‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪1‬‬

‫(ورث‪)202‬‬ ‫هندصة وراثية‬

‫النواقل التعبيرية‬
‫‪Expression vectors‬‬
‫قشم الوراثة – كلية الزراعة – جامعة عين شمس‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪2‬‬

Transformation ‫التحول الوراثي‬ ‫هندصة وراثية‬

4/26/2024 geneticsdepartment@agr.asu.edu.eg ‫األسبوع الحادى عشر‬ 3

 Let’s agree some SUBSTANTIAL RULES

4/26/2024 ‫األسبوع الحادى عشر‬ 4

 ‫خطىاث الهندست الىزاثيت‬
‫‪ .1‬جحضير الجين محل الدزاست‬
‫‪ .2‬قطع ال ‪ DNA‬باسخخدام إهزيماث القطع‬
‫‪Ligation .3‬‬
‫‪ .4‬الخحىل الىزاثي‬
‫فى معظم ججازب الهندست الىزاثيت ‪ ،‬يندزج الهدف من ججسبت الـ ‪ Gene cloning‬جحذ احد احخمالين‪:‬‬
‫‪- ١‬اهخاج عدة وسخ مً الجين ) ‪(Cloning vector‬‬
‫‪- ٢‬الحصىل على هاجج الجين )‪(Expression vector‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪5‬‬

 ‫‪pUC vectors‬‬
‫‪1. An origin of replication‬‬
‫‪2. A selectable marker‬‬
‫‪3. An inducible promoter‬‬
‫جدخىي هره العائلت مً هىاقل البالشميداث على ) ‪(lac promoter Plac‬حىبا الى‬
‫حىب مع مىطقت الـ )‪(lac operator Olac‬‬
‫‪4. Lac I gene‬‬
‫يشفس الى البروجين الكابذ ‪Lac I‬‬
‫‪5. Lac Z' gene‬‬
‫ييخج الطسف الامينى الهصيم البيخا حاالكخىشيديص‬
‫)‪6. Polylinker (MCS‬‬
‫جقع بعد مىطقت البرومىجىز و داخل مىطقت ال ‪LacZ‬بعد عدد قليل مً بدايت‬
‫شفساث ال ‪LacZ gene‬‬
‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪6‬‬
 ‫‪pUC vectors‬‬
‫شفساث قساءة )‪(codons‬حين الطساش البري إلهصيم ال ‪β-galatosidase l‬ممشلت باللىن الازحىاوى‬ ‫‪-‬‬
‫شفساث قساءة مىطقت ال ‪MCS‬ممشلت باللىن الاسىد‬ ‫‪-‬‬
‫بئخخالف هىع و جخابع اهصيماث القطع املىحىدة فى مىطقت ال ‪Polylinker‬فئنها مخاخت فى صىزة عديد مً‬ ‫‪-‬‬
‫الشالزياث مما يبقى جخابع حين ال ‪'LacZ‬فى إلاطاز ‪in frame‬و بالخالى جظل السلسلت البيبخيديت الىاججت حعمل‬
‫بكفاءة فى اخخباز الـ ‪α- complemetation‬‬
‫ييخج عً خشس قطعت الـ ‪DNA‬فى مىطقت ال ‪MCS‬اخد ر إخخماالث ممكىت مً إطاز القساءة ‪reading frame‬‬ ‫‪-‬‬
‫للبروجين الىاجج‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪7‬‬

 : ‫جحذ احد احخمالين‬Gene cloning ‫يندزج الهدف من ججسبت الـ‬

Expression vector Cloning vector

‫الحصىل على هاجج الجين‬ ‫اهخاج عدة وسخ مً الجين‬

Prokaryotic Eukaryotic
expression vector expression vector

4/26/2024 ‫األسبوع الحادى عشر‬ 8

 ‫‪Prokaryotic Expression Vectors‬‬
‫‪:pLacZ expression vectors‬‬ ‫يمشلها فى املقام الاول مجمىعت الـ ‪.I‬‬
‫‪pUC family of vectors‬مشال‬
‫‪ -‬على السغم مً ان هره املجمىعت مً هىاقل البالشميداث ) ‪(pUC family‬ال حسخخدم عادة للخعبير عً البروجيىاث‬
‫املعادة الصياغت الا انها جدخىي على العناصس الضسوزيت للىاقل الخعبيري ‪expression vector‬‬
‫‪pET expression vectors .II‬‬
‫‪ -‬يمكً الحصىل على هاجج الجين مدل الدزاست مً خالل دمج املىطقت املشفسة للجين مع املدافظت على إطاز قساءة‬
‫‪'lacZ‬‬
‫‪ -‬يخم إسخدشار الخعبير الجينى مً خالل مادة ال ‪IPTG‬‬
‫‪ -‬سىف يدخىي البروجين الىاجج فى الطسف الامينى الخاص به على جخابع قليل الول الاخماض الاميييت الخاصت بئهصيم‬
‫البيخا حاالكخىشيديص و هى ما يطلق عليه البروجين املىدمج ‪fusion protein‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪9‬‬

 ‫‪pET vectors‬‬
‫يحخىي الناقل على العناصس الخاليت لكى ينخج البروجين ‪:‬‬

‫‪T7 promoter -‬‬

‫‪Lac Operator -‬‬

‫‪-‬جخابع ازجباط السيبىسىماث ‪Shine Delgarno Sequence‬‬
‫‪-‬مىطقت الـ ‪polylinker‬‬

‫‪T7 transcriptional terminator -‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪10‬‬

 ‫‪pTac expression Vector .III‬‬
‫اهم العناصس التى جميز هرا النىع من النىاقل ‪:‬‬
‫‪ -‬البرومىجىز فى هرا الناقل عبازة عن هجين ما بين ‪:‬‬
‫‪Lac-Z promoter –operator -‬‬
‫‪ -‬و التربخىفان‬
‫و لرلك يطلق عليه ‪ptac‬او ‪ptrc‬‬

‫‪-‬جخابع قصير الول ‪٦‬احماض امينيت للهسديدين ‪Histidine residues‬فى الطسف الامينى للبروجين‬
‫الناجج و هى ما يسمى منطقت ‪His tag‬‬

‫‪ ‬الهدف من ال ‪His tag :‬‬

‫‪ -‬جكىن الـ ‪ histidine residues‬منطقت ازجباط باملعادن (النيكل ‪(Ni2+‬فى البروجين الناجج‬
‫‪-‬جملك البروجيناث الناججت ذاث ال ‪ His tag‬اهجراب ‪ affinity‬للمعادن املخلبيت مما يفيد فى‬
‫جنقيت البروجين محل الدزاست‬
‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪11‬‬
‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪12‬‬
 ‫‪Eukaryotic Expression Vectors‬‬
‫‪-‬يعخمد جصميم الىاقل الخعبيري فى الكائىاث خقيقيت الىىاة على طبيعت الىظام او اليسيج‬
‫املسخخدم و كرلك الجين املطلىب جسحمخه‬
‫‪-‬فى معظم الاخىال يخم معالجت جصميم الىاقل بديث يعبر اوال فى البكتريا كخطىة اولى زم بعدها يخم هقله‬
‫الى الكائىاث خقيقيت الىىاة و هى ما يعسف بئسم ‪shuttle vector‬‬
‫‪-‬يخم جصميم الىىاقل بأخد صىزجين إما جىدمج ‪Integrate‬فى كسومىسىم العائل او يخم حعبير الجين‬
‫بصىزة مؤقخت مً على الىاقل ‪transient episomal expression‬‬
‫‪-‬يجب ان يدخىي الىاقل على صفت اهخخابيت حسمذ بالغسبلت فى كال الىظامين (اوليت الىىاة و خقيقيت‬
‫الىىاة )على خدة‬
‫‪-‬يجب ان يدخىي على الخخابعاث الخىظيميت الخاصت بالخعبير الجينى ( بسومىجىز قىي ‪ ،‬مىطقت الازجباط‬
‫بالسيبىسىم ‪ ،Kozac sequences‬و مىطقت الاهتهاء)‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪13‬‬

 ‫‪Shuttle vector‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪14‬‬

 ‫العائل ‪Host‬‬
‫عادة ما يخم عمل الخدىل الىزاسى للبالشميد معاد الصياغت كخطىة اولى فى بكتريا الـ ‪E. coli‬‬
‫فى خالت ما أذا كان الغسض الخأكد مً هجاح جكىن البالشميد معاد الصياغت ‪ ،‬او الحصىل على عدة وسخ مً‬
‫الجين مدل الدزاست يخم عمل الخدىل الىزاسى فى ساللت خاصت مً الـ ‪ E. coli‬حسمى ‪DH5 α‬او‬
‫‪Cloning strain‬‬
‫أما إذا كان الغسض الحصىل على الخعبير الجينى الخاص بالجين مدل الدزاست يخم عمل خطىة الخدىل‬
‫الىزاسى فى ساللت اخسي مً ال ‪E. coli‬حسمى ‪BL21‬او ‪Expression strain‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪15‬‬

 ‫يخميز التركيب الىزاثى لساللت الـ ‪ DH5 alpha‬باالحى ‪:‬‬

‫‪-‬طفسة فى حين ‪endA1‬و ذلك إلسدبعاد وشاط اهصيماث هدم (جدليل )الاخماض الىىويت‬
‫الداخليت و بالخالى الحفاظ على البالشميد‬
‫‪-‬طفسة فى حين ‪recA1‬لخشبيط خدور اجداداث وزازيت حديدة بين الىاقل و الكسومىسىم‬
‫البكخيري و بالخالى الحفاظ على زباث الجين مدل الدزاست‬
‫‪-‬طفسة فى حين ‪Lac Z‬بديث ييخج الطسف الامينى فقط إلهصيم البيخاحاالكخىشيديص‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪16‬‬

 ‫يخميز التركيب الىزاثى لساللت الـ ‪ BL 21‬باالحى ‪:‬‬
‫‪ -‬جدخىي على اهصيم ‪T7 polymerase‬املطلىب لبدء عمليت اليسخ‬
‫‪ -‬جدخىي على طفسة فى حين ‪OmpT‬و ‪Ion‬و كالهما مسؤول عً جكسير البروجيىاث‬
‫الغسيبت عً الخليت و بالخالى فى خالت إطفازهم يخم الحفاظ على البروجين الىاجج دون ان‬
‫يلحق به اذي‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪17‬‬

 ‫النواقل التعبيرية ‪Expression vectors‬‬ ‫هندصة وراثية‬

‫قشم الوراثة – كلية الزراعة – جامعة عين شمس‬ ‫‪Email‬‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫‪geneticsdepartment@agr.asu.edu.eg‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪18‬‬
‫النواقل التعبيرية ‪Expression vectors‬‬ ‫هندصة وراثية‬
‫‪Do you have‬‬
‫? ‪any Question‬‬
‫قشم الوراثة – كلية الزراعة – جامعة عين شمس‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪19‬‬

 Expression ‫النواقل التعبيرية‬ ‫هندصة وراثية‬
vectors
How to Contact Us
Facebook www.facebook.com/101746015601374-‫شمس‬-‫عين‬-‫جامعة‬-‫الزراعة‬-‫كلية‬-‫الوراثة‬-‫قشم‬

Twitter https://twitter.com/Genetics_Shams

Telegram https://t.me/GeneticsAgrASU

Website GeneticsASU.blogspot.com

‫قشم الوراثة – كلية الزراعة – جامعة عين شمس‬ Email

4/26/2024 geneticsdepartment@agr.asu.edu.eg ‫األسبوع الحادى عشر‬ 20
 ‫النواقل التعبيرية ‪Expression‬‬ ‫هندصة وراثية‬
‫‪vectors‬‬
‫‪Thank You‬‬

‫قشم الوراثة – كلية الزراعة – جامعة عين شمس‬

‫‪4/26/2024‬‬ ‫األسبوع الحادى عشر‬ ‫‪21‬‬