SNAREs: Methods and Protocols

Rutilio Fratti
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/snares-methods-and-protocols-rutilio-fratti/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Zebrafish Methods and Protocols Koichi Kawakami

https://textbookfull.com/product/zebrafish-methods-and-protocols-
koichi-kawakami/

Epitranscriptomics: Methods and Protocols Narendra

Wajapeyee

https://textbookfull.com/product/epitranscriptomics-methods-and-
protocols-narendra-wajapeyee/

Phytoplasmas: Methods and Protocols Rita Musetti

https://textbookfull.com/product/phytoplasmas-methods-and-
protocols-rita-musetti/

Metalloproteins: Methods and Protocols Yilin Hu

https://textbookfull.com/product/metalloproteins-methods-and-
protocols-yilin-hu/
Nanotoxicity: Methods and Protocols Qunwei Zhang

https://textbookfull.com/product/nanotoxicity-methods-and-
protocols-qunwei-zhang/

Autoantibodies: Methods and Protocols Gunnar Houen

https://textbookfull.com/product/autoantibodies-methods-and-
protocols-gunnar-houen/

Oligodendrocytes: Methods and Protocols David Lyons

https://textbookfull.com/product/oligodendrocytes-methods-and-
protocols-david-lyons/

Bacteriophages Methods and Protocols Ebenezer Tumban

https://textbookfull.com/product/bacteriophages-methods-and-
protocols-ebenezer-tumban/

Antibody Engineering Methods and Protocols Damien

Nevoltris

https://textbookfull.com/product/antibody-engineering-methods-
and-protocols-damien-nevoltris/
Methods in
Molecular Biology 1860

Rutilio Fratti Editor

SNAREs
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences,
University of Hertfordshire,
Hatfield, Hertfordshire AL10 9AB, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
 SNAREs

Methods and Protocols

Edited by

Rutilio Fratti
Department of Biochemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA
Editor
Rutilio Fratti
Department of Biochemistry
University of Illinois Urbana-Champaign
Urbana, IL, USA

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-8759-7 ISBN 978-1-4939-8760-3 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8760-3
Library of Congress Control Number: 2018956143

© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Humana Press imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC part of
Springer Nature.
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface

Eukaryotic cells are compartmentalized into membrane-bound organelles encased by a

plasma membrane. Vesicular content of membrane proteins and luminal constituents are
trafficked through cells using a set of highly regulated pathways that culminate in fusion with
a target membrane and transfer of products. The fusion of vesicles is critical for maintaining
cellular homeostasis and is essential for the release of neurotransmitters, hormones, anti-
bodies, as well as the turnover of receptors, the destruction of pathogens, and the generation
of antigens. The machinery that controls membrane fusion is conserved from yeast to
mammals, and mechanisms described in one system are applicable to most fusion models.
Although membrane trafficking requires numerous factors such as cargo receptors, coat
proteins, Rab GTPases, and tethering factors, the terminal catalysts of fusion are SNAREs
(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors). All SNAREs
contain a canonical heptad repeat, termed a “SNARE motif,” that is flanked by various
N-terminal domains and C-terminal membrane anchors. SNAREs form parallel four helical
bundles through their SNARE motifs. These regions are primarily composed of hydropho-
bic residues with the exception of a central polar glutamine (Q), or arginine (R) that interact
in the ionic zero layer. Each SNARE bundle is composed of 3 Q-SNAREs donated by one
membrane and 1 R-SNARE by its partner membrane.
This book covers many of the ways that SNAREs and their function are examined in the
laboratory. The methods described in each chapter are described in detail such that novice as
well as experienced researchers can explore the mechanisms of SNARE-mediated membrane
fusion. Therefore, I expect that this book will serve as a valuable tool for all investigators
interested in the field.
This volume of Methods in Molecular Biology contains 26 chapters that are grouped into
sections, starting with Biophysical and Computational Alaysis of SNAREs. Part II is dedi-
cated Biochemical methodologies for examining the interactions of SNAREs with proteins
and lipids. Part III includes Functional methods for measuring SNARE complex formation,
calcium transport and and membrane fusion. Part IV is comprised of advanced microscopy
methods to observe membrane fusion.

Urbana, IL, USA Rutilio Fratti

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

PART I BIOPHYSICS AND COMPUTATIONAL ANALYSIS

1 Molecular Dynamics Simulations of the SNARE Complex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Maria Bykhovskaia
2 Mesoscale Computational Modeling of Protein-Membrane
Interactions Based on Continuum Mean-Field Theory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
George Khelashvili
3 EPR Lineshape Analysis to Investigate the SNARE Folding
Intermediates. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Ryan Khounlo, Brenden J. D. Hawk, and Yeon-Kyun Shin
4 Dynamic Light Scattering Analysis to Dissect Intermediates
of SNARE-Mediated Membrane Fusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Byoungjae Kong, Yoosoo Yang, and Dae-Hyuk Kweon
5 SNAREpin Assembly: Kinetic and Thermodynamic Approaches . . . . . . . . . . . . . . 71
Feng Li and Frederic Pincet
6 Single-Molecule Optical Tweezers Study of Regulated SNARE
Assembly. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Lu Ma, Junyi Jiao, and Yongli Zhang
7 Studying Munc18:Syntaxin Interactions Using Small-Angle
Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Andrew E. Whitten, Russell J. Jarrott, Shu-Hong Hu, Anthony P. Duff,
Gordon J. King, Jennifer L. Martin, and Michelle P. Christie
8 Using Force Spectroscopy to Probe Coiled-Coil Assembly
and Membrane Fusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Hannes Witt and Andreas Janshoff

PART II BIOCHEMISTRY

9 SNAP-25 S-Guanylation and SNARE Complex Formation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

Yusuke Kishimoto, Takaaki Akaike, and Hideshi Ihara
10 Analysis of the Role of Sec3 in SNARE Assembly
and Membrane Fusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
Kunrong Mei, Peng Yue, and Wei Guo
11 Use of Microscale Thermophoresis (MST) to Measure Binding
Affinities of Components of the Fusion Machinery. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Robert P. Sparks and Rutilio Fratti

vii
viii Contents

12 Use of Surface Plasmon Resonance (SPR) to Determine

Binding Affinities and Kinetic Parameters Between Components
Important in Fusion Machinery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Robert P. Sparks, Jermaine L. Jenkins, and Rutilio Fratti
13 Determination of Sec18-Lipid Interactions by Liposome-Binding
Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Matthew L. Starr and Rutilio Fratti
14 Using Nanodiscs to Probe Ca2+-Dependent Membrane Interaction
of Synaptotagmin-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Ekaterina Stroeva and Shyam S. Krishnakumar
15 Functional Reconstitution of Intracellular Vesicle Fusion
Using Purified SNAREs and Sec1/Munc18 (SM) Proteins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
Haijia Yu, Lauren Crisman, Michael H.B. Stowell, and Jingshi Shen

PART III FUNCTIONAL ASSAYS

16 Assay of Lipid Mixing and Fusion Pore Formation in the Fusion

of Yeast Vacuoles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
Massimo D’Agostino and Andreas Mayer
17 A Nanodisc-Cell Fusion Assay with Single-Pore Sensitivity
and Sub-millisecond Time Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Natasha R. Dudzinski, Zhenyong Wu, and Erdem Karatekin
18 An In Vitro Assay of Trans-SNARE Complex Formation During Yeast
Vacuole Fusion Using Epitope Tag-Free SNAREs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
Youngsoo Jun
19 A Cell-Free Content Mixing Assay for SNARE-Mediated
Multivesicular Body-Vacuole Membrane Fusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Mahmoud Abdul Karim, Dieter Ronny Samyn,
and Christopher Leonard Brett
20 Reconstituted Proteoliposome Fusion Mediated by Yeast
SNARE-Family Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
Joji Mima
21 Real-Time Fluorescence Detection of Calcium Efflux
During Vacuolar Membrane Fusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Gregory E. Miner and Rutilio Fratti

PART IV MICROSCOPY

22 Single-Molecule Fluorescence Measurement of SNARE-Mediated

Vesicle Fusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
Yachong Hu, Zhiqi Tian, and Jiajie Diao
23 Quantifying Intramolecular Protein Conformational Dynamics
Under Lipid Interaction Using smFRET and FCCS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
Pei Li, Yawei Dai, Markus Seeger, and Yan-Wen Tan
 Contents ix

24 Visualization of SNARE-Mediated Organelle Membrane

Hemifusion by Electron Microscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
Sevan Mattie, Tom Kazmirchuk, Jeannie Mui, Hojatollah Vali,
and Christopher Leonard Brett
25 Studies of the Secretory Machinery Dynamics by Total Internal
Reflection Fluorescence Microscopy in Bovine Adrenal Chromaffin
Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379
José Villanueva, Yolanda Gimenez-Molina, and Luis M. Gutiérrez
26 Imaging SNAP-29 in Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391
Hao Xu and Bryan Stewart

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
Contributors

TAKAAKI AKAIKE  Department of Environmental Medicine and Molecular Toxicology, Tohoku

University Graduate School of Medicine, Sendai, Japan
CHRISTOPHER LEONARD BRETT  Department of Biology, Concordia University, Montréal,
QC, Canada
MARIA BYKHOVSKAIA  Department of Neurology, Wayne State University School of Medicine,
Detroit, MI, USA; Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University
School of Medicine, Detroit, MI, USA
MICHELLE P. CHRISTIE  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University
of Melbourne, Parkville, VIC, Australia
LAUREN CRISMAN  Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,
University of Colorado, Boulder, CO, USA
MASSIMO D’AGOSTINO  Département de Biochimie, Université de Lausanne, Epalinges,
Switzerland
YAWEI DAI  State Key Laboratory of Surface Physics and Department of Physics, Fudan
University, Shanghai, China; Department of Physics, The University of Hong Kong, Hong
Kong, China
JIAJIE DIAO  Department of Cancer Biology, University of Cincinnati College of Medicine,
Cincinnati, OH, USA
NATASHA R. DUDZINSKI  Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, New
Haven, CT, USA; Nanobiology Institute, Yale University, West Haven, CT, USA
ANTHONY P. DUFF  Australian Nuclear Science and Technology Organisation, Lucas
Heights, NSW, Australia
RUTILIO FRATTI  Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign,
Urbana, IL, USA
YOLANDA GIMENEZ-MOLINA  Instituto de Neurociencias, Centro Mixto CSIC-Universidad
Miguel Hernández, Sant Joan d’Alacant, Alicante, Spain
WEI GUO  Department of Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
LUIS M. GUTIÉRREZ  Instituto de Neurociencias, Centro Mixto CSIC-Universidad Miguel
Hernández, Sant Joan d’Alacant, Alicante, Spain
BRENDEN J. D. HAWK  Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular
Biology, Iowa State University, Ames, IA, USA
SHU-HONG HU  Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, Nathan, QLD,
Australia
YACHONG HU  Department of Cancer Biology, University of Cincinnati College of Medicine,
Cincinnati, OH, USA; School of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University,
Xi’an, China
HIDESHI IHARA  Department of Biological Science, Graduate School of Science, Osaka
Prefecture University, Sakai, Japan
ANDREAS JANSHOFF  Institute of Physical Chemistry, University of Goettingen, Göttingen,
Germany
RUSSELL J. JARROTT  Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, Nathan,
QLD, Australia

xi
xii Contributors

JERMAINE L. JENKINS  Structural Biology and Biophysics Facility, University of Rochester,

Rochester, NY, USA
JUNYI JIAO  Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine, New Haven,
CT, USA; Integrated Graduate Program in Physical and Engineering Biology, New
Haven, CT, USA
YOUNGSOO JUN  School of Life Sciences, Cell Logistics Research Center, and Silver Health Bio
Research Center, Gwangju Institute of Science and Technology, Gwangju, Republic of
Korea
ERDEM KARATEKIN  Nanobiology Institute, Yale University, West Haven, CT, USA;
Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, New
Haven, CT, USA; Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University,
New Haven, CT, USA; Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Paris,
France
MAHMOUD ABDUL KARIM  Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC,
Canada; Department of Cell Biology, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada
TOM KAZMIRCHUK  Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC, Canada
GEORGE KHELASHVILI  Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical
College of Cornell University, New York, NY, USA; Institute for Computational
Biomedicine, Weill Cornell Medical College of Cornell University, New York, NY, USA
RYAN KHOUNLO  Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular
Biology, Iowa State University, Ames, IA, USA
GORDON J. KING  Centre for Microscopy and Microanalysis, The University of Queensland, St
Lucia, QLD, Australia
YUSUKE KISHIMOTO  Department of Biological Science, Graduate School of Science, Osaka
Prefecture University, Sakai, Japan
BYOUNGJAE KONG  Department of Integrative Biotechnology, College of Biotechnology and
Bioengineering, Sungkyunkwan University, Suwon, Republic of Korea
SHYAM S. KRISHNAKUMAR  Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine,
New Haven, CT, USA; Department of Clinical and Experimental Epilepsy, Institute of
Neurology, University College London, London, UK
DAE-HYUK KWEON  Department of Integrative Biotechnology, College of Biotechnology and
Bioengineering, Sungkyunkwan University, Suwon, Republic of Korea; Biomedical
Institute for Convergence, Sungkyunkwan University, Suwon, Republic of Korea
FENG LI  Department of Cell Biology and Nanobiology Institute, School of Medicine, Yale
University, New Haven, CT, USA
PEI LI  State Key Laboratory of Surface Physics and Department of Physics, Fudan
University, Shanghai, China
LU MA  Beijing National Laboratory for Condensed Matter Physics and CAS Key
Laboratory of Soft Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing,
China
JENNIFER L. MARTIN  Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, Nathan,
QLD, Australia
SEVAN MATTIE  Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC, Canada;
Montreal Neurological Hospital and Institute, McGill University, Montréal, QC, Canada
ANDREAS MAYER  Département de Biochimie, Université de Lausanne, Epalinges,
Switzerland
KUNRONG MEI  Department of Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
JOJI MIMA  Institute for Protein Research, Osaka University, Osaka, Japan
 Contributors xiii

GREGORY E. MINER  Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-

Champaign, Urbana, IL, USA
JEANNIE MUI  Facility for Electron Microscopy Research, Department of Anatomy and Cell
Biology, McGill University, Montréal, QC, Canada
FREDERIC PINCET  Department of Cell Biology and Nanobiology Institute, School of
Medicine, Yale University, New Haven, CT, USA; Laboratoire de Physique Statistique,
Ecole Normale Supérieure, PSL Research University, Université Paris Diderot Sorbonne
Paris Cité, Sorbonne Universités UPMC Univ Paris 06, CNRS, Paris, France
DIETER RONNY SAMYN  Department of Biology, Concordia University, Montréal, QC,
Canada
MARKUS SEEGER  Biological Imaging Center, Technische Universit€ at München, München,
Germany
JINGSHI SHEN  Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of
Colorado, Boulder, CO, USA
YEON-KYUN SHIN  Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular
Biology, Iowa State University, Ames, IA, USA
ROBERT P. SPARKS  Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-
Champaign, Urbana, IL, USA
MATTHEW L. STARR  Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-
Champaign, Urbana, IL, USA
BRYAN STEWART  Department of Biology, University of Toronto Mississauga, Mississauga,
ON, Canada
MICHAEL H. B. STOWELL  Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,
University of Colorado, Boulder, CO, USA
EKATERINA STROEVA  Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine, New
Haven, CT, USA
YAN-WEN TAN  State Key Laboratory of Surface Physics and Department of Physics, Fudan
University, Shanghai, China
ZHIQI TIAN  Department of Cancer Biology, University of Cincinnati College of Medicine,
Cincinnati, OH, USA; School of Life Science and Technology, Xi’an Jiaotong University,
Xi’an, China
HOJATOLLAH VALI  Facility for Electron Microscopy Research, Department of Anatomy and
Cell Biology, McGill University, Montréal, QC, Canada
JOSÉ VILLANUEVA  Instituto de Neurociencias, Centro Mixto CSIC-Universidad Miguel
Hernández, Sant Joan d’Alacant, Alicante, Spain
ANDREW E. WHITTEN  Australian Nuclear Science and Technology Organisation, Lucas
Heights, NSW, Australia
HANNES WITT  Institute of Physical Chemistry, University of Goettingen, Göttingen,
Germany
ZHENYONG WU  Nanobiology Institute, Yale University, West Haven, CT, USA;
Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, New
Haven, CT, USA
HAO XU  School of Biological, Environmental, and Earth Sciences, University of Southern
Mississippi, Hattiesburg, MS, USA
YOOSOO YANG  Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology
(KIST), Seoul, Republic of Korea; Division for Bio-Medical Science and Technology, KIST
School, Korea University of Science and Technology, Seoul, Republic of Korea
PENG YUE  Department of Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
xiv Contributors

HAIJIA YU  Jiangsu Key Laboratory for Molecular and Medical Biotechnology, College of Life
Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, China; Department of Molecular,
Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, CO, USA
YONGLI ZHANG  Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine, New
Haven, CT, USA
 Part I

Biophysics and Computational Analysis

 Chapter 1

Molecular Dynamics Simulations of the SNARE Complex

Maria Bykhovskaia

Abstract
Molecular dynamics (MD) simulations enable in silico investigations of the dynamic behavior of proteins
and protein complexes. Here, we describe MD simulations of the SNARE complex and its interactions with
the neuronal protein complexin. Complexin is an effector of neuronal secretion that inhibits spontaneous
fusion and is thought to clamp the fusion process via the interactions with the SNARE complex. We
describe MD simulations of the SNARE complex alone and bound to complexin. The MD simulations
under external forces imitating the repulsion between lipid bilayers enabled us to investigate unraveling and
assembly of the SNARE complex.

Key words Synaptic transmission, Exocytosis, Synaptobrevin, Syntaxin, SNAP25, Forces, Assembly

1 Introduction

Molecular dynamics (MD) is a powerful computational approach

that enabled investigations of protein dynamics at the atomic level
[1]. This approach has proved to be instrumental in guiding site-
directed mutagenesis of receptors, ion channels, and enzymes
[2–4]. Until recently, a critical limitation of MD simulations was
the inability to simulate protein dynamics at timescales beyond a
few nanoseconds. However, recent advances in supercomputing,
such as MD software packages developed for parallel platforms [5],
a new generation of supercomputers, and specialized supercompu-
ters designed for MD simulations [6], have enabled a break-
through. Currently, the dynamics of protein complexes can be
investigated employing MD simulations at sub-microsecond or
even microsecond range, approaching the timescales required to
detect major conformational transitions in proteins and protein
complexes.
We employed MD simulations [7, 8] to develop dynamic mod-
els of the final steps of SNARE unraveling and assembly and their
regulation by the protein complexin (Cpx). Cpx is a SNARE-

Rutilio Fratti (ed.), SNAREs: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1860,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8760-3_1, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

3
4 Maria Bykhovskaia

interacting protein which is thought to prevent full SNARE assem-

bly and clamp spontaneous fusion [9–12]. Initial MD studies of the
SNARE complex enabled assessing overall flexibility of the SNARE
bundle [13, 14] and also investigating it in the presence of Cpx
[15]. We performed MD simulations of the SNARE complex under
external forces to imitate the influence of lipid bilayers, and inves-
tigated how Cpx affects the separation and assembly of membrane-
proximal layers of the SNARE bundle. Combined with targeted
mutagenesis in Drosophila [8], these simulations enabled us to
develop a model for the dynamic interaction of Cpx with the
SNARE bundle and its role in neuronal section.

2 Materials

1. ZMM software package (www. zmmsoft.com [16, 17])

enabling initial optimization and homology modeling was
used for the system setup.
2. VMD (Visual Molecular Dynamics, NIH Center for Macro-
molecular Modeling and Bioinformatics, University of Illinois
at Urbana-Champaign) software (http://www.ks.uiuc.edu/
Research/vmd/) was used for the system setup and data analy-
sis. We used the versions 1.8 and 1.9 for Windows.
3. NAMD Scalable Molecular Dynamics [5] (NIH Center for
Macromolecular Modeling and Bioinformatics, University of
Illinois at Urbana-Champaign, versions 2.8–2.10) were used
for MD computations. The heating phase was performed
under Windows platform at PC computers, while production
runs were performed at Stampede and Ranger supercomputers
through XSEDE (eXtreme Science and Engineering Discovery
Environment, www.xsede.org) network.
4. The software package Vega ZZ (Drug design Laboratory,
http://nova.disfarm.unimi.it/cms/index.php?Software_pro
jects:VEGA_ZZ) under Windows platform was used for the data
analysis. The software package PyMol (www.PyMol.org) was
used to create illustrations.
5. MatLab software (MathWorks) was used for the system setup
and data analysis.
6. All the X-ray structures used for the initial system setup were
downloaded from the protein data bank (http://www.rcsb.
org).
7. Drosophila protein sequences were downloaded from NCBI
(National Center for Biotechnology Information) database.
 MD Simulations of the SNARE Complex 5

3 Methods

3.1 System Setup Use the high-resolution (1.4A) X-ray structure 1N7S for the initial
topology of the SNARE complex [18]. Optimize the structure
3.1.1 SNARE-Cpx
employing the Monte-Carlo Minimization (MCM) method [19]
Complex
with ZMM software package.
Construct the initial topology of the SNARE-Cpx complex out
of two X-ray structures: 1N7S, the high-resolution structure of the
SNARE complex, and 1KIL [20], the structure of the SNARE-Cpx
complex obtained by a combination of crystallography and NMR
approaches with 2.3 A resolution. Construct the SNARE-Cpx
model using the ZMM/MVM package in the following way:
1. The SNARE bundle structure (from 1N7S) is kept rigid, and
Cpx (from 1KIL) is docked to the bundle by imposing har-
monic distance constraints obtained from 1KIL SNARE-Cpx
structure. The constraints are imposed on all the atoms of the
SNARE bundle and Cpx that are within van der Waals (VdW)
distances.
2. Optimize the resulting structure employing the MCM algo-
rithm with ZMM/MVM package and imposing constraints on
all the C-alpha atoms, which are rigidly pinned.
3. Remove all the constraints and optimize the structure of the
SNARE-Cpx complex employing MCM with no constraints.

3.1.2 Homology Perform sequence alignments between the Drosophila and mamma-
Modeling of the Drosophila lian protein fragments using the BLAST algorithm in NCBI
Complex (National Center for Biotechnology Information) database. Derive
the 3D model of the Drosophila SNARE-Cpx complex from the
model of the mammalian complex (described in the previous sec-
tion) employing ZMM package. Perform the residue substitutions
on one helix at a time (overall five rounds for five helixes comprising
the complex), and optimize the structure after each round with
MCM employing ZMM package. Manually perform the substitu-
tions within the *.pep file generated by ZI module of ZMM pack-
ager (see Note 1). After each round of substitutions, optimize the
structure with Cɑ atoms being rigidly pinned, and then optimize
again with no constraints. The resulting 3D structure of the Dro-
sophila complex was similar to the mammalian complex (Fig. 1).

3.1.3 Molecular Perform operations using VMD software. Build the molecular
Topology, Single-Point topology file *.psf employing the Automatic Psf Generator (see
Mutations, Water Box, Note 2). Introduce single-point mutations in Syx, Syb, and Cpx
and Ionization employing VMD Mutator. Add the water box using Add Solvation
Box function. The size of the box is 150
70
70 Å (Fig. 2). Add
ions employing the Add Ions function. Add K+ and Cl+ ions to
neutralize the negative charge of the protein complex and to yield
150 mM concentration of KCl (see Note 3).
6 Maria Bykhovskaia

Fig. 1 Two views of superimposed mammalian (blue) and Drosophila (green)

SNARE-Cpx complexes after the optimization show almost perfect overlay of the
backbone (top) and moderate deviations of side chains (bottom)

Fig. 2 The periodic cell containing water molecules, potassium ions (blue
spheres), and chlorine ions (green spheres). SNARE-Cpx complex is shown in
the cartoon representation (blue)

3.2 Molecular Perform MD simulations employing NAMD package and

Dynamics CHARMM22 force field [21–23] (see Note 4) with periodic
boundary conditions and Ewald electrostatics at NTP ensemble.
Keep bond lengths of water molecules fixed (see Note 5). Regulate
the pressure with Berendsen barostat.
 MD Simulations of the SNARE Complex 7

3.2.1 Energy Perform the energy minimization for 100 iterations (see Note 6),
Minimization and Heating followed by the heating phase. At the heating phase, set the time
Phase step to 1 fs. Set the initial temperature to 200 K and adjust every
500 steps in increments of 50 K by velocity rescaling (see Note 7).
Set the Berendsen barostat parameters to:

useGroupPressure Yes
BerendsenPressureTarget 1.01325
BerendsenPressureCompressibility 4.57E-5
BerendsenPressureRelaxationTime 40
BerendsenPressureFreq 2

Set the heating phase to last 10 ps (see Note 8). Use a scaling of
2 for electrostatic interactions: fullElectFrequency ¼ 2.

3.2.2 MD Perform production runs with a step of 2 fs. Use a scaling of 2 and
Production Runs 4 for non-bonded and electrostatic interactions, respectively:

timestep 2.0
nonbondedFreq 2
fullElectFrequency 4

Control the temperature with Langevin thermostat with the

damping factor langevinDamping ¼ 5.0. Set the parameters of
Berendsen barostat to optimize the speed (see Note 9):

BerendsenPressureRelaxationTime 160
BerendsenPressureFreq 8

Set the production runs to last 200–300 ns (see Note 10).

To avoid a rotation of the molecular complex in the prolonged
rectangular water box, apply harmonic constraints to Cɑ atoms of
the C-terminal residue (K256) of syntaxin (Syx), the C-terminal
residue (K83) of SN1 unit of SNAP25, and the N-terminal residue
(G139) of SN2 unit of SNAP 25 (Fig. 3a, see Note 11).

3.2.3 SNARE Separation Apply external forces to the Cɑ atom of the C-terminal residue
Under External Forces (W89) of synaptobrevin (Syb). Compute the direction of the force
as a vector perpendicular to the plain defined by the constrained
atoms of the t-SNARE bundle (Fig. 3a, see Note 12). Perform
these calculations employing MatLab (see Note 13). Vary the mag-
nitude of the force within the limits predicted by the computations
of the membrane electrostatic potential ([7, 24], 2–4 kcal/mol/Å,
see Note 14). The force of 2 kcal/mol/Å produced unraveling of
the bundle within 100–200 ns (Fig. 3b).
8 Maria Bykhovskaia

Fig. 3 Simulations of SNARE unraveling under external forces. (a) The positions
of the C-terminal residue of Syx, C-terminal residue of SN1 subunit of SNAP25,
and N-terminal residue of SN2 subunit of SNAP25 are constraint (black circles).
The external force (arrow) is directed perpendicular to the plain defined by the
constraint atoms. (b) Unraveling of Syb under the external force of 2 kcal/mol/Å
at different time points of the trajectory. The structures are shown in two
representations: left—backbone; right—all-atom as VdW spheres

Use a time step of 1 fs for simulations under external forces and

maintain the temperature by velocity rescaling (as during the heat-
ing phase, see Note 15).

3.2.4 SNARE Assembly For the simulations of the SNARE assembly, use the initial states
obtained by the simulations under pulling forces (Fig. 3b), as
described in the previous section. Perform the simulations of the
SNARE assembly in two different ways [7]: (1) with no external
force applied, and (2) with a weak external force applied (see Note
16). We found that the second paradigm produced a faster zipper-
ing (see Note 17), since in the absence of constraints the unstruc-
tured C-terminus Syb tended to interact with distal layers of the
bundle.
The parameters of the simulation were identical to those
described in Subheading 3.2.2 for the paradigm 1, and to the
parameters described in Subheading 3.2.3 for the paradigm 2.
 MD Simulations of the SNARE Complex 9

3.3 Trajectory 1. Set the interval between trajectory points to 10 ps.

Analysis 2. Evaluate the separation of Syb and Cpx from the SNARE
bundle by computing the distance between Cɑ atoms of several
key residues. Compute the distance using Vega ZZ software
(Analysis/Measure function).
3. Check the periodic images of the complex at several trajectory
points employing VMD software (see Note 18).
4. Compute the interaction energies of different parts of the
complex employing VMD/namd2 interface (NAMD Energy
function within the VMD package).
5. Generate images of the models employing PyMol and VMD
packages.

4 Notes

1. This approach was practical, since homology was relatively high

(>70%). With lower homology, automated approaches should
be used, such as Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)
or similar software.
2. It is critical to ensure that the topology parameter file used to
build the molecular structure (*.psf) matches the force-field
parameter file used for MD computations. Current CHARMM
topology and force-field parameter files can be obtained from
the MacKerell Lab, www site (http://mackerell.umaryland.
edu/charmm_ff.shtml).
3. Potassium ions were added, since we aimed to simulate the
SNARE complex inside the cell. If the goal is to reproduce the
results of in vitro experiments, then the ion concentration and
composition should closely match the buffer solution.
4. Currently, the latest version of the CHARMM force field is
CHARMM36 [21] (http://mackerell.umaryland.edu/
charmm_ff.shtml), and earlier versions can be considered obso-
lete. Importantly, the major changes in force-field parameters
between the versions CHARMM22, 27, and 36 involved
nucleic acids, lipids, and carbohydrates, but not proteins.
Since we have a molecular system composed out of proteins
in water and ion environment, it is unlikely that the behavior of
this system would be altered when switching from
CHARMM22 to CHARMM36. However, the CHARMM36
version is presently considered the most accurate.
5. Sometimes the system becomes unstable during the heating
phase or at the initial stages of the production run, and in such
cases it may be helpful to equilibrate the system with all the
bond length being flexible. However, this would drastically
10 Maria Bykhovskaia

increase the simulation time, and this is not recommended for

production runs.
6. If the minimization length is not sufficient, then the system
would become unstable at the beginning of the heating phase.
The most common error in these cases would be velocities of
selected atoms exceeding the maximally allowed values. In such
cases, additional minimization should be performed. However,
the minimization algorithms employed within NAMD are very
powerful, and after 400–500 steps of minimization the system
can considerably deviate from its initial state. Thus, if 200–300
minimization steps were not sufficient, the system setup should
be checked thoroughly.
7. If the system becomes unstable during the heating phase, it
may be helpful to start from lower temperatures (50–100 K)
and proceed in smaller increments (10–20 K).
8. The pressure should be checked in the end of the heating
phase. The value of Group Pressure Average should fluctuate
within 5 to 5 bar range. If the values are consistently higher,
additional equilibration may be needed.
9. If the values of Group Pressure Average (see above) become too
high, both parameters should be reduced.
10. Supercomputers of the latest generation enable MD simula-
tions of longer trajectories (at a microsecond range) for this
system. It would be of interest to investigate how the accessory
helix of Cpx interacts with the SNARE bundle at longer time-
scales. Our simulations at the 200–300 ns range demonstrated
that these interactions are dynamic and that Cpx may tightly
interact with the bundle, or it may deviate from the bundle.
Simulations at a microsecond scale would be of interest for
performing a statistical analysis of the Cpx states.
11. In vivo, the residue K256 of Syx would be attached to the
plasma membrane, and the palmitoylated loop of SNAP25,
which spans between the C-terminus of its SN1 unit and the
N-terminus of its SN2 unit, would be attached to the mem-
brane as well. These interactions would restrict movements of
both proteins. Thus, our constraints imitate the attachment of
the t-SNARE (Syx and SNAP25 complex) to the plasma mem-
brane via the transmembrane domain of Syx and the palmitoy-
lated loop of SNAP25.
12. An alternative design would be applying opposing forces to
C-termini of Syb and Syx. This paradigm usually produces
unraveling of both Syb and Syx from the bundle. Such simula-
tions would be appropriate to imitate unraveling of the SNARE
complex in vitro. In contrast, applying constraints to Syx and
SNAP25 and applying a force to Syb, as described here, pro-
duce unraveling of Syb from the core t-SNARE bundle. Such
 MD Simulations of the SNARE Complex 11

scenario appears most appropriate to imitate SNARE unravel-

ing in vivo, with the core t-SNARE bundle being attached to
the membrane.
13. The following MatLab code computes the force vector:
a=[]
b=[]
c=[]
d=a-b
e=c-a
k=cross(d,e)
lk=sqrt(sum(k.*k))
nk=k./lk

Coordinates of the three constrained atoms should be entered

for a, b, and c, and the unitary vector perpendicular to the plain
defined by these three atoms will be computed. This vector
should be multiplied by the value of the force.
14. The computations of the electrostatic repulsion predict that the
force applied to the SNARE bundle would be 2–4 kcal/Mol/Å
when the complex is fully or nearly fully zippered, and decrease
exponentially as the distance between Syx and Syb C-termini
increases, becoming negligibly small at a separation of 5–6 nm
[7, 24]. However, various forces have been used in biophysical
in vitro experiments to investigate SNARE unraveling. When
the force is below 1.5 kcal/mol/Å, the complex usually does
not unravel within 100–200 ns, and therefore we employed the
forces of 2 kcal/Mol/Å or higher. However, as longer MD
simulations become realistic, it would be of interest to explore
SNARE unraveling under weaker forces and to relate this
dynamics to single-molecule experiments.
15. We found that in this system external forces are not compatible
with Langevin thermostat, since this combination destabilized
the system. Similarly, increasing the time step compromised the
stability.
16. We used the forces of 0.5 or 0.25 kcal/Mol/Å. These forces
would imitate the inertia imposed on Syb by the attached
vesicle. This force should not be applied when simulating the
dynamics of the isolated SNARE complex.
17. Within the simulation times employed in our studies
(200–400 ns), we never observed full SNARE assembly if
more than one C-terminal helical turn of Syb was initially
unraveled. Zippering of a single C-terminal helical turn of
Syb (Layer 8) was usually observed within 20–100 ns of the
simulation.
12 Maria Bykhovskaia
18. One needs to ensure that the unraveled terminus of Syb does
not contact with the periodic image of the SNARE complex.
The cell size we chose was sufficient as long as Syb was unra-
veled up to the layer 6. If a more radical separation is simulated,
the size of the periodic cell has to be increased.
References
1. Karplus M, McCammon JA (2002) Molecular
dynamics simulations of biomolecules. Nat
Struct Biol 9(9):646–652. https://doi.org/
10.1038/nsb0902-646
2. Roux B, Schulten K (2004) Computational
studies of membrane channels. Structure 12
(8):1343–1351. https://doi.org/10.1016/j.
str.2004.06.013
3. Zhou HX, McCammon JA (2010) The gates of
ion channels and enzymes. Trends Biochem Sci
35(3):179–185. https://doi.org/10.1016/j.
tibs.2009.10.007
4. Miao Y, McCammon JA (2016) G-protein
coupled receptors: advances in simulation and
drug discovery. Curr Opin Struct Biol
41:83–89. https://doi.org/10.1016/j.sbi.
2016.06.008
5. Phillips JC, Braun R, Wang W, Gumbart J,
Tajkhorshid E, Villa E et al (2005) Scalable
molecular dynamics with NAMD. J Comput
Chem 26(16):1781–1802
6. Shaw DE, Dror RO, Salmon JK, Grossman JP,
Mackenzie KM, Bank JA, Young C, Deneroff
MM et al. (2009) Millisecond-scale molecular
dynamics simulations on Anton. Proceedings
of the conference on high performance com-
puting, networking, storage and analysis, vol
SC09. ACM, New York
7. Bykhovskaia M, Jagota A, Gonzalez A, Vasin A,
Littleton JT (2013) Interaction of the com-
plexin accessory helix with the C-terminus of
the SNARE complex: molecular-dynamics
model of the fusion clamp. Biophys J 105
(3):679–690
8. Vasin A, Volfson D, Littleton JT, Bykhovskaia
M (2016) Interaction of the complexin acces-
sory helix with synaptobrevin regulates sponta-
neous fusion. Biophys J 111(9):1954–1964.
https://doi.org/10.1016/j.bpj.2016.09.017
9. Huntwork S, Littleton JT (2007) A complexin
fusion clamp regulates spontaneous neuro-
transmitter release and synaptic growth. Nat
Neurosci 10(10):1235–1237
10. Brose N (2008) For better or for worse: com-
plexins regulate SNARE function and vesicle
fusion. Traffic 9(9):1403–1413. https://doi.
org/10.1111/j.1600-0854.2008.00758.x
11. Reim K, Mansour M, Varoqueaux F, McMa-
hon HT, Sudhof TC, Brose N, Rosenmund C
(2001) Complexins regulate a late step in Ca2
+dependent neurotransmitter release. Cell
104(1):71–81
12. Kummel D, Krishnakumar SS, Radoff DT,
Li F, Giraudo CG, Pincet F, Rothman JE,
Reinisch KM (2011) Complexin cross-links
prefusion SNAREs into a zigzag array. Nat
Struct Mol Biol 18(8):927–U1603
13. Durrieu MP, Lavery R, Baaden M (2008)
Interactions between neuronal fusion proteins
explored by molecular dynamics. Biophys J 94
(9):3436–3446
14. Bock LV, Hutchings B, Grubmuller H, Wood-
bury DJ (2010) Chemomechanical regulation
of SNARE proteins studied with molecular
dynamics simulations. Biophys J 99
(4):1221–1230
15. Ghahremanpour MM, Mehrnejad F, Moghad-
dam ME (2010) Structural studies of SNARE
complex and its interaction with complexin by
molecular dynamics simulation. Biopolymers
93(6):560–570
16. Tikhonov DB, Zhorov BS (2012) Architecture
and pore block of eukaryotic voltage-gated
sodium channels in view of NavAb bacterial
sodium channel structure. Mol Pharmacol 82
(1):97–104
17. Bruhova I, Zhorov BS (2010) A homology
model of the pore domain of a voltage-gated
calcium channel is consistent with available
SCAM data. J Gen Physiol 135(3):261–274
18. Ernst JA, Brunger AT (2003) High resolution
structure, stability, and synaptotagmin binding
of a truncated neuronal SNARE complex. J
Biol Chem 278(10):8630–8636
19. Li ZQ, Scheraga HA (1987) Monte-Carlo-
minimization approach to the multiple-minima
problem in protein folding. Proc Natl Acad Sci
U S A 84(19):6611–6615
20. Chen X, Tomchick DR, Kovrigin E, Arac D,
Machius M, Sudhof TC, Rizo J (2002) Three-
dimensional structure of the complexin/
SNARE complex. Neuron 33(3):397–409
21. Huang J, MacKerell AD Jr (2013)
CHARMM36 all-atom additive protein force

field: validation based on comparison to NMR
data. J Comput Chem 34(25):2135–2145.
https://doi.org/10.1002/jcc.23354
22. Vanommeslaeghe K, Hatcher E, Acharya C,
Kundu S, Zhong S, Shim J et al (2010)
CHARMM general force field: a force field for
drug-like molecules compatible with the
CHARMM all-atom additive biological force
fields. J Comput Chem 31(4):671–690.
https://doi.org/10.1002/jcc.21367
MD Simulations of the SNARE Complex 13
23. Mackerell AD Jr (2004) Empirical force fields
for biological macromolecules: overview and
issues. J Comput Chem 25(13):1584–1604
24. Fortoul N, Singh P, Hui C-Y, Bykhovskaia M,
Jagota A (2015) Coarse-grained model of the
Snare complex determines the number of
Snares required for docking. Biophys J 108
(2):154a
 Chapter 2

Mesoscale Computational Modeling of Protein-Membrane

Interactions Based on Continuum Mean-Field Theory
George Khelashvili

Abstract
Quantitative computational modeling of protein-membrane interactions is of great importance as it aids in
the interpretation of experimental results and enables design and exploration of new experimental systems.
This review describes one such computational approach conceived specifically to treat electrostatically
driven interactions between a lipid membrane and a protein (or protein domains) adsorbing onto the
membrane. The methodology is based on self-consistent minimization of the governing free energy
functional which is expressed in the mean-field approximation and has contributions from electrostatic
interactions as well as from mixing entropy of lipids in the membrane and ions in the solution. The method
enables calculation of the free energy of the binding process and quantification of the steady-state lipid
distribution around the adsorbing protein. The extension of the method to include membrane deformation
degrees of freedom further allows calculation of the equilibrium bilayer shape upon the protein binding.

Key words Poisson-Boltzmann theory, Cahn-Hilliard equation, Coarse-grained theory, Lipid

mixing, Electrostatic interactions, PIP2 lipids, Lipid diffusion and segregation, Cell signaling

1 Introduction

To perform their physiological function, signaling proteins and

other macromolecules are often required to associate with the cell
plasma membrane by means of nonspecific electrostatic interactions
between anionic lipids residing in the intracellular leaflet of the
plasma membrane and clusters of basic residues on the adsorbing
protein [1–3]. This process is not only energetically preferred, but
also driven by entropic factors responsible for the mobility of ions
in the bulk solution. Indeed, when in isolation, a protein and a lipid
membrane maintain charge neutrality by sequestering on or near to
their surfaces the so-called counterions from the solution
[4–7]. Upon protein-membrane binding, these counterions can
be released to the bulk solution to produce a gain in translational
entropy, while the protein and membrane electro-neutralize each
other [5, 8–10]. Thus, the stronger the extent of the aggregation of

Rutilio Fratti (ed.), SNAREs: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1860,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8760-3_2, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019

15
16 George Khelashvili

charged lipids near the protein (lipid demixing), the higher gains in
the translation entropy of the counterions due to their release. But
the local demixing of lipids itself comes at an entropic cost. For
example, multivalent lipids, such as phosphatidylinositol
4,5-bisphosphate (PIP2), would incur a smaller demixing penalty
and larger counterion release entropy per sequestered lipid, com-
pared to monovalent phosphatidylserine (PS) lipids, simply because
each PIP2 head group carries a larger charge (but loses the same
entropy) [11].
The balance between the maximal counterion release and the
minimal lipid demixing ultimately determines the equilibrium state
of the system. To quantify the process of protein-membrane bind-
ing, it is therefore essential to take into consideration the degrees of
freedom related to mixing of lipids and the solution ions self-
consistently with the electrostatic interactions. Achieving such
description with conventional computational methodologies, such
as molecular dynamics (MD) simulations, remains a challenge due
to the extended time and length scales required for rigorous sam-
pling of protein-lipid interactions and concomitant lipid reorgani-
zation in the membrane plane.
A realistic alternative is to consider the free energy functional
(F) of the protein-membrane system on the mean-field level and
express it in terms of all the relevant degrees of freedom, i.e., local
lipid and ionic concentrations. Specifically, consider charged pro-
teins and lipid bilayers immersed in an aqueous solution. The
adsorbing protein is represented in full-atomistic three-dimensional
(3D) details (taking into consideration point charges and van der
Waals radii of all the constituent atoms), whereas the membrane is
treated as a two-dimensional (2D) incompressible, tensionless,
elastic medium comprised of 2D smooth charged surfaces (where
the lipid polar head groups reside), and a low-dielectric hydropho-
bic core volume. For simplicity, it is assumed for now that in the
process of protein adsorption the bilayer remains on average flat so
that it is sufficient to consider only one such 2D surface, represent-
ing the protein-facing leaflet (Fig. 1). This leaflet is presumed to be
a binary mixture of charged and neutral lipids. As described in
Subheading 4 below and in published papers [11, 12] the formula-
tion has been extended to the cases in which the membrane is
undergoing deformations (see Note 3) and/or contains mixtures
with arbitrary number of charged lipid species (see Note 2).
The free energy functional of the full-atomistic protein and
continuum membrane hybrid system introduced above can be
expressed in the mean-field approximation as a sum of three con-
tributions: electrostatic energy (Fel), mobile salt ion translational
entropy (Fion), and lipid mixing entropy (Flip) [5, 8–10, 13, 14]:
F ¼ F el þ F ion þ F lip : ð1Þ
 Mean-field Modeling of Protein-membrane Interactions 17

Fig. 1 SNARE protein syntaxin 1B sequestering PIP2 lipids. Panels A and B depict
two views related to each other by 90 rotation, of residues 1–264 of syntaxin 1B
(in cartoon) interacting with a lipid membrane leaflet which contains 5% PIP2
lipid in mixture with other neutral lipids (see Ref. 27 for more details). Only part
of the membrane leaflet near the protein is shown and is represented by a plane
color according to PIP2 enrichment values (ratios of local, ϕ, and average, ϕ0,
PIP2 concentrations) as predicted by the self-consistent minimization scheme
described in this work. The locations with the enrichment value >1 represent
regions with elevated PIP2 concentrations compared to the average composition.
For completeness, in panel A some key basic residues driving the lipid seques-
tration are shown in licorice and labeled

The system’s electrostatic (Coulomb) energy is given by

ð
1 kB T
F el ¼ ε0 r; t ÞÞ2 dv:
εd ð∇Ψ ð~ ð2Þ
2 e2
V

Here, Ψð~ r; t Þ ¼ eΦð~

r; t Þ=kB T is the reduced (dimensionless)
electrostatic potential in space, with Φ representing the electrostatic
potential, e the elementary charge, kB the Boltzmann constant, and
T the temperature; ε0 denotes the permeability of free space and εd
is the dielectric constant within the volume element dv, assumed to
18 George Khelashvili

be low inside the membrane and the protein and high in the
aqueous solution. ~ r denotes a position in the space, and the ð~ r; t Þ
notation represents the fact that the electrostatic potential can vary
in time in response to rearrangements of the solution ions or lipids
in the membrane. The integration in Eq. (2) is carried out over the
volume V of the entire space.
The translation entropy of mobile ions in the solution can be
written as
Ðh   n ð~r;t Þ
F ion ¼ kB T nþ ð~ r;t Þ ln nþnð~0r;t Þ þ n ~
r; t ln n0

V
  i ð3Þ
 nþ ð~ r;t Þ þ n ~ r;t  2n0 dv:

In the above, nþ ð~ r; t Þ and n ð~ r; t Þ represent local concentra-

tions of the positive and negative ions of the solution, respectively,
and n0 is the bulk concentration of the ions.
The 2D mixing entropy of lipids in the membrane is given by
ð

kB T ϕð~ r; t Þ ð1  ϕð~
r;t ÞÞ
F lip ¼ ϕð~r; t Þ ln þ ð1  ϕð~ r;t ÞÞln ds:
a ϕ0 ð1  ϕ0 Þ
A
ð4Þ
Here, the integration is over the 2D membrane plane,
a represents the lateral area per lipid head group (assumed, for
simplicity, to be the same for all the lipids), and ϕ0 and ϕð~ r; t Þ
are, respectively, the average and local mole fractions of the charged
lipids in the membrane. The local lipid compositions are related to
local charge densities, σ ð~r; t Þ, through the expression
e
r; t Þ ¼ zϕð~
σ ð~ r; t Þ: ð5Þ
a
In the above, z is the valency of the charged lipid. Functional
minimization of F with respect to the mobile ion concentrations
leads to the nonlinear Poisson-Boltzmann (NLPB) equation [6, 10,
15–17]:
r; t Þ ¼ λD 2 sinhΨð~
∇2 Ψð~ r; t Þ: ð6Þ
Here λD is the Debye length of the solution corresponding to
the bulk ion concentration. Eq. (6) is solved to obtain the reduced
electrostatic potential, Ψ, in space. Based on the minimized ionic
concentrations and Ψ, the so-called full electrostatic energy
Ffull ¼ Fel + Fion can then be calculated using Eqs. (2) and (3).
Since lipids are fluid and can freely diffuse in the membrane
plane, additional minimization of the free energy functional with
respect to local lipid compositions is also required. This is done
using dynamic propagation scheme, based on the Cahn-Hilliard
(CH) formalism that reaches the equilibrium lipid distribution in
the long-time regime [18]. Thus, the CH equation propagates the
 Mean-field Modeling of Protein-membrane Interactions 19

local compositions of the charged lipids based on the gradients in

their respective electrochemical potential:
ϕð~
r; t þ Δt Þ ¼ ϕð~
r; t Þ þ ΔtD lip ∇2 μð~
r; t Þ: ð7Þ
Here Dlip is the diffusion constant of lipids (assumed, for
simplicity, to be the same for all the lipid species), Δt represents
discretization step, and μð~r; t Þ is the electrochemical potential of
the charged lipids given by


∘ ϕð~r; t Þð1  ϕ0 Þ
μð~
r; t Þ ¼ μ þ kB T ln þ zΨð~
r; t Þ : ð8Þ
ϕ0 ð1  ϕð~ r; t ÞÞ
In the above, μo represents standard chemical potential for the
charged lipid that is independent from ϕ. In order to solve Eq. (7)
for all the charged lipid species in the system, the corresponding
electrochemical potentials need to be first calculated from Eq. (8).
Since μð~ r; t Þ-s are dependent on the local Ψð~ r; t Þ potentials, which
are, in turn, obtained from the NLPB equation (Eq. (6)), the
minimization of the free energy functional must be performed
self-consistently. This can be conveniently achieved using the fol-
lowing iterative scheme: first, given the initial lipid compositions in
the membrane, Ψ is calculated everywhere in space by solving the
NLPB equation. The resulting Ψ values are then used to calculate
the electrochemical potential of all the charged lipids and every-
where on the membrane using Eq. (8). Finally, using these μð~ r; t Þ-s,
the local lipid compositions are propagated according to Eq. (7) to
yield a new set of local lipid compositions. In the next iteration of
the protocol, these updated ϕð~ r; t Þ-s are used to obtain the new
electrostatic potential in space, and so on. This self-consistent loop
involving Eqs. (6)–(8) is repeated until there is no change in the
free energy (within the set threshold), or equivalently, until no
gradients in the electrochemical potential of the lipids remain (see
Note 1). At this point, the system is assumed to have reached the
equilibrium and the binding free energy as well as spatial distribu-
tion of the lipids in the membrane are calculated.
Note that, in order to preserve the overall number of lipids in
the system during the self-consistent minimization procedure out-
lined above, the membrane patch must be strictly considered to be
of infinite size. In practice, however, the calculations are performed
for a finite-size system which is assumed to be coupled to a reservoir
of lipids having the same average composition (i.e., containing a
fraction ϕ0 of charged lipids) [10]. To account for such coupling, it
is necessary to consider the additional free energy contribution,
standard within regular solution theory [19], related to the entropy
of an ideally mixed system composed of Nlip number of lipids:
    
e ϕ
F ideal ¼ N lip kB T ϕlog eþ 1ϕ e log 1  ϕ e : ð9Þ
Another random document with
no related content on Scribd:
 Tiedät myös, että se tulppaani jäi seisomaan tuokkoseensa
pitkäksi aikaa sen jälkeen kun se oli kuihtunut. Se seisoi siinä vielä
keväälläkin muitten tulppaanien jo puhjettua puutarhassa. Sillä kaikki
aavistivat, ettei se ollut mikään tavallinen tulppaani, eikä kukaan
hennonut sitä heittää pois. Kirstikin katseli tuota sinertävää ja
rutistunutta kasvia hienotunteisella arkuudella, sillä hänkin tiesi, kuka
sen oli lähettänyt, ja että jos siihen kajosi, saattoi se koskea kipeästi
Yrjöön.

24.

Kevät tuli aikaisin sinä vuonna. Kottaraiset pesivät jo huhtikuussa.

Peipposet ja leivosetkin saapuivat samassa ja täyttivät ilman
liverryksillään. Noilla viljavilla aukeamilla oli kymmeniä ja satoja
yht'aikaa nousemassa korkeammalle ja korkeammalle kohti
loistavaa taivaan kupua ja kiitostaan laulamassa ylitsevuotavin
riemusävelin siitä että olivat olemassa. Siitä kiittivät myöskin helein
värein krokukset ja skillat puutarhassa ja siitä paisuivat koivujen
nuput. Mutta tuo ihme, joka yhtä vakaavana joka vuosi uudistuu, se
tapahtui lauantain ja sunnuntain välisenä yönä. Sunnuntaiaamuna
avatessamme ikkunat olivat koivut puhjenneet lehtiin ja voimakas
tuoksu lemusi vastaamme kostean lämpimässä aamutuoreudessa.

Viikkoa myöhemmin tulit ylioppilaaksi.

Isä ja minä kävelimme Aleksanterinkatua pitkin jutellen sinusta.

Puhuimme lapsuudestasi ja siitä pitkästä ulkomaanmatkasta, jolloin
ensi kertaa olimme sinusta erossa ja jolloin meillä lopulta molemmin
puolin oli niin ikävä, että laskimme päivät ja tunnit kotiin tuloomme.
Meidän sitten saapuessamme eräänä varhaisena aamuna kotiin,
nukkui koko talo, mutta äänemme olivat herättäneet sinut ja juosta
lippasit ulos paitasillasi portaille asti. Silloin sinä itkit ilosta.
Poissaolon aikana olit kasvanut kovasti ja näytit siinä pitkine paljaine
säärinesi kuin olisit kävellyt puujaloilla.

Mutta vielä enemmän puhuimme siitä onnesta, että sinulla oli

sellainen ystävä kuin Marja. Ja siitä että teidän suhteenne oli saanut
säilyä niin häiriintymättömänä molempien kodeissa ja niinikään
koulussa. Se oli ollut niin avoin ja raikas, että teidät oli jätetty
rauhaan.

Siitä iloitsimme lähestyessämme Senaatintoria. Jäisi ainiaaksi

kaunis muisto tästä ajasta teille molemmille, niin sinulle kuin
Marjallekin, vaikkei siitä kehittyisikään mitään sen enempää. Senpä
takia se tyttö ansaitsisi oikein kauniin ruusukimpun Yrjön
vanhemmilta.

Ja isä osti kukkia Yrjölle ja vielä muutamille heidän tovereilleen. Ja

hän antoi minulle toisen puolen heille jaettavaksi.

Senaatintori oli sitten täynnä odottavia, kuten tavallisesti tällaisissa

tilaisuuksissa. Siellä oli tietysti sukulaisia ja ystäviä — eikä vähimmin
ylioppilaita, jotka pari- kolmevuotisen arvonsa huipulta tahtoivat
tervehtiä nuoria keltanokkia. Seisottiin ja juteltiin — katsottiin tuon
tuostakin Nikolainkirkon tornia ja alettiin ikävystyä.

Silloin kuului huuto. Ja ensimmäinen joukko valkotakkisia juoksi

alas yliopiston portaita. Mutta sinä et ollut vielä heidän joukossaan.

Ihmiset saivat taas yrittää lyhentää odotusaikaansa kertomalla

toisilleen mitä tiesivät. Helsinkiläisillä oli kyllä hauskin vastaanotto,
arveltiin, koska heillä on eniten tuttuja ja he ovat joka vuosi
ensimmäiset. Nytkin istui jo ylioppilaita Kaivohuoneella odottamassa
uusia tovereitaan yhteiseen juhlaan.

Taas kuului huuto ja taas tulvi valkotakkisia leveitä portaita alas.

Pian oli pitkä poikamme raivautunut tungoksen läpi luoksemme ja
tervehti meitä ilosta sädehtien. Olit ehtinyt saada kukkia jo matkaltasi
— Henrik enolta — ja Etalta — ja Erikiltä — ja Anna tädiltä — ja
kaikki olivat tulleet varta vasten sinun takiasi! Ja nyt sinun piti pian
hankkia karjalaiset värit lakkiisi.

Sinä otit lakin päästäsi tarkastaaksesi lyyraa. Se ei ollut pienen

pieni eikä suuren suuri, vaan juuri sitä lajia kuin pitikin.

Ja koko elämä oli parhaimmillaan semmoisena kuin se oli juuri nyt.

Sitten sinä sait ruususi meiltä ja neilikan mummon ikkunalta ja

Kirstiltä kieloja, joita hän oli löytänyt metsästä. Niin tosiaankin, Kirsti!
Hän oli surumielisenä pistänyt kukkasensa äidin käteen, sillä eihän
hän saanut tulla kaupunkiin niin myöhään valvoakseen. Mutta sinä
kaipasit pientä liinapäätä sisartasi. Olisipa tuo ollut paras kaikesta,
jos hän olisi ollut mukana!

Mutta kun ei Marjaa näkynyt eikä kuulunut, vaikka häntä

odottelimme, saivat ympärillä seisovat toverit ensin oman osansa, ja
kun odotus tuntui olevan aivan tuloksetonta, vähitellen myöskin
Marjalle aiotut ruusut, niin että lopuksi seisoimme siinä tyhjin käsin.

Silloin hän tuli. Ilmestyi nauravana ja välkkyvin silmin ja kiersi

käsivartensa takaa päin kaulaani. Ja Marjan isä ojensi sinulle, Yrjö,
ruusun.
 Silloin kävin niin murheelliseksi, että jalkani tuntuivat lyijyn
raskailta, ja ilta tuli harmaaksi ja värittömäksi. Ja pyysin sanattomasti
teiltä molemmilta anteeksi sitä, että olin ehkä nostattanut hattaran
teidän pilvettömälle taivaallenne.

Katsoin syrjäsilmällä sinuun ja olinkin huomaavinani pienen

pettymyksen ilmeen.

Mutta Marja ei tuntunut mitään odottaneen. Hän oli miltei

suunniltaan ihastuksesta:

— Voi miten äärettömän — käsittämättömän — kauhistuttavan

hauskaa!

Niin oli. Tietysti niin oli. Koetin salata pahaa mieltäni, mutta sanoin
itselleni, että siinä se nyt taas oli, se mitä eniten vihasin — tuo
elämän taitamattomuus — ah, juuri senlaatuinen paha, joka estää
hetken tulemasta niin rikkaaksi kuin se muuten voisi olla! — Siinä ne
aina niin äkkiarvaamatta ilmestyivät eteeni, nuo laiminlyöntisynnit —
pahimmat kaikista — joita pitäisi olla helppo välttää ja joita kuitenkin
jokaisella on omallatunnollaan hirvittävä liuta.

Mutta tehtyä ei voinut tehdä tekemättömäksi.

Ja heitin luotani mielenapeuteni. Mutta aavistin, että sinä tuossa

vieressäni kulkiessasi itseksesi haudoit, miten voisit Marjalle korvata
ne kukkaset, joita hän ei saanut isältä ja äidiltä. Pian kävit taas täysin
hilpeäksi ja sait minutkin siirtymään omaan tunnelmaasi.

Marja erosi meistä seuraten isäänsä, mutta tunnin perästä nuorten

piti tavata toisensa Kaivohuoneella, ja isä ja minä aioimme mennä
sinne mekin kerran katsomaan nuorten iloa.
 Silloin oli tyyni ilta vaikka hiukan kolkko. Mutta eiväthän nuoret
siitä välittäneet. Kaivohuoneen salista kuului remuava melu ja
eteisessä juoksi ylioppilaita sisään ja ulos. Löysimme pienen pöydän
itsellemme ikkunan luona ja näimme sieltä, miten sinä seisoit portilla
Marjaa odottamassa. Napinlävessä sinulla oli ainoastaan pari kolme
kukkasta, muut kaikki, koko suuren kimpullisen ruusuja, pidit
kädessäsi. Toverit kulkivat toinen toisensa jälkeen ohitsesi päätä
nyökäyttäen, ikäänkuin olisi ollut päivän selvää, että siinä jotakin
odottelit.

Vihdoin Marja tulikin, valkoisiin puettuna, iloisena ja säteilevänä ja

pisti kätensä kainaloosi. Ja sinä, Yrjö — niin, Marja on sen minulle
perästäpäin kertonut — sinä otit takinkauluksesi alta pienen
orvokkikimpun, ojensit sen Marjalle ja sanoit:

— Tuon lähetti Henrik eno sinulle ja pyysi sanomaan terveiset.

— Hänkin! — Voi kuin tämä päivä on ihastuttava!

Mutta et itsekään muistanut, että Henrik eno, antaessaan sinulle

kukat, hienotunteisesti oli sanonut: Ja anna sitten nämä kukat sille
tovereistasi, josta eniten pidät. — Niin, sehän oli heti niin selvä asia.

Ja siinä astuessanne leveätä ja tuuheata lehmuskäytävää, nostit

koko kukkaisrunsautesi Marjan eteen, ojensit sen hänelle ja sanoit:

— Ja nämä saat sitten minulta!

— Yrjö — ei — miksi annat minulle kaikki kukkasesi?

Marja miltei säikähti.

— Sen takia vain, että annan.

 — Miksikä niin — miksi annat kukkasesi pois? — Missä täti? —
missä setä? — missä he istuvat? — Tule! Niin paljon en ota sinulta!

Te löysitte meidät nurkastamme.

— Ajatelkaa! — mitä te siihen sanotte? — huudahti Marja. — Yrjö

antaa minulle kaikki kukkasensa! — Miksi pitää minun tänään saada
niin paljon? — miksi kaikki ihmiset ovat niin hyviä? — ja — kuinka
voin ottaa nämä vastaan sinulta, Yrjö?

— Ota sinä, minkä saat — sanoi isä vakavasti. — Sellaisia lahjoja

ei anneta eikä otetakaan kuin kerran elämässä, luulen ma.

Sitten katselimme teidän jälkeenne, kun te siinä käsi kädessä

kuljitte salin läpi omaa pöytäänne kohti, jossa toverit teitä odottivat.
Teihin kiinnitti moni muukin katseensa, yksi ja toinen kääntyi
tuolillaan teitä silmillään seuraamaan. Sillä teistä uhkui kevät ja
anteliaan luonnon kauneus, ja teitä yhdisti toisiinne se salaperäinen
voima, jota kaikki ihmiset tieten tai tietämättään eniten ihailevat ja
palvovat.

25.

Kylmä ja sumuinen viima kiersi Kaivopuiston rantoja. Se kiersi

katuja ja kulmauksia kuin hyljätty ja petetty; joka tahtoo kostaa
pettäjällensä.

Mutta kuka huomaa sellaista sinä päivänä, jolloin on lyyrynsä

saanut! Tällaisena aivan erikoisena, unohtumattomana iltana! Jos
meri olisi sinisenä siintänyt tai hopeaisena hohtanut Kaivopuiston
valleilta ja linnut pitäneet kevätlaulajaisiaan vanhoissa puissa, niin
tietysti se olisi ollut hurmaavaa ja olisi tullut siitäkin iloinneeksi. Mutta
kun sen sijaan miltei satoi räntää, ei tullut sitä ajatelleeksikaan, vaan
oli kuin se olisi asiaan kuulunut, ja kaikki oli siitä huolimatta niin
täydellistä, ettei mitään parempaa kaivannut.

Ja sinä tulit salin halki häntä kädestä pitäen, ja te astuitte hitain

askelin pöytien lomitse. Mutta toverisi näkivät heti, että kaikki
kukkasesi olivat tyttösi kädessä ja että hänen ilmeensä oli tullut
sisäisen hartaaksi ja lempeäksi.

Mutta kukaan ei siitä virkkanut mitään.

Sinä toit vettä korkeaan maljakkoon ja te istuuduitte muitten

seuraan.

Mutta vaikka katse oli teitä seurannutkin, vaikka muutkin asiat

tuokioksi kiinnittivät läsnäolijoitten mielen, missään ei viivytty, kaikki
yksityisseikat olivat kuin kuplia rientävän virran kalvossa. Elämän
riemu siinä virrassa lainehti. Nuoruuden hurmio siinä vaahtoili. Ja
virran mukana kulkijat näkivät maailman kuin lapsi näkee sen
unenpöpperöstä herätessään jouluaamuna, kun hän vielä kosteitten
silmäripsien lomitse tanssittaa aarrevarastoaan sikin sokin ja ylös
alaisin silmäinsä edessä.

Siinä tuli ovesta eräs sanomalehden toimittaja — pelätyimpiä

ivansa ja ankaran arvostelunsa vuoksi. Ja miten hän yhtäkkiä näytti
iäkkäältä! Pitkän pöydän päässä istui — sanoisinko — vanha
aviopari, tutun näköisiä ihmisiä. En olisi koskaan ennen sanonut
heitä iäkkäiksi, mutta nyt! Miltä mahdoimmekaan me itse näyttää?
Tämä ympäristö oli niin verevää nuoruutta täynnänsä, että kaikki
vähänkin pitemmälle elämän polulla ehtineet heti poikkeuksellisesti
pistivät silmään kuin oksattomat pökkelöt nuoressa viidakossa,
totiset ja harmaat.

Sanomalehdentoimittaja katsoi ympärilleen paikkaa etsien.

Hänestä oli kokonaan haihtunut tuo hänelle joskus ominainen yli-
ihmisen ilme ja hän näytti miltei vaatimattomalta. Tänä iltana hän
antoi vähäpätöisellekin anteeksi hänen vähäpätöisyytensä.

— Onko sinullakin jokin onnellinen täällä — kysyi hän ystävällisesti

tuttavaltaan ohitse kulkiessaan ja hipaistessaan hänen tuolinsa
selustinta.

— Poika on.

— Minulla on täällä kaksi yhtaikaa.

Ja hänen kasvoilleen välähti leveä hymy.

Siinä aaltoili nyt valkolakkisten meri ja pauhasi kuin vallattomat

hyrskyt kirkkaana kevätpäivänä. Ja pökkelöt salissa katselivat sitä
vaieten, nykyisyyttään unohtaen, nuoruuttaan muistaen, tapsiinsa
sulautuen. Mieli pehmeänä ja ehkä hiukan surunvoittoisena.

Arvoisa toimittaja löysi yksinäisen paikan toisessa nurkassa.

Kukaan ei häntä huomannut. Ylioppilaat melusivat ja huusivat — he
heiluttivat takkejansa ja laulaa jyrisivät. Hän katseli heitä ikäänkuin
he kaikki olisivat olleet hänen poikiansa — tahi ikäänkuin hänen
omat nuoruudenpäivänsä olisivat nousseet kuolleista. Ja hän tyytyi
täydelleen olemaan unohdettu ja syrjäytetty. Hänen herkkä ja hieno
minänsä, joka muuten peittyi kuorensa alle, otti hänet kokonaan
valtoihinsa.
 Mutta äänten melske pauhasi taukoamatta. Mistään muusta ei
tiedetty, ei välitetty, kuin tämän hurmaavan illan taivasta
tavoittelevasta ilosta. Pois tieltä! Eläköön! — Ensi kertaa todella
vapaita! — Nyt vasta oikein täysi-ikäisiä! — Nimet
ylioppilasluettelossa! — Vanhempien ylioppilaiden juhlimia! —
Ylioppilas!— Ja koulu vihdoin jossain kaukaisessa menneisyydessä
— kirjat suolattuina ja opettajat kuin museossa! — Nyt ei ollut
kellään sanomista, vaikka olikin paperossi hampaissa, vaikka olisikin
lasia kallistanut! — Sai tehdä niin tai näin, olla maistamatta tai
maistaa, niinkuin kukin oli asian mielessään päättänyt. — Nyt oltiin
ylioppilaita! Ja pois tieltä vaan, tässä tuli vapaa mies!

Mutta maistoivatpa he tai ei, tarkastelivat he salaa jännittyneellä

uteliaisuudella niitä vanhempia tovereita, jotka olivat istuneet siellä
tuntikausia ja saaneet jo liikaa.

Ja voi tämän illan ystävyyttä ja veljeyttä! Siellä vaelsi poikia

käsikkäin tai kaulakkain tai kädet toistensa olkapäillä — sama
hyväntahtoisuus sulki heidät kaikki helmaansa. Pökkelöt
kummastelivat itseksensä, mistä mahtoi olla kotoisin tuo myöhempi
kinastelu ja puoluekiihko, joka aina pyrki kehittymään jokaisessa
ylioppilaspolvessa. Mistä sitten tullee, mutta ei siihen täällä tuntunut
alkuvihjaustakaan olevan.

Siinä oli pitkä poika, joka näytti tuntevan sellaista autuuden

ylenpalttisuutta, että hänen täytyi hypätä tasajaloin kaikkien lähellä
olevien pikkupöytien ääressä — hänen täytyi syleillä jokaista uutta
tuttavaa — hänen täytyi nousta tuolille heiluttamaan kättä niille
monille, joita hän ei voinut henkilökohtaisesti tavata. Hän oli istunut
siellä aikaisemmista iltapäivätunneista saakka, kuten samaan
seurueeseen kuuluva toverinsakin, joka piilotteli aarretta takkinsa
alle. Hän painoi sen hellästi povellensa, nosti joskus takin reunaa ja
tirkisti sen alle. Joillekuille hän sen näyttikin — pyhän vaitiolon
ehdolla — he räjähtivät nauramaan, löivät häntä olkapäälle ja
pyöräyttivät hänet ympäri. Silloin tällöin tempasi hän sen esille
aiheettomalla avomielisyydellä, pisti sen kainaloonsa, eikä ollut
tietävinäänkään. Silloin kävi ilmi, että se olikin vain ympyriäinen
tuolinistuin, jonka hän oli näperrellyt irti jostain tuolista.

Hän piti sitä yksityishuvituksenaan, joka sulostutti hänen iltansa.

Yrjö ja Marja istuivat kaukana salin toisessa päässä. He pitivät

iloansa ilman punssia ja liköörejä — siis myöskin ilman tuolinistuimia
ja tasajaloin hyppelehtimistä. Mutta heitäkin ja heitäpä varsinkin
hurmasi tuo yhteinen riemu, joka sulki koko maailman povellensa.

*****

Lähdimme aikaisin kotiin päin astumaan. Eteisessä tapasimme

Ennin, Yrjön ja Marjan toverin. Hän oli menossa kutsuihin, jotka
hänen vanhempansa olivat panneet toimeen hänen kunniaksensa.

Meri oli yhtenä ainoana sankkana pimeänä ja lyhtyjen valo oli

kelmeän kellertävä sumussa. Ei tihuuttanut kosteutta, mutta satoi
miltei lumiräntää.

Enni ei sitä näkynyt huomaavan.

— Jos ymmärtäisin — tarinoi hän meille herttaisella

avomielisyydellään — miksi kaikki on niin hauskaa, ei ainoastaan
tämä päivä, vaan muutenkin kaikki — mikään ei ole ikävää. Pidän
kaikista tovereista — tuskin koskaan voin heitä unhottaa — ja kun
sain lakin, luulin kuolevani ilosta. — Ja nyt saan mennä äidin kanssa
huvilallemme kylvämään puutarhaamme. Meillä on ikkunallamme
tomaatteja, tämän pituisia. Ja ensi talvena aion itse hoitaa
talouttamme — käyn torilla kysymässä kalanhintoja — leivon
pikkuleipiä ja teen kastikkeita — se on jännittävää ja hirveän
hauskaa! Pidän ihan kaikesta, myös siitä, mitä ennen en voinut
kärsiä — niinkuin yleisestä historiasta! Voisin vaikka hakea lisätietoja
kuninkaista ja piispoista, mikä ennen oli sietämätöntä. — Mutta
toistaiseksi on kaikkein hupaisinta mennä huomenna maalle lavaa
kylvämään.

Niinpä niin, Enni! Kaikki on kauhean hauskaa! Ainakin tänä

ihmeellisenä, sanomattoman autuaana toukokuun yönä, jolloin sataa
räntää ja pohjoinen puhaltaa ja kostea viima jäätää jäsenet
lämpimänkin vaipan alla.

26.

Aamulla hohtivat nurmikot valkoisina, ja lumi peitti allensa koivujen

lehdet. Isä jäi sanatonna seisomaan huoneensa avattuun akkunaan.
Lunta toukokuussa! Oliko talvi todellakin katunut aikaista
väistymistään, vai puhalteliko se kylmää vain pilan päiten? Nyt oli
maailma kuin loihdittuna tuon pehmeän vaipan alle, ei tiennyt oliko
kesä vai talvi, tuskin edes oliko päivä vai yö.

Mutta isä veti voimakkaasti sieraimiinsa mehevän rehevyyden

tuoksua, joka täytti kostean ilman.

Ja räystäistä valui vettä, oksista tippui raskaita vesikarpaloita

maahan. Ja ilma hohti harmahtavan hopeisen pilviverhon alla, jonka
takana päivä paistoi kuin himmeän lasin läpi.

Isä otti nahkasalkkunsa ja astui portaita alas eteiseen, veti

takkinsa ylleen, löysi hattunsa ja keppinsä tavallisilta paikoiltaan ja
oikaisi puutarhan läpi asemalle päin mennäkseen työhönsä
kaupunkiin.

Mutta korkeitten koivujen alle hän pysähtyi. Missä oli se tavallinen

piipatus ja vikinä puissa? Kottaraiset pysyivät niin hiljaa pesissään
kuin olisivat olleet kuolleet. Mutta sydän heillä varmaan tykytti
rauhattomuudesta ja neuvottomuudesta, siipi värisi ja pyöreät silmät
katsahtivat pesän reunan yli raskaitten lumipisaroitten tippuessa.

Sinä, Yrjö, olit nukkunut kauan sinä aamuna. Tuntui niin suloiselta
herätä ja muistaa ettei tarvinnut mihinkään kiirehtiä. Nousit
kumminkin lopuksi ja pukeuduit hitaasti ja vihellellen
kylpyhuoneessa. Käväisit suihkun alla tutisten ja päristen kylmässä
räiskeessä, ja puistit sitten vaatteesi kappale kappaleelta
parvekkeella, avaten oven selkoselälleen ja vetäen vaatteet yllesi
raikkaassa ulkoilmassa. Ketään ei näkynyt tiellä, kukaan ei astunut
veräjästä sisään. Naapurienkin puutarhat olivat tyhjät, eikä
hiiskaustakaan kuulunut mistään. Kaukana vihelsi juna — tullen —
mennen — yhtä kaikki.

Vihdoin olit pukeutunut ja sitonut kaulaliinasi. Muutamin harvoin

harppauksin laskeuduit tapasi mukaan portaita alas alakertaan,
samat vaaleanharmaat vaatteet ylläsi, kuin edellisenä päivänä
ollessasi lakkia saamassa.

Ruokahuoneessa odotti sinua aamiaispöytä, katettu yksin sinulle.

Pöydällä oli kukkia maljakossa ja toisia taitetun lautasliinan
kupeessa. Pehmeäksi keitettyjä munia oli kannen alla.
 Kirsti hypähti jostain esille ja karkasi sinuun kiinni. Hän kiskoi
sinua kädestä ja istutti sinut kukkia ihailemaan. Ne hän oli näet itse
äsken puutarhasta poiminut, vaikka siinä jalat kastuivatkin. Nyt odotti
hän kiitosta ja sen hän sai. Sitten istuutui hän veljeään vastapäätä
pitääkseen hänelle seuraa.

Te puhuitte puoliääneen. Ikäänkuin salaliitossa keskenänne.

Joskus helähti Kirstin nauru ja hän huudahti jotakin äänekkäästi, ja
siitä syntyi väittely ja yhteinen ilon temmellys.

— En mene minnekään, kun saan kerran olla rauhassa kotona —

kuului vastaukseksi Kirstin kysymykseen.

— En minäkään sitten mene — en Eijan enkä Sirkankaan luo. —

Etkö lähde kaupunkiinkaan?

— Ai, se on totta, valokuvaajaan pitää mennä.

— Jaa! Katsopas nyt! — Etpä malttanut olla — etpä malttanut olla

— — jaa!

— Kyllä olisin malttanut — —

— Etpä olisi — etpä olisi, kyllä minä sen tiedän — etpä olisi
malttanut!

— Mitä sinä muka tiedät?

— En sano. Mutta tiedänpä mitä tiedän. Kaikkea ei sanotakaan —

eipä niinkään!

Sitten te taas vaivuitte hiljaiseen yhteisymmärrykseen.

*****
 Mummo istui ikkunan ääressä poimuttaen pieluksen päällisten
nauhoja, ennenkuin järjesti puhtaat liinavaatteet kaappiin. Hänen
valkoista päätään peitti musta pitsimyssy ja hänen ruskeat silmänsä
hymyilivät. Hän katsahti silloin tällöin lapsiin, asetti valmiin päällisen
muitten valmiitten päälle ja otti käsiteltäväkseen uuden
suoranauhaisen viereltään, antaakseen sillekin saman pienen
hienostuksen leiman. Niitä ei millään muotoa sopinut järjestää
paikoilleen ilman näitä poimutettuja nauhoja, jotka osoittivat niiden
sivistyneisyyttä.

Ja mummo katsoi Yrjöön ja Kirstiin ja antoi tapansa mukaan

aatoksensa mennä omia menojaan.

— Tuossa ne nyt ovat — ajatteli hän — tuossa on Yrjö nyt

ylioppilaana — ja tuossa on Kirsti joka tuli miltei eilen. — Ja isä on
kaupungissa ja äiti missä lienee puutarhassa — ja he kuuluvat kaikki
toisillensa, vaikkeivät verisiteet sido heitä yhteen. Ja ehyempi on
tämä koti kuin moni muu, jossa on toisin. Ja minä tässä myöskin
olen ja askaroitsen ja kuulun minäkin tähän kokonaisuuteen, vaikka
minulla on monet muutkin lapset ja lastenlapset. Mutta kukapa ei
tuota Yrjöä rakastaisi omana lapsenaan — ja olen jo ennättänyt
Kirstinkin itselleni omistaa, niin ettei ole eroa mielessäni näitten ja
muitten lastenlasteni välillä. — Enhän aivan samalla lailla elä näissä
eteenpäin, kuin heissä. — Mutta onhan heihinkin vierasta tullut
paljonkin, ovat vain puoleksi tai neljänneksittäin omiani, eikä
niinkään paljon, jos oikein ajattelee. Mutta Jumalan kiitos — sitä ei
tule tuollaista niin miettineeksi — tulee vain heistä pitäneeksi
semmoisinaan — eikä tutkistele miksi. Onneksi ei olekaan tärkeätä
sitä tietää — tavallisesti rakastaa eniten silloin, kun ei mitään kysy.
Ja minä pidän heistä kaikista — se on pääasia.
 Ja kun tulee vanhemmaksi — tuumi hän vielä lepuuttaen kättään
helmassaan — niin käyväthän lapset entistään rakkaammiksi, mutta
samalla rakastaa ehkä muitakin enemmän kuin ennen. Sillä siirtyy
itse ikäänkuin kaikesta loitommalle ja huomaa, että yhtähän he ovat
kaikki, omat ja vieraat — ja tänne ne jäävät kaikki, kun itse lähtee —
ja niinpä tekee mieli heitä kaikkia siunata mennessään.

*****

Sinä, Yrjö, olit lopettanut ruokailusi ja seurasit silmilläsi mummon

työtä. Seisoit siinä ja olit tyytyväisen näköinen. Mummo kysäisi, oliko
sinulla ollut hauska eilen.

Hauskako? Sinä nauroit ja vakuutit, että kyllä olit parastasi

koettanut. Ensin Kaivohuoneella. Mutta vasta sieltä lähdettyä olitte
oikein hullutelleet. Olit Jussin kanssa vaeltanut pitkin katuja ja nähnyt
jos mitä hullunkurista. Puistokadulla Henrik enon talon lähellä istua
kyykötti kaksi keltanokkaa matalalla puutarhamuurilla erästä ikkunaa
tähystellen. Sen takana tietysti asui jokin ihastus, jota he tahtoivat
palvoa salaa. Uudin oli alhaalla, mutta uutimen edessä istua mökötti
lurppakorva Musti, oikea mopsinaama. Tytön koira tietysti. Toisella
pojalla oli kova hattu kainalossa ja hän härnäsi sillä koiraa. Hän
vaihtoi ylioppilaslakin hattuun, keikautti sen kallelleen, oli olevinaan
päissään ja hoiperteli pitkin muuria jalat sisäänpäin käännettyinä.
Koira julmistui, nousi kahdelle jalalle, pullisti silmänsä ja oli vähällä
haukkua. Silloin oli mies muurilla selvä taasen, oikaisi jalkansa,
piilotti hatun kainaloon ja sai valkolakin päähänsä. Ja koira
rauhoittui. Silläpä koiralla oli kauneudenaistia — enemmän kuin
monella taidearvostelijalla. Mutta kun ei tyttöä näkynyt, eivätkä
ylioppilaat viitsineet enää mopsin kanssa ilvehtiä, valmistautuivat he
rauhassa nauttimaan olostansa, heittäytyivät muurille pitkälleen,
avasivat voileipäkäärönsä — ja olisit nähnyt, mummo, miten niissä
voileivissä oli kokoa! Ja noin paksulta kinkkua! Kyllä olivat
varustautuneet kauan odottamaan kaunottarensa heräämistä.
Ehkäpä istuvat siellä vieläkin.

Se huvitti sinua vielä perästäpäinkin. Ja kuitenkin sinusta tuntui,

kuin se kaikki olisi jo ollut jotakin kaukaista.

*****

Kuljit huoneitten läpi ja pysähdyit ikkunan eteen. Miten siellä

ulkona kaikki oli valkoista ja puhdasta! Saviset tietkin ja mustan
kiiltävät pellot. Ja miten kaikki oli hiljaista, kuin olisi luonnossa suuri
sunnuntairauha. Sinulla oli sunnuntaisi nyt kaikkien noitten vuosien
aherruksen jälkeen. Tuo valkeus ulkona oli kyllä vain hetken harhaa,
sillä räystäissä helisi sulavan lumen solina, ja puitten oksista satoi.
Pian olisivat nuo vainiot taas paljaat, ojissa lorisisi ruskea vesi, ja
teillä savi kuohuisi kuten keväällä aina. Mutta sekin oli tuttua ja
kotoista ja yhtä rakasta. Sillä siihen kuului leivosen liverrys ja
keväthuuhkajan yksitoikkoinen uukahdus valoisina kevätiltoina.

Kerrankin sait nauttia tästä kaikesta täysin rinnoin, kenenkään ja

minkään häiritsemättä. Sait vaipua omiin tunnelmiisi ja hommiisi ja
vihdoinkin olla rehellisesti oma itsesi omine harrastuksinesi.

Avasit ikkunan äidin huoneessa ja katselit ulos.

Kotirauhan ja kotiviihtymyksen tunne lämmitti sinua niin että

selkäpiitäsi suloisesti värähdytti. Kun oli paikka, josta ei tehnyt mieli
pois, vaan jonne mieli jäädä! Ja kuitenkin edessä avara maailma,
joka sekin aikanaan saisi osansa.
 Tuossa oli kellertävä kotiaitaus ja sen takana pellot ruohoisine
ojineen. Peltojen keskellä oli lehtosaareke, josta puitten lomitse
kuulsi taittokattoinen herraskartanon pääty. Ja sivuitse siitä
alempana oli pieni keltainen pysäkkihuone ratavallilla ja sen alla yli
äyräittensä paisuvat tienristeykset. Aina niistä kuitenkin ylitse pääsi.

Ja kauempana oli metsäinen taivaanranta, josta paljaana paistoi

kivinen kukkula, venäläisten sotamiesten metsättömäksi tekemä.
Sinne oli monesti noustu katsomaan kaupunkia kaukaa kesäillan
valaistuksessa.

Ja pitkin teitä oli puhelinlankoja ja humisevia puhelinpylväitä ja

pieniä huviloita puutarhoineen toinen toisensa vieressä asemalle
asti. Siellä oli lautakäytävällä kiirehtiviä kulkijoita junien lähtöaikoina,
mutta väliajoin oli maassa rauha, kuten nyt — ja muu maailma
kaukana.

Täällä oli ihmisellä koti eikä vain asunto.

Siinä kulki Anna puutarhatietä pitkin kori käsivarrellaan nähtävästi

kauppapuotiin. Hän oli äsken sulkenut sähköpumpun, jonka ääni
kumisi talossa heti kun sähkönappula nostettiin keittiön seinällä.
Kuului silloin siltä kuin olisi tavaton ampiainen hyrräten surissut
huoneissa pääsemättä ulos. Aina kuulostelit tuota ääntä
päättääksesi, täyttyikö vesisäiliö tasaisesti vedellä ja oliko koneisto
kunnossa. Jos oli syytä epäilykseen, kiiruhdit heti vikaa korjaamaan.

Nyt seisoit ja katselit Annaa, joka oli sulkenut portin jälkeensä ja

loittoni tietä pitkin.

Hänkin oli sitä, mikä kuului tänne. Miten kauan hän jo oli täällä
liikkunut pitämässä huolta kellareista ja keittiöstä ja kaikesta muusta
talossa, sitä et muistanutkaan. Ja ennen kuin hän tänne tuli, oli hän
ollut mummon kodissa ja sitä ennen isän vanhempien kodissa, niin
että meille hän oli kuulunut nuoruudestaan asti. Hän puhui hiljaisella
äänellä ja hiukan yksitoikkoisesti, mutta eihän hänen elämässään
ollut niin kovin paljon vaihtelua ollutkaan.

Anna oli aarre, uskollinen ja tunnollinen. Kukaan ei siinä häntä

voittanut. Eikä hän vaivojaan säästänyt. Hän oli enemmän ystävä
talossa kuin perheen palvelija.

Mutta Kirsti oli kiertänyt puutarhat ja verannat, alakerrat ja

yläkerrat ja tuli veljensä luokse »Max und Moritz» kädessään,
valkoisiin korukansiin sidottuna ja nimi kannella hienoin mustin
kirjaimin. Sen olit saanut joskus jonkun ulkomaanmatkan tuomisina.
Kirstin mielestä olit nyt vieläkin joutilaamman näköinen kuin joskus
iltaisin läksyt luettuasi ja kirjoituspöytäsi laatikoista kaivettuasi esille
Husqvarnan tai muitten tehtaitten valmisteluetteloita, joita huviksesi
tutkistelit, tai autojen ja ilmalaivojen kuvasarjoja. Et nytkään estellyt,
vaan nostit hänet polvillesi ja näytit hänelle aina yhtä hauskan »Max
und Moritzin».

Istuit äidin keltaiseen nurkkasohvaan, tyttö sylissäsi, ja aloit:

Als die gute Witwe Bolte

sich von ihrem Schmerz erholte — — —

Kirsti tuijotti sinua silmiin, mitään ymmärtämättä ja kuitenkin

nauttien runon poljennasta ja vieraan kielen oudosta soinnusta.

Hetkisen perästä juoksi hän taasen tiehensä viedäkseen kirjan

takaisin paikoillensa.
 Mutta sinä et voinut mihinkään tarttua. Olihan sitä tartuttukin
tarpeeksi ja liiaksikin, varsinkin viime aikoina, niin että nyt oli
hengähtämisen vuoro. Etkä tällä hetkellä toivonut mitään sen lisäksi
mitä oli. Siellä kaupungissa elämä pauhasi ja paloi, hurisi ja humisi
mukaansa tempoen tarkoituksettomastikin, usein ilman pontta ja
perää. Siellä kai toverit nytkin katuja kiertelivät, heillä kun ei ollut
kotia maalla.

Heittäydyit taasen sohvan nurkkaan, josta näit sekä salin että

ruokahuoneen ja katselit sieltä lattian kotikutoisia karvamattoja,
ruskean punamustine juovineen, jotka muistit siitä asti kun yleensä
aloit jotakin tajuta. Holmbergin metsämaisema oli myöskin aina
riippunut sohvaseinällä ja Thorvaldsenin friisi flyygelin yläpuolella.
Täällä pitäisi kaiken jäädä koskemattomaksi ikuisiksi ajoiksi. Juuri
tuossa piti olla nuottikaapin, ja ikkunoissa piti aina olla kukkivia
pelargooneja ja nupussa olevia ruusuja.

Tänne pitäisi saada tulla vastakin elämän tuoksinasta — ajattelit

sinä — kaukaakin ja pitkienkin aikojen perästä — ja tavata tämä
muuttumattomana ja alati samana.

Nousit, suljit ikkunan ja katsoit kelloasi. Voi ihmeitä! — Ihanhan

aika oli lentänyt — sinunhan piti joutua päiväjunalla kaupunkiin,
ennättääksesi sitten isän kanssa takaisin päivällisille.

— Äiti, missä olet? —Tulehan, katsohan — mitkä kukat sopisivat

napinläpeen, kun menen valokuvaajalle!

Harppailit ylös huoneeseesi ja osoitit lasia kirjoituspöydälläsi. Siinä

oli isän antama muutama ruusu ja mummon antama neilikka, Kirstin
kieloja ja yhtä ja toista sen lisäksi — ei paljon mitään valitsemisen
varaa.
 — Tämän otan ainakin, sanoit nostaen lasista ruusun, neilikan ja
pari kieloa. Mutta jos otan tämän vielä, onko silloin liikaa? En voi
kärsiä liikaa kukittamista kuvissa.

Tunsin sen ruusun Marjan eilen antamaksi ja sanoin vain:

— Hyvä on. Juuri niinkuin pitää. Panen ne paperiin. — Kas tässä!

Otit paperitötterön ja juoksit alas portaita:

— Nuppineuloja, äiti!

— Pistin pari paperiin — katsohan tarkemmin!

27.

Seuraavana päivänä panit toimeen tanssiaiset tovereillesi.

Silloin tippui vielä vettä räystäistä ja ruohokentät olivat ohuen

lumen peitossa.

Mummo kasteli salissa kukkia ja asetti punaisen kaktuksen niin

päin, että sen puhjenneiden kukkien runsaus täytti ikkuna-aukon.
Toisessa ikkunassa rehoittivat ruusut, ja läntisellä seinällä korkealla
olevalta pitkältä ikkunalaudalta riippuivat kukkivat lobeliat.

Hän kääntyi Kirstiin, joka iltaa odottaessaan ei näkynyt malttavan

mihinkään ryhtyä.

— Tänään sinun täytyy auttaa äitiä! Ajattele, kuinka monta

voileipää hänen täytyy laittaa! Voit latoa ne tarjottimelle sitä myöten