BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: Nguyễn Hoàng Thảo Ly

Tổ thực hành: 23.N5.T5

Thời gian thực hành: 8h ngày 23, 24/10/2023 và 10h ngày 25/10/2023

Danh sách thành viên của nhóm:

1. Huỳnh Nhật Tân – 21129902 – DH21DD

2. Văn Thị Thanh Mai – 21129752 – DH21DD

3. Tăng Khả Quy – 21125521 – DH21DD

4. Phạm Bích Ngọc – 21125245 – DH21DD

5. Võ Hoàng Tâm – 21129901 – DH21DD

6. Nguyễn Lê Như Quỳnh – 21129886 – DH21VT

TP.Hồ Chí Minh, ngày 3 tháng 11 năm 2023

 BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ
STT Họ và tên
1 Văn Thị Thanh Mai
2 Phạm Bích Ngọc
3 Tăng Khả Quy
4 Nguyễn Lê Như Quỳnh
5 Võ Hoàng Tâm
6 Huỳnh Nhật Tân
Công việc
- Ghi nhận số liệu và hình ảnh bài 1, 2, 3
- Làm bài báo cáo hoàn chỉnh
- Phân công công việc
- Làm bài 4
- Tổng quan, các bước tiến hành, kết quả bài 4
- Chuẩn bị mẫu: tinh dầu
- Tổng quan, các bước tiến hành, cách tính kết
quả bài 1
- Tổng quan, các bước tiến hành, cách tính kết
quả bài 2
- Chuẩn bị mẫu: nước dừa, kháng sinh
penicillin
- Tổng quan, các bước tiến hành, cách tính kết
quả bài 3
- Tính kết quả và giải thích bài 1, 2, 3
- So sánh với TCVN
2
 MỤC LỤC

BÀI 1: XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM
MỐC .................................................................................................................................... 5
I. Tổng quan .................................................................................................................... 5
1. Vi khuẩn hiếu khí .................................................................................................... 5
2. Nấm men - nấm mốc ............................................................................................... 5
3. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ ....................................................................... 6
II. Cách tiến hành ............................................................................................................ 7
1. Sơ đồ quy trình ....................................................................................................... 7
2. Thuyết minh quy trình............................................................................................. 8
III. Kết quả ...................................................................................................................... 9
1. Công thức tính ......................................................................................................... 9
2. Kết quả của nhóm ................................................................................................... 9
BÀI 2: XÁC ĐỊNH TỔNG COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN ..................................................................................................... 13
I. Tổng quan .................................................................................................................. 13
1. Coliforms .............................................................................................................. 13
2. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ ..................................................................... 14
II. Cách tiến hành .......................................................................................................... 15
1. Sơ đồ quy trình ...................................................................................................... 15
2. Thuyết minh quy trình........................................................................................... 16
III. Kết quả .................................................................................................................... 17
BÀI 3: XÁC ĐỊNH VÒNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
KHUẾCH TÁN ĐĨA GIẤY THẠCH ............................................................................... 20
I. Tổng quan .................................................................................................................. 20
1. Xác định vòng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy
thạch .......................................................................................................................... 20
2. Ý nghĩa của phương pháp ..................................................................................... 20

3
 3. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ ..................................................................... 20
II. Cách tiến hành ........................................................................................................... 21
1. Sơ đồ quy trình....................................................................................................... 21
2. Thuyết minh quy trình............................................................................................ 22
III. Kết quả ..................................................................................................................... 22
1. Công thức tính ....................................................................................................... 22
2. Kết quả của nhóm .................................................................................................. 23
BÀI 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ LÊN MEN THỰC PHẨM ............................... 26
I. Tổng quan .................................................................................................................. 26
1. Sữa chua ................................................................................................................ 26
2. Vi sinh vật trong sữa chua..................................................................................... 26
3. Dụng cụ, nguyên liệu làm sữa chua ...................................................................... 27
II. Cách tiến hành .......................................................................................................... 28
1. Sơ đồ quy trình ...................................................................................................... 28
2. Thuyết minh quy trình........................................................................................... 28
III. Kết quả .................................................................................................................... 29

4
 BÀI 1: XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG
SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC

I. Tổng quan
1. Vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là loại vi khuẩn cần oxy phân tử để sống và phân bào.
Vd: Vi khuẩn Salmonella
1.1. Phương pháp để định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm

- Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng
Plate Count Agar (PCA), từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn
lạc sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu để định lượng tổng vi
sinh vật hiếu khí trong thực phẩm.

1.2. Ý nghĩa của phương pháp

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn được gọi tên khác là: số vi sinh vật hiếu khí,
tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn.
- Ý nghĩa: Chỉ tiêu này là dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và
sản phẩm để từ đó đánh giá được tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản
sản phẩm, dự đoán được khả năng hư hỏng của sản phẩm

2. Nấm men - nấm mốc

- Nấm men, nấm mốc có mặt trong nhóm sinh vật nhân chuẩn và có thành tế bào, vỏ chitin,
là những vi sinh vật dị dưỡng tiêu thụ nguồn carbon hữu cơ được cung cấp bởi môi trường
ngoại bào.
- Một số nấm men và nấm mốc là hiếu khí bắt buộc, một số khác có thể phát triển ở điều
kiện vi hiếu khí.
- Một số loài có thể nhận oxy nguyên tử từ chất nền, nhưng bất kể ở dạng nào, oxy vẫn là
yếu tố cần thiết cho nấm men, nấm mốc phát triển.
Vd: - Penicillium italicum
- Nấm men Saccharomyces liquefaction

5
*Phương pháp để định lượng tổng số nấm mốc và nấm men:
- Sử dụng kỹ thuật pha loãng và đổ đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên
môi trường DRBC (Dichloran Rose Bengal Chlorgamphenicol Agar) để xác định nấm men,
nấm mốc trong mẫu.

3. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ

- Nguyên liệu: Nước dừa
- Môi trường:
+ Plate Count Agar (PCA)
+ Agar
+ Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)
- Dụng cụ:
+ Que cấy trang
+ Micropipette
+ Đèn cồn
+ Đĩa petri
+ Tủ ấm 370C
+ Máy trộn Voltex

6
II. Cách tiến hành
1. Sơ đồ quy trình

Mẫu

Pha loãng mẫu

Hút 1ml dịch mẫu vào giữa đĩa

Đổ 15ml DRBC vào đĩa petri
petri

Đổ 15ml môi trường PCA vào Hút 0.5ml dung dịch mẫu vào
đĩa petri chính giữa đĩa petri

Xoay đĩa để trộn đều mẫu với

Trải mẫu đều
môi trường

Ủ 370C, 24h Ủ 370C, 24h

Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa
Tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu Tính kết quả tổng nấm men – nấm
khí trong mẫu mốc trong mẫu
(CFU/ g hoặc CFU/ ml) (CFU/ g hoặc CFU/ ml)

7
 2. Thuyết minh quy trình
+ Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, Vortex mẫu để
mẫu đồng nhất. Thu được dung dịch mẫu có nồng độ 10-1
+ Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất.
Vortex mẫu để mẫu đồng nhất. Thu được dung dịch mẫu có nồng độ 10-2
+ Tiếp tục làm liên tục như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử với các nồng độ tương
ứng 10-3, 10-4 , 10-5, 10-6.
* Chú ý: mọi thao tác đều làm dưới ngọn lửa đèn cồn.

A. Quy trình vi sinh vật hiếu khí.

- Bước 1: Đổ đĩa
+ Sử dụng 3 nồng độ pha loãng là 10-4, 10-5, 10-6 để nuôi cấy. Mỗi nồng độ dùng 2 đĩa petri.
+ Dùng Micropipette vô trùng hút 1ml dịch mẫu có nồng độ phù hợp vào giữa đĩa petri.
+ Thạch PCA (Plate Count Agar) đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 – 50oC trong điều
kiện vô khuẩn.
+ Rót vào mỗi đĩa petri cho độ dày từ 2 - 3mm ở nhiệt độ khoảng 500C .
+ Thời gian từ khi chuẩn bị xong dung dịch pha loãng 10-1 đến khi rót môi trường vào các
đĩa không vượt quá 45 phút.
+ Xoay đĩa petri cùng chiều kim đồng hồ 3 vòng và ngược chiều kim đồng hồ cũng 3 vòng
để trộn dịch cấy với môi trường, để cho thạch được đông đặc lại. Khi thạch đã đông lật úp
các đĩa.
*Chú ý: thực hiện tất cả các thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
- Bước 2: Ủ đĩa
Lật úp các đĩa đã cấy mẫu và đặt vào tủ ủ ở 370C trong 24h.
- Bước 3: Đếm khuẩn lạc và tính kết quả
Lấy các đĩa ra khỏi tủ ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa. Đếm các khuẩn lạc chính và
tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa.

8
B. Quy trình nấm men, nấm mốc.
- Bước 1: Đầu tiên ta đổ môi trường DRBC vào 6 đĩa petri, mỗi đĩa 10 – 15ml, để khoảng
10-15 phút cho thạch đông lại.
- Bước 2: Tiếp đến, dùng micropipette hút 0,5ml dịch mẫu đã được pha loãng ở nồng độ
10-4, 10-5 , 10-6 vào chính giữa đĩa petri (mỗi nồng độ 2 đĩa).
- Bước 3: Dùng que cấy trang (que cấy trang phải được rửa, lau cồn và hơ qua ngọn lửa
đèn cồn trước khi sử dụng để tránh nhiễm vi sinh vật bên ngoài môi trường) để dàn đều
dịch mẫu đó sao cho phủ khắp bề mặt đĩa, để khô. Để yên trên bề mặt ngang 15 phút.
* Chú ý: + Thao tác trang đều không quá 20 phút.
+ Thực hiện tất cả thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn.
- Bước 4: Sau đó ủ ngửa ở 37°C trong 24h.
- Bước 5: Đếm khuẩn lạc và tính kết quả tổng nấm men, nấm mốc trong mẫu.

III. Kết quả

1. Công thức tính
𝑁
A (CFU/ml)=
𝑛1𝑉𝑓1+⋯+𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖
Trong đó:
A: số tế bào vi sinh vật trong 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu cấy trong đĩa (ml)
fi: độ pha loãng tương ứng

2. Kết quả của nhóm

*Kết quả:

9
Hình 1.1. VSV hiếu khí ở nồng độ mẫu 10-4

Hình 1.2. VSV hiếu khí nở nồng độ mẫu 10-5

10
 Hình 1.3. VSV hiếu khí ở nồng độ mẫu 10-6

Đĩa 10-4 Đĩa 10-5 Đĩa 10-6

Thứ tự đĩa 1 2 1 2 1 2

Số khuẩn lạc 9 6 1 6 2 1

Hình 1.4. Nấm men, nấm mốc ở các nồng độ mẫu 10-4, 10-5, 10-6

11
 Đĩa 10-4 Đĩa 10-5 Đĩa 10-6

Thứ tự đĩa 1 2 1 2 1 2

Số lạc khuẩn 7 2 1 3 1 0

*Tính toán kết quả:

+ Với môi trường PCA:
Tổng vi sinh vật hiếu khí: < 2.5 x 102 CFU/ml
+ Với môi trường DRBC
Tổng nấm men - nấm mốc: < 2.5 x 102 CFU/ml

*Giải thích:
+ Vì tổng số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa với nồng độ pha loãng thấp nhất (10-4) đều
< 25 khuẩn lạc.

+ So với QĐ 46/2007 BYT giới hạn VSV và hóa học trong thực phẩm, quy định về giới
hạn cho phép vi sinh vật hiếu khí xuất hiện trong thực phẩm nước giải khát không cồn là
102 CFU/ml (trong 1ml thực phẩm đồ uống).

*Kết luận:

+ Mẫu thu được kết quả tổng cho vi sinh vật hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc <2.5x102
CFU/ml.
Như vậy, có thể thấy nước dừa khi mua trái và về tự xử lí để lấy nước có thể có lượng vi
sinh vật ở mức thấp và có thể đạt chuẩn của BYT.

*Giải thích:
+ Nước dừa vốn là nguồn nước uống sạch.
+ Trong nước dừa cũng có những hợp chất như lauric, caprylic hay capric có tính năng
kháng khuẩn, kháng động vật nguyên sinh.
+ Quá trình lấy nước và bảo quản tại nhà cẩn thận, công cụ vệ sinh.

12
 BÀI 2: XÁC ĐỊNH TỔNG COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

I. Tổng quan
1. Coliforms
Nguyên nhân của những vụ ngộ độc thực phẩm được bắt nguồn chủ yếu từ những vi
sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm, đồ uống,… Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu
đã dùng biện pháp nhất phổ biến nhằm xác định tổng vi khuẩn Coliforms và Coliforms
chịu nhiệt có trong thực phẩm.
- Giới thiệu về Coliforms:
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ.

Hình 2.1. Coliforms

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong
thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của
các vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với một loài duy nhất
là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.
Chúng có thể tồn tại ở nhiều môi trường khác nhau như đất, nước (trong nước sinh
hoạt, nước uống,…), trong thức ăn (thức ăn chưa chín, thức ăn bị nhiễm khuẩn) hay chất
thải của động vật.

13
2. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ
- Môi trường: + Lauryl Sulphate Broth (LSB)
+ Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)
+ E. coli medium (EC)
- Nguyên liệu: Nước dừa
- Dụng cụ:
+ Đèn cồn;
+ Bình schott (loại 150ml và 500ml);
+ Micropipet;
+ Ống duharm;
+ Ống nghiệm;
+ Ống nghiệm loại nhỏ;
+ Đầu típ đã tiệt trùng;
+ Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave);
+ Tủ ủ;
+ Máy đồng nhất mẫu.

14
II. Cách tiến hành
1. Sơ đồ quy trình

Hút 1ml dung dịch mẫu ở nồng

MẪU Pha loãng mẫu ở các
độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 vào
nồng độ 10-1, 10-2, 10-3
ống chứa 10ml môi trường LSB

Ghi nhận các ống LSB (+)

Ủ 37oC, 24 giờ
Ống duharm nổi, ống có bọt khí

Cấy vào ống môi trường BGBL, Cấy vào ống môi trường EC,
ủ ở 37OC trong 24 giờ. ủ ở 42OC trong 24 giờ.

Tra bảng
Mac Crady

Coliforms Coliforms chịu nhiệt

15
 2. Thuyết minh quy trình
Pha loãng mẫu

Hình 2.2. Phương pháp pha loãng mẫu

Đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất.
- Hút 1ml dung dịch có nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 vừa pha loãng vào 9 ống nghiệm
LSB đã chuẩn bị từ trước. (Mỗi nồng độ pha loãng thực hiện ở 3 ống nghiệm)
- Ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, sau 24 giờ ghi nhận ống LSB (+).

Hình 2.3. Ống nghiệm LSB trước khi đem ủ

- Cấy vào ống môi trường BGBL và ống môi trường EC: Dùng micropipette
hút 1ml dung dịch từ ống LSB (+) có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào 3 ống môi
trường BGBL và 3 ống môi trường EC. Làm tương tự với 2 nồng độ pha loãng
còn lại.

16
 - Môi trường BGBL ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, môi trường EC ủ ở nhiệt độ
42oC trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ đọc kết quả.
III. Kết quả
Từ số ống (+) ở mỗi độ pha loãng, dùng bảng Mac Crady loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ
pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật có trong mẫu.
Công thức: A (MPN/ml) = kết quả tra bảng x f/10
Trong đó:
A: mật độ vi sinh vật trong mẫu
f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)
Kết quả:
Với ba nồng độ 10-1 , 10-2, 10-3 sau khi cấy mỗi nồng độ vào 3 ống nghiệm chứa môi trường
LSB kết quả thu được:
+ Nồng độ 10-1: 3/3 ống nghiệm bị vẩn đục
+ Nồng độ 10-2: 1/3 ống nghiệm bị vẩn đục
+ Nồng độ 10-3: 0/3 ống nghiệm bị vẩn đục
Sau khi có kết quả của ba nồng độ, ta chọn lấy một ống nghiệm có kết quả dương tính ở
mỗi nồng độ. Ở nồng độ 10-3 tuy không thấy hiện tượng vẩn đục tuy nhiên vẫn lấy một ống
nghiệm để thực hiện kiểm chứng cho bước tiếp theo.

Hình 2.4. Ống nghiệm môi trường BGBL sau khi ủ

17
 Hình 2.5. Ống nghiệm môi trường EC sau khi ủ
10-1 10-2 10-3
BGBL 3/3 bị vẩn đục 3/3 bị vẩn đục 0/3 bị vẩn đục
EC 3/3 bị vẩn đục 3/3 bị vẩn đục 3/3 bị vẩn đục

Kết quả tính toán:

+ Coliforms ở môi trường BGBL: 240x101/10 = 240 MPN/ml
+ Coliforms ở môi trường EC: > 1100x101/10 = >1100 MPN/ml
+ So với QĐ 46/2007 BYT giới hạn VSV và hóa học trong thực phẩm, quy định về giới
hạn cho phép vi sinh vật hiếu khí xuất hiện trong thực phẩm nước giải khát không cồn là
10 CFU/ml (trong 1ml thực phẩm đồ uống).

KẾT LUẬN:
+ Tuy trong dừa có những hợp chất kháng khuẩn, tuy nhiên vi khuẩn vẫn có thể bị nhiễm
trong quá trình lấy nước dừa, và vi khuẩn có thể tồn tại dưới dạng bào tử. Khi gặp điều
kiện thuận lợi (nuôi cấy) thì chúng vẫn có thể phát triển trở lại.
+ Như vậy, theo kết quả thí nghiệm và theo chuẩn của BYT thì mẫu nước dừa đã không
đạt tiêu chuẩn cho Coliforms.

18
Giải thích:
+ Hiện tượng ở nồng độ 10-3 của môi trường LSB không có ống bị vẩn đục, tuy nhiên sau
khi cấy sang môi trường EC thì lại vị vẩn đục: vì ở nồng độ 10-3 lượng Coliforms quá ít,
khi chúng tăng sinh thì lượng vi sinh vật sinh ra vẫn chưa đủ làm đục môi trường. Vì vậy,
khi cấy sang môi trường BGBL chúng vẫn không tăng sinh đủ lượng để làm đục BGBL ở
nồng độ 10-3, tuy nhiên, trong môi trường EC lại bị vẩn đục vì có thể đã bị nhiễm vi khuẩn
từ môi trường.
+ Đầu tip bị nhiễm khuẩn trong quá trình dùng không cẩn thận của các nhóm trước (vì là
nhóm thực hiện thao tác sau cùng)

19
 BÀI 3: XÁC ĐỊNH VÒNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN ĐĨA GIẤY THẠCH

I. Tổng quan
1. Xác định vòng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán đĩa
giấy thạch

- Phương pháp khuếch tán đĩa giấy thạch là phương pháp kiểm tra độ nhạy cảm của vi sinh
vật với các chất có hoạt tính sinh học (chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm). Trong
phương pháp này, vi sinh vật được trải đều lên đĩa thạch chứa sẵn môi trường. Sau đó, đĩa
giấy lọc chứa dịch thử nghiệm được đặt lên trên môi trường thạch. Ủ trong điều kiện thích
hợp. Khi ủ, dịch thử nghiệm sẽ khuếch tán qua môi trường thạch và ức chế sự phát triển
của vi sinh vật. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường
kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.

2. Ý nghĩa của phương pháp

+ Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn
gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh
nhân.

+ Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn.
Qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn
kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.

3. Môi trường, nguyên liệu và dụng cụ

- Môi trường:
+ Tryptone Soya Agar (TSA)
+ Agar
- Nguyên liệu:
+ 1 viên kháng sing Penicillin
+ Tinh dầu (dầu gió)
- Dụng cụ:
20
 + Đĩa petri + Micropipette 1ml, 5ml
+ Que cấy trang + Tủ ấm 370C
+ Cân phân tích + Máy trộn Voltex
+ Đĩa giấy kháng sinh + Thước đo vòng vô khuẩn
+ Đèn cồn + Dụng cụ đặt đĩa giấy kháng sinh
+ Cốc thủy tinh (Dispensing apparatus)

II. Cách tiến hành

1. Sơ đồ quy trình
Đổ vào mỗi đĩa petri 15ml môi Vi sinh vật được điều chỉnh để có
trường TSA đã hấp tiệt trùng nồng độ 106 – 108 CFU/ml

Hút 100𝜇𝑙 dịch vi sinh vật vào giữa đĩa thạch, dùng que trang đều tới khi khô
(không được quá 20 phút)

Đặt đĩa giấy đã được vô trùng lên đĩa thạch

Nhỏ 10𝜇𝑙 dịch kháng khuẩn, kháng nấm lên đĩa giấy

Ủ ngửa ở 370C trong 24 giờ

Đo đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm

 2. Thuyết minh quy trình
- B1: Đổ đĩa
+ Chuẩn bị 6 đĩa petri sau khi đã được hấp tiệt trùng
+ Thạch TSA (Tryptone Soya Agar) đã đun nóng chảy, để nguội đến 45- 50 độ trong điều
kiện vô khuẩn rót từ từ vào đĩa petri khoảng 1/3 phần đĩa đợi cho thạch nguội.
- B2: Cấy VSV vào đĩa
+ Dùng micropipet hút 100µl vi sinh vật Staphylococcus aureus vào giữa đĩa thạch.
+ Dùng que trang đều bề mặt cho tới khi khô (chú ý thời gian trang không được quá 20 phút).
+ Đặt đĩa giấy đã được vô trùng vào giữa đĩa thạch sao cho không bị rách thạch.
+ Đối với đĩa đối chứng (+) nhỏ 1 giọt penicilin đã được pha sẵn lên đĩa giấy.
+ Đối với đĩa đối chứng mẫu nhỏ 1 giọt dầu gió vào đĩa giấy.
*Chú ý: mọi thao tác cần thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.
- B3: Ủ ngửa
Để ngửa các đĩa và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 24h.
- B4: Đo đường kính vòng kháng khuẩn kháng nấm
+ Lấy các đĩa ra khỏi tủ ủ, xác định vòng tròn vô khuẩn sau đó dùng thước đo các đường kính
dài nhất, đường kính ngắn nhất của vòng kháng khuẩn.
III. Kết quả
1. Công thức tính
A=D-d
Trong đó:
A: Đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm (mm)
D: Đường kính vòng kháng ngoài (mm)
d: Đường kính đĩa giấy (mm)

22
 2. Kết quả của nhóm
 Kết quả thí nghiệm:

Hình 3.1. Các đĩa đối chứng sau khi ủ

Đối chứng (+)

Đối chứng (-) Mẫu
Penicillin
D (mm) 32.5 80 80 32.5 60 60
d (mm) 6 6 6 6 6 6
A = D - d (mm) 26.5 74 74 26.5 54 54

+ 1 đĩa petri đối chứng âm: xuất hiện vòng kháng khuẩn đường kính 26.5mm.
 Hiện tượng cho thấy nhóm có kết quả không đúng với lý thuyết.
+ 2 đĩa petri đối chứng dương với penicillin: xuất hiện vòng kháng khuẩn với đường kính
là 74mm.
+ 3 đĩa petri mẫu: xuất hiện vòng kháng khuẩn với đường kính lần lượt là 26.5, 54 và
54mm.

23
 Giải thích kết quả:
 Đối với mẫu đối chứng âm:
+ Theo lý thuyết, mẫu đối chứng (-) sẽ không có sự xuất hiện của vòng kháng khuẩn vì
không chứa các thành phần kháng khuẩn nên Staphylococcus aureus ở môi trường dinh
dưỡng TSA tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
+ Tuy nhiên, trong quá trình thực hành kẹp gắp đĩa giấy có thể đã bị nhiễm một lượng
kháng sinh nhưng chưa được vệ sinh kỹ dẫn đến việc kết quả cuối cùng xuất hiện vòng
kháng khuẩn.

Hình 3.2. So sánh đối chứng (-) có kết quả đúng (bên trái) và đối chứng (-) của nhóm
(bên phải)

 Đối với mẫu penicillin:

Penicillin là một nhóm kháng sinh thu được từ nấm Penicilium hay được điều chế để điều
trị cho các trường hợp nhiễm khuẩn vi sinh vật còn nhạy cảm, có khả năng chống lại bằng
cách giết chết các vi khuẩn và hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Vì vậy, tạo được vòng
kháng khuẩn có đường kính kháng khuẩn khá cao. Và với hoạt tính kháng khuẩn mạnh
cùng hàm lượng thích hợp đã cho ra kết quả kháng khuẩn tốt nhất so với các mẫu còn lại.

24
 Hình 3.3. Đĩa đối chứng penicillin

 Đối với mẫu dầu gió:

Dầu gió không phải là chất kháng sinh tự nhiên. Dầu gió có khả năng kháng khuẩn rất
mạnh nên đĩa xuất hiện vòng kháng khuẩn có đường kính lớn.

Hình 3.4. Mẫu đối chứng dầu gió

 Kết luận:
Việc bổ sung các thành phần kháng khuẩn có thể là chất kháng khuẩn từ vi sinh vật, chất
kháng khuẩn tự nhiên,…giúp làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Tuy
nhiên ở mỗi thành phần kháng khuẩn khác nhau sẽ có khả năng ức chế vi sinh vật khác
nhau tùy thuộc vào khả năng nhạy cảm của kháng sinh với vi sinh vật gây bệnh.

25
 BÀI 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ LÊN MEN THỰC PHẨM

I. Tổng quan
Tổ 5 chọn thực phẩm lên men là sữa chua.
1. Sữa chua
- Sữa chua là sản phẩm sữa đã được lên men và axit hóa bởi vi khuẩn, tạo ra một sản
phẩm đặc, có vị chua, có thời hạn sử dụng kéo dài. Sữa chua chứa các chất dinh dưỡng
thiết yếu và là thực phẩm giúp tăng cường sức khỏe.
- Lợi ích của sữa chua đối với sức khỏe:
 Cung cấp canxi cho cơ thể (trong 100g sữa chua có chứa khoảng 200mg canxi)
 Cung cấp vitamin (riboflavin (B2), thiamin (B1), cobalamin (B12), folate (B9),
niacin (B3) và vitamin A).
 Cung cấp lợi khuẩn
 Có khả năng cải thiện khả năng dung nạp lactose (Hàm lượng lactose ban đầu
trong sữa giảm đi 20-30% trong quá trình lên men do lactose chuyển thành
dạng glucose và galactose đơn giản do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn
acid lactic).
 Tăng cường miễn dịch và ngăn ngừa rối loạn tiêu hóa
2. Vi sinh vật trong sữa chua
- Lactobacillus bulgaricus:
 Thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic, là một trong những vi khuẩn chính được sử dụng
để sản xuất sữa chua
 Là một vi khuẩn hình que gram dương
 Không di động và không hình thành bào tử
 pH để phát triển trong khoảng 5.4 đến 4.6
 Nhiệt độ tối ưu là khoảng 40 – 45oC trong điều kiện yếm khí
- Streptococcus thermophilus
 Thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic, là một trong những vi khuẩn chính được sử dụng
để sản xuất sữa chua

26
  Vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử và kỵ khí tùy nghi
 Phạm vi nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là khoảng 42–45°C
3. Dụng cụ, nguyên liệu làm sữa chua
* Nguyên liệu
- 380g sữa đặc
- 100g sữa chua không đường
- 500 ml sữa tươi không đường
- 500 ml nước
* Dụng cụ
- Nồi
- Muỗng
- Hũ có nắp đậy
- Thùng có nắp đậy

27
II. Cách tiến hành
1. Sơ đồ quy trình

2. Thuyết minh quy trình

Bước 1. Phối trộn: Cho sữa đặc, sữa tươi, nước vào nồi, khuấy đều hỗn hợp
Bước 2. Gia nhiệt: Đun hỗn hợp trên bếp đến nhiệt độ khoảng 45oC
Bước 3. Làm nguội đến khoảng 35-40oC
Bước 4. Cấy men: Cho sữa chua vào hỗn hợp, khuấy đều.
Bước 5. Cho hỗn hợp ra hủ có nắp đậy.
28
 Bước 6. Xếp các hủ vào thùng kín, cho nước ấm (nhiệt độ khoảng 40-45oC) ngập 1/3
thân hủ, đậy kín nắp thùng và ủ 12 tiếng.
* Lưu ý:
- Dụng cụ làm sữa chua phải được rửa sạch, trụng qua nước sôi.
- Nếu sữa chua để trong tủ lạnh thì phải chờ sữa chua trở về nhiệt độ bình thường
trước khi cho vào hỗn hợp sữa.
III. Kết quả
- Sữa chuyển từ dạng lỏng sang dạng đặc là do casein trong sữa bị biến tính tạo nên cấu
trúc gel.
- Quá trình lên men của vi khuẩn chuyển đổi đường lactose thành acid lactic, làm giảm
độ pH của sữa, do đó sữa sau khi ủ có vị chua.

29