! Hyppää, hyppää pian! Päästä hänet, Vanja, tulee hauskaa.
Hän voi jotenkuten loikoa tässä jalkojen päällä. Lojutko, von Sohn?
Vai pistäisikö hänet pukille ajomiehen kanssa?… Hyppää pukille,
von Sohn!

Mutta Ivan Fjodorovitš, joka jo oli istuutunut paikalleen, töytäisi

äkkiä mitään sanomatta ja kaikin voimin Maksimovia rintaan, niin
että hän lensi sylen päähän. Sattumalta vain hän ei kaatunut.

— Antaa mennä! — huudahti Ivan Fjodorovitš vihaisesti

ajomiehelle.

— No, mitäs sinä? Mitä sinä? Miksi sinä häntä noin? — alkoi
Fjodor
Pavlovitš torua, mutta rattaat olivat jo lähteneet liikkeelle. Ivan
Fjodorovitš ei vastannut.

— Senkin mokoma! — lausui Fjodor Pavlovitš oltuaan vaiti pari

minuuttia ja katsoi karsaasti poikaansa. — Sinun keksintöäsihän oli
koko tämä luostari, sinä itse yllytit, itse hyväksyit, miksi sitten nyt olet
vihainen?

— Riittää jo roskan puhuminen, levätkää edes nyt pikkuisen, —

tokaisi
Ivan Fjodorovitš töykeästi.
 Fjodor Pavlovitš oli taas vaiti pari minuuttia.

— Nyt olisi konjakki paikallaan, — huomautti hän mietteissään.

Mutta
Ivan Fjodorovitš ei vastannut.

— Kunhan tullaan perille, niin sinäkin juot.

Ivan Fjodorovitš oli yhä vaiti.

Fjodor Pavlovitš odotti vielä pari minuuttia.

— Mutta Aljoškan minä kuitenkin otan pois luostarista siitä

huolimatta, että se on teistä sangen epämieluisaa, kunnioitettava
Karl von Moor.

Ivan Fjodorovitš kohautti halveksivasti olkapäitään, kääntyi

poispäin ja alkoi katsella tielle. Sen jälkeen he eivät koko
kotimatkalla enää puhuneet mitään.

Kolmas kirja

Hekumoitsijat

1.

Palvelijainhuoneessa
 Fjodor Pavlovitš Karamazovin talo ei suinkaan ollut aivan
kaupungin keskustassa, mutta ei ihan laidassakaan. Se oli
vanhanpuoleinen, mutta ulkoapäin miellyttävän näköinen: se oli
yksikerroksinen, siinä oli ullakkokerros, väriltään se oli harmaa, ja
rautakatto oli punainen. Se saattoi muutoin tehdä tehtävänsä vielä
pitkät ajat, oli tilava ja kodikas. Siinä oli paljon monenlaisia
komeroita, erilaisia piilopaikkoja ja portaita siellä, missä niitä ei olisi
odottanut. Talossa oli rottia, mutta Fjodor Pavlovitš ei ollut niille ihan
koko sydämestään vihainen: »Onhan kuitenkin vähän rattoisampaa,
kun on yksin kotona.» Hänellä oli tosiaankin tapana lähettää
palvelijat yöksi sivurakennukseen ja sulkeutua taloon yksin koko
yöksi. Tämä sivurakennus oli pihan puolella ja oli avara sekä
lujatekoinen. Sinne oli Fjodor Pavlovitš määrännyt sijoitettavaksi
myöskin keittiön, vaikka talossakin oli keittiö. Hän ei pitänyt keittiön
hajusta, ja ruoat tuotiin pihan poikki sekä talvella että kesällä.
Yleensä talo oli rakennettu isolle perheelle, ja sekä herrasväkeä että
palvelijoita olisi siihen mahtunut viisi kertaa enemmän. Mutta
kertomuksemme aikana asuivat talossa vain Fjodor Pavlovitš ja Ivan
Fjodorovitš, kun taas sivurakennuksessa oli ainoastaan kolme
henkeä palvelusväkeä: vanhus Grigori, vanha eukko Marfa, hänen
vaimonsa, ja palvelija Smerdjakov, joka vielä oli nuori mies. Täytyy
mainita hieman tarkemmin näistä kolmesta palvelijasta. Ukko Grigori
Vasiljevitš Kutuzovista muuten olemmekin jo puhuneet tarpeeksi.
Hän oli luja ja taipumaton mies, joka itsepintaisesti ja suoraa tietä
kulki määräämäänsä pistettä kohti, jos vain tuo piste joistakin syistä
(usein ihmeellisen epäjohdonmukaisesti) oli hänen edessään
eittämättömänä totuutena. Yleensä hän oli rehellinen ja lahjomaton.
Hänen vaimonsa Marfa Ignatjevna, joka oli koko elämänsä ajan
vastaansanomatta taipunut miehensä tahtoon, ahdisteli siitä
huolimatta kovasti miestään, esimerkiksi kohta talonpoikain
vapautuksen jälkeen, kehoittamalla tätä lähtemään pois Fjodor
Pavlovitšin talosta Moskovaan ja aloittamaan siellä jotakin pientä
kaupustelua (heillä oli jonkin verran rahoja). Mutta Grigori päätti
silloin kerta kaikkiaan, että akka jaarittelee joutavia, »sillä kaikki akat
ovat epärehellisiä», ja että heidän ei pidä lähteä entisen isännän
luota, olipa tämä millainen tahansa, sillä »tämä oli nyt heidän
tällöinen velvollisuutensa».

— Ymmärrätkö sinä, mitä velvollisuus on? — kääntyi hän Marfa

Ignatjevnan puoleen.

— Velvollisuuden minä ymmärrän, Grigori Vasiljevitš, mutta mikä

velvollisuus meidän on jäädä tänne, sitä minä en ensinkään
ymmärrä, — vastasi Marfa Ignatjevna lujasti.

— Ole sitten ymmärtämättä, mutta niin tehdään. Vastedes pidä

suusi kiinni.

Niin kävikin: he eivät lähteneet pois, ja Fjodor Pavlovitš määräsi

heille pienen palkan, jonka hän maksoi säännöllisesti. Grigori tiesi
sitäpaitsi, että hänellä oli kiistämätön vaikutusvalta isäntäänsä. Hän
tunsi sen, ja asia oli niin: viekas ja itsepäinen narri Fjodor Pavlovitš,
joka oli sangen lujaluonteinen »muutamissa elämän asioissa», kuten
hänellä itsellään oli tapana sanoa, oli omaksi hämmästyksekseen
luonteeltaan suorastaan sangen heikko eräissä toisissa »elämän
asioissa». Ja hän tiesi itse, millaisia asioita ne olivat, ja pelkäsi
monia seikkoja. Muutamissa elämän asioissa täytyi olla varovainen,
ja tällöin oli vaikeata tulla toimeen ilman uskollista ihmistä, mutta
Grigori oli mitä uskollisin mies. Kävi niinkin, että Fjodor Pavlovitš
monta kertaa elämänsä aikana olisi voinut saada selkäänsä ja tulla
pahoinkin piestyksi, mutta joka kerta tuli hänelle avuksi Grigori,
vaikka joka kerta sitten nuhteli häntä jäljestäpäin. Mutta pelkkä
selkäsauna ei olisi peloittanut Fjodor Pavlovitšia: oli tärkeämpiä
tilanteita, vieläpä sangen arkaluontoisia ja monimutkaisia, jolloin
Fjodor Pavlovitš kenties ei itsekään olisi kyennyt määrittelemään sitä
erikoislaatuista uskollisen ja läheisen henkilön tarvetta, jota hän
äkkiä toisinaan käsittämättömällä tavalla silmänräpäyksessä alkoi
itsessään tuntea. Ne olivat melkein sairauden kaltaisia tapauksia:
irstas Fjodor Pavlovitš, joka hekumallisuudessaan usein oli julma
kuin ilkeä hyönteinen, tunsi toisinaan juovuspäissään sielullista
kauhua ja siveellistä järkytystä, joka niin sanoakseni tuntui myöskin
fyysillisesti hänen sielussaan. »Sieluni ikäänkuin vapisee kurkussani
noina kertoina», puhui hän toisinaan. Juuri näinä hetkinä hänestä oli
mieluisaa, että hänen vierellään, läheisyydessään tai vaikkapa
toisessa huoneessa, sivurakennuksessa, oli tuommoinen ihminen,
uskollinen, luja, aivan toisenlainen kuin hän, ei irstailija, joka kyllä
näki kaiken irstailun ja tiesi kaikki salaisuudet, mutta kuitenkin
uskollisuudessaan salli kaiken tapahtua, ei pannut vastaan eikä —
mikä oli tärkeintä — nuhdellut eikä uhannut millään enemmän tässä
kuin tulevassakaan elämässä, vaan tarpeen tullen ikäänkuin puolusti
häntä, — ketä vastaan? Jotakin tuntematonta, mutta peloittavaa ja
vaarallista vastaan. Kysymys oli nimenomaan siitä, että oli
välttämättömästi toinen ihminen, vanhastaan tuttu ja ystävällinen,
jonka saattoi sairauden hetkenä kutsua luokseen ainoastaan
katsellakseen hänen kasvojaan, ehkäpä vaihtaa jonkin aivan
asiaankuulumattoman sanankin, ja jos hän ei ole millänsäkään, ei
ole vihainen, niin on ikäänkuin helpompi sydämelle, mutta jos hän on
vihainen, no, silloin on surullisempaa. Tapahtui (muutoin sangen
harvoin), että Fjodor Pavlovitš meni yölläkin sivurakennukseen
herättämään Grigorin, jotta tämä hetkiseksi tulisi hänen luokseen.
Tämä tuli, ja Fjodor Pavlovitš alkoi puhella aivan joutavista asioista
sekä päästi hänet pian menemään, toisinaan ivaillen ja leikkiä
laskien, minkä jälkeen hän sylkäisi, kävi makaamaan ja nukkui
hurskaan unta. Jotakin tämäntapaista sattui Fjodor Pavlovitšille
silloinkin, kun Aljoša oli tullut. Aljoša »lävisti hänen sydämensä» sillä,
että »eli, näki kaikki eikä mitään tuominnut». Vieläpä enemmänkin,
hän toi tullessaan jotakin aivan uutta: täydellisen halveksimisen
puutteen häntä, ukkoa, kohtaan; päinvastoin hän osoitti aina
ystävällisyyttä ja aivan luonnollista, rehellistä kiintymystä häneen,
joka niin vähän sitä ansaitsi. Tämä kaikki oli vanhalle irstailijalle ja
perheettömälle miehelle täydellinen yllätys, aivan odottamatonta
hänelle, joka tähän asti oli rakastanut vain »saastaa». Aljošan
mentyä pois hän myönsi oppineensa ymmärtämään yhtä ja toista,
mitä tähän saakka ei ollut tahtonut ymmärtää.

Olen jo maininnut kertomukseni alussa, miten Grigori vihasi

Adelaida Ivanovnaa, Fjodor Pavlovitšin ensimmäistä vaimoa ja
hänen vanhimman poikansa Dmitri Fjodorovitšin äitiä, ja miten hän
päinvastoin puolusti hänen toista vaimoaan, riivattua, Sofia
Ivanovnaa, omaa herraansakin vastaan ja kaikkia vastaan, joille
saattoi pistää päähän lausua tästä naisesta paha tai kevytmielinen
sana. Myötätunto tuota onnetonta kohtaan oli muuttunut hänessä
jonkinlaiseksi pyhäksi tunteeksi, niin että vielä kaksikymmentä vuotta
myöhemmin hän ei olisi suvainnut keneltäkään epäedullista
viittaustakaan, joka koski vainajaa, vaan olisi heti torjunut
loukkauksen. Ulkonaiselta olemukseltaan Grigori oli kylmä ja
arvokas mies, ei lörpötellyt, vaan puhui harkiten eikä kevytmielisesti.
Niinikään olisi ollut mahdotonta saada hänestä selville ensi
katsauksella, rakastiko hän säyseätä, nöyrää vaimoaan vai eikö,
mutta hän rakasti häntä todellakin ja vaimo tietysti ymmärsi sen.
Tämä Marfa Ignatjevna ei ensinkään ollut tyhmä nainen, vaan oli
kenties viisaampikin kuin miehensä, ainakin hän oli tätä järkevämpi
käytännöllisissä asioissa, mutta kuitenkin hän alistui miehensä
tahtoon nurkumatta ja vastaansanomatta aivan avioliiton alusta
alkaen ja kunnioitti häntä henkisessä suhteessa korkeammalla
olevana. Huomattavaa on, että he koko elämänsä aikana puhuivat
keskenään perin vähän, vain kaikkein tärkeimmistä juoksevista
asioista. Arvokas ja juhlallinen Grigori harkitsi kaikki asiansa ja
huolensa aina yksinään, niin että Marfa Ignatjevna jo kauan sitten oli
tullut ymmärtämään, että mies ei ollenkaan kaivannut hänen
neuvojaan. Hän tunsi, että hänen miehensä pitää arvossa hänen
vaitioloaan ja pitää sitä älykkyyden merkkinä. Vaimoaan Grigori ei
koskaan lyönyt, yhden kerran vain ja silloinkin vähän. Adelaida
Ivanovnan ollessa ensimmäistä vuotta naimisissa Fjodor Pavlovitšin
kanssa olivat kerran maalla kylän tytöt ja eukot, jotka silloin vielä
olivat maaorjia, kokoontuneet herraskartanoon laulelemaan ja
tanssimaan. Aloitettiin eräs tanssilaulu »Niityllä», ja äkkiä Marfa
Ignatjevna, joka silloin vielä oli nuori nainen, hyppäsi kuoron eteen ja
alkoi lasketella »venäläistä» erikoisella tavalla, ei maalaistapaan
niinkuin eukot, vaan kuten hän oli tanssinut silloin, kun palveli
rikkailla Miusoveilla heidän kotiteatterissaan maalla, jossa
näyttelijöitä opetti tanssimaan Moskovasta tilattu tanssimestari.
Grigori näki, millä tavoin hänen vaimonsa tanssi, ja kotona
mökissään hän tuntia myöhemmin antoi tälle hiukan opetusta vetäen
häntä hiuksista. Mutta siihen kuritukset kerta kaikkiaan loppuivatkin
eivätkä enää kertaakaan toistuneet koko elämän aikana, eikä Marfa
Ignatjevnaakaan siitä lähin ollut halu vetänyt tanssimaan.

Lapsia ei Jumala heille suonut. Yksi lapsi oli ollut, mutta sekin oli
kuollut. Grigori oli ilmeisesti lapsirakas eikä salannutkaan sitä, t.s.
hän ei hävennyt tunnustaa sitä. Dmitri Fjodorovitšin hän oli ottanut
kolmivuotiaana poikana hoitoonsa, kun Adelaida Ivanovna karkasi, ja
puuhasi hänen kanssaan melkein vuoden, itse kampasi häntä, itse
pesi häntä kaukalossa. Myöhemmin hän puuhasi sekä Ivan
Fjodorovitšin että Aljošan kanssa ja sai siitä palkakseen
korvapuustin. Mutta kaikesta tästä olen jo kertonut. Oma lapsi
taasen ilahdutti häntä vain toivolla Marfa Ignatjevnan ollessa
raskaana. Mutta syntyessään lapsi täytti hänen sydämensä
murheella ja kauhulla. Tämä poika nimittäin syntyi kuusisormisena.
Sen nähtyään Grigori masentui siinä määrin, että ei ainoastaan ollut
sanaakaan puhumatta aivan ristiäisiin asti, vaan meni varta vasten
puistoon saadakseen olla puhumatta. Oli, kevät, hän kaiveli yhtä
mittaa kolme päivää lavoja hedelmätarhassa ja kukkapenkkejä
puistossa. Kolmantena päivänä oli pienokainen kastettava. Siihen
mennessä oli jokin ajatus kypsynyt Grigorin päässä. Kun hän saapui
tupaan, jonne jo olivat kokoontuneet kirkonpalvelijat ja vieraat ja
lopulta tullut itse Fjodor Pavlovitš ollakseen risti-isänä, niin hän
yht'äkkiä ilmoitti, että lasta »ei pitäisi ollenkaan kastaa», — ilmoitti
sen hiljaisella äänellä eikä monisanaisesti, vaan sanoi vaivoin sanan
kerrallaan katsellen tylsästi ja silmiään pois kääntämättä pappia.

— Miksi niin? — tiedusti pappi iloisesti ihmetellen.

— Siksi… että tämä on… traakki… — mutisi Grigori.

— Mikä ihmeen traakki? Kuinka niin?

Grigori oli jonkin aikaa vaiti.

— Luonnossa on tapahtunut sekaannus… — mutisi hän hyvin

epäselvästi, mutta sangen varmasti, eikä nähtävästi halunnut ryhtyä
tarkempiin selityksiin.

Naurettiin ja lapsi-raukka tietysti kastettiin. Grigori rukoili

kastemaljan ääressä hartaasti, mutta ei muuttanut mielipidettään
äskensyntyneestä. Muuten hän ei mitenkään häirinnyt toisten