Structural and Biochemical

Characterization of the YaxAB Pore

forming Toxin from Yersinia
Enterocolitica Bastian Bräuning
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Characterization of Glycans 1st Edition Michael A.
Madson

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Tunnel Design 1st Edition Benjamín Celada (Author)

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Cold Micro Metal Forming: Research Report of the

Collaborative Research Center “Micro Cold Forming” (SFB
747), Bremen, Germany Frank Vollertsen

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Control Rashmi Avinash Agarwal

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The Nature of Dusty Star Forming Galaxies 1st Edition

William Cowley (Auth.)

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Materials Forming, Machining and Post Processing Kapil

Gupta

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Sustainable material forming and joining First Edition

Gunasekara

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and-joining-first-edition-gunasekara/
Springer Theses
Recognizing Outstanding Ph.D. Research

Bastian Bräuning

Structural and
Biochemical
Characterization of the
YaxAB Pore-forming
Toxin from Yersinia
Enterocolitica
Springer Theses

Recognizing Outstanding Ph.D. Research

Aims and Scope

The series “Springer Theses” brings together a selection of the very best Ph.D.
theses from around the world and across the physical sciences. Nominated and
endorsed by two recognized specialists, each published volume has been selected
for its scientific excellence and the high impact of its contents for the pertinent field
of research. For greater accessibility to non-specialists, the published versions
include an extended introduction, as well as a foreword by the student’s supervisor
explaining the special relevance of the work for the field. As a whole, the series will
provide a valuable resource both for newcomers to the research fields described,
and for other scientists seeking detailed background information on special
questions. Finally, it provides an accredited documentation of the valuable
contributions made by today’s younger generation of scientists.

Theses are accepted into the series by invited nomination only

and must fulfill all of the following criteria
• They must be written in good English.
• The topic should fall within the confines of Chemistry, Physics, Earth Sciences,
Engineering and related interdisciplinary fields such as Materials, Nanoscience,
Chemical Engineering, Complex Systems and Biophysics.
• The work reported in the thesis must represent a significant scientific advance.
• If the thesis includes previously published material, permission to reproduce this
must be gained from the respective copyright holder.
• They must have been examined and passed during the 12 months prior to
nomination.
• Each thesis should include a foreword by the supervisor outlining the signifi-
cance of its content.
• The theses should have a clearly defined structure including an introduction
accessible to scientists not expert in that particular field.

More information about this series at http://www.springer.com/series/8790

Bastian Bräuning

Structural and Biochemical

Characterization
of the YaxAB Pore-forming
Toxin from Yersinia
Enterocolitica
Doctoral Thesis accepted by
Technische Universität München, Garching,
Germany

123
Author Supervisor
Dr. Bastian Bräuning Prof. Michael Groll
Molecular Machines and Signaling Technische Universität München
Max Plank Institute for Biochemistry Garching, Germany
Martinsried, Germany

ISSN 2190-5053 ISSN 2190-5061 (electronic)

Springer Theses
ISBN 978-3-030-29438-0 ISBN 978-3-030-29439-7 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-030-29439-7
© Springer Nature Switzerland AG 2019
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recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission
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to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Springer imprint is published by the registered company Springer Nature Switzerland AG
The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland
Supervisor’s Foreword

Pore-forming toxins (PFTs) are among the most common bacterial toxins. They are
produced by a variety of pathogens, which infect a wide range of organisms
including plants, insects and humans. Bacteria utilize PFTs to gain access to nutri-
ents, modulate their environment and suppress host immune responses. Expressed as
soluble monomers, PFTs insert into cell membranes by forming an oligomeric pore
complex. Subsequently, homeostasis of infected cells is impaired, ultimately
resulting in necrosis and apoptosis.
The maturation of these particles and the structural changes required for pore
formation are still poorly understood for many PFT families. The challenge of
Dr. Bastian Bräuning’s Ph.D. thesis was to decode the lytic mechanism of an
a-helical pore-forming toxin composed of two different subunits. To this end, the
YaxA and YaxB proteins from Yersinia enterocolitica were cloned, heterologously
expressed in Escherichia coli and purified. Crystallization experiments were initially
difficult, but eventually yielded diffracting crystals. Data collection was performed at
a third-generation synchrotron facility at the Paul-Scherrer Institute in Villingen
(Switzerland), which led to X-ray structures of YaxA, YaxB as well as the ortho-
logue PaxB from the insect pathogen Photorhabdus luminescens. Next, the YaxAB
pore complex was reconstituted in erythrocyte membranes as well as by detergent
treatment. Together with Eva Bertosin and Prof. Dr. Hendrik Dietz at the Technical
University of Munich, the oligomeric complex was subjected to single-particle
cryo-electron microscopy analysis. The individual crystallographic models were
placed into the sub-nanometer resolution electron density map of the assembled
pore. The structure of YaxAB allowed identification of critical residues for pore
formation, which were confirmed by a series of mutants together with haemolytic
and membrane-binding activity assays. Using a diverse panel of biochemical and
structural techniques, Dr. Bräuning and colleagues succeeded in dissecting the
mechanistic contributions of the two toxin components and elucidated the lytic state
of the pore complex.
The results of this Ph.D. thesis on the YaxAB system are applicable to ortho-
logues from agriculturally relevant insect pathogens like Xenorhabdus nematophila
(XaxAB) and P. luminescens (PaxAB). Promising insecticidal properties of YaxAB

v
vi Supervisor’s Foreword

orthologues have already been identified and future bioengineering efforts certainly
will take advantage of the here presented structural and mechanistic insights into
PFTs.

Garching, Germany Prof. Michael Groll

August 2019
Abstract

Many pathogenic bacteria have acquired an arsenal of proteinaceous virulence

factors, to counteract and highjack host immune response systems. Among these
factors, pore-forming toxins (PFTs) are some of the most conserved and potent.
A hallmark of PFTs is their ability to transform from soluble to membrane-bound
states, a transition often accompanied by formation of large transmembrane oli-
gomers. The vast majority of structurally elucidated PFTs form homooligomeric
assemblies and produce b-barrel type pores (b-PFT). YaxAB from Yersinia ente-
rocolitica, along with its orthologues from insect and plant pathogens, are
two-component PFTs predicted to be entirely a-helical. As a putative virulence
factor, obtaining mechanistic insights into its binary mode of action would inform
future efforts to target the proteins therapeutically as well as to exploit them for
biotechnological purposes. In this thesis, structures of the soluble components
YaxA and YaxB could be obtained by X-ray crystallography, along with a
cryo-electron microscopy structure of the reconstituted YaxAB pore. Together with
structure-guided mutagenesis and biochemical assays, a plausible pathway of pore
formation could be proposed. Comparison with the ClyA pore revealed great
compositional diversity amongst members from the wider family of ClyA-like
a-PFTs, which includes homomeric, binary and tripartite assemblies.

vii
Parts of this thesis have been published in the following journal articles:

“Structure & mechanism of the two-component a-helical pore-forming toxin

YaxAB”
Bastian Bräuning, Eva Bertosin, Florian Praetorius, Christian Ihling, Alexandra
Schatt, Agnes Adler, Klaus Richter, Andrea Sinz, Hendrik Dietz, Michael Groll
Nature Communications 9 (1), 1806 (2018); https://doi.org/10.1038/s41467-018-
04139-2
Published as an Open Access article under a Creative Commons Attribution 4.0
International License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

ix
Acknowledgements

I would like to thank my advisor Prof. Dr. Michael Groll for his unending trust and
enthusiasm for the projects I worked on throughout the years at his group. It is hard
for me to imagine another setting where I could have enjoyed the same level of
freedom and independence—as a Ph.D. student—as I did under his supervision. For
this I am extremely grateful!
To Astrid König and Ute Kashoa: thanks for making sure that the lab and all
administrative things ran as smoothly as they did!
Thanks to all my colleagues past and present for laughs and support in and out
of the lab: Haissi, Chris, Philipp Baer, Flo, Alois, Hartmut, Sebastian, Seppi,
Annika, Camille, Marie-Theres, Eva, Philipp Beck, Felix, Leo, Christopher and
Fan.
Special thanks to Florian Praetorius, Eva Bertosin and Prof. Dr. Hendrik Dietz
for the wonderful collaboration on the YaxAB project, which would have been
unimaginable without all your EM contributions.
To Prof. Dr. Aymelt Itzen and his entire group—especially Rudi, Sophie and
Doro—I am grateful for the fruitful collaborations and the support one could always
count on.
Thanks to all the students and interns who worked with me during these four
years: Johannes, Gerald, Iana, Doro, Toni, Agnes, Melina, Julia and Carina.
I am grateful to Dr. Dejana Mokranjak for the collaboration on the TOM project
and for teaching me so many valuable lessons in membrane protein purification.
My biggest gratitude goes out to my family and friends: Mama und Papa, ihr
seid die Besten!

xi
Contents

1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1
1.1 The Enterobacteriaceae: Successful Pathogens with a Broad Host
Spectrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1
1.1.1 The Human Pathogen Yersinia enterocolitica . . . . . . . . .. 1
1.1.2 The Insect Pathogen Photorhabdus luminescens . . . . . . .. 2
1.2 Pore-Forming Toxins (PFT) as Virulence Factors of
Enteropathogenic Bacteria from the Genera Enterobacteriaceae
and Bacillus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Structure and Mechanism of PFTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.1 Homomultimeric b-PFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.2 Homomultimeric a-PFTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3.3 Heteromultimeric PFT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 The XaxAB Family of Heteromultimeric a-PFTs . . . . . . . . . . . . . 9
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........ 17
3.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ........ 17
3.1.1 Standard Laboratory Chemicals . . . . . . . . . . . . ........ 17
3.1.2 Material for Molecular Cloning and Expression
Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.1.3 Protein and DNA Standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.1.4 Bacterial Strains and Growth Media . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.1.5 FPLC Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.1.6 Protein Crystallization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1.7 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2 General Biochemical Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2.1 Molecular Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.2.2 Agarose Gel Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

xiii
xiv Contents

3.2.3 DNA Isolation and PCR Clean-Up . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.2.4 SDS-PAGE Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2.5 Determination of Protein Concentration . . . . . . . . . . . . . . 29
3.3 Recombinant Toxin Expression and Purification . . . . . . . . . . . . . 29
3.4 Protein Crystallization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.5 X-ray Data Collection and Structure Determination . . . . . . . . . . . 31
3.6 Reconstitution and Purification of YaxAB Pores from Human
Erythrocyte Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 32
3.7 Negative-Stain EM Data Acquisition and Image Processing . . ... 33
3.8 Preparation of the Detergent-Treated YaxAB Complex
for Cryo-EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.9 Cryo-EM: Sample Vitrification and Data Acquisition . . . . . . . . . . 34
3.10 Cryo-EM: Image Processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.11 Modelling the YaxAB Pore into the Cryo-EM Density . . . . . . . . . 35
3.12 Generation of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.13 Liposome Floatation Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.14 Erythrocyte Membrane Co-sedimentation Assay . . . . . . . . . . . . . . 36
3.15 Hemolysis Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.16 MBP-Tag Localization and Negative-Stain Analysis . . . . . . . . . . . 36
3.17 Crosslinking/Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.18 Native Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.19 Analytical Ultracentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.20 Multiple Sequence Alignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1 Statement of Contributions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2 Cloning, Protein Expression and Purification . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.1 Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.2 Protein Expression and Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3 Protein Crystallization and Structure Determination . . . . . . . . . . . 44
4.3.1 Protein Crystallization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3.2 Experimental Phasing of YaxA and PaxB by Selenium
SAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 44
4.4 Crystal Structure of YaxA, YaxB and PaxB . . . . . . . . . . . . . . .. 45
4.5 Comparison of YaxA and PaxB with Known Protein
Structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 48
4.6 Reconstituting a YaxAB Pore Complex . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 51
4.6.1 YaxA and YaxB Form Large Hourglass Shaped
Soluble Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 51
4.6.2 Low-Resolution TEM Analysis of the YaxAB Pore
Extracted from Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 52
Contents xv

4.7 Cryo-EM Analysis of the YaxAB Pore . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 55

4.7.1 The Process of Obtaining Well-Dispersed YaxAB
Particles in Vitreous Ice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 55
4.7.2 Single-Particle Analysis of YaxAB in Vitreous Ice . . . . .. 55
4.7.3 Fitting of YaxA and YaxB Crystal Structures
into the YaxAB Cryo-EM Map . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 57
4.7.4 Architecture of the YaxAB Pore . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 59
4.7.5 Interfaces Between Subunits in the YaxAB Pore . . . . . . .. 62
4.7.6 Characteristics of the YaxAB Transmembrane
Segment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 65
4.8 Conformational Changes of YaxA and YaxB Accompanying
YaxAB Pore Formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 67
4.9 Biochemical Dissection of YaxA and YaxB Membrane Binding
Capabilities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 70
4.9.1 YaxA Can Bind Membranes via Its Conserved Foot
Domain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 70
4.9.2 Head Domain Interaction Is Sufficient for YaxB
Recruitment to Membrane-Bound YaxA . . . . . . . . . . . . .. 73
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 73
5 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

Appendix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Abbreviations

2xTY Twice tryptone and yeast extract

ADP Adenosine diphosphate
Ail Attachment invasion locus protein
APS Ammonium persulfate
CDC Cholesterol-dependent cytolysin
cDNA Copy deoxyribonucleic acid
ClyA Cytolysin A
Cry Crystal
Cryo-EM Cryogenic electron microscopy
C-terminal Carboxy-terminal
CytK Cytolysin K
Da Dalton [g/mol]
DEN Dynamic elastic network
DMSO Dimethylsulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
DNAse Deoxyribonuclease
dNTP Deoxyribonucleotide
DSBU Disuccinimidyl dibutyric urea
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EHEC Enterohemorrhagic E. coli
ESI Electrospray ionization
et al. et alia
FF Fast flow
FPLC Fast protein liquid chromatography
FraC Fragaceatoxin C
FSC Fourier shell correlation
g Gravity

xvii
xviii Abbreviations

GTPase Guanosine triphosphate hydrolase

Hbl Hemolysin BL
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
His6 Hexahistidine
Hlg2 Gamma-hemolysin component A
HPLC High-performance liquid chromatography
HT His6-TEV
IPTG Isopropylthiogalactoside
LB Lysogeny broth
LLG Log-likelihood gradient
LukF Leukocidin-F subunit precursor
MBP Maltose-binding protein
MPD 2-Methyl-2,4-pentanediol
MR Molecular replacement
MS Mass spectrometry
MW Molecular weight
NCS Non-crystallographic symmetry
Nhe Non-hemolytic enterotoxin
ORF Open reading frame
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
Pax Xenorhabdolysin: Photorhabdus orthologue
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PDB Protein data bank
PEG Polyethylenglycol
PFT Pore-forming toxin
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
RMSD Root mean square deviation
RovA Regulator of virulence protein A
SAD Single-wavelength anomalous dispersion
SDS Sodium dodecyl sulfate
SOC Super optimal broth with catabolite repression
SUMO Small ubiquitin-related modifier
Ta Annealing temperature
Taq Thermus aquaticus (polymerase)
Tc Toxin complex
TEM Transmission electron microscopy
TEMED Tetramethylethylenediamine
TEV Tobacco etch virus
TLS Translation-liberation-screw
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane
UV/VIS Ultra-violet/visible
WT Wild-type
Xax Xenorhabdolysin
YadA Adhesin A
Abbreviations xix

Yax Xenorhabdolysin: Yersinia orthologue

Yop Yersinia outer proteins
Ysc Yop proteins translocation protein
a-PFT Alpha-helical pore-forming toxin
b-PFT Beta-barrel pore-forming toxin
List of Figures

Fig. 1.1 Gallery of representative homomultimeric b-PFTs in their

soluble and pore-protomeric forms. a Structural transition from
soluble (left) to protomeric (right) conformation. Protein
regions becoming part of the transmembrane pore are colored
in gold. The corresponding PDB codes are: 4YHD
(a-hemolysin, monomer), 7AHL (a-hemolysin, pore), 1XEZ
(Vc cytolysin, monomer), 3O44 (Vc cytolysin, pore), 3ZXG
(Lysenin, monomer), 5EC5 (Lysenin, pore), 5AOD
(Pneumolysin, monomer), 5LY6 (Pneumolysin, pore). b Two
orthogonal views of the pore assemblies from the respective
PFTs in (a). One protomer is highlighted in yellow.
Different PFT cartoons are not shown to scale . . . . . . . . . . . . . . 6
Fig. 1.2 Gallery of representative homomultimeric a-PFTs in their
soluble and pore-protomeric forms. a Structural transition from
soluble (left) to protomeric (right) conformation. Protein
regions becoming part of the transmembrane pore are colored
in gold. The corresponding PDB codes are: 3VWI
(Fragaceatoxin C, monomer), 4TSY (Fragaceatoxin C, pore),
1QOY (Cytolysin A, monomer), 2WCD (Cytolysin A, pore),
4O9Y (Toxin complex A, monomer), 5LKI (Toxin complex A,
pore). b Two orthogonal views of the pore assemblies from the
respective PFTs in (a). One protomer is highlighted in yellow.
Different PFT cartoons are not shown to scale . . . . . . . . . . . . . . 7
Fig. 1.3 Hydrophobic surface rendering of PFTs delineates their
approximate transmembrane regions. Shown are the pores of
a-hemolysin (PDB code 7AHL), anthrax protective antigen
(PA, PDB code 3J9C), Fragaceatoxin C (PDB code 4TSY),
Cytolysin A (PDB code 1Q0Y). Surfaces are colored from
hydrophilic (white) to hydrophobic (gold). The approximate
membrane boundaries are indicated by the grey box . . . . . . . . . 8

xxi
xxii List of Figures

Fig. 1.4 The heteromultimeric b-PFT c-hemolysin. a Conformational

changes going from monomeric to protomeric states for LukF
(blue) and Hgl2 (pink). Regions of the protein becoming part
of the transmembrane pore are colored in gold. The
2-methyl-2,4-pentanediol (MPD) molecule bound to
protomeric LukF is shown in sphere representation. PDB
codes are: 1LKF (LukF, soluble), 2QK7 (Hlg2, soluble),
3B071 (pore assembly). b Ribbon model of the
heteromultimeric c-hemolysin pore assembled in the presence
of MPD. c Surface rendering of the pore according to
hydrophobicity. Approximate membrane boundaries are
indicated by the grey box. A clipped view into the pore interior
(right) visualizes the MPD binding pockets of LukF, which at
this distance to the hydrophobic membrane plane mimic
phospholipid head groups . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 11
Fig. 3.1 Restriction-free cloning principle. In the first PCR reaction, an
insert of interest is amplified using primers 5′ complementary
to 30 base pairs upstream of the target vector insertion site and
3′ complementary to the start of the insert sequence. The same
design holds true for the reverse primer, with 5′
complementarity to the 30 base pairs downstream of the target
vector insertion site. In a second PCR, this megaprimer is
inserted into a defined site on the target vector by
whole-plasmid amplification. Lastly, the PCR reaction is
digested with DpnI to eliminate original, methylated target
vectors and transformed into competent E. coli cells . . . . . . . .. 26
Fig. 4.1 Amplification of YaxA and YaxB coding regions from
Y. enterocolitica genomic DNA. Shown are 1% (w/v) agarose
electrophoresis gels of the PCR reactions. The YaxA and
YaxB fragments were amplified using primer pairs
pRSET-HT-YaxA-F/pRSET-HT-YaxA-R and
pRSET-HT-YaxB-F/pRSET-HT-YaxB-R, respectively . . . . . . .. 42
Fig. 4.2 Purification of YaxA, YaxB and PaxB. a Purification of YaxA
by cobalt-affinity chromatography (Co-affinity),
anion-exchange chromatography (AEC: Resource Q 6 mL)
and size-exclusion chromatography (SEC: Superdex 75).
Shown are SDS-PAGE gels stained with Coomassie. Fractions
with red dashed boxes were pooled and taken to the next
step. b Purification of YaxB. c Purification of PaxB. d Native
mass spectrometry analysis of purified YaxA (red) and YaxB
(blue), indicating that both toxin subunits are monomers . . . . .. 43
List of Figures xxiii

Fig. 4.3 Crystallization of YaxA, YaxB and PaxB. White light images,
taken under a stereomicroscope, are shown for representative
crystals used for diffraction data collection . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Fig. 4.4 Experimental Se-SAD electron densities for YaxA and PaxB
following density modification. Clear helical features are
apparent in both cases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Fig. 4.5 Crystal structure B-factor distribution and quality of the
electron density maps. a Rendering of YaxA, PaxB and YaxB
crystal structures by B-factor values. For PaxB, all four
NCS-related copies are presented. b Electron density quality of
two YaxA regions with distinct average B-factor values: the
coiled-coil stalk and foot domains (left) and the head domain
(right). Shown are three different maps for each region:
2mFo-DFc map (top), simulated-annealing (SA) composite
omit 2mFo-DFc map (middle) and feature-enhanced map
(bottom). All maps were calculated using PHENIX.
c 2mFo-DFc electron density quality for the foot domain
of the four NCS-related PaxB models . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Fig. 4.6 X-ray analysis of YaxA, YaxB and the YaxB orthologue
PaxB. a Crystal structures of YaxA (blue), YaxB (pink) and
the YaxB orthologue PaxB (orange). Ribbons are shaded from
light (N-terminus) to dark (C-terminus). Lines delineate the
approximate boundaries for the three protein domains.
b Topology diagrams of YaxA, YaxB and PaxB colored
according to (a). a1–a6 in bold black outline denote the
structural frame common to the toxin subunits. Dotted lines
emphasize protein regions unresolved in the crystal structures.
c Crystal structures of ClyA in its soluble form (PDB code
1QOY) and as a pore-protomer (PDB code 2WCD).
d Topology diagrams of ClyA in soluble and pore-protomeric
states . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Fig. 4.7 Overlays of YaxA, YaxB and PaxB. a Ribbon plots of
monomeric YaxA with PaxB (left) and YaxB with PaxB (right).
b Alignment of the YaxA and PaxB head domains . . . . . . . . . . . 48
Fig. 4.8 Structural superposition of YaxA with ClyA family toxins.
a DALI analysis and alignment of the YaxA head domain
(including residues 45–237 and 310–410) with various ClyA
family toxins. PDB codes for aligned structures: 1QOY
(soluble ClyA), 2WCD (pore-protomeric ClyA), 4K1P
(NheA), 5KUC (Cry6AA), 2NRJ (Hbl-B). DALI Z-score,
RMSD (Å) and sequence identity between aligned pairs are
reported for each superposition. b Superposition of YaxA
xxiv List of Figures

(full-length) and pore-protomeric ClyA. The proteins were

aligned by their head domains according to (a). Full-length
pore-protomeric ClyA produced no DALI match, despite
well-aligning head domains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 49
Fig. 4.9 Structural superposition of PaxB with ClyA family toxins.
a DALI analysis and alignment of the PaxB head domain
(including residues 12–153 and 279–353) with various ClyA
family toxins. b Superposition of PaxB (full-length) and
pore-protomeric ClyA as output by DALI analysis . . . . . . . . . .. 50
Fig. 4.10 Characterizing a soluble YaxAB complex. YaxA and YaxB
were mixed 1:1 at protein concentrations of 1 mg/mL. 500 µL
of the sample were injected onto a Superose 6 10/300 column.
Peak fractions were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie
staining, depicted below the chromatogram. Fractions from the
high-molecular weight peak, containing both YaxA and YaxB,
were subsequently imaged by negative-stain TEM.
A representative micrograph is shown to the right . . . . . . . . . .. 51
Fig. 4.11 Reconstitution of YaxAB pores on erythrocyte ghosts. a YaxA
and YaxB were added sequentially onto human erythrocyte
ghosts and imaged by negative-stain TEM. The membranes
were densely covered in pore complexes (enlarged view).
b Screening to find suitable detergents for YaxAB pore
extraction. Superose 6 elution profiles are shown. Asteriks
mark distinct peaks containing both subunits. c YaxAB
enriched membranes were solubilized with 1% Cymal-6 and
injected onto a Superose 6 gel filtration column. YaxAB eluted
in the first peak, which was verified by SDS-PAGE analysis
(shown on the right). d Representative negative-stain TEM
micrograph of the purified YaxAB complex . . . . . . . . . . . . . . .. 52
Fig. 4.12 Membrane extracted and detergent treated YaxAB samples are
similar. a Comparative gel filtration profiles between
detergent-treated (orange trace) and non-treated (purple)
YaxAB complexes (left). A representative TEM micrograph
each, of detergent-treated (middle) and membrane extracted
(right) complexes, is shown. b Sedimentation-velocity
ultracentrifugation analysis (AUC) of three differently obtained
YaxAB complexes (left). As indicated by orange and purple
boxes, YaxAB partitioned between a *18–21 S and a diffuse
20–60 S fraction, respectively. Analyzed samples used were
proven to contain both subunits (SDS-PAGE, right). . . . . . . . .. 53
List of Figures xxv

Fig. 4.13 Negative-stain TEM analysis of YaxAB. a Gallery of top- and

side-view 2D class averages of YaxAB (left) and the
distribution of top-view radial spoke numbers (right). b Three
views from a 3D reconstruction of membrane-extracted
YaxAB, bearing apparent C11 symmetry . . . . . . . . . . . . . . . . .. 54
Fig. 4.14 Cryo-EM analysis of YaxAB. a Amphiphol exchange of
Cymal-6 purified YaxAB as the last step of sample preparation
for cryo-EM. Shown are the first SEC trace of detergent-treated
YaxAB run in presence of Cymal-6 (orange) and the second
SEC run after amphiphol exchange in absence of detergent
(purple). b Representative cryo-EM micrographs of detergent
purified (top) and amphiphol exchanged (bottom) YaxAB. In
detergent, particles tended to aggregate into long stacks while
in amphiphol the complexes remained separate. c Gallery of
2D class averages after four rounds of classification, starting
from 178,000 raw particles selected from automated particle
picking. d Comparison of top-view radial spoke numbers
between negative-stain and cryo-EM datasets. In both cases,
the majority of particles possessed C10 symmetry . . . . . . . . . .. 56
Fig. 4.15 Cryo-EM 3D reconstruction and validation. a Workflow of 3D
reconstruction for the C10 symmetric complex. b Workflow of
3D reconstruction for the C9 symmetric complex. c FSC plot
for C10 pore reconstruction. d FSC plot for C9 pore
reconstruction. e Particle orientation distribution and f local
resolution maps for the final reconstruction with C10
symmetry. g Comparison of selected experimental 2D class
averages with similar views from 2D projections of the C10
symmetric map . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 59
Fig. 4.16 Quality of the cryo-EM map and refined structures.
a Examples of the final map at different regions of the
protomeric YaxA and b YaxB models. Density for the YaxB
transmembrane helices a4′ and a4″ is overlaid with a Ca-trace
(left) and with side-chains modeled (right). Maps are displayed
at a contour level of 7r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 60
Fig. 4.17 Biochemical validation of the YaxAB model. a Localization
of the YaxA and YaxB C-termini within the YaxAB complex
by MBP-tagging and TEM analysis. C-terminal MBP-fusions
of YaxA and YaxB were mixed with the respective un-tagged
interaction partner and detergent treated. Negative-stained
complexes were imaged by TEM and subjected to 2D
classification. Compared with native YaxAB classes (black),
both MBP-tagged complexes revealed additional density
inside (pink, YaxB-MBP) and outside (blue, YaxA-MBP) the
spoked rim. The inset illustrates an enlarged detail of the
xxvi List of Figures

additional densities encircling the complex containing

YaxA-MBP. Shown on the right is the location of the MBP
tags relative to the cryo-EM map of YaxAB. b XL-MS
supports the arrangement of YaxA and YaxB coiled-coils in
the YaxAB model. YaxAB (membrane extracted as in Fig. S6)
at 5–10 µM was crosslinked with the amine-reactive
homobifunctional cross-linker DSBU. SDS-PAGE analysis
and Coomassie staining (left) confirmed cross-linking
efficiency, resulting in one covalent high-molecular weight
species. A high density of cross-links was identified between
the coiled-coil stalks of YaxA and YaxB. Right: Residues of
YaxA (red) cross-linked to YaxB (blue) are presented
pairwise. The DSBU cross-linker bridges distances
up to 25 Å . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Fig. 4.18 Architecture of the YaxAB pore (C10). a Final sharpened
cryo-EM density of YaxAB together with the refined pore
model (side view). The chosen contour level (4.5 r)
corresponds to 1.21 Å3/Dalton. Fitted YaxA and YaxB models
are colored blue and pink, respectively. The amphipol belt,
illustrated in gold, demarcates the putative transmembrane
region. Dimensions of the complex are given in Å. b Top view
of the pore complex, overlaid with the cryo-EM map. YaxA
and YaxB form outer and inner rings, respectively (left).
A zoom of the amphipol-enclosed portion of the complex
(right) is contoured at 6.5 r to better distinguish individual
helices. Labels of the secondary structure elements adhere to
the nomenclature shown in Fig. 1b. c Pore diameter plotted
against the coordinate along the vertical axis. Calculations
have been performed using the program HOLE [17] (left).
The red line indicates the narrowest point in the channel. Two
major constrictions along the YaxAB model are emphasized
(right) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Fig. 4.19 Comparison of C9 and C10 symmetric pore complexes. a C9
symmetric (left) and C10 symmetric (right) YaxAB pore
models fitted into the respective cryo-EM densities. b Pore
diameter of the C9 (black) and C10 (red) complex plotted
against the coordinate along the vertical axis. Calculations
have been carried out with the program HOLE.
c Superposition of cis-dimers in the C10 (blue/pink) and C9
(grey) complexes. Arrows emphasize regions of significant
rearrangement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
List of Figures xxvii

Fig. 4.20 Subunit interfaces in the YaxAB pore. a Cryo-EM map (left)
and modeled structure (right) of the cis interface between
YaxA (blue) and YaxB (pink) within a radial spoke (cis).
Boxes labeled I and II indicate contact regions within the
protomer pair that are displayed enlarged (right). Residues in
interacting proximity are shown as sticks; hydrophobic side
chains are colored in gold. b Depiction as in (a), but of the
trans interface between YaxA and YaxB from two adjacent
radial spokes. Box III indicates the contact region between the
protomer pair, colored as in (a). c SEC analysis (Superose 6) of
YaxAB complexes containing putative trans-interface
mutants. SDS-PAGE analysis of the same fractions across
different runs illustrates the shift in oligomer size, towards
smaller assemblies, as more negative charges are introduced
into the apolar interface. d Depiction as in (a), but of the
homotypic YaxB-YaxB foot domain interface, colored
as in (a) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Fig. 4.21 Characteristic of the transmembrane segment. a Details of a
transmembrane segment of the pore. The YaxAB pore model
was submitted to the PPM server to delineate the buried
hydrophobic membrane surface. Shown are foot domains from
one cis-dimer as well as the neighboring protomers
(transparent ribbons). Membrane exposed residues are colored
in gold. The golden spheres demarcate the calculated
boundaries of the lipid membrane. b Hydrophobic surface
rendering of the YaxAB model. The golden rectangle
delineates the approximate membrane boundaries. c Charge
distribution of the pore lumen. The surface is rendered by
qualitative electrostatic representation in PyMOL
(Schrödinger, LLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Fig. 4.22 Conformational changes accompanying pore formation.
a Overview of conformational changes within YaxA and YaxB
in context of a cis dimer. The interacting protomer is shown in
transparent surface representation. Alignment has been carried
out between head domains only, given the small
rearrangements in this region. Left: Monomeric (grey) and
protomeric (blue) YaxA. Right: Monomeric PaxB (grey) and
protomeric YaxB (pink). Arrows emphasize the structural
rearrangements during oligomerization. b Structural
superposition of YaxB (soluble) with YaxB (pore). The
interacting YaxA in cis is illustrated as transparent surface
(blue). Note the foot domain is not resolved in the monomeric
xxviii List of Figures

YaxB structure (indicated by a grey oval). c Details of the

conformational change in the YaxB/PaxB foot domain
transitioning from monomeric to protomeric states. Apolar side
chains are colored in gold . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Fig. 4.23 Reducing the flexibility of the YaxB foot domain impair lytic
activity. Left: the disulfide-locked mutant YaxB
(I184C/I229C), after oxidation, shows reduced hemolytic
activity compared to the WT (black trace). Erythrocytes were
first incubated with YaxA (2 µM), after which YaxB was
titrated. Right: the disulfide-locked mutant YaxB
(V190C/L223C) assayed for hemolytic activity. Upon addition
of DTT, lytic activity of both mutants were restored to WT
levels. Figure insets illustrate the position of the disulfide
bond, using a homology model of the YaxB foot domain based
on the PaxB coordinates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Fig. 4.24 YaxA binds to membranes via its foot domain. a Liposome
floatation assay to test membrane-binding abilities of YaxA
and YaxB. Left: Schematic presentation of the experiment.
Right: Membrane binding of YaxA, YaxB, sequentially added
YaxA and YaxB (YaxA ! YaxB) and pre-mixed YaxA and
YaxB (YaxA + YaxB) assessed by Coomassie stained
SDS-PAGE analysis of top and bottom gradient fractions. For
each sample, a control run was performed without liposomes.
b Close-up view of YaxA’s surface-hydrophobic foot domain.
c Erythrocyte membrane co-sedimentation assay of WT and
mutant YaxA. Top: For each condition, trypsinized erythrocyte
ghosts were incubated with the respective toxin component,
sedimented and analyzed by Coomassie stained SDS-PAGE.
Bottom: YaxA band intensities relative to the YaxA-only
sample (lane 2) were determined densitometrically from the
SDS-PAGE scans. Data points from five independent
experiments (n = 5) are shown, along with their means and
corresponding standard deviations (SD). d Erythrocyte
hemolysis assay of WT and mutant YaxA. Erythrocytes were
treated first with serial dilutions of WT YaxA or its mutants,
followed by YaxB addition. Plotted are the averages from three
independent experiments (n = 3) along with the SD; solid lines
correspond to the fitted dose-response curves . . . . . . . . . . . . . . . 71
Fig. 4.25 Head domain interactions are sufficient for YaxB membrane
recruitment. a Membrane co-sedimentation assay
demonstrating the ability of membrane-bound YaxA to recruit
the isolated YaxB head domain to membranes. Membranes
List of Figures xxix

were not trypsinized beforehand; hence protein contaminants

(asterisks) are present. b Gel filtration of a 1:1 (w/w) mixture
of YaxA and YaxB head domains revealed their
oligomerization in solution (top). Peak fractions were analyzed
by SDS-PAGE and Coomassie staining (middle) and fractions
containing both proteins were imaged by negative-stain TEM
(bottom). The isolated head domains form spoked rings
resembling the rims of the full-length YaxAB complex. The
inset show enlarged details of raw particles . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Fig. 5.1 Multiple sequence alignment of YaxA and YaxB orthologues.
a Sequence alignment of YaxA orthologues. Sequences
correspond to orthologues from Providencia alcalifaciens
(PaYaxA), Pseudomonas syringae (PsYaxA), Proteus
mirabilis (PmYaxA), Morganella morganii (MmYaxA),
Yersinia enterocolitica (YaxA), Photorhabdus luminescens
(PaxA), Xenorhabdus nematophila (XaxA). The conserved
hydrophobic foot is highlighted by a black frame; positions
where charge mutants were introduced are indicated by red
stars. Residues engaged in cis-type and trans-type interaction
with YaxB are emphasized by cyan and green circles,
respectively. b Sequence alignment of YaxB orthologues.
Sequences were named according to (a). The conserved apical
foot domain is framed in black. Residues engaged in
YaxB-YaxB contacts inside the membrane plane are
highlighted by orange circles. Red arrows denote conserved
residues facing the lipid milieu as part of the transmembrane
segment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Fig. 5.2 Proposed assembly pathway of the YaxAB pore and
comparison with ClyA: schematic overview of our proposed
YaxAB pore assembly pathway at targeted membranes.
(i) YaxA binds to membranes via its hydrophobic foot,
(ii) after which YaxB, harboring no membrane binding
capacity on its own, (iii) is recruited via initial interaction
between the head domains. (iv) At this stage, YaxB’s foot
domain rearranges to its membrane-inserted state, stabilized by
YaxA’s hydrophobic foot. (v) Another membrane-bound
YaxAB dimer interacts with the first dimer via the trans
YaxA-YaxB contact sites. (vi) Further association of
protomers eventually drive formation of the closed YaxAB
pore complex. Red outlines indicate the exposure of
membrane-active moieties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
xxx List of Figures

Fig. 5.3 Comparison of ClyA family pore architectures. For a to-scale

comparison between YaxAB and ClyA pores (PDB accession
code 2WCD) the structures were tiled in UCSF Chimera. The
golden bar indicates approximate membrane boundaries . . . . . . . 80
Fig. A.1 Structural integrity of YaxA mutants studied. Gel filtration
traces (Superdex 200 10/300 increase) of YaxA mutants used
in this work, including wild-type (WT) protein. For each run,
500 µL of protein at *0.3 mg/mL was injected . . . . . . . . . . . . . 86
List of Tables

Table A.1 Minimal medium supplements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

Table A.2 X-ray data collection and refinement statistics . . . . . . . . . . . . . . 84
Table A.3 Cryo-EM data collection, refinement and validation
statistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

xxxi
Chapter 1
Introduction

1.1 The Enterobacteriaceae: Successful Pathogens

with a Broad Host Spectrum

The family of Enterobacteriaceae comprises a vast number of gram-negative bacte-

rial genera, many of which are characterized by the ability to colonize the intestinal
tracts of their host organism [1]. Pathogenic members of this family can colonize an
impressive variety of animal hosts, ranging from nematodes to humans. To accom-
plish the feat of switching between different intermediate and terminal hosts within
one life cycle, many pathogenic enterobacteriaceae have acquired complex arsenals
of proteinaceous factors, which modulate and block host cellular defense mech-
anisms [2–4]. This thesis will focus on the structural elucidation of one particular
protein factor present in at least six pathogenic enterobacteriaceae genera, with exper-
imental evidence supporting a role in pathogenesis in three genera. As orthologous
proteins from Yersinia enterocolitica and Photorhabdus luminescens were charac-
terized, brief introductions into their respective roles as human and insect pathogens
will be outlined in the following section.

1.1.1 The Human Pathogen Yersinia enterocolitica

The family of Yersiniaceae contains three main human pathogenic species: Y. pestis,
the causative agent of the plague [5], Y. pseudotuberculosis, the causative agent of Far
East scarlet-like fever [6] and Y. enterocolitica, the most common cause of human gas-
trointestinal yersiniosis [7]. These three species have long served as a model to study
the molecular genetic basis of virulence evolution and host species adaptation [8, 9],
reflected in the very different modes of infection between the three species. While Y.

© Springer Nature Switzerland AG 2019 1

B. Bräuning, Structural and Biochemical Characterization of the YaxAB
Pore-forming Toxin from Yersinia Enterocolitica, Springer Theses,
https://doi.org/10.1007/978-3-030-29439-7_1
2 1 Introduction

pestis infection manifests itself in acute pneumonic plague of the respiratory tissue,
Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis have evolved into consummate colonizers
of the gastrointestinal tract and the underlying lymph system. Infection with Y. ente-
rocolitica occurs most frequently via ingestion of contaminated foot—undercooked
pork in particular, given the prevalence of high-pathogenicity strains within porcine
reservoirs [10]—and less frequently through contaminated blood transfusions, where
the species represents the most significant bacterial contaminant given its ability to
reproduce at low temperatures [11]. Once in the gastrointestinal tract, the bacterium
can adhere to the gut epithelium via a set of chromosomally encoded adherence
proteins—Invasin and Ail—as well as a plasmid encoded adherin called YadA [7].
Once past the epithelial layer, the bacterium progresses into the Peyer’s patches,
which are gut-associated lymph nodes. It is here that the tissue pathologies associ-
ated with yersiniosis begin to manifest: as a response to pathogen intrusion, the host
immune system initiates inflammatory lymphocyte infiltration at the site of bacterial
accumulation [3]. For this, the bacterium possesses a powerful defense mechanism
termed the Ysc-Yop Type III system [12], comprising a needle-like injection appara-
tus at the bacterial cell surface which can deliver a slew of so-called effector proteins
(Yops) into the targeted host cell. In the case of macrophages, these Yop effectors are
understood to interfere with the phagocytotic machinery allowing the engulfment
and destruction of the bacterial pathogen [13].

1.1.2 The Insect Pathogen Photorhabdus luminescens

P. luminescens, belongs to the genus Photorhabdus, which comprise several species

of bioluminescent, entomopathogenic (insect pathogenic) bacteria living symbioti-
cally within nematode worms [14]. This bacterium displays a fascinating life cycle,
which is split between a replicative phase within the nematode host (Heterorhab-
ditis megidis) and a highly pathogenic phase within the insect larva, into which the
bacterium is released upon larval infection by the nematode symbiont. Symbiosis is
achieved by the bacterium feeding off the larval biomass (which is gradually decom-
posed, presumably by a host of toxins released by P. luminescens in the later stages
of infection), replicating and in turn feeding the nematode. The symbiotic bacteria-
nematode pair is so effective in infection and killing of a number of agricultural insect
pests, that bacteria-bearing nematodes have become a popular pesticide, persistent
in soil for several years [15, 16]. Like other pathogenic Enterobacteriaceae such as Y.
enterocolitica, P. luminescens must face a rapid host immune response upon enter-
ing the insect prey. Like its human pathogenic relative, P. luminescens relies on a
Type III injection system to deliver toxic effector proteins into lymphocytes, which
inactivate the phagocytotic machinery of these host immune cells [17, 18], thereby
evading destruction.
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The Project Gutenberg eBook of Pour moi seule
This ebook is for the use of anyone anywhere in the United States
and most other parts of the world at no cost and with almost no
restrictions whatsoever. You may copy it, give it away or re-use it
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United States, you will have to check the laws of the country where
you are located before using this eBook.

Title: Pour moi seule

roman

Author: André Corthis

Release date: December 13, 2023 [eBook #72393]

Language: French

Original publication: Paris: Albin Michel, 1919

Credits: Laurent Vogel and the Online Distributed Proofreading Team

at https://www.pgdp.net (This file was produced from
images generously made available by The Internet
Archive/Canadian Libraries)

*** START OF THE PROJECT GUTENBERG EBOOK POUR MOI

SEULE ***
 ANDRÉ CORTHIS

POUR MOI SEULE

ROMAN

PARIS
ALBIN MICHEL, Éditeur
22, RUE HUYGHENS, 22
 DU MÊME AUTEUR

Chez FASQUELLE, Bibliothèque Charpentier.

Gemmes et Moires (poésies).

Mademoiselle Arguillès (roman).
Le Pauvre amour de doña Dalbine (roman).
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 IL A ÉTÉ TIRÉ DE CET OUVRAGE

10 exemplaires sur papier du Japon

numérotés à la presse de 1 à 10

25 exemplaires sur papier de Hollande

numérotés à la presse de 1 à 25

Tous droits de traduction et reproduction réservés pour tous pays. Copyright by

Albin Michel 1919.
A ma chère Maman
je dédie ce livre
 POUR MOI SEULE

Sur le toit de tuiles rousses que je vois de ma fenêtre, une fumée

voudrait monter, que rabat le grand vent. Elle bouillonne au sortir de
la cheminée noire comme un jet d’eau sans force ; elle se couche et
s’échevèle. En la regardant, je pense à beaucoup de choses que je
ne saurais pas bien dire. Certes, j’ai de l’instruction. A Paris, j’ai suivi
des cours. Je lis quelquefois. Et l’on m’a toujours affirmé que je fais
bien les lettres. Mais il est difficile de connaître ce que l’on éprouve
et de l’exprimer exactement.
Je voudrais cependant m’y appliquer. Les journées sont longues
et ma sœur Guicharde me décharge de tout le soin de la maison. En
ce moment (c’est aujourd’hui samedi), elle s’occupe en bas à
changer le papier bleu sur les planches du buffet. Elle est prompte
dans ses gestes, et les vaisselles déplacées font en se heurtant un
tapage qui inquiéterait bien mon mari, plus ménager que moi-même,
et qui devrait peut-être m’émouvoir.
Seule dans ma chambre, devant ce papier que je viens de
prendre, je me trouve toute sotte, comme on dit ici. Et qu’est-ce que
je vais raconter, puisqu’il ne s’est rien passé qui ne fût au dedans de
moi ? Cependant, je voudrais essayer… Ce sera bien ordinaire sans
doute, et tourné maladroitement, mais personne n’en pourra rire et le
feu seul connaîtra ces pages, quadrillées de bleu, après que mon
écriture les aura couvertes.
 … Notre maison est sombre et froide avec un seul étage et de
très grands greniers. Point de jardin. Une cour seulement, par
derrière, nous sépare de la chapelle désaffectée d’un ancien
couvent ; un acacia maigre y puise un peu de vie. Ses branches
balancées touchent à nos fenêtres et s’allongent de l’autre côté
jusqu’aux petits vitraux jaunes et bleus ; ses fleurs, flétries presque
en naissant mais cependant odorantes, recouvrent au printemps
avec la même abondance notre toit aux fortes lucarnes et le toit
ovale que surmontent encore la cloche et la croix. Pas de vue de ce
côté et pas de vue sur la rue, qui est étroite. Elle s’appelle la rue des
Massacres en souvenir d’horribles choses qui s’accomplirent là
pendant les guerres de religion… Mais ce n’est pas ainsi que je dois
commencer.
Il y a cinq ans que je suis venue dans cette ville, il y en a quatre
que je suis mariée et que j’habite cette maison. Les premiers jours…
Ah ! ce n’est point encore cela. Vais-je enfin y parvenir ? Tout à
l’heure ils m’appelleront pour le souper et je n’aurai pas écrit quatre
lignes. Il me faudrait les premières phrases ; le reste sera bien
facile… Cette fois, j’ai trouvé ; voici qui est vraiment pour moi le
commencement de tout :
Je me souviendrai ma vie entière du jour où maman nous
raconta son histoire.

*
* *

Nous étions à Paris alors, quelques mois après la mort de mon

père, et nous occupions rue des Feuillantines ce petit appartement
propre et triste où j’avais toujours vécu. Un brouillard vert, traversé
d’or, flottait entre les branches des arbres lointains où commençaient
de naître les premières feuilles. Penchée à la fenêtre ouverte, je les
regardais ; je regardais le ciel, bleuâtre sous ses voiles gris étirés
déjà et prêts à se rompre, et je dis tout à coup :
 — Maman, n’est-ce point cette année que nous irons à la
campagne dans votre pays ?
— Ferme la fenêtre, Alvère, dit maman. Je m’enrhume et tu vas
prendre froid.
— Mais il ne fait plus froid… c’est le printemps.
Cependant j’obéis. Guicharde, avec des ciseaux qui grinçaient,
taillait sur la table un corsage d’étoffe noire. Nous étions dans la
salle à manger où se passaient nos journées, car il n’y avait pas de
salon et nos deux chambres étaient obscures et petites. Je me
rappelle ces pauvres meubles que nous avons dû vendre, car ils ne
valaient pas ce que leur transport eût coûté, le bureau de mon père,
dans un coin, avec le papier à lettres et les livres de comptes, les six
chaises dont le cuir très usé commençait à blanchir, et la petite
étagère à côté du buffet bas où les vieux journaux étaient rangés
soigneusement, près de quelques boîtes ayant contenu des poudres
ou de la mercerie, vides, mais fort nettes, et qui pouvaient servir un
jour.
— J’aimerais bien aller dans votre petite maison, maman. J’ai
rêvé cette nuit des trois figuiers autour du bassin et du potager en
terrasse d’où l’on voit toute la plaine avec le Rhône, et les Alpes au
loin quand l’air est bien limpide, après les grandes pluies.
— Avec nos pauvres rentes, dit Guicharde, nous pourrions là-bas
vivre mieux qu’à Paris. J’ai payé les œufs quatre francs ce matin et
nous n’aurons pas de dessert à dîner parce que les châtaignes se
finissent et que les confitures ont augmenté encore.
— Hélas ! soupira maman, ce serait mieux sans doute. Oui, ce
serait mieux…
Elle secouait la tête. Une détresse profonde qui montait de son
cœur serré à son pauvre visage faisait trembler et se crisper chaque
muscle sous la peau mince et pâle. Des larmes montaient à ses
yeux toujours beaux.
— Ce serait mieux, je me le répète souvent. Mais je n’ose pas
retourner là-bas. J’ai peur de « les » revoir. « Ils » lui ont fait trop de
mal. « Ils » m’ont trop fait souffrir.
 Elle parlait des parents de mon père, nous le savions. Nous
savions que la misère de notre vie était due à cette laide colère qu’ils
avaient sentie en voyant un des leurs épouser une fille pauvre et de
naissance presque ouvrière. Et, sans les avoir jamais vus, comme
nous les haïssions, ces Landargues, de Saint-Jacques, directeurs
des grandes carrières de Saint-Jacques au bord du Rhône où mon
père aurait dû faire sa fortune comme chacun des fils de cette
famille y faisait la sienne depuis plus de deux cents ans ! Cependant
nous ne redoutions point de nous trouver en leur présence.
Guicharde, rancunière et point timide, souhaitait le plaisir insolent de
les bien regarder et puis de détourner la tête en gonflant une bouche
méprisante, et moi je ne jugeais pas qu’ils valussent ce sacrifice que
nous leur faisions, de n’occuper point une maison qui nous venait
des parents de maman et dont le loyer ne nous coûterait rien.
— Vraiment, dit ma sœur, interrompant son ouvrage et
s’asseyant au bord de la table, le temps serait venu, je crois, de
prendre une décision. Pourquoi nous obstiner à rester ici et que
pourrions-nous regretter de Paris ? Nous ne voyons jamais
personne, nous ne prenons pas un plaisir, et nous mangeons très
mal, quoique dépensant pour notre nourriture beaucoup d’argent.
— Je sais, continuait de soupirer maman, je sais bien.
J’insistai à mon tour.
— Le jardin nous donnerait quelques légumes. Nous pourrions
porter des souliers de toile avec des semelles en corde, qui ne
coûtent pas bien cher. Et le bon air de Lagarde nous ferait à toutes
tant de bien !
— Oui, oui, disait maman… l’air est bon… mais les gens ne le
sont pas…
— C’est ridicule, s’exclama Guicharde, tout à fait ridicule. Ces
Landargues, en somme, ne sont pas tout le pays.
— Mais, dit maman, et jamais elle ne m’avait paru si humble et si
découragée, ce ne sont pas seulement les Landargues, c’est tout le
pays que je redoute.
 — Tout le pays, répéta Guicharde, — et comme elle n’éprouvait
rien qu’avec violence, elle n’était pas en ce moment surprise, mais
stupéfaite. — Vous redoutez tout le pays !… Et pourquoi cela ?
— Parce que tu étais déjà au monde depuis plusieurs années
quand je me suis mariée, ma petite fille, et que là-bas, les gens le
savent bien.

Maman dit cela sans baisser la voix. Elle avait porté son secret
trop longtemps et maintenant elle le laissait aller devant nous,
simplement, parce que le cœur s’ouvre de lui-même comme font les
mains quand elles sont trop lasses et que toute la volonté ne peut
plus servir de rien. Elle ne parut pas gênée du silence qui suivit ses
paroles, et le petit soupir qu’elle poussa était comme de
soulagement… Je la regardais, et, dans cette seconde, me
rappelant toutes les sévérités de notre éducation, les livres
défendus, les coiffures sans fantaisie, les belles phrases
impérieuses sur l’honneur féminin, je sentais, je le crois bien, plus de
trouble encore que de désespoir et je ne pouvais plus rien
comprendre… Mais Guicharde avait dix ans de plus que moi. Elle
posa doucement ses ciseaux. On eût dit qu’elle écoutait quelque
chose, et sûrement se lamentaient autour d’elle toutes les détresses
qui s’étaient un jour levées autour de notre mère. Et puis elle se jeta
vers elle, l’enveloppa de ses deux bras, et glissant sur les genoux :
— Oh ! maman, ma pauvre maman ! gémit-elle, sur un ton de
tendresse que n’avait jamais eu sa voix un peu rude.

*
* *

Maman appuya sa tête sur l’épaule de Guicharde et se laissa

bercer ainsi. Dans le silence, j’entendais rouler une lente et lourde
voiture sur les pavés de notre rue. Un fouet claquait allégrement,
mais on devinait bien qu’il ne touchait pas aux bêtes et rythmait
seulement au-dessus de leur fatigue une chanson entraînante. La
fenêtre était demeurée ouverte. Un petit souffle faisait doucement
trembler sur la table l’étoffe que tout à l’heure taillait Guicharde.
— Vous comprenez, disait maman rêvant à mi-voix, tout
inconsciente et apaisée, quand je suis entrée à l’usine pour y tenir
certains comptes, ils étaient tous très aimables pour moi. Il y avait le
père Landargues qui vivait encore ; mais il ne s’occupait plus de
grand’chose et il n’a pas tardé à mourir. Et puis Mme Landargues qui
faisait tout marcher. Elle avait déjà les cheveux blancs, à cette
époque, et aussi étincelants que peut l’être au soleil la cime du mont
Ventoux, et la figure bien fraîche, mais pas trop bonne, avec une
bouche toute serrée et sans lèvres, et des yeux gris, très durs. Il y
avait aussi Robert, le fils aîné qui était veuf et déjà bien malade, et
puis son fils à lui, le petit François.
Elle réfléchit et calcula :
— Il doit bien avoir plus de trente-cinq ans aujourd’hui. C’est lui
qui sera l’héritier de tout.
Je m’étais rapprochée d’elle, moi aussi ; je m’appuyais
maintenant à son fauteuil et, moins effrayée, quelquefois,
doucement, j’embrassais ses cheveux. Elle continuait, lentement et
comme heureuse que nous fussions enfin ses confidentes :
— Ils étaient bien aimables pour moi au début, oui, et même ils
avaient l’air assez simple et de ne pas trop s’en croire. Ils m’ont
invitée deux fois à déjeuner… Mais après, oh ! après ! quand ils ont
vu que Georges devenait amoureux de moi…
Tout maigre et consumé que fût son visage, tout enveloppé de
misérables cheveux gris, qu’il paraissait jeune en ce moment, avec
cette flamme qui se levait soudain au fond des yeux, ces yeux de
maman, un peu gris, un peu bleus, verdâtres quelquefois, d’une
couleur indécise, hésitante, eût-on dit, et timides comme l’était ce
cher être tout entier ! qu’il paraissait jeune, ce visage, à ce tourner
ainsi vers l’amour d’autrefois !
— Alors, voilà, vous comprenez, mes petites… Moi, vous le
savez, j’étais la fille d’un menuisier, bien artiste, c’est vrai, et qui
aimait les livres, et qui savait parfaitement réparer les vieux
meubles, avec leurs pieds tordus et toutes leurs petites sculptures,
mais enfin, un ouvrier tout de même, et qui employait seulement
deux ouvriers. Et Georges, c’était M. Georges Landargues, le
second fils des Landargues, de Saint-Jacques… Alors, ses parents
à lui, n’est-ce pas, c’était bien naturel qu’ils ne soient pas très
contents… Après seulement ils auraient pu être moins méchants.
Oh ! oui… après… parce que voilà… Quand Guicharde a été sur le
point de venir au monde, nous sommes partis tous les deux pour
Paris à cause du scandale… tout le monde savait… et nous ne
pouvions plus rester au pays. Ma mère était bien en colère. Elle
m’aurait gardée cependant, je le crois, parce que… le mal, c’est
avec un Landargues que je l’avais fait, et les Landargues, dans notre
région, vous ne pouvez pas savoir ce que c’est comme
importance… Mais c’est mon père qui ne pardonnait pas… Une fille
bien élevée comme j’avais été, avec de l’instruction et toutes ces
habitudes de dame qu’on m’avait données…
— Maman, disait Guicharde quand elle se taisait, la tenant
toujours serrée comme un enfant et lui caressant la joue de ses
lèvres, ma petite maman.
— … Oh ! ma grande… si tu savais… la honte… comme ça peut
faire du mal, mal comme de se couper ou de se brûler, aussi fort…
seulement ça ne guérit pas… Alors nous sommes venus à Paris,
dans une petite chambre d’abord, presque misérable. Georges
n’avait pas voulu demander un sou à ses parents parce qu’ils lui
avaient dit sur moi et sur lui de trop vilaines choses… Il a travaillé,
mais il connaissait seulement les carrières et comme il faut
commander à trois cents ouvriers. Dans les tissus, il n’y entendait
rien, et dans la porcelaine non plus, ni dans l’ameublement. Il a
essayé de tout ça. Il ne gagnait pas grand’chose. Un hiver nous
étions trop malheureux. Il a écrit à sa mère. Elle a répondu : Si tu
renonces à tes droits sur mon héritage, que tu ne mérites pas, et si
je dois n’entendre plus jamais parler de toi, je veux bien te donner
cent mille francs… Naturellement il a renoncé à tout… Cent mille
francs… pensez donc…
— Tout de même, dit Guicharde qui était pratique.
 — Ah ! il fallait voir où nous en étions… A cause de ces cent mille
francs, pendant quelques mois nous avons été bien heureux.
Georges me disait : je cherche une bonne affaire, et j’y entrerai
comme associé. Je ne sais pas bien être employé. Je n’ai pas été
dressé à ça… mais comme patron, tu vas voir… Et il a bien trouvé
l’affaire : seulement, elle était mauvaise et les cent mille francs ont
failli être perdus. On a pu en sauver la moitié ; mais nous avions eu
si peur… si peur, que nous ne voulions plus risquer rien. Nous les
avons placés en fonds d’État pour être tranquilles et votre père a
trouvé chez Marpeau cette petite place de caissier où il est resté
plus de vingt ans, jusqu’à sa mort…
Nous savions certains de ces détails, mais les plus familiers
aujourd’hui étaient pour nous comme les inconnus et nous écoutions
avec un étonnement triste et passionné cette histoire nouvelle…
Guicharde baissa la voix pour demander :
— Et alors, maman… votre mariage ?…
— Voilà, dit-elle. C’est quand mon père allait mourir. Il ne voulait
pas me revoir et j’en avais du chagrin… Georges, — il était si
doux… et un : peu craintif aussi… comme moi ! — il espérait
toujours que sa mère pardonnerait, et qu’elle autoriserait notre
mariage. Comme il avait été très bien élevé, et ne pouvait pas se
passer de ce consentement… Il me le disait et je le comprenais bien.
Mais il a fini par se rendre compte qu’elle le détestait pour la vie et
que sa colère contre lui, rien ne pouvait la faire plus grande. Alors,
un jour, après en avoir bien parlé, nous sommes partis tous les deux
pour la mairie et pour l’église sans rien dire à personne. Comme à
Paris on m’appelait déjà Madame Landargues, ça n’a rien changé ;
mais tu te rappelles bien, Guicharde ? c’est ce matin où, quand nous
sommes rentrés, nous t’avons apporté la belle poupée avec sa robe
rose, et il y avait un gâteau pour le dessert tout couvert de crème
glacée et de fruits confits.
— Mais oui, dit Guicharde, je me rappelle très bien… J’étais si
contente !… Ah ! c’était pour cela le gâteau et la poupée… On ne
sait pas comprendre quand on est petit.
 Maman se redressa dans son fauteuil, et regardant par la fenêtre
le ciel et ces vilains toits gris qui commençaient de devenir bleus :
— Voilà, dit-elle encore… voilà… Vous comprenez, mes petites,
pourquoi je vous ai élevées comme j’ai fait. Deux heures tous les
matins dans une petite pension du quartier. Et je vous conduisais
moi-même, et j’allais vous chercher. Comme instruction, c’était bien
suffisant puisque je ne voulais pas que vous fassiez aucun travail qui
vous aurait éloignées de moi… Ah ! non ! j’avais trop peur… Dans
toutes ces maisons où l’on emploie des jeunes filles, dans tous ces
bureaux, c’est mon histoire qui recommence… Non !… non !… Je ne
voulais pas… J’aimais mieux que vous ne gagniez aucun argent.
J’aimais mieux notre misère et vous garder là, près de moi,
toujours… Alors, si je vous ai élevées bien sévèrement, si j’avais
peur de tout, des amies, des livres, des théâtres, de la rue, si vous
vous êtes toujours bien ennuyées, vous comprenez, maintenant, il
ne faut pas m’en vouloir…
Elle n’avait pas su nous dire de bien grands mots et elle
n’attendait pas que nous lui en disions. Mais je crois que depuis
longtemps elle éprouvait un grand besoin de ne plus nous mentir sur
elle-même, et presque vieille déjà, languissante et affaiblie, de se
remettre entre nos mains. Elle se pressait maintenant contre
Guicharde, et quelquefois contre moi, avec une tendresse touchante
et rassurée. Nous étions désormais ses confidentes et son soutien.
Et quand, ce même jour, un peu plus tard, ma sœur, dans sa
sagesse, eut décidé qu’un passé aussi lointain, suivi des années les
plus honorables, ne pouvait vraiment nous empêcher d’organiser
notre vie selon la raison et l’économie, elle approuva aussitôt,
obéissante et résignée.

*
* *

La maison de mon grand-père le menuisier était au cœur même

de la très vieille ville. D’autres maisons la pressaient ; son toit se
confondait parmi des toits inégaux. Le soir de notre arrivée, au sortir
de la petite gare, quand maman étendant le bras nous dit : c’est là !
nous ne vîmes rien d’abord au flanc de la colline qu’un
enchevêtrement de tuiles, couleur d’amandes brûlées, sur de petits
murs couleur de rouille et de miel. Le clocher carré de l’église portait,
visible à tout le ciel dans une belle couronne de fer forgé, sa plus
grosse cloche, et toutes les cheminées des maisons s’élevaient vers
lui, surmontées chacune de deux briques, inclinées et unies par leur
pointe comme sont les doigts roides des saintes en prière dans les
sculptures primitives et dans les tableaux d’autrefois.
C’était à la fin d’avril et, comme le vent soufflait, il faisait encore
froid. La nuit tomba dans le temps que nous gravissions le chemin
qui monte. Par les petites rues tournant sous des voûtes, par les
petites places qui s’empanachent d’un gros orme ou de trois
acacias, nous gagnâmes la ruelle où s’ouvre notre maison. Le vent
plus fort y coulait comme une lame et déchirait les poumons. Nos
valises liées de cordes et le gros sac de moleskine où étaient nos
provisions de route, tout alourdi de verres et de bouteilles qui
résonnaient à brinqueballer ainsi et à se heurter les uns contre les
autres, nous coupaient les doigts. Et personne ne nous attendait que
la simple maison mise en état par une servante de quinze ans que
Guicharde avait engagée par lettres adressées à la mairie deux
semaines auparavant.
Il fallut heurter trois fois, et cette fille enfin se décida à nous
ouvrir. Elle avait l’air niais et bon, la gorge déjà hardie dans un
corsage à raies roses, et de fausses pierres vertes, enchâssées de
cuivre, pendeloquaient à ses oreilles. En nous voyant, elle demeura
bêtement à rire sur le seuil sans même songer à nous débarrasser.
Mais déjà, dans les autres maisons, des rideaux se soulevaient
derrière les vitres verdâtres des petites fenêtres. Une porte
s’entr’ouvrait. Quelqu’un, d’un balcon, se penchait vers nous. Une
voix souffla :
— La femme de Georges Landargues, avec ses deux filles.
— Entrons, dit maman, entrons vite.
 Et elle passa la porte, toute roide et violente de gestes, avec une
sorte de courage désespéré. Mais Guicharde, sur le seuil, demeura
derrière elle : elle fixa les fenêtres derrière lesquelles frissonnait
sournoisement une curiosité sans bienveillance et j’eus l’impression
que son dur et hardi regard faisait se détourner, derrière les rideaux
fanés, d’autres regards invisibles. Ensuite elle entra à son tour et la
petite servante referma la porte. Je dis tout bas :
— Nous sommes chez nous.
Je regardais le couloir que remplissait l’escalier de bois, les deux
portes ouvertes, à gauche sur la salle qu’enfumait une lampe coiffée
de jaune, à droite sur la cuisine où flambaient de menues branches
dans une large et noire cheminée… Déjà Guicharde relevait la
mèche de la lampe, ouvrait les placards, s’inquiétait de la façon dont
passeraient par l’escalier trop étroit nos malles que l’on devait porter
le lendemain. Maman se taisait. Il me semblait qu’elle baissait la tête
et serrait les épaules. Elle s’approcha d’une fenêtre qui devait
donner sur le jardin et regarda la nuit. Elle tremblait doucement.
Peut-être elle pensait à ces rideaux soulevés sur son arrivée, et
peut-être ce qui se chuchotait à cette heure, dans les maisons
obscures, venait jusqu’à elle.
— Je n’aurais pas dû revenir ici, dit-elle.
— Mais puisqu’il était impossible de faire autrement, remarqua
Guicharde, avec son bon sens un peu brusque.
Et elle demanda une bougie pour monter aux chambres.
Maman soupira :
— C’est vrai !
Résignée, elle s’assit devant la table où le couvert était mis. Elle
avait retiré sa jaquette noire garnie de faux astrakan, mais elle
conservait son petit chapeau de crêpe tout déformé et déplacé par le
voyage. Je le lui fis remarquer.
— Enlevez-le, maman. On dirait que vous n’êtes pas chez vous,
et que vous allez repartir.
Aussitôt elle obéit avec une tranquillité douce.
 — C’est vrai, tout de même, dit-elle, que je suis chez moi… m’y
voici donc revenue, dans ma maison.
Elle me montra dans un coin une chaise de paille, très basse,
dont le simple dossier portait en relief trois abeilles sculptées dans
une couronne d’olivier.
— Tu vois, c’est là que je m’asseyais quand j’étais toute petite.
Et elle me montra encore, près de la fenêtre, une table carrée
avec des pieds en torsade qui luisaient sous la lampe :
— C’est là que j’écrivais mes devoirs. J’y ai préparé mon
certificat d’études. Après, je faisais surtout des comptes. C’est mon
oncle Jarny qui m’apprenait. Il avait été caissier à Paris dans une
grande maison de tissus.
Elle se tut, regardant de nouveau la fenêtre, et ce qu’elle voyait
maintenant, je le savais bien, était au delà des meubles et des
murs… Sa tristesse, en ce moment, me pénétra jusqu’au désespoir.
Son pauvre cœur saignait et pleurait dans mon cœur, et, doucement,
je passais ma main sur la petite main si pâle. Mais Guicharde entrait
à grands pas. Parlant des malles, elle déclara :
— Elles passeront, mais il faudra prendre garde à ne pas érafler
le mur.
Derrière elle venait la servante Adélaïde portant la soupière et
nous prîmes place pour le repas. Nous n’avions pas grand’faim. La
lampe continuait de fumer et d’éclairer mal. A travers l’odeur de sa
mèche grésillante l’odeur humide et morte des vieilles pierres et des
vieux plâtres tenus trop longtemps dans l’ombre nous devenait
sensible. La grande force du vent, se pressant contre les murs,
menaçait de faire crouler cette pauvre demeure. Dans son
grondement des lanières claquaient, qui, semblait-il, retombaient sur
nos cœurs tressaillants. Par instant, il semblait s’apaiser. Mais de
ces silences nous venait une oppression plus grande, car nous
sentions bien qu’il était toujours là, couché sur la maison,
l’enveloppant de sa force pour bondir et siffler de nouveau dès qu’il
aurait bien pris son repos effrayant. La fatigue maintenant pesait sur
nous au point que nous ne pouvions plus parler. Et cependant il