Grupa Wykonujący Data wykonania Data oddania

BT-8 Veronika 11.12.2023 28.12.2023

Vrublevs’ka

Podstawy mikroskopii konfokalnej

Wstęp teoretyczny
Mikroskopia konfokalna to jedno z bardzo ważnych narzędzi w dziedzinie badań
biologicznych, umożliwiające obserwację struktur mikroskopowych z wysoka
rozdzielczością. Jest to zaawansowana modyfikacja tradycyjnej mikroskopii
świetlnej, rewolucjonizującą obserwacje mikroświata poprzez zastosowanie
zmian konstrukcyjnych. Wprowadzenie tej techniki umożliwiło przekroczenie
ograniczeń mikroskopów tradycyjnych, pozwalając na zbadania procesów
dynamicznych i kinetycznych oraz architektury wewnątrz komórki.
Mikroskopia konfokalna jest oparta na zasadzie eliminacji niepożądanego światła
spoza płaszczyzny ogniskowania, umożliwiając uzyskanie obrazów o wyjątkowej
ostrości poprzez stosowanie przesłony pierścieniowej „pinhole” przed
detektorem, co umożliwia kontrolowanie wielkości szczeliny.
W przeciwieństwie do tradycyjnej mikroskopii optycznej, gdzie cały preparat jest
oświetlany, mikroskopia konfokalna wykorzystuje laser, co pozwala na generację
monochromatycznej wiązki światła o dużej mocy z możliwością kontroli jej
intensywności. zastosowanie lasera pozwala na przekierowanie światła przez
obiektyw na obiekt i odbicie przez układ optyczny do półlustra. To półlustro
odpowiada za naprawianie światła do detektora, zwykle wyposażonego w układ
fotomultiplikatorów (PMT).
Dla przemieszczania wiązki lasera po powierzchni próbki stosuje się skaner. Ten
mechanizm umożliwia otrzymanie obrazu w trzech wymiarach, co jest dość
przydatne podczas badania dużych obszarów. Nie mniej ważnym elementem jest
komputer z oprogramowanie obrazowania, które umożliwia kontrolę skanowania,
rejestrację oraz analizę danych. Zwykle te komputery obsługują wyłącznie dany
mikroskop, ponieważ oprogramowanie jest dość rozbudowane.
Mikroskop pozwala na rejestrowanie serii przekrojów optycznych na różnych
głębokościach preparatu, dlatego jest stosowany dla tworzenia obrazów
trójwymiarowych. Niestety, rozdzielczość w osi Z jest gorszy niż na osiach X i Y,
z tego powodu obraz 3D na duże niedokładności kształtów.
Tak jak mikroskop konfokalny często jest stosowany w technikach
fluoroscencyjnych, to odpowiednio używa się barwników fluoroscencyjnych,
takich jak DAPI, fluorochromy FITC lub rhodamina, które absorbują światło o
określonej długości fali, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokim kontraście.
Rozdzielczość tej mikroskopii przewyższa tradycyjne mikroskopy optyczne,
czyniąc ją niezastąpionym narzędziem w badaniach na skalę mikroskopową.
Ponadto, w mikroskopii konfokalnej istnieje dużo zmiennych paramentów, do
których można zaliczyć: natężenie światła wzbudzającego, rozmiar szczeliny,
czas naświetlenia, szybkość i obszar skanowania, powiększenie obiektywu itd. Te
charakterystyki można dostosować dla otrzymania lepszego obrazu badanej
próbki.
Celem tego ćwiczenia było zapoznanie się z podstawami działania mikroskopu
konfokalnego poprzez zmienianie parametrów mikroskopu dla porównania
zmiany jakości otrzymanego obrazku.

Wykonanie
W ćwiczeniu wykorzystano preparat łodyżki. Podczas wykonania ćwiczenia
mieliśmy możliwość zmieniać różne parametry, zwłaszcza ilość pikseli,
szerokość szczeliny, natężenie światła wzbudzającego itd.
Na rysunkach 1 - 2 przedstawiono dwa obrazy, różniące się szerokością
przesłony, 1 i 2 jednostki Airy’ego odpowiednio.

Rysunek 1. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z szerokością przesłony ustawionej na 1 jednostkę Airy'ego

 Rysunek 2. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z szerokością przesłony ustawionej na 2 jednostki Airy'ego

Szerokość przesłony wpływa na ilość światła przechodzącego przez przesłonę i

ma znaczenie na takie zjawisko optyczne jak dyfrakcja, co może oddziaływać na
rozkład intensywności światła i kontrastowość obrazu. Jak widać na rysunkach 1
i 2, zdjęcie z szerszą przesłoną charakteryzuje się lepszą jakością. Ponadto na
rysunku 2 widać więcej struktur mikroskopowych, które znajdują się wewnątrz
komórek, są one bardzie wyraźne i łatwiejsze do zidentyfikowania, co można
zaobserwować w zaznaczonych na pomarańczowo obszarach.
Następnym zmienionym parametrem było liczba skanowanych punktów. Przy
wzroście ilości skanowanych punktów również zwiększa się ilość pikseli, i
odpowiednio rozdzielczość obrazu. Poniżej zostały umieszczone rysunki 3-5
reprezentujące różna ilość pikseli 128x128, 512x512 i 2042x2042 odpowiednio.
Rysunek 3. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z rozdzielczością 128x128 px

Rysunek 4. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z rozdzielczością 512x512 px

 Rysunek 5. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego z rozdzielczością 2048x2048 px

Różnica tych trzech obrazków jest dość oczywista. Rysunek 5 jest bardzo
czytelny, bez widocznych szumów, co ułatwia identyfikację i analizę. rysunek 3
jest trudny do identyfikacji i analizy ze względu na niską rozdzielczość, co
ogranicza dokładność obrazu. Ale warto zauważyć, że wysoka rozdzielczość
obrazu skutkuje dłuższym czasem pomiaru i większym rozmiarem zapisanego
pliku.
Następnie zmieniono czas, przez który każdy obszar jest poddawany
naświetlaniu, czyli długość naświetlania. Zbyt krótki czas naświetlania może
skutkować niską jakością, a za długi – prześwietleniem obrazu lub do utraty
fluorescencji z powodów za intensywnego światła. Optymalna wartość długości
naświetlania podnosi wyrazistość obrazu.
Na rysunku 6 jest przedstawiony obraz ze zmienioną szybkością skanu, z 3 ms do
9 ms, zmiana tego parametru skutkuje większą trwałością pomiaru. Jak widać
zdjęcie jest kontrastowe i czytelne, ale w porównaniu do rysunku 5, zawiera
więcej szumów.
 Rysunek 6. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego – długość naświetlania 9 ms

Tak jak szum pomiarowy jest parametrem niezależnym i losowym, więc

uśrednienie jest skuteczną metodą na redukcję jest przeprowadzenie serię
pomiarów tego samego obszaru i końcowe uśrednienie, w celu poprawionej
ogólnej jakości obrazu.
Na rysunku 7 przedstawiono uśredniony obraz z czterech pomiarów, powodując
poprawienie jakości rysunku i minimalizacji szumu, co można zaobserwować na
krajach obiektu, w porównaniu do rysunku 6, szczególnie w wydzielonych na
żółto obszarach.

Rysunek 7. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego - średnia z 4 pomiarów

W mikroskopii konfokalnej też jest możliwe uzyskanie obrazów
trójwymiarowych. Ten proces polega na zbieraniu danych o intensywności
światła dla różnych głębokości obszarów. Podczas skanowanie też jest możliwe
zbieranie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez poszczególne barwniki.
Zebrane dane komputerowo przetwarzano w obraz trójwymiarowy.
Na rysunkach 8 i 10 są przedstawione obrazy dwuwymiarowe, z i bez
fluorescencji, o wysokiej głębokości dla wygenerowania których było wykonano
40 zdjęć. Na podstawie tych danych były stworzone projekcje 3D, umieszczone
na rysunkach 9 i 11. Jak już wspomniano wcześniej, obrazy trójwymiarowe
charakteryzują się niższą jakością z powodów gorszej rozdzielczości na osi Z, co
i można zaobserwować na tych przykładach.

Rysunek 8. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego – pomiar 3D

 Rysunek 9. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego – projekcja 3D

Rysunek 10. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego – fluorescencja, pomiar 3D

 Rysunek 11. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego – fluorescencja, projekcja 3D

Wnioski
Mikroskopia konfokalna daje możliwość do generacji obrazów o lepszej jakości
i kontrastowości w porównaniu do mikroskopii szerokiego pola.
Dla polepszenia jakości obrazu można zmieniać ustawienia samego mikroskopu,
takie jak szerokość przesłony, liczba skanowanych punktów, szybkość skanu,
głębokość obrazu itd. W celu eliminacji szumu i poprawienia czytelności stosuje
się uśrednienie obrazów.
Mikroskopia konfokalna odgrywa ważną rolę w badaniach naukowych, między
innymi biologicznych i medycznych, wspomagając analizę struktury i funkcji
różnych struktur mikroskopowych.

Literatura
1. Krajnik, Bartosz & Pikatkowski, D & Ma'ckowski, S & Gago's, M &
Tomaszewska, Emilia & Grobelny, Jaroslaw. (2011). Mikroskopia
konfokalna SIL. LAB Laboratoria, Aparatura, Badania. 16. 6-8.
2. Brutkowski, W. (2013). Mikroskopia konfokalna a mikroskopia szerokiego
pola - dwa podejścia do badań przyżyciowych. Kosmos, 62(2), 171–180.
3. Snopiński, P., Jarka, P., & Bilewicz, M. (2017). Mikroskopia świetlna i
konfokalna. LAB - Laboratoria, Aparatura, Badania, 18–22,35.
4. Brutkowski, W. (2013). Nowy wymiar mikroskopii – skanujący laserowy
mikroskop konfokalny. Kosmos, 62(2), 149-160.