MASARYKOVA UNIVERZITA

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Bakalářská práce

Brno 2015 Martina Hrivňáková

 MASARYKOVA UNIVERZITA
PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

REZISTENCE BAKTERIÍ KE
KARBAPENEMŮM
Bakalářská práce

Martina Hrivňáková

V e d o u c í p r á c e : RNDr. Monika D o l e j s k á , PhD. Brno 2015

Bibliografický záznam

Autor: Martina Hrivňáková

Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita
Ústav experimentální biologie

Název práce: Rezistence baktérií ke karbapenemům

Studijní program: Experimentální biologie

Lékařská genetika a molekulární diagnostika

Studijní obor:

Vedoucí práce: RNDr. Monika Dolejská, PhD.

Akademický rok: 2014/2015

Počet stran: 54

Klíčová slova: beta-laktamy; karbapenemy; rezistence; vnější

membránové proteiny; efluxní pumpy; penicilin-
vazebné proteiny; karbapenemazy; mobilní genetické
elementy; molekulárně-genetická detekce;
fenotypová detekce
Bibliografický záznam

Autor: Martina Hrivňáková

Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita
Ústav experimentálnej biológie

Názov práce: Rezistencia baktérií ku karbapenémom

Študijný program: Experimentálna biológia

Lekárska genetika a molekulárna diagnostika

Študijný obor:

Vedúci práce: RNDr. Monika Dolejská, PhD.

Akademický rok: 2014/2015

Počet strán: 54

Kľúčové slová: beta-laktamy ;karbapenémy; rezistencia; vonkajšie

membránové proteiny; efluxné pumpy; penicilín-
väzobné proteiny; karbapenemázy; mobilné genetické
elementy; molekulárne-genetická detekcia;
fenotypová detekcia
Bibliographic Entry

Author Martina Hrivnakova

Faculty of Science, Masaryk University
Department of experimental biology

Title of Thesis: Bacterial resistence to carbapenems

Degree programme: Experimental biology

Field of Study: Medical Genetics and Molecular Diagnostics

Supervisor: RNDr. Monika Dolejskä, PhD.

Academic Year: 2014/2015

Number of Pages: 54

Keywords: beta-lactam; carbapenem; resistant; outer membrane

proteins; efflux pump; penicillin binding proteins;
carbapenemases; mobil genetic elements; molecular-
genetic detection; phenotypic detection
Abstrakt
Tato bakalářská práce se věnuje problematice vzniku rezistence ke
karbapenémovým antibiotikům, jejich mechanismu, způsobu přenosu a možností
jejich detekce. Práce je zaměřená hlavně na karbapenemázy, které jsou důležitým
mechanismem rezistence proti karbapenémovým antibiotikům. Zabývá se situací
karbapenemáz ve světě, ale i v České republice a jejich výskytu u vybraných typů
bakterií. Díky horizontálnímu přenosu genetického materiálu je toto téma aktuální
a důležité z klinického i epidemiologického hlediska. Pochopení mechanismu
rezistence a jeho správné určení může pomoci prodloužení použitelnosti
antibiotika.

Abstrakt
Táto bakalárska práca sa venuje problematike vzniku rezistencie ku
karbapenémovým antibiotikám, ich mechanizmu, spôsobu prenosu a možnosti
ich detekcie. Práca je zameraná hlavne na karbapenemázy, ktoré sú dôležitým
mechanizmom rezistencie proti karbapenémovým antibiotikám. Zaoberá sa
situáciou karbapenemáz vo svete, ale aj v Českej republike a ich výskyte
u vybraných typov baktérií. Vďaka horizontálnemu prenosu genetického materiálu
je toto téma aktuálne a dôležité z klinického aj epidemiologického hľadiska.
Pochopenie mechanizmu rezistencie a jeho správne určenie môže pomôcť
predĺženiu použiteľnosti antibiotika.
Abstract
This bachelor thesis deals with the issue of occurrence of resistance to
carbapenem antibiotics, their mechanism, mean of their carryover and the
possibilities of their detection. The thesis is focused mainly on carbapenemase,
which are a crucial mechanism of resistance against carbapenem antibiotics. It
deals with the situation of carbapenemase in the World as well as in Czech Republic
and their appearance in certain types of bacteria. This is a current and crucial topic
not only from clinical but also epidemiological aspect, due to horizontal
transfer/transmission of genetic material. Grasping of the mechanism of resistance
and its accurate assessment can help prolong the applicability of antibiotics.
 Masarykova univerzita ^íiTŕ
Přírodovědecká fakulta W
ZADANÍ BAKALÁRSKE PRACE
Student: Martina Hrivňáková
Studijní program: Biologie
Studijní obor: Lékařská genetika a molekulárni diagnostika

Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF M U Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu
M U určuje bakalářskou práci s tématem:

Rezistence bakterií ke karbapenemům

Bacterial resistance to carbapenems

Oficiální zadání:
Antibiotika a historie antibiotické terapie. Beta-laktamová antibiotika. Struktura, mechanismus účinku
a použití karbapenemů. Mechanismy rezistence bakterií k antimikrobialním látkam. Rezistence ke
karbapenemům - mechanismus a genetický zaklad. Výskyt karbapenemáz u vybraných bakteriálních
druhů - klinický význam, aktuální situace u nás a ve stětě. Metody průkazu produkce karbapenemáz.
Mechanismy šíření rezistence ke karbapenemům - role mobilních genetických elementů.

Literatura:
1/GuptaNetál. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology andprevention.
ClinlnfectDis. 2011, 53:60-67.
2/Nordmann P et ál. Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae: here is the storm!
Trends Mol Med. 2012,18:263-272.

Jazyk závěrečné práce: slovenský

Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Monika Dolejská, PhD.
Podpis vedoucího práce: IÍUA
Konzultant:

Datum zadání bakalářské práce: 11. listopadu 2014

V Brně dne 11. listopadu 2014

" 7
M. RNDr. Jan Šmardaf, CSc.
řejdiiel Ústavu experimentální biologie

Zadám bakalářské práce převzal dne: 11. listopadu 2014

Podpis studenta
Poďakovanie
Na tomto mieste by som chcela poďakovať vedúcej, mojej bakalárskej práce
RNDr. Monike Dolejskej, PhD., za konzultácie a predovšetkým za jej pomoc a cenné
rady pri zpracovaní tejto práce. Ďalej by som rada poďakovala všetkým, ktorý sa
akýmkoľvek spôsobom podieľali na spracovaní tejto bakalárskej práce.
V neposlednej rade ďakujem svojej rodine a priateľom za ich podporu v mojom
snažení.

Prehlásenie
Prehlasujem, že som túto bakalársku prácu vypracovala samostatne s využitím
informačných zdrojov, ktoré sú v práci citované.

Brno 12. mája 2015

Martina Hrivňáková
OBSAH

1. ÚVOD 11
2. ANTIBIOTIKÁ 12
2.1. História antibiotík 12
2.2. Účinky antibakteriálnych látok 13
2.2.1. Mechanizmus účinku antibiotík 13
2.2.2. Nežiadúce účinky antibiotík 13
3. BETA-LAKTAMOVÉ ANTIBIOTIKÁ 14
3.1. Mechanizmus účinku beta-laktamových antibiotík 15
3.2. Karbapenémy 16
3.2.1. Štruktúra karbapenémov 16
3.2.2. Rozdelenie karbapenémov 17
3.2.3. Použitie karbapenémov 19
4. REZISTENCIA N A ANTIBIOTIKÁ 20
4.1. Obecné mechanizmy rezistencie 20
4.1.1. Zmena cieľového miesta a zhoršený prienik antibiotika do bunky 21
4.1.2. Aktívne odčerpanie antibiotika z bunky 21
4.1.3. Bakteriálne enzýmy 22
4.2. Beta-laktamázy 22
5. M E C H A N I Z M U S REZISTENCIE K U KARBAPENÉMOM 23
5.1. Karbapenemázy 24
5.1.1. Karbapenemázy molekulárnej triedy A 24
5.1.2. Karbapenemázy molekulárnej triedy B 25
5.1.3. Karbapenemázy molekulárnej triedy D 27
5.1.4. Výskyt karbapenemáz v Českej republike 28
5.2. NEENZYMATICKÁ REZISTENCIA K U K A R B APENÉMOM 29
5.2.1. Efluxné pumpy 29
5.2.2. Mutácie v PBP 30
5.2.3. Poríny 31
6. KARBAPENEMÁZY U VYBRATÝCH PATOGÉNOV 32
6.1. P. aeruginosa 32
9
 6.2. A. baumannii 32
6.3. E. coli 33
6.4. K. pneumoniae 34
7. METÓDY PREUKÁZANIA KARBAPENEMÁZ 35
7.1. Fenotypové metódy 35
7.2. Molekulárne metódy 36
8. MOBILNÉ GENETICKÉ E L E M E N T Y 37
8.1. Plazmidy 38
8.2. Transpozóny 38
8.3. Integróny a génové kazety 39
9. ZÁVER 40
Z O Z N A M POUŽITEJ LITERATÚRY 41

10
1. ÚVOD

Boj medzi prírodou a človekom prebieha od nepamäti. S vývojom novej antibiotickej

terapie prebieha u baktérií aj nový spôsob ochrany. A preto, tak ako sa vyvíja stále nová
antibiotická terapia, tak si vyvíjajú aj baktérie nové spôsoby ochrany. Vznik rezistencie je
teda u baktérií prirodzený, evolučný mechanizmus. Nesprávne užívanie antibiotík však tento
prirodzený proces podstatne urýchľuje, a to sa stáva v posledných desaťročiach vážnym
problémom. Objavujú sa nové kmene so širokým rozsahom rezistencie, atak prirodzene
narastá celosvetová potreba riešiť tento problém. Medzi obeťami takýchto baktérií sa
nachádzajú veľmi často ľudia imunokompromitovaní, pacienti podstupujúci rôzne
chirurgické, alebo invazívne výkony. Boj človeka s takýmito baktériami znamená v prvom
rade správnu antibiotickú politiku, výskum v oblasti mechanizmov rezistencie, monitorovanie
výskytu rezistencií a v neposlednom rade aj farmaceutický výskum.
Karbapenémy patria k rezervným antibiotikám, ktoré často slúžia ako posledná záchrana pri
ochoreniach vyvolaných multirezistentnými organizmami, avšak rezistencia proti tomuto
antibiotiku, už tiež nieje ničím novým.
Jadro predkladanej práce je rozdelené na sedem kapitol. Prvé tri kapitoly majú za cieľ
poskytnúť základné poznatky, a princípy mechanizmu rezistencie k antibiotickým látkam.
Ďalšie kapitoly predstavujú základ tejto práce. Prvá podkapitola sa venuje beta-laktamázam,
ako spôsobu rezistencie ku karbapenémom a ich výskyt v Českej republike. Ďalšia
podkapitola sa venuje rozboru neenzymatického spôsobu rezistencie. Šiesta kapitola sa venuje
výskytu karbapenemáz u vybratých patogénov. Siedma kapitola sa venuje spôsobu detekcie
karbapenemáz fenotypovými, a molekulárnymi metódami. Nakoniec v poslednej kapitole sa
venujem role mobilných genetických elementov a spôsobu prenosu rezistencie horizontálnou
cestou.
Cieľom predloženej práce je priblížiť spôsob rezistencie na poli karbapenémovych
antibiotík.

11
 2. ANTIBIOTIKÁ

2.1. História antibiotík

Antibiotiká sú v podstate mikrobiálne metabolity, ktoré sú schopné usmrtiť, prípadne

potlačiť rast baktérií a niektorých ďalších mikroorganizmov. História antibiotík sa viaže
s objavom baktérií a s rozvojom metód ich kultivovania a pozorovania (Votava, 2005).
Za objavom prvého antibiotika stojí Alexander Fleming, ktorý vďaka náhode objavil
antibakteriálne účinky plesne Penicilium notatum. Fleming v tej dobe ešte nebol schopný
zlúčeninu extrahovať, napriek tomu ale pochopil význam objavu a v roku 1929 svoj objav
publikoval. Vedec Alexander Fleming však nebol prvý, ktorý si všimol antimikrobiálnych
vlastností penicilínov. Francúzsky lekár Ernest Duchesne už v roku 1896 zaznamenal, že
niektoré rody Penicillium sú schopné inhibovať rast baktérií. No jeho výskum bol zabudnutý
a až neskôr bol znovu objavený.
Moderná etiologická terapia v 30 rokoch 20. storočia prebiehala sulfonamidmi. Prispel k
tomu nemecký vedec Gerhard Domagk, ktorý skúmal antibakteriálne vlastnosti niektorých
farbív. Jedným z nich bol prontosil (sulfonamid), ktorý sa dokáže v tele pacienta premieňať
na aktívnu formu. Toto antibiotikum sa stalo jedným z prvých úspešne aplikovaných
antibiotík na pacientovi. Prvenstvo však patrí tímu českých lekárov Honí ovi aBukovskému,
ktorí popísali prvé liečebné použitie antibiotika - anginolu a to už v roku 1899 (Aminov,
2010).
K celosvetovému použitiu antibiotík prispela hlavne druhá svetová vojna. Tím pod vedením
Howarda W. Floreyiho vyprodukoval veľké množstvo čistého antibiotika, rovno pripraveného
pre klinické štúdie. Lekárov, ale aj verejnosť prekvapila účinnosť antibiotík na choroby, ktoré
boli do tejto doby často veľmi ťažko liečiteľné, či končili smrťou (Aminov, 2010; Schindler,
2014).
V roku 1952 sa americký biochemik ukrajinského pôvodu Selman Abraham Waksman
zaslúžil o objav nového typu antibiotika, ktorý extrahoval z organizmu Streptomyces gryseus.
Nové antibiotikum dostalo názov streptomycín a používa sa hlavne v boji proti baktérii
Mycobacterium tuberculosis (Bednář et al., 1996; Votava, 2005).

12
2.2. Účinky antibakteriálnych látok

Antibiotiká môžu byť prirodzené produkty metabolickej činnosti, nazývame ich antibiotiká,
alebo môžu byť výsledkom chemickej syntézy, nazývame ich potom chemoterapeutika. Látky
spôsobujúce smrť baktérií, sa volajú baktericídne. Sú ireverzibilné a spravidla majú rýchlejší
účinok v porovnaní s bakteriostatickými antibiotikami. Tie pôsobia pomalšie a ich účinok je
reverzibilný. Často sa však stáva, že bakteriostatické antibiotiká pôsobia vo vyšších
koncentráciách baktericídne (Votava, 2005; Schindler, 2014).
Antibiotiká sa tiež líšia svojimi farmakokinetickými vlastnosťami. Niektoré z nich sú
závislé na koncentrácií, iné zase na dobe po ktorú sa darí udržovať ich hladinu v plazme nad
minimálnu inhibičnú koncentráciu (MIC). Jednotlivé antibiotiká vykazujú taktiež rôzne
spektrum účinku. Niektoré majú veľmi úzke spektrum účinku, iné zase veľmi široké.
K antibiotikám vyznačujúcim sa širokým spektrom účinku, môžeme zaradiť napríklad
cefalosporíny (Votava, 2005).

2.2.1. Mechanizmus účinku antibiotík

Antibakteriálne látky môžeme rozdeliť podľa viacerých faktorov. Jedným z nich je cieľ
antibakteriálneho pôsobenia na antibiotiká inhibujúce syntézu bakteriálnej steny. Sem patria
antibiotika beta-laktamové, alebo napríklad glykopeptidy. Ďalej sú to antibiotiká pôsobiace na
syntézu nukleových kyselín. Zastupujú ich hlavne chinolóny, ovplyvňujúce D N A gyrázu,
potom sú to ansamyciny, či nitroimidazoly. Na poškodenie bunkových membrán pôsobia
polypeptidické antibiotiká. Inhibíciu proteosyntézy spôsobujú aminoglykosidy, alebo
tetracyklíny. Sulfonamidy pôsobia ako antimetabolity tým, že brzdia syntézu kyseliny listovej
na základe kompetitívnej inhibície s kyselinou p-aminobenzoovou (Votava, 2005).

2.2.2. Nežiadúce účinky antibiotík

Antibiotikum nesmie poškodzovať eukaryotické bunky a prípadný účinok na nich musí byť
zanedbateľný, najlepšie žiadny (Bednář et al., 1996; Schindler, 2014). Antibiotiká nie sú
úplne bez vedľajších účinkov, nakoľko nie sú telu prirodzené. Z toho dôvodu sa pri užívaní
antibiotík môže vyskytnúť rada nežiadúcich účinkov. Nežiadúcim účinkom antibiotík môžu
byť alergie, ktoré sú najčastejšie biologické, alebo toxické. Alergické vedľajšie účinky sa

13
môžu prejavovať ako ľahké alergické reakcie, v závažnejších prípadoch ako anafylaktický
šok. Pri predávkovaní, prípadne opomenutí upravenia dávkovania, môže dôjsť k toxickým
účinkom. Podľa miesta toxicity môžeme antibiotiká deliť na neurotoxické, hepatotoxické,
hematotoxické, nefrotoxické atď. Osobitou skupinou je aj biologický dopad podávania
antibiotík, kedy antibiotiká ničia normálnu mikroflóru a tým môžu nepriamo spôsobiť
premnoženie patogénov (Votava, 2005).

3. BETA-LAKTAMOVÉ ANTIBIOTIKÁ

Beta-laktamové antibiotika zahŕňajú celú radu prírodných a semisyntetických zlúčenín,

ktoré majú jeden spoločný rys, beta-laktamový kruh (Mascaretti et al., 2003). Tento beta-
laktamový kruh je tvorený štvorčlennou štruktúrou skladajúci sa z troch atómov uhlíka a z
jedného atómu dusíka (Votava, 2005). Jednotlivé druhy beta-laktamov sa od seba líšia
zložením ďalšieho kruhu pripojeného na tento cyklus. Do roku 1971 patrili do skupiny beta-
laktamových antibiotík len penicilíny a cefalosporíny. Od roku 1971, kedy boli objavené
mono abicyklické beta-laktamové štruktúry, klasifikujeme penicilíny a cefalosporíny ako
tradičné, alebo klasické beta-laktamové antibiotiká (tabuľka č.l). Mono abicyklické beta-
laktamové antibiotiká zahŕňajú monobaktamy, cefamyciny a karbapenémy a nazývame ich
ako netradičné, alebo nie klasické antibiotiká (tabuľka č.2). Pôsobia baktericídne a miesto
účinku je bakteriálna stena. Sú relatívne netoxické a majú krátky post antibiotický efekt
(Mascaretti et al., 2003).

14
 Tabuľka č.1: S k u p i n a A - Tradičné beta-laktamové antibiotiká (Mascaretti et a l . , 2 0 0 3 ;

V o t a v a , 2 0 0 5 ; upravené)

benzylpenicilín (acidolabilný),
Klasické fenoxymetylpenicilín
(acidostabilný)
Aminopenicilín ampicilín.amoxycilín
Penicilíny Širokospektré
Karboxypenicilín tikarcilín,
penicilíny
Ureidopenicilín azlocilín.piperacilín
Antibiotiká odolné voči
oxacilín, meticilín
stafilokokovej penicilináze
inj.: cefalotin, cefazolin
1 .generácia
p.o.: cefalexin, Cefadroxil, Cefaclor
inj.: Cefuroxim
2.generácia
p.o.: Cefuroxim axetil, cefprozil
Cefalosporíny
cefotaxim, cefriaxon, ceftazidim,
inj.:
3.generácia cefoperazon
p.o.: Cefixim
4.generácia inj.: cefepim
pozn.: inj.- znači injekčné podávané antibiotiká; p.o.- značí ústne podávané antibiotiká

Tabuľka č.2: S k u p i n a B- Netradičné beta-laktamové antibiotiká (Mascaretti et a l . ,

2 0 0 3 ; V o t a v a , 2 0 0 5 ; upravené)

Cefamycíny cefoxitin, cefotetan, c e f m e t a z o l e

Karbapenémy i m i p e n e m , ertrapenem, m e r o p e n e m
Monobaktamy aztreonam

3.1. Mechanizmus účinku beta-laktamových antibiotík

Baktérie sú obklopené bunkovou stenou, ktorej hlavnou úlohou je chrániť baktériu pred

poškodením. Hlavná zložka bakteriálnej steny je peptidoglykán, ktorý je tvorený

polysacharidmi a polypeptidmi. Je spevnený priečnymi väzbami a tvorí v bakteriálnej stene

sieť priestorovo usporiadaných vlákien.

Beta-laktamy svojou štruktúrou napodobňujú látky, ktoré sú esenciálne pre tvorbu

peptidoglykánu. Pôsobia ako ireverzibilné inhibitory D-alanyl-D-alanín karboxypeptidázy/

transpeptidázy, inak aj DD-peptidázy, známe pod pojmom: penicilín viažuce proteiny,

z angličtiny penicillin binding proteins, PBP (Mascaretti et al., 2003). Tieto PBP sú dôležité

vo finálnom kroku tvorbe bakteriálnej steny. Normálne sa na tieto miesta viažu

15
transpeptidázy, transglykolázy či karoxypeptidázy a zabezpečujú syntézu a trojrozmernú
štruktúru peptidoglykánu. Beta-laktamové antibiotika zabezpečujú dlhú životnosť acyl-
enzymatických medziproduktov, ktoré sú zodpovedné za inhibíciu PBP. Toto všetko vedie
nakoniec k zastaveniu tvorby bunkovej steny a zároveň k aktivácií rôznych enzýmov, ktoré
vedú k lýze bunky (obr. č. 1). Pôsobia však vždy len na rastúcu bunku a ich účinnosť je
časovo závislá (Mascaretti et al., 2003; Votava, 2005).

Obrázok č.l: Mechanizmus účinku beta-laktamových antibiotík na peptidoglykán (Wikipedia

[online])

Alariine (L or D)

3.2. Karbapenémy

Karbapenémy sú širokospektrálne beta-laktamové antibiotiká, odolné proti väčšine foriem

beta-laktamáz. Patria k tzv. rezervným antibiotikám, čiže k antibiotikám používaným k liečbe
komplikovaných chorôb vyvolaných multirezistentnými organizmami, kde sú často poslednou
záchranou. Je to z dôvodu predĺženia ich účinnosti a zabráneniu vzniku rezistencie (Edwards
a Betts, 2000).

3.2.1. Štruktúra karbapenémov

Beta-laktamový kruh je zlúčený s päťčlenným kruhom, s variabilnými postrannými

reťazcami. Názov karbapenémov pochádza od termínu uhlík. Je to kvôli tomu, že aj keď je

16
štruktúra veľmi podobná penicilínu, atóm síry (nachádzajúci sa v penicilíne), je nahradený
atómom uhlíka. Zároveň obsahuje oproti penicilínu v kruhu dvojitú väzbu. Na obrázku č.2 sú
vyznačené tieto miesta krúžkom. (Hauser, 2012).

Obrázok č. 2: Štruktúra karbapenémov - číslo 1 značí beta laktamový kruh, zvýraznené

miesta značia rozdiely medzi karbapenémami a penicilínami (Hauser, 2012; prepracované).

Rl

I / \ /
CHg — C H — C H — C H C
I ©I II
0 = C N CH

COOH

Štruktúra karbapenémov je zodpovedná za ich široké spektrum aktivity voči baktériám. Sú

to pomerne malé molekuly, vďaka čomu môžu využívať špeciálne poríny vo vonkajšej
membráne gramnegatívnych baktérií, cez ktoré sa lepšie dostanú k PBP (Hauser, 2012).
Zároveň sú skoro úplne rezistentné voči beta-laktamázam a majú afinitu k veľkému množstvu
PBP. Mechanizmom účinkuje zastavenie bunkovej steny, a následná lýza bunky.

3.2.2. Rozdelenie karbapenémov

V súčasnosti sú v Českej republike k dispozícií tri druhy karbapenémov. Sú to imipenem,

meropenem a ertrapenem (Phoenix, stav k 10.4.2015). Niektoré ďalšie druhy sa nachádzajú
napríklad v Japonsku (doripenem je zaregistrovaný v Japonsku pod obchodným názvom
Finibax) (Legal Force-Trademarkia [online]).
Thienamycín (obr. č.3) je produkovaný Streptomyces cattelya. Je považované za úplne prvé
karbepenémové antibiotikum (Finch et al., 2003). Vďaka jeho veľkej nestabilitě, ale nemohol
byť používaný v lekárskej praxi. Hľadanie stabilnejšieho derivátu thienamycínu, viedlo
k vytvoreniu imipenému. Amidinový derivát thienamycínu - imipenem (obr.č.3), bol oproti
svojmu predchodcovi nielen stabilnejší, ale aj účinnejší. Vyznačuje sa veľkou odolnosťou
prakticky voči všetkým beta-laktamázam. Nevýhodou je, že imipenem je metabolizovaný
v obličkách cicavcov na toxický produkt a to pomocou dehydropeptidázy I. Z tohto dôvodu
musí byť zároveň podávaný s cilastatínom (obr.č.3), ktorý funguje ako protektant obličiek.
Klinické štúdie ukázali, že imipenem s cilastatínom z veľkej časti splnili predpoklady

17
očakávaného laboratórneho úžitku. Niektoré štúdie však dokázali, už pri začiatkoch
používania týchto látok, vznik rezistencie u problémových baktérií, ako je napríklad
Pseudomonas aeruginosa (Norrby et al., 1993; Finch et al., 2003).

Obrázok č.3:thienamycín, imipeném a cilastatín (Finch et al., 2003; Papp-Wallace et al.,

2011; prispôsobené)

thicnamycín imipeném cilastatín

Pridanie 1-beta-methyl substituentu do karbapenémovho kruhu zabezpečilo stabilitu pred

hydrolýzou dehydropeptidázy I v obličkách (Finch et al., 2003). Výsledkom sú antibiotiká:
meropenem, ertapenem, a biapeném.
Meropeném (obr. č.4) vykazuje oproti imipenému menšiu účinnosť proti grampozitívnym
baktériám (tabuľka č.3). Na druhej strane jeho účinnosť proti gramnegatívnym baktériám je
veľmi dobrá a zahrňuje aj baktérie ako Haemophilus influenzae (Finch et al., 2003).
Antimikrobiálna aktivita ertapenému (obr. č.4) voči aeróbnym a anaeróbnym organizmom,
je zrovnateľná s imipenémom (tabuľka č. 3). Klinicky sa používa proti infekciám vyvolaným
gramnegatívnymi bacilami (Wexler et al., 2000). Ertrapeném sa nehodí pre liečbu
nosokomiálnych nákaz a to z dôvodu častej rezistencie (Finch et al., 2003).
Biapeném (obr. č.4) má spektrum účinku približne rovnaké, príp. mierne silnejšie účinky
voči gramnegatívnym aeróbnym baktériám a mierne slabšie účinky voči grampozitívnym
baktériám (Finch et al., 2003).

Obrázok č.4: meropeném, ertapeném, a biapeném, (Finch et al., 2003; Papp-Wallace et al.,
2011; prispôsobené.)

18
 Panipenem/betamipron je karbapenémové antibiotikum používané v Japonsku pod
obchodným názvom Carbenin. Betamipron funguje v tomto prípade ako renálny inhibitor
(Finch et al., 2003).

3.2.3. Použitie karbapenémov

Karbapenémy sa primárne používajú ako záložné liečivá v terapii závažných, často

polymikrobiálnych infekcií. Podávajú sa intramuskulárne, alebo intravenózne (Finch et al.,
2003). Jednotlivé použitie zástupcov karbapenémov sa mierne líši. Je to spôsobené rozdielmi
viazania PBP a tým aj rozdielnym spektrom účinku (Hammond, 2004). Aktivitu jednotlivých
zástupcov karbapenémov proti bežným bakteriálnym patogénom vyjadruje tabuľka (č.3).

Tabuľka č.3: Aktivita jednotlivých zástupcov karbapenémov, proti bežným

bakteriálnym patogénom: M I C , minimálna inhibičná koncentrácia, (mg/l), (prebraté z

Finch et a l . , 2003).

Organizmus Ertrapenem Imipenem Meropenem

S. aureus{MSSA) 0,12 0,03 0,12
S. aureus (MRSA) 2,0 0,5 2,0
S. pyogenes <0,03 <0,01 <0,01
S. pneumoniae
penicilin-citlivy <0,03 0,008 0,008
penicilin-
rezistentny 1,0 0,03 0,12
E. faecalis 16 1,0 4,0
H. influenzae <0,03 1,0 0,06
Neisseria spp. <0,03 <0,25 <0,03
E. coli <0,03 0,12 0,03
K. pneumoniae <0,03 <0,25 0,03
P. aeruginosa 4,0 4,0 4,0
B. fragilis 0,25 0,25 0,12

19
4. REZISTENCIA NA ANTIBIOTIKA

Rezistencia na antibiotiká sa stáva čoraz väčším problémom v terapií. Je to vlastne

schopnosť baktérie odolávať pôsobeniu antibiotika. Neexistuje však presný výklad tohto slova
z viacerých dôvodov. Prvým dôvodom je možná definícia rezistencie z klinického, alebo
biologického stanoviska. Druhým dôvodom je rozdielne zaradenie baktérií ako rezistentných,
či citlivých vjednotlivých krajinách, ktoré sa hodnotia na základe M I C (Finch et al., 2003).
Svetová organizácia W H O definuje rezistenciu voči antimikrobiálnym látkam ako odolnosť
bakterií proti antimikrobiálnym látkam, ktoré boli naň určené (WHO [online]).
Niektoré mikrobiálne druhy sú primárne rezistentné voči niektorým antibiotikám. Táto
schopnosť je daná druhom mikroorganizmu a jeho vlastnosťami (Votava, 2005). Sekundárna
rezistencia sa týka baktérií, ktoré boli prirodzene citlivé a v dôsledku mutácie sa stali
rezistentnými. Takáto mutácia sa dedí z potomstva na potomstvo a je výsledkom vývojového
procesu (Schindler, 2014). Rezistenciu na antibiotikum však môže baktéria získať aj od inej
baktérie.
Kmene rezistentné na antibiotikum, dokážu v jeho prítomnosti prežívať a vďaka pôsobeniu
antibiotika na citlivú populáciu, čoskoro prerastú vnímavú populáciu (Votava, 2005). Toto sa
často deje v nemocničných zariadeniach, kde je spotreba antibiotík naozaj vysoká. Korelácia
rezistencie a stúpajúceho výskytu nemocničných infekcií a s tým spojené zvýšené náklady na
liečebnú starostlivosť sú hlavnými dôvodmi, prečo je rezistencia k antibiotikám jednou
z priorít výskumu a praxe verejného zdravotníctva (Schindler, 2014).

4.1. Obecné mechanizmy rezistencie

Jednotlivé mikroorganizmy majú svoje vlastné špecifické mechanizmy, vďaka ktorým

vznikne rezistencia na antibiotikum. Existujú štyri mechanizmy vďaka ktorým dokáže
baktéria obísť účinok antibiotík. A to sú: zmena cieľového miesta, aktívne odčerpanie
antibiotika z bunky, zhoršený prienik antibiotika do bunky a bakteriálne enzýmy.

20
4.1.1. Zmena cieľového miesta a zhoršený prienik antibiotika do bunky

Tento mechanizmus je založený na zmene molekuly, kde pôsobí antibiotikum. Takáto

rezistencia je známa hlavne pri baktériách rezistentných na makrolidy, linkosamidy, či beta-
laktamy (Votava, 2005).
Jedná sa o rôzne molekuly esenciálne pre život baktérie. Príkladom môžu byť PBP, ktoré sú
dôležité pri raste a obnove bakteriálnej steny. Každá baktéria má niekoľko takýchto
väzobných proteínov. Aj malá alternácia v molekule PBP, alebo znížená afinita PBP môže
viesť k neúčinnosti antibiotika (Finch et al., 2003).
Ďalším príkladom je rezistencia na aminoglykosidy, ktorá môže byť spôsobená alternáciou
v špecifických ribozomálnych väzobných proteínoch, alebo rezistencia na rifampicín, ktorej
vznik závisí od modifikácie R N A polymerázy (Finch et al., 2003).
Antibiotiká môžu byť prenesené do bunky pomocou porínov, difúziou cez dvojitú vrstvu
fosfolipidov, alebo vďaka podpornému vychytávaniu. To, ktorou z možností to bude, záleží
od ich chemického zloženia (Votava, 2005). Zhoršený prienik antibiotika do bunky a s ňou
spojená rezistencia, je zvlášť dôležitá u gramnegatívnych baktérií. Tieto baktérie majú síce
tenšiu stenu oproti grampozitívnym baktériám, ale oveľa zložitejšiu. Je tvorená
peptidoglykánom a vonkajšou membránou, ktorá je dôvodom ťažšieho preniknutia do bunky.
Tento mechanizmus bol popísaný u aminoglykosidov, tetracyklínov a chinolínov (Votava,
2005).

4.1.2. Aktívne odčerpanie antibiotika z bunky

Ďalšou možnosťou rezistencie u baktérií je aktívne odčerpanie (eflux) antibiotika z bunky.

Takýto mechanizmus rezistencie poznáme u antibiotík, ako sú aminoglykosidy, tetracyklíny,
či chinolóny (Votava, 2005).
Množstvo bakteriálnych efluxných púmp, patriacich do rodiny sekundárnych prenášačov,
dokáže sprostredkovať aktívny transport toxických látok z cytoplazmy do vonkajšieho okolia
bunky. Tieto pumpy sú všade prítomné proteiny, nachádzajúce sa v cytoplazmatickej
membráne, vo všetkých typoch buniek, od baktérií až po eukaryoty (Van Bambeke et al.,
2003).

21
 4.1.3. Bakteriálne enzýmy

Jednou z ďalších možností ochrany baktérií pred účinkom antibiotík je tvorenie špeciálnych
enzýmov, ktoré dokážu modifikovať alebo rozkladať molekulu antibiotika (Finch et al.,
2003).

4.2. Beta-laktamázy

Rezistencia na beta-laktamové antibiotika bola známa ešte pred objavením penicilínu. V

roku 1940 Abraham a Chain prvýkrát popísali bakteriálny enzým, schopný znemožniť účinok
penicilínu. Nazvali ju penicilináza, keďže beta4aktamová štruktúra penicilínu nebola ešte
v tej dobe známa (Mascaretti et al., 2003). Toto zistenie viedlo k všeobecným obavám
a neskôr aj k vývoju širokospektrálneho penicilínu a cefalosporínu, ktoré zostali v popredí
antibakteriálnej liečby, až pokiaľ nezačali beta4aktamázy predstavovať vážny problém
(Medeiros, 1997).
Beta4aktamázy sú špecifické enzýmy výhradne produkované baktériami. Tieto enzýmy
hydrolyzujú beta4aktamové antibiotiká, vďaka čomu sa beta4aktamový kruh nemôže
naviazať na PBP (Finch et al., 2003). Beta4aktamázy sú uvoľňované do periplazmatického
priestoru u gramnegatívnych bakterií, alebo do vonkajšieho prostredia u grampozitívnych
baktérií. Nomenklatúra beta4aktamáz je veľmi rôznorodá a neodráža bežné, zaužívané
pravidlá. Často sú názvy odvodené od látky, ktorú hydrolyzujú (CARB, O X A , JJVIP), alebo na
základe ich biochemických vlastností (SHV). Iné dostali svoje pomenovanie na základe
baktérie ktorá ich produkuje, nemocníc kde boli objavené, alebo pacientov od ktorých boli
izolované (Mascaretti et al., 2003).

Inhibitory beta-laktamáz

S rozšírenosťou beta4aktamáz sa začali vyvíjať látky na potlačenie ich účinku. V dnešnej

klinickej praxi je veľmi dôležité, aby pri preukázaní produkcií beta4aktamáz u baktérie boli
zároveň pacientovi podávané aj látky potlačujúce účinok beta4aktamáz. Medzi
najrozšírenejšie inhibitory beta4aktamáz patria sulbaktam, kyselina klavulanová a tazobaktam
(Votava, 2005). Zmienené inhibitory pôsobia hlavne na molekulárnu triedu A beta4aktamáz.
Voči štruktúrne odlišným beta-metalo4aktamázam sú prakticky neúčinné. Proti tomuto typu,

22
beta-laktamázam z molekulárnej triedy B , sa používajú ako inhibitory chelátory kovových
iontov (EDTA) (Song et al., 2015 ).

Klasifikácia beta-laktamáz

Rozšírenosť beta-laktamáz potrebovala funkčné rozdelenie, ktoré by efektívne odrážalo ich

sekvenčnú heterogenitu. Beta-laktamázy boli rozdelené na základe ich funkcie, fyzikálnych
vlastností, ale aj na základe genetickej lokalizácií na plazmide, alebo na chromozóme
(Mascaretti et al., 2003). Najviac rozšírené sa stalo Amblerovo rozdelenie, založené na
aminokyselinových sekvenciách. Pôvodne obsahovalo len dve skupiny: A a B. Dnes zahrňuje
už štyri (Ambler et al., 1991). Jedná sa o triedu A , C, D, ktoré obsahujú serín v aktívnom
mieste a triedu B, ktorá je závislá na zinku (Mascaretti et al., 2003).
Ďalšie možné rozdelenie je Bushovo-Jacobyho-Madeirovo, ktoré rozdeľuje prirodzene sa
vyskytujúce bakteriálne izoláty do štyroch skupín na základe substrátu a inhibítora. Prvá
skupina obsahuje cefalosporinázy, ktoré nie sú dobre inhibované kys. klavunulovou. Skupina
číslo dva obsahuje beta-laktamázy, ktoré sú touto kyselinou dobre inhibované. Tretia skupina
obsahuje špecifickú skupinu metalo-beta-laktamáz a štvrtá skupina zahŕňa malú skupinu
penicilináz, ktoré nie sú dobre inhibované kyselinou klavunulovou. Problém v klasifikácií
nastáva, vďaka čoraz rýchlejšiemu pribúdaniu stále nových karbapenemáz a produkcií
širokospektrých beta-laktamáz E S B L (Mascaretti et al., 2003).

5. M E C H A N I Z M U S REZISTENCIE K U K A R B A P E N É M O M

Mechanizmus rezistencie ku karbapenémom zahŕňa produkciu beta-laktamáz, efluxné

pumpy a mutácie, ktoré ovplyvňujú expresiu, alebo funkciu porínov a penicilín väzobných
proteínov. Kombinácie týchto mechanizmov vedú k mnohočetným rezistenciám, nielen ku
karbapenémom, ale aj k beta-laktamom ako takým.
Jednotlivé mechanizmy rezistencie voči karbapenémom sa u jednotlivých typov baktérií
líšia. U grampozitívnych baktérií je častý spôsob rezistencie voči karbapenémom popísaný
zmenou sekvencie PBP, príp. vďaka obstaraniu úplne nových PBP, ktoré sú rezistentné voči
pôsobeniu karbapenémom. Príkladom môže byť zástupca S. aureus (Koga et al., 2009).

23
 Gramnegatívne baktérie využívajú ako spôsob rezistencie produkciu beta-laktamáz, efluxné
pumpy, pri p. alternácie v PBP.

5.1. Karbapenemázy

Beta-laktamázy ovplyvňujúce účinok karbapenémov, sa nazývajú karbapenemázy. Nie však

všetky skupiny beta-laktamáz sú automaticky aj karbapenemázamy. Skupina molekulárnej
triedy C podľa Amblera, alebo jedna podľa Busha, nemá karbapenemázovú aktivitu. Avšak
karbapenémová rezistencia u klinických izolátov P. aeruginosa zahrňuje často rôzne
kombinácie porínových, či efluxných mechanizmov s produkciou tejto skupiny beta-laktamáz
(Quale et al., 2006). Genetická informácia pre tieto enzýmy je kódovaná chromosomálne a je
pozorovateľná v baktériách ako Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., alebo
Morganella spp. Dokážu hydrolyzovať veľké množstvo beta-laktamových antibiotík,
zahrňujúcich cefamycíny, či cefalosporíny, ale nie karbapenémy (Mascaretti et al., 2003).

5.1.1. Karbapenemázy molekulárnej triedy A

Atribútom beta-laktamáz triedy A , je prítomnosť disulfidovej väzby medzi Cys69 a Cys238

(Ambler et al., 1991). Sú z veľkej časti kódované plazmidami a sú veľmi rozšírené medzi
grampozitívnymi a gramnegatívnymi baktériami. Všetky majú schopnosť hydrolyzovať
širokú škálu beta-laktamov, vrátane karbapenémov, cefalosporínov, penicilínov, či
aztreonamu. Zároveň sú všetky inhibované kyselinou klavunulovou a tazobaktamom, čo sa
veľmi často využíva vo fenotypových testoch. Mechanizmus účinku spočíva v štiepení
cyklickej amidovej väzby. To zahŕňa nukleofilnú adíciu na hydroxilovú skupinu serínu a na
karbonylový uhlík. V závere dochádza k tvorbe tetraedrického medziproduktu, ktorý sa
nakoniec zrúti na acyl-enzýmový medziprodukt (Mascaretti et al., 2003).
Jedným z poddruhov beta-laktamáz zo skupiny A , sú enzýmy K P C . Názov beta-laktamáz
K P C je odvodený od baktérie Klebsiella pneumoniae (z angl. Klebsiella pneumoniae
carbapenemase). Prvý zástupca K P C rodiny bol popísaný v roku 1996 v U S A . Gén bla -\ WC

poskytoval rezistenciu proti viacerým druhom karbapenémom (imipenem, meropenem), ale

taktiež proti cefalosporínom, či monobaktamom (aztreonam) (Yigit et al., 2001). Dnes už je
známych aspoň 22 typov K P C a bolo zaznamenaných veľa druhov baktérií, z viacerých krajín
sveta, ktorých rezistencia ku karbapenémom je založená na tomto spôsobe (Lahey [online]).
24
 Ďalšou skupinou beta-laktamáz zo skupiny A , je rodina GES/IBC, ktorá bola prvý krát
zaznamenaná u Enterobacter cloacae (GES-1) a u K. pneumoniae z Francouzské Guyany
(IBC-1, neskôr známa ako GES-7) (Giakkoupi et al., 2000; Poirel et al., 2000a). Gény
zabezpečujúce expresiu enzýmov GES/IBC, ale aj vyššie spomínaného enzýmu K P C , sú často
identifikované na plazmidoch. Enzýmy GES-1 a IBC-1 sú si veľmi podobné. Odlišnosť je len
v niekoľkých substitúciách. S ostatnými beta-laktamázami sú si však veľmi málo príbuzné
(Delbrück et al., 2012). Dnes už bolo rozpoznaných aspoň 26 typov enzýmov beta-laktamáz
GES/IBC (Lahey [online]).
Beta-laktamázy zo skupiny A , môžu byť okrem kódovania na plazmidoch, kódované aj na
chromozómoch. K tejto skupine môžeme zaradiť skupiny enzýmov S M E , NmcA
a z prevažnej väčšiny aj IMI. Beta-laktamáza typu SME-1, inak aj Serratia marcescens
enzým, bola po prvý krát izolovaná od dvoch izolátov S. marcescens (Yang et al., 1990; Naas
et al., 1994). Izoláty baktérií produkujúcich S M E z rôznych krajín sveta, sa od seba líšia
(Queenan et al., 2006). Databáza lahey uvádza 5 typov S M E (Lahey [online]). Doteraz
prevláda názor, že výskyt S M E je len v rámci druhu S. marcescens. Enzým NmcA (z angl.,
Non-metallo-carbapenemase-A) bol prvýkrát popísaný u E. Cloacae vo Francúzsku
(Nordmann et al., 1993) a jeho podobnosť s enzýmom S M E bola dokázaná viacerými testmi
(Naas et a l , 1994).
Molekulárna trieda PMI (imipenem hydrolizujúce beta-laktamázy) a NmcA sú z 97%
totožné s skupinou S M E (Naas et al., 1994). Mobilita génu blami je však sporná. Avšak u
kmeňa E. cloacae izolovaného v Cíne, bol gén kódujúci tento enzým identifikovaný na
plazmide (Yu et al., 2006). Dnes už je známych prinajmenšom 9 typov PMI (Lahey [online]).

5.1.2. Karbapenemázy molekulárnej triedy B

Skupinu molekulárnej triedy B , zahŕňajú metalo-beta-laktamázy. Všetci jej známi

zástupcovia majú dve konzervované kov-viažuce miesta a vyžadujú ióny zinku ako
enzymatické kofaktory. Takto katalyzujúca hydrolýza beta-laktamových antibiotík robí
zodpovedajúce kmene baktérií rezistentné ku všetkým beta-laktamovým antibiotikám
(Mascaretti, 2003).
Prvá metalo-beta-laktamáza bola popísaná na organizme Bacillus cereus. Vďaka
potrebnému kofaktoru v podobe zinku, viedla identifikácia zinku k odlíšeniu metalo-beta-
laktamázy (Kuwabara a Abraham, 1967). Nasledoval nález ďalších metalo-beta-laktamáz

25
závislých na zinku, ako boli metalo-beta-laktamázy u baktériae Aeromonas spp. (Iaconis a
Sanders, 1990), alebo metalo-beta-laktamázy u Pseudomonas maltophilia, dnes už nazývaná
Stenotrophomonas (Saino et al., 1982). V roku 1991 bola v Japonsku prvýkrát zaznamenaná
prenosná rezistencia na imipenem, vďaka metalo-beta-laktamázam u Pseudomonas
aeruginosa (Watanabe et al., 1991).
Rozdelenie metalo-beta-laktamáz na podskupiny predstavuje problém. Skutočná výška
rozmanitosti medzi metalo-beta-laktamázami je v súčasnej nomenklatúre podhodnocovaná.
Skupina metalo-beta-laktamáz je síce odlišná od ostatných skupín beta-laktamáz, ale je
rozdielna aj medzi sebou. Preto ju rozdeľujeme ešte v rámci skupiny. A to na B I , B2 a B3.
Podskupina B I a B 2 vykazuje podobnosť, zatiaľ čo podskupina B3 sa výrazne líši (Hall a
Barlow, 2005). Najrozšírenejšie metalo-beta-laktamázy, spadajú do podskupiny B I . Patria
sem VĽV1, ĽVIP, N D M . Enzýmy SPM, GĽVI, DĽVI, či K H M patria vo svete k menej
rozšíreným. Ich výskyt je hlásený len v určitej oblasti.
V I M enzým, z angličtiny Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase, bol prvý krát
izolovaný v talianskej Veroně v roku 1997. Gén pre VIM-1 enzým bol nájdený u P.
aeruginosa, po enormnom vzostupe rezistencií na karbapenémy v univerzitnej nemocnici.
Tento gén bol identifikovaný na génovej kazete integrónu 1. triedy (Lauretti et al., 1999).
O rok neskôr bol vo Francúzsku nahlásený enzým VIM-2, ktorý bol vyizolovaný z P.
aeruginosa (Poirel et al., 2000b) Dnes, práve gén pre tento enzým, je najrozšírenejší zo
všetkých V I M variant. Rezistencia vďaka tomuto typu enzýmu je hlásená od veľa druhov
baktérií, ako je napríklad Acinetobacter baumannii (Tsakris et al., 2006), Escherichia coli
(Scoulica et al., 2004), alebo K. pneumoniae (Barbarini et al., 2015). Dnes už je známych
približne 46 typov enzýmu V I M (Lahey [online]).
Prvý záznam o enzýme IMP-1 pochádza z Japonska z roku 1991, z kmeňa P. aeruginosa
rezistentného k imipenému. Gén pre enzým ĽVIP-1 bol nájdený na konjugatívnom plazmide
pMS350 (Watanabe et al., 1991). Dnes už poznáme prinajmenšom 50 variant enzýmu ĽVIP
(Lahey [online]), ktoré sú rozšírené po celom svete (Watanabe et al., 1991; Tysall et al., 2002;
Jeannot et al., 2012; Shigemoto et al., 2012).
Ďalším typom metalo-beta-laktamáz, je enzým N D M , z angličtiny New Dehli metallo-beta-
lactamase. Tento typ M B L bol vyizolovaný z K. pneumoniae v Indii od švédskeho pacienta,
ktorý cestoval do Indie (Yong et al., 2009). Odvtedy je zaznamenané rozšírenie tejto metalo-
beta-laktamázy do celého sveta a do viacerých zástupcov baktérií. Je známych prinajmenšom
16 typov tohto typu enzýmu (Lahey [online]). Význam enzýmu N D M je značný. Zdá sa

26
možná expozícia N D M - 1 životným prostredím. Walsh a kol. analyzovali vzorky verejnej
vody po celom New Dehli. Vzorky boli pozitívne na gén WÖNDM-I v 4 % vzorkách pitnej a v
30% vzorkách presakujúcej vody. Tiež bola dokázaná prítomnosť génu WÖNDM-I vo vzorkách,
u jedenástich druhov baktérií (Walsh et al., 2 0 1 1 ) .
Enzým GIJVI bol prvýkrát vyizolovaný v Nemecku a to až od piatich rôznych pacientov,
v jednej Dúseldorfskej nemocnici. Získaná M B L bola identifikovaná u P. aeruginosa,
expresiou génu nájdeného na plazmide v rámci 1. triedy integrónu (Castanheira et al., 2004).
V roku 2 0 1 4 sa po prvý krát podarilo dokázať produkciu GIM-1 aj u Acinetobacter pittii
(Kaase et al., 2 0 1 4 ) . Zdá sa, že rezistencia vďaka GIJVI má obmedzený výskyt iba v Nemecku.
Z iných zemí výskyt zatiaľ hlásený nebol. Databáza lahey uvádza 2 typy GUVI enzýmov
(Lahey [online]).
Prvá identifikácia S P M (z angl. Sao Paulo metallo-beta-lactamase), prebehla u P.
aeruginosa vyizolovanej z pacienta trpiaceho leukémiou v Brazílií. Genetické analýzy génu
zodpovedajúceho za expresiu enzýmu SPM-1, dokázali nízky obsah GC párov na hladine. To
svedčí o poznatku, že enzým SPM-1 pôvodne nepochádza od P. aeruginosa, pretože jeho
zastúpenie GC párov na hladine je nižšie, ako by sa čakalo (Toleman et al., 2 0 0 2 ) .
Izolát Citrobacter freundii pochádzajúci z Japonska, bol pozitívny na nový typ enzýmu,
ktorý bol vtedy pomenovaný ako Kyorin health science M B L 1, v skratke K H M - 1 . Genetické
analýzy ukázali, že enzým pôvodne nepochádza z C. freundii, ale naznačujú pôvod u Vibrio
parahaemolyticus (Sekiguchi et al., 2 0 0 8 ) .
Enzým DPM z Pseudomonas stützen, bol po prvý krát popísaný u holandského pacienta
v roku 2010. Po viacerých analýzach bol popísaný tento enzým, ako nový typ a nazvaný DIVÍ.
Na úrovni aminokyselinovej sekvencie je táto M B L najviac podobná GPM-1 ( 5 2 %) a UvIP-1
(45%) (Poirel et a l , 2 0 1 0 ) .
Ďalšie geograficky menej rozšírené metalo-beta-laktamázy sú SPM-1, izolovaná u A.
baumannii v Kórei (Lee et al., 2 0 0 5 ) , SMB-1 nájdená u Serratia marescens v Japonsku
(Wachino et al., 2 0 1 1 ) , T M B - 1 izolovaná v Líbii u Achromobacter xylosoxidans (El Salabi et
al., 2 0 1 2 ) , a FIM-1 izolovaná v Taliansku (Pollini et al., 2 0 1 2 ) .

5.1.3. Karbapenemázy molekulárnej triedy D

Skupina D bola stanovená až v roku 1980. Často sú nazývané ako oxacilín hydrolyzujúce
enzýmy, vďaka ich schopnosti hydrolyzovať oxacilín. V aktívnom mieste obsahujú serín,

27
rovnako ako beta-laktamázy A a C. Prvá O X A beta-laktamáza s karbapenamázovou aktivitou
bola popísaná až v roku 1993. Jednalo sa o OXA-23, izolovanou v Škótsku u A. baumannii
(Paton et al., 1993). O X A beta-laktamázy sú rozšírené celosvetovo a boli popísané
u viacerých druhov batérii. Napríklad u zástupcu čeľade Enterobacteriaceae a P. aeruginosa
(Mascaretti et al., 2003). Hydrolýza karbapenémov pomocou tejto skupiny je poväčšine slabá
a z toho dôvodu je často doplnená ostatnými mechanizmami rezistencie (Héritier et al., 2005).
V súčasnej dobe bolo identifikované veľké množstvo O X A beta laktamáz a boli
identifikované po celom svete. Príkladom môže byť nájdenie OXA-23 u A. baumannii v
Kórei (Jeon et al., 2005), alebo v Brazílií (Dalla-Costa et al., 2003). Jedným z dôležitých
enzýmov O X A beta-laktamáz, je OXA-58, ktorý bol originálne izolovaný od A. baumannii vo
Francúzku (Héritier et al., 2005). V epidemiológií má však najväčší význam enzým OXA-48.
V súčasnej dobe je známych najmenej 5 variant odvodených od enzýmu OXA-48. Známe
sú napríklad OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-204, alebo OXA-232. OXA-48 bola
originálne identifikovaná u organizmu K. pneumoniae v Turecku (Poirel et al., 2004). O X A -
163, ako jedna varianta OXA-48, bola po prvý krát identifikovaná u izolátov K. pneumoniae a
E. cloacae v Argentíne (Poirel et al., 2011b). OXA-181 bola zase pôvodne identifikovaná u
Enterobacteriaceae v Indií (Castanheira et al., 2011).

5.1.4. Výskyt karbapenemáz v Českej republike

Výskyt karbapenemáz v Českej republike je sporadický, väčšinou výsledkom importu

z iných krajín. Prvá metalo-beta-laktamáza v Českej republike bola zaznamenaná u P.
aeruginosa. Išlo o karbapenemázu IMP-7 (Hrabák et al., 2009a). Onedlho na to prišli správy
aj o identifikácií VEVI na území Českej republiky. Jednalo sa o enzým VEVI-1 a VIM-4
izolovaného z K. pneumoniae (Hrabák et al., 2011).
Prvá baktéria produkujúca K P C v Českej republike bola K. pneumoniae. Jeden izolát
produkujúci KPC-3, bol získaný od pacienta v nemocnici v Prahe, predtým hospitalizovaného
v Taliansku. Druhý import bol zaznamenaný od pacienta z Grécka a jednalo sa o KPC-2
(Hrabák et al., 2011). A. baumannii rezistentný ku karbapenémom v dôsledku tvorby NDM-1
a OXA-23, bol importovaný do Českej republiky z Egypta (Nemec et al., 2011). Prvá
produkcia karbapenemázy OXA-23, pri ktorej sa nejedná o import, pochádza z roku 2012 a
bola zachytená v nemocnici v Olomouci (Šenkýřiková et al., 2012). NDM-4 bola po prvý krát
identifikovaná na území Českej republiky u E. cloacae od pacientky predtým hospitalizovanej

28
na Srí Lanke (Studentova et al., 2013).V roku 2008 bola tiež u tohto typu baktérie popísaná
rezistencia proti karbapenémom vďaka zvýšenej expresií blaoxA-51 (Nemec et al., 2008).
Predpokladá sa spojitosť medzi týmto typom beta-laktamázy izolovanej v Českej republike
a enzýmom izolovaným v Poľsku (Izdebski et al., 2012). Toto všetko viedlo k navrhnutiu
odporúčaní, ktoré český vedec Hrabák a jeho kol., uvádza ako úspešné pri stabilizácií, či
znížení incidiencie výskytu karbapenemáz v Českej republike u Enterobacteriaceae (Hrabák
et al., 2013).

5.2. NEENZYMATICKÁ REZISTENCIA K U KARBAPENÉMOM

5.2.1. Efluxné pumpy

Jednou z možností pre baktériu, ako sa vyhnúť účinku niektorých druhov karbapenémov, je
nadmerná expresia efluxných púmp. Efluxné pumpy sú klasifikované do viacerých rodín
(obr.č.5).
Efluxné pumpy, ktoré sú zodpovedné za rezistenciu voči karbapenémom, patria do rodiny
RND, z angličtiny resistence-nodulation-cell division (obr. č.4.). Ich funkcia je asociovaná so
špeciálnymi proteínmi na vonkajšej membráne a s membránovými fúznymi proteínmi. Takto
tvoria transportný systém spájajúci vonkajšiu a vnútornú membránu, ktorý im dovoľuje
prenášať karbapenémy priamo z cytoplazmy, alebo periplazmatického prostredia do
vonkajšieho prostredia (Finch et al., 2003). Často sa jedná o dvojzložkové, alebo trojzložkové
systémy. V štúdií z roku 2009 u baktérie Acinetobacter spp., sa ukázal význam rezistencie ku
karbapenémom práve vďaka trojzložkovému systému AdeABC a dvojzložkového systému
AdeRS a ich vzájomnej kombinácií s enzýmami O X A (Wong et al., 2009). Héritier a jeho kol.
tiež potvrdili prispenie AdeABC v rezistencií ku karbapenémom a to hlavne v súčinnosti
O X A enzýmov (Héritier et al., 2005).
Ďalšou vhodnou kombináciou tohto typu rezistencie je kombinácia s vonkajšími
membránovými proteínmi. Známy systém púmp je MexAB-OprM, popísaný u baktérie P.
aeruginosa (Bonomo a Szabo, 2006). U tohto typu organizmu popísal rezistenciu vďaka
efluxným pumpám aj Köhler s jeho tímom (Köhler et al., 1999). V roku 1999 zaznamenal
Ochs s jeho tímom rezistenciu k imipenému ameropenému, spôsobenú zvýšenou expresiou
Mexx-OprN, doplnenú zníženou expresiou OprD (Ochs et al., 1999). Toto všetko dokazuje,

29
že efluxné pumpy, ako mechanizmus rezistencie, je účinný až po doplnený iným
mechanizmom rezistencie (Chau et al., 2004).

Obrázok č. 5: Schématické porovnanie piatich rodín efluxných púmp (prevzaté z

Piddock,2006)
RND
Family

5.2.2. Mutácie v PBP

Mutácie v PBP, príp. znížená expresia PBP, môže tiež viesť k tvorbe fenotypov
rezistentných na karbapenémy. PBP katalyzujú konečný stupeň polymerácie a zosietenie
peptidoglykanu. Medzi hlásené rezistencie ku karbapénemom vďaka zmene PBP, patria
napríklad štúdie z Nemecka (Gehrlein et al., 1991), alebo Španielska popísané u A.
baumannii (Fernandez-Cuenca et al., 2003). Fernandez-Cuanca a jeho kol. analyzovali A.
baumannii a študovali princíp rezistencie podmienený penicilín väzobnými proteínmi.
Dokázali prispenie rezistencie ku karbapenémom aj vďaka PBP, ale hlavne dôležitosť
doplnenia rezistencie PBP aj s inými mechanizmami. Či už s prítomnosťou oxacilináz, alebo
dôležitou zmenou, či neprítomnosťou vonkajších membránových proteínov.
Jedným z ďalších príkladov rezistencie vďaka PBP, môže byť baktéria Próteus mirabilis:
Znížená afinita jedného druhu PBP (PBP2) u P. mirabilis, zapríčinila zníženú citlivosť, či
rezistenciu ku karbapenémom (Neuwirth et al., 1995). Mechanizmus substitúcie, príp. výroby
úplne nového PBP, bol popísaný aj u S. aureus (Katayama et al., 2004).

30
5.2.3. Poríny

Veľa antibiotík je hydrofilnej povahy a to predstavuje problém pre vstup antibiotík hlavne u
gramnegatívnych baktérií, ktoré obsahujú zložitú vonkajšiu membránu. Vonkajšia membrána
pôsobí ako selektívna bariéra vďaka kombinácií vysoko hydrofóbnej lipidovej dvojvrstvy,
ktorá je posiata špecifickými porínmi. Antibiotiká preto využívajú rôzne druhy proteínov
k prechodu cez vonkajšiu membránu. Tieto proteiny nesú názov OMP, z angličtiny outer
membráne proteins a sú dôležitým miestom bránenia sa baktérií voči antibiotikám.
Substitúcie, či zníženie expresie špecifických porínov, môžu viesť k zníženiu, či úplnému
neúčinku karbapenémov. Často je tento mechanizmus rezistencie doplňovaný efluxnými
pumpami, alebo tvorbou karbapenemáz (Finch et al., 2003; Votava, 2005).
Tento typ rezistencie bol zaznamenaný najprv u baktérie P. aeruginosa. Izolácia kmeňa
rezistentného na imipeném ukázala dôležitú úlohu OprD, pri priepustnosti imipenému (q et
al., 1989). Neskoršie štúdie preukázali skutočnosť, že OprD porín je dôležitý pre absorpciu
základných aminokyselín a peptidov, ktoré zdieľajú štrukturálnu podobnosť s molekulou
karbapenému (Trias a Nikaido, 1990). Dôležitosť OMP pri rezistencií na karbapenémy, bola
dokázaná aj u Enterobacter spp., alebo E. coli. Karbapenémy využívajú práve OmpF a OmpC
k vstupu do týchto baktérií. Strata, alebo znížená expresia týchto porínov, či už OprD, alebo
OmpF a OmpC, často vedie k rezistencií na dané antibiotikum a vďaka skríženej rezistencií aj
na ostatné antibiotiká (Finch et al., 2003).
Neskoršie izolácie rôznych baktérií potvrdili dôležitosť tohto typu rezistencie
na karbapenémové antibiotiká. Quale a jeho tým izolovali baktériu A. baumannii rezistentnú
na karbapenémy. Príčina rezistencie bola zapríčinená zníženou expresiou 47-, 44-, a 37- kDa
vonkajších membránových proteínov (Quale et al., 2003). Podobne aj Clark našiel zníženú
expresiu 33- a 36- kDa proteínov u A. baumannii rezistentnej na imipeném (Clark, 1996). Bou
a jeho tým zaznamenal rezistenciu vďaka OMP, ktorý fungoval ako doplnkový mechanizmus
ku produkcií O X A beta-laktamáz (Bou et al., 2000). Ako aj u ostatných neenzymatických
mechanizmov rezistencie, tak aj pri porínovej rezistencií je často dôležité doplnenie tohto
mechanizmu rezistencie, inými.

31
6. KARBAPENEMÁZY U VYBRATÝCH PATOGÉNOV

6.1. P. aeruginosa

P. aeruginosa je významným podmieneným patogénom. Je častým pôvodcom

nemocničných, ale aj primárnych infekcií. Jedná sa o gramnegatívnu tyčku, ktorá stojí za
vznikom rôznych kožných infekcií, infikuje popálené plochy a tiež často vyvoláva infekcie
urogenitálneho, či respiračného traktu. Osobitnú úlohu hrá aj u komplikovaných pľúcnych
infekciách u pacientov s cystickou fibrózou (Votava, 2006; Schindler, 2014). Rastúci počet
prípadov rezistencie tejto baktérie spôsobuje čoraz väčšie problémy v terapii.
Princíp karbapenémovej rezistencie u P. aeruginosa zahŕňa nízku priepustnosť vonkajšej
membrány, stálu tvorbu rôznych efluxných púmp a produkciu beta4aktamáz. Častý je vznik
rezistencie pomocou produkcie VJJVI enzýmu, ktorá je veľmi často hlásená práve u tejto
baktérie (Lauretti et al., 1999; Poirel et al., 2000b) a pomocou produkcie enzýmu JJVIP
(Watanabe et al., 1991; Jeannot et al., 2012). Rezistencia ku karbapenémom v dôsledku
produkcie beta4aktamázy G I M , bola po prvý krát popísaná v Nemecku, práve u P.
aeruginosa (Castanheira et al., 2004). Ďalšia známa je produkcia metalo-beta4aktamázy S P M
(Toleman et al., 2002). Z beta4aktamáz zo skupiny A , je popísaná rezistencia pomocou
produkcie enzýmov K P C , alebo GES (Villegas et al., 2007; Iraz et al., 2014). Zo skupiny
oxacilín hydrolyzujúcich enzýmov, sú známe enzýmy OXA-2, alebo OXA-10, ktoré primárne
radíme medzi beta4aktamázy širokého spektra. Avšak niektoré štúdie potvrdzujú u nich
karbapenemázovú aktivitu (Bert et al., 2002).

6.2. A. baumannii

Multirezistentný A. baumannii je významným pôvodcom infekcií u pacientov

nachádzajúcich sa v nemocničnej starostlivosti. Je to gramnegatívny kokobacil, ktorý je často
vyizolovaný od osôb s popáleninami, alebo od osôb trpiacich zníženou imunitou (Votava,
2006).
Vznik multirezistentných kmeňov A. baumannii má viacero dôvodov. Po prvé je to tým, že
má schopnosť veľmi rýchlo získať potrebné gény pre antibiotickú rezistenciu (Metzgar et al.,
2004). Tiež je to tým, že dokáže produkovať beta4aktamázy zo skupiny D a zároveň je táto
baktéria schopná vykazovať rezistenciu ku karbapenémom aj vďaka kombinácií rôznych

32
iných systémov. Jednotlivé mechanizmy často kombinuje so zníženou produkciou
špecifických porínov (Limansky et al., 2002) a produkciou efluxných púmp (Martinez-
Martinez et al., 2013). Kombinácia jednotlivých mechanizmov rezistencie vedie k
vývinu multirezistených kmeňov A. baumannii. Najdôležitejším typom rezistencie ku
karbapenémom je však produkcia beta-laktamáz triedy A a B. V roku 2011 bola tiež po
prvýkrát izolovaná u tohto organizmu produkcia GES-1, beta-laktamázy zo skupiny A
(Shahcheraghi et al., 2011). Z metalo-beta-laktamáz, je známa rezistencia napríklad pomocou
produkcie enzýmu N D M (Nemec et al., 2011), alebo produkcie enzýmu V I M . Gén blavm-i
bol po prvýkrát u tohto organizmu izolovaný v Grécku (Tsakris et al., 2006). Ďalšia známa
tvorba karbapenemáz, je produkcia metalo-beta-laktamázy IMP. Tysall a jeho tím
zaznamenali produkciu IMP-1 u tohto organizmu pomerne skoro (Tysall et al., 2002). Jednou
z dalších beta-laktamáz produkovaných touto baktériou, je aj čoraz rozšírenejší enzým SPM.
Príkladom je produkcia enzýmu SPM-1 izolovaného v Iráne (Shahcheraghi et al., 2011).
Z beta-laktamáz, podľa Amblera zo skupiny D , sú často nachádzané produkcie enzýmu O X A -
51, OXA-58, OXA-24. Pričom sa zdá, že najčastejšiu početnosť má OXA-23 (Dalla-Costa et
a l , 2003; Jeon et a l , 2005; Nemec et al., 2011).

6.3. E. coli

Je najdôležitejšia a zároveň najznámejšia zo všetkých escherichií. Jedná sa

o gramnegatívnu tyčinku, ktorá žije ako komenzál v hrubom čreve teplokrvných živočíchov
a je pôvodcom hnačkovitých ochorení u malých detí, ale aj u dospelých. Je pôvodcom aj
extraintestinálnych infekcií, ako sú infekcie močových ciest, dýchacích ciest, infekcie rán,
spôsobuje septické stavy, či novorodeneckú meningitídu. Často sa jedná o multirezistentné
kmene, ktoré produkujú E S B L (Votava, 2006; Schindler, 2014), čo značne znižuje spektrum
antibiotík použiteľných pri terapií ochorení, spôsobených touto baktériou.
Popri rôznych typoch nadobudnutia rezistencie u E. coli, ako je napríklad strata, alebo
nedostatočné prejavenie špecifických porínov (napr. OmpF a OmpC) (Oteo et al., 2008), je
veľmi dôležitou možnosťou vzniku rezistencie proti karbapenémom produkcia beta-laktamáz.
Príkladom je produkcia beta-laktamázy triedy B , NDM-1. Kmeň E. coli, produkovaný túto
beta-laktamázu, bol v roku 2009 izolovaný u pacienta, u ktorého bola izolovaná aj úplne prvá
produkcia N D M vôbec (Yong et al., 2009). Dnes už prebehla izolácia NDM-1 u baktérie E.
coli vo veľa krajinách. Či už na území jej pôvodu (Tada et al., 2014), alebo v Európe (Solé et

33
al., 2011). Ďalšou dôležitou beta-laktamázou u tejto baktérie, je produkcia V I M (Scoulica et
al., 2004). Peirano ajeho tým vo svojej štúdií preukázali dôležité zastúpenie ďalšieho typu
metalo-beta-laktamáz u E. coli a to K P C (Peirano et al., 2014). U tejto baktérie boli taktiež
preukázané karbapenemázy zo skupiny beta-laktamáz triedy A , ako napr. G I M (Wendel et al.,
2013) . Známa je tiež produkcia enzýmov O X A , náležiacich do beta-laktamáz zo skupiny D
(Barbarini et a l , 2015).

6.4. K. pneumoniae

Jedná sa o gramnegatívnu baktériu z čelade Enterobacteriaceae, ktorá je častou príčinou

nozokomiálnych nákaz. Klebsiely sú druhými najčastejšími pôvodcami močových infekcií
v nemocnici. Spôsobujú tiež gastroenteritidy, meningitídy, alebo septický stav (Schindler,
2014) .
Najčastejšou produkciou karbapenemáz u K. pneumoniae, je tvorba K P C zo skupiny beta-
laktamáz triedy A . Prvý krát bol enzým K P C izolovaný v roku 1996 v U S A , práve u K.
pneumoniae (Yigit et al., 2001). Aj keď je výskyt K P C z prevažnej väčšiny hlásený v USA,
napriek tomu sa v posledných rokoch začína objavovať tento typ rezistencie v Európe, čoraz
častejšie. Prvá zmienka o K P C enzýme v Európe, pochádza z Francúzska od pacienta predtým
hospitalizovaného v U S A (Naas et al., 2005). Ďalšie identifikácie enzýmu K P C u baktérie K.
pneumoniae v Európe prebehli v Anglicku (Woodford et al., 2008), či v Grécku (Pournaras et
al., 2009). V štúdií, ktorá vychádzala z výskumu prebiehajúceho v rokoch 2011-2014
v Taliansku, až 56 % karbapeném-rezistentných izolátov K. pneumoniae, vykazovalo tvorbu
enzýmu K P C (Barbarini et al., 2015). V roku 2000 bola zaznamenaná aj rezistencia vďaka
produkcií GES-1 (Poirel et a l , 2000a).
Zaznamenané sú prípady aj tvorby enzýmov O X A (Barbarini et al., 2015). Prvá produkcia
enzýmu O X A u K. pneumoniae, bola produkcia OXA-48, izolovaná v Turecku (Poirel et al.,
2004). Produkcia metalo-beta-laktamáz, nie je tiež ničím neobvyklým u tohto typu baktérie.
Známa je produkcia enzýmu N D M , (Yong et al., 2009), VĽVI (Barbarini et al., 2015), alebo
FMP, ktoré sú u K. pneumoniae často identifikované v Japonsku (Shigemoto et al., 2012).

34
 7. METÓDY PREUKÁZANIA KARBAPENEMÁZ

Neustály nárast produkcie karbapenemáz u rôznych typov baktérií s celosvetovým

rozšírením, pridáva na potrebe ich rýchlej a presnej detekcii. Určeniu o aký typ karbapenemáz
ide, predchádzajú difúzne alebo dilučné testy. Princíp difúznych testov spočíva v difúzií
antibiotika do agaru s naočkovaným bakteriálnym testovaným kmeňom. Dilučné testy závisia
na hodnote MIC (Votava, 2005). V prípade, že sa potvrdí rast kultúry vykazujúcej výrazne
zvýšené hodnoty MIC, príp. so zmenšenou inhibičnou zónou pre karbapenémy, pristupuje sa
k detekcií mechanizmu rezistencie, ktorý veľmi často zahŕňa aj tvorbu karbapenemáz. Popri
fenotypových a molekulárnych metódach detekcie karbapenemáz, je novinkou jednoduchý
biochemický test C A R B A NP, založený na hydrolýze imipenému, detekovateľnému vďaka
zmene farby indikátora v dôsledku poklesu pH. Výsledok takéhoto testu je naozaj rýchli, do
dvoch hodín (Nordmann et al., 2012).

7.1. Fenotypové metódy

Fenotypové metódy detekcie karbapenémových antibiotík sú založené na schopnosti

niektorých látok inhibovať aktivitu týchto enzýmov. Disky s inhibítorom sa umiestnia
doprostred a v jeho okolí sa umiestnia disky obsahujúce karbapenémy (Hrabák et al., 2009b).
Jednou z metód je aproximačný diskový test, kedy sa dávajú do pomeru priemery inhibičných
zón medzi diskom s indikátorovým antibiotikom, a diskom s antibiotikom a inhibítorom
(Giske et al., 2011). Modifikovaný Hodgeov test (MHT) je tiež jednou z možností
preukázania prítomnosti expresie karbapenémov. Princípom je inaktivácia karbapenémov
pomocou rezistentného bakteriálneho kmeňa a tým zabezpečený rast citlivého bakteriálneho
kmeňa súbežne s tým rezistentným (Lee et al., 2001). M H T vykazuje často vysokú senzitivitu,
ale interpretácia je často zložitá a subjektívna (Carvalhaes et al., 2010). Niektoré štúdie tiež
demonštrujú falošné výsledky M H T pri prítomnosti E S B L a AmpC beta-laktamáz (Doumith
et a l , 2009).
K identifikácií metalo-beta-laktamáz sa využíva fakt, že sú inhibované chelátormi
kovových iontov, ako sú EDTA, dipikolinová kyselina, či fenantrolin (Hrabák et al., 2012).
Jeden z testov využívajúci synergiu inhibítora s karbapenémom je napríklad E-test. Jedná sa
vlastne o diagnostický prúžok, na ktorom sa znižuje koncentrácia antibiotika a vytvára sa na
ňom inhibícia rastu, ktorá sa následne odčíta (Walsh et al., 2002).

35
 Beta-laktamáza K P C , je inhibovaná kyselinou fenylboritou a jej derivátmi, ktoré slúžia aj
ako inhibitory v prípade beta-laktamázy AmpC. To spôsobuje problémy v nesprávnej
diagnostike kmeňov, produkujúcich AmpC a využívajúcich iný systém rezistencie ku
karbapenémom, ako tvorbu karbapenemáz. Možnosťou je disk s kloxacilínom, Hrabák a kol.
však uvádza výskyt kmeňov K. pneumoniae, s výskytom v Českej republike, ktoré vykazujú
produkciu AmpC typu DHA-1 a beta-laktamázu typu O X A - 1 , ktorá hydrolyzuje kloxacilín
a tým vykazuje falošnú pozitivitu produkcie K P C (Hrabák et al., 2012). Ďalšími možnosťami
je použitie komerčných diskov na detekciu M B L , ako je napríklad Mastdiscs ID, alebo Rosco
Diagnostica.
Problém s detekciou pomocou fenotypových metód, naberá význam pri detekcii beta-
laktamáz skupiny O X A , ktorých identifikácia musí byť vždy doplnená molekulárnymi
testami. Možnosťou fenotypových testov u tejto beta-laktamázy, je použitie diskov
s temocilínom (Hrabák et al., 2012), príp. s inhibítorom NXL104, ktorý však nieje špecifický,
pretože dokáže inhibovať väčší počet beta-laktamáz (Aktas et al., 2012).

7.2. Molekulárne metódy

Detekcia produkcie karbapenemáz musí byť často potvrdená pomocou molekulárnych

metód. Patria sem molekulárne genetické metódy a ďalej sem môžu byť zaradené metódy,
ktoré sú založené na spektrometrickom určovaní prítomnosti karbapenemáz.
Hmotnostná spektrometria patrí k relatívne novým metódam určenia karbapenemáz.
Napriek tomu sa v posledných rokoch stala akceptovanou štandardnou metódou. Technika sa
nazýva M A L D I - T O F a j ej princíp je založený na zistení molekulárnych hmotností
chemických zložiek vo vzorku, ktorý je inkubovaný s meropenémom. V prípade, že je kmeň
producentom karbapenemáz, je v spektre prítomný aspoň jeden degradačný produkt
meropenému a zároveň nie je detekovateľná molekula meropenému, alebo jeho sodnej soli
(Hrabák et al., 2012). Možnosťou veľmi rýchleho určenia produkcie karbapenemáz, je
použitie M A L D I - T O F M S priamo z krvnej kultúry, po niekoľkohodinovej inkubácií
(Carvalhaes et a l , 2014).
Molekulárne genetické metódy sú založené na detekcií génov karbapenemáz. Zahrňujeme
sem techniky ako klasickú PCR, multiplex aj real-time PCR, D N A hybridizáciu
a sekvenovanie. Hlavnou výhodou molekulárne-genetických metód, je schopnosť určenia
špecifického typu a aj varianty karbapenemázy. Problémom však môže byť vysoká cena a

36
aj potreba vyškolených pracovníkov. Metóda polymerázovej reťazovej rekcie (PCR), je
najrýchlejšou metódou stanovenia typu beta-laktamázy.
Metóda multiplex P C R bola vyvinutá pre detekciu a správne rozdelenie piatich rodín
metalo-beta-laktamáz a to VPM, EVIP, SPM, GEVI a SPM. Podstatou je prítomnosť viac dvojíc
primerov pre amplifikáciu rôznych génov (Ellington et al., 2007). Účinok sa neskôr rozšíril
modifikáciou tohto testu (zloženého z troch multiplex P C R reakcií), aj na K P C , N D M a beta-
laktamázy typu OXA-48 (Poirel et al., 2011a). Jednou z ďalších možností preukázania
karbapenemáz, je tiež využitie mikročipov. V roku 2010 bol vyvinutý mikročip, ktorý dokáže
identifikovať karbapenemázy typu K P C , O X A , IMP, S P M , V I M , SIM a GĽVI (Ulyashova et
a l , 2010).

8. MOBILNÉ GENETICKÉ E L E M E N T Y

Pri selekčnom tlaku, kedy antibiotikum potlačuje rast senzitívnej populácie, sa bez
obmedzenia pomnožia rezistentné bunky a populácia sa stáva rezistentnou. Túto rezistenciu
(ktorá sa šíri z potomstva na potomstvo) označujeme ako vertikálny prenos rezistencie. Gény
pre rezistenciu sa však môžu prenášať aj medzi rôznymi jedincami v rámci jednej generačnej
vrstvy. To je označované ako horizontálny prenos (Schindler, 2014).
Šírenie rezistencie z organizmu na organizmus je zabezpečené vďaka konjugácií
(intracelulárny prenos plazmidu, či transpozónu), transdukcií (transfer nukleovej kyseliny
pomocou bakteriofága), či transformácií (príjem holej D N A ) . Šírenie rezistencie vďaka
transdukcií, nie je v prírode veľmi častý proces. Známy je prípad prenosu plazmidu
penicilinázy u S. aureus. Transformácia je zase dôležitá forma šírenia rezistencie hlavne u pár
typov organizmov, ktoré ľahko podliehajú počas niektorého obdobia svojho životného cyklu
transformácií. Příkladovými organizmami môžu byť Streptococcus pneumoniae, či
Acinetobacter spp. V prípade rezistencie baktérií hrajú dôležitú úlohu aj inzerčné sekvencie.
Sú to veľmi jednoduché mobilné genetické elementy, ktoré v niektorých prípadoch mobilizujú
gény rezistencie (Finch et al., 2003).

37
8.1. Plazmidy

Plazmidy sú celkom malé, sami sa replikujúce molekuly D N A , ktoré sa prirodzene

nachádzajú vcytoplazme baktérií, často v jednej, alebo v dvoch kópiách. A k obsahujú gény
pre antibiotickú rezistenciu, nazývame ich R-plazmidy. Plazmidy sú často využívané
v procese konjugácie. Konjugatívne plazmidy, čiže plazmidy schopné sa sami prenášať, sú
dobre popísané u gramnegatívnych črevných baktérií (Finch et al., 2003). Tieto plazmidy nesú
gény pre replikáciu D N A , gény pre ich transfer z jednej bunky do druhej a gény pre rôzne iné
fenotypy. Príkladom je nesenie génu zabezpečujúceho antibiotickú rezistenciu, alebo génu
zabezpečujúceho tvorbu nádorov (Ti-tumour inducing plazmid), či nesenie génu pre tvorbu
sex pilov (Clark a Pazdernik, 2012). Nekonjugatívne plazmidy môžu byť prenesené do inej
baktérie, ak sú súčasne aktivované konjugatívnym plazmidom, alebo pomocou transdukcie,
alebo transformácie. Baktérie majú však vplyvom konjugatívnych plazmidov obmedzený
rozsah hostiteľov. Napríklad je konjugácia všeobecne nemožná medzi grampozitívnymi
a gramnegatívnymi baktériami (Finch et al., 2003). Beta-laktamázy typu V I M , O X A , K P C , či
N D M sú asociované s plazmidmi. Bolo dokázané nosičstvo génu blavm na plazmidoch IncN.
Gén blaoxA-48 bol nájdený na plazmidoch IncL/M a gény blaKPC sú často nájdené na
plazmidoch IncF, IncN a IncL/M, príp. na malých nekonjugovaných plazmidoch. Gény pre
expresiu enzýmov zo skupiny N D M , boli identifikované na plazmidoch IncHIl, alebo na
plazmidoch L / M . Enzým EVIP-4, kódovaný génom blamp-4, bol nájdený tiež na plazmidoch a
to triedy L / M . Plazmidy tiež často figurujú ako hostitelia pre iné typy mobilných genetických
elementov, ktoré nie sú schopné samostatnej replikácie (Carattoli et al., 2009).

8.2. Transpozóny

Transpozóny sú takzvané diskrétne sekvencie D N A , ktoré sú schopné sa premiestniť

z jedného, do druhého replikónu, či už sa jedná o plazmid, alebo chromozóm. Často sa preto
transpozóny pomenovávajú ako tzv. skákajúce gény (Finch et al., 2003). Všetky transpozóny,
ktoré sú na báze D N A , majú dva podstatné znaky. V prvom rade obsahujú na jednom konci
obrátené repetície. V druhom obsahujú aspoň jeden gén, ktorý kóduje enzým-transpozáza. Tá
je zodpovedná za pohyb transpozónu (Clark a Pazdernik, 2012). Špeciálnym typom
transpozónov, sú transpozóny, ktoré majú schopnosť konjugácie, tzv. konjugatívne
transpozóny. Tieto transpozóny sa dokážu prenášať priamo z jedného chromozómu
bakteriálneho kmeňa, na druhý, bez prítomnosti plazmidu (Finch et al., 2003).
38
 Dôležitým transpozónom je transpozón Tn4401, na ktorom sú často identifikované gény
pre karbapenemázy K P C (Cuzon et al., 2010). V prípade, že je fragment D N A ohraničený
dvoma kópiami identických inzerčných sekvencií, jedná sa o kompozitný, čiže zložený
transpozón. Transpozón Tn/25 nesie gén WÚÍNDM-I a je často ohraničený dvoma kópiami
inzerčných sekvencií !SAbal25 (Poirel et al., 2012). Gén blaoxA-23 bol zase lokalizovaný na
transpozóne Tn2006. Ten je takmer vždy ohraničený na obidvoch stranách inzerčnými
sekvenciami ISAbal (Seputiene et al., 2012).

8.3. Integróny a génové kazety

Ďalším dôležitým mechanizmom šírenia rezistencie sú integróny. Nemajú vlastný počiatok

a z toho dôvodu je ich možné nájsť na chromozómoch, či veľmi často aj na plazmidoch, alebo
v iných mobilných genetických elementoch. Jedná sa o miestne-špecifický rekombinančný
systém, ktorý dokáže rozpoznať a zachytiť génové kazety, ktoré obsahujú informácie
o antibiotickej rezistencií. Štruktúra integrónu zahŕňa gén pre integrázu (iní), miesto na ktoré
sú pomocou integrázy začleňované génové kazety (attl) a jeden, alebo viac promótorov. Na
základe rozdielnej sekvencie kódujúcej integrázu, rozdeľujeme integróny na päť tried (Mazel,
2006). Gény blamp boli nájdené napríklad na integrónoch 3. triedy. Génové kazety často
obsahujú iba jeden gén, ktorý kóduje rezistenciu k príslušnému antibiotiku. Avšak týchto
génových kaziet môže integrón obsahovať niekoľko. Dnes poznáme veľké množstvo
génových kaziet, ktoré kódujú napríklad gény pre metalo-beta-laktamázy (Finch et al., 2003).
Gény pre enzýmy VJJV1, sú často nachádzané na itegrónoch 1. triedy. Príkladom môže byť
enzým VJJVl-1, kódovaný génom, ktorého lokalizácia je často identifikovaná na génovej
kazete, na integróne 1. triedy, lokalizovanej na chromozóme (Lauretti et al., 1999). Gén pre
enzým GJJV1 u P. aeruginosa bol identifikovaný na génovej kazete, na integróne 1. triedy,
ktorého prenos bol zabezpečený pomocou plazmidu (Castanheira et al., 2004). V roku 2004
bol tiež identifikovaný gén pre enzým JJV1P-16 u Pseudomonas spp. Jeho lokalizácia bola na
integróne prvej triedy asociovanej s chromozómom (Mendes et al., 2004)

39
9. ZÁVER

Rezistencia ku karbapenémovým antibiotikám sa stala neprehliadnuteľným problémom,

ktorý má tendenciu narastať a spôsobovať veľké problémy v antibiotickej terapii.
Mechanizmus rezistencie baktérií ku karbapenémom môže byť enzymatický,
alebo neenzymatický, príp. spôsobený ich rôznymi kombináciami. K veľmi obávaným patrí
hlavne enzymatický proces tvorby karbapenemáz, pričom obzvlášť nebezpečnou sa zdá byť
karbapenemáza N D M , ktorej výskyt sa v posledných rokoch značne zvýšil.
Každé antibiotikum, aj keď rezervné, je schopné sa stať nepoužitelným pri jeho masívnom
použití. Z vyššie napísaného je jasné, že šírenie rezistencie pomocou horizontálneho prenosu,
nie je ničím neobvyklým. Deje sa často prirodzene a nie je možné mu zabrániť. Čo však je
možné ovplyvniť, je prístup k antibiotickým látkam. V rámci obmedzenia šírenia rezistencie
je dôležitá múdra, antibiotická politika, ktorá okrem iného, zahŕňa aj potrebu rýchleho
a presného určenia mechanizmu rezistencie. Aj keď je v rámci Českej republiky rezistencia
ku karbapenémom udržovaná pod kontrolou a vyskytuje sa sporadicky, tak sa táto situácia
môže kedykoľvek zmeniť. Preto je dôležitá spolupráca jednotlivých krajín na zavedení
jednotnej a rozumnej antibiotickej terapie.

40
Z O Z N A M POUŽITEJ LITERATÚRY

Aktas Z., Kayacan C , Oncul O. (2012): In vitro activity of avibactam (NXL104) in

combination with ß-lactams against Gram-negative bacteria, including OXA-48 ß-lactamase-
producing Klebsiella pneumoniae. Int J Antimicrob Agents 39: 86-89.

Ambler R.P., Coulson A. F., Frěre J. M . , Ghuysen J. M . , Joris B., Forsman M . ,

LevesqueR. C , TirabyG, Waley S. G. (1991): A standard numbering scheme for the class A
beta-lactamases. Biochem J 276: 269 270.

Aminov R.I. (2010): A brief history of the antibiotic era: lessons Learned and challenges for
the future. Front Microbiol 1:134.

Barbarini D., Russello G., Brovarone F., Capatti C., Colla R., Perilli M . , MoroM.L.,
Carretto E . (2015): Evaluation of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in an Italian
setting: Report from the trench. Infect Genet Evol 30: 8-14.

Bert F., Catherine Branger C , Lambert-Zechovsky N. (2002): Identification of PSE and

O X A ß-lactamase genes in Pseudomonas aeruginosa using PCR-restriction fragment length
polymorphism. J Antimicrob Chemother 50:11-18.

Bednář M . Fraňková V., Schindler J., Souček A., Vávra J. (1996) Bakteriologie, virológie,
parazitológie. Praha: Marvil, 560s, ISBN: 8594031505280

Bou G., Cervero G., Dominguez M.A., Quereda C , Martinez-Beltran J . (2000):

Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter
baumannii strain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme: high-level carbapenem resistance
in A. baumannii is not due solely to the presence of ß-lactamases. 7 Clin Microbiol 38: 3299-
3305.

Bonomo R.A., Szabo D. (2006): Mechanisms of multidrug resistance in Acinetobacter

species and Pseudomonas aeruginosa. Clin Infect Dis 43:S49-S56.

Carattoli A. (2009): Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents

Chemother 53: 2227-2238.

Carvalhaes C G . , Picäo R.C, Nicoletti A.G., Xavier D.E., Gales,A.C. (2010): Cloverleaf
test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae:
be aware of false positive results. J Antimicrob Chemother 65: 249-251.

41
Carvalhaes C G , Cayö R., Visconde M.F., Barone T., Frigatto E.A., Okamoto D., Assis
D.M, Juliano L . , Machado A.M, Gales A.C. (2014): Detection of carbapenemase activity
directly from blood culture vials using M A L D I - T O F M S : a quick answer for the right
decision. J Antimicrob Chemother 69: 2132-2136.

Castanheira M., Toleman M.A., Jones R.N., Schmidt F.J., Walsh T.R. (2004): Molecular
characterization of a B-lactamase gene, bla.Gm.-u encoding a new subclass of metallo-B-
lactamase. Antimicrob Agents Chemother 48:4654-4661.

Castanheira M., Deshpande L . M., Mathai D., BellJ. M., Jones R. N., and Mendes R. E.
(2011): Early dissemination of N D M - 1 - and OXA-181-producing Enterobacteriaceae in
Indian hospitals: report from the SENTRY antimicrobial surveillance program 2006-2007.
Antimicrob Agents Chemother 55: 1274-1278.

Clark R.B. (1996): Imipenem resistance among Acinetobacter baumannii: association with
reduced expression of a 33-36 kDa outer membrane protein. J Antimicrob Chemother 38:245-
251.

Clark D.P., Pazdernik N.J. (2012): Molecular Biology: Understanding the Genetic
Revolution. Oxford, Boston Elsevier, 907 s, ISBN: 0123785944.

Cuzon G., Naas T., Truong H., Villegas M.-V., Wisell K. T., Carmeli Y.,Nordmann P.,
Gales A., Navon-Venezia S., Quinn J . (2010): Worldwide diversity of Klebsiella
pneumoniae that produce ß-lactamase WÖKPC-2 gene. Emerg Infect Dis 16: 1349 1356.

Dalla-Costa L . M . , Coelho J.M., Souza H.A.P.H.M., Castro M.E.S., Stier C.J.N.,

Bragagnolo K.L., Rea-Neto A., Penteado-Filho S.R., Livermore D.M., Woodford N.
(2003): Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23
enzyme in Curitiba, Brazil. 7 Clin Microbiol 41: 3403-3406.

Delbrück FL, P Bogaerts P., Kupper M.B., de Castro R.R., Bennink S., Glupczynski Y.,
Galleni M . , Hoffmann K.M., Bebrone K. (2012): Kinetic and crystallographic studies of
extended-spectrum GES-11, GES-12, and GES-14 ß-lactamases. Antimicrob Agents
Chemother 56: 5618-5625.

Doumith M . , Ellington M.J., Livermore D.M., Woodford N. (2009): Molecular

mechanisms disrupting porin expression in ertapenem-resistant Klebsiella and Enterobacter
spp. clinical isolates from the U K . J Antimicrob Chemother 63: 659-667.

42
Edwards J.R., Betts M.J. (2000): Carbapenems: the pinnacle of the P-lactam antibiotics or
room for improvement. J Antimicrob Chemother 45:1-4.
Ellington M.J., Kistler J., Livermore D.M., Woodford N. (2007): Multiplex PCR for rapid
detection of genes encoding acquired metallo-P-lactamases. J Antimicrob Chemother 59:321-
322

El Salabi A., Borra P. S., Toleman M . A., Samuelsen O., Walsh T. R. (2012): Genetic and
biochemical characterization of a novel metallo-beta-lactamase, TMB-1, from an
Achromobacter xylosoxidans strain isolated in Tripoli, Libya. Antimicrob Agents Chemother
56: 2241-2245.

Fernandez-Cuenca F., Martinez-Martinez L . , Conejo M.C., Ayala J.A., Perea E.J.,

Pascual A. (2003): A Relationship between P-lactamase production, outer membrane protein
and penicillin-binding protein profiles on the activity of carbapenems against clinical isolates
of Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 51:565-574.

Finch R.G., Greenwood D., Ragnar Norrby S.R., Whitley R.J. (2003): Antibiotic and
Chemotherapy: Anti-Infective Agents and Their Use in Therapy. 8th edition. Nottingham:
Churchill Livingstone, 1000s, ISBN:0443071292.

Gehrlein M , Leying H , Cullmann W, Wendt S, Opferkuch W. (1991): Imipenem

resistance in Acinetobacter baumanniiis due to altered penicillin-binding proteins.
Chemotherapy 37:405-412.

Giakkoupi P., Tzouvelekis L.S., Tsakris A., Loukova V., Sofianou D., Tzelepi E . (2000):
IBC-1, a novel integron-associated class A P-lactamase with extended-spectrum properties
produced by an Enterobacter cloacae clinical strain. Antimicrob Agents Chemother 44:2247-
2253.

Giske C.G., Gezelius L., Samuelsen O., Warner M . , Sundsfjord A., Woodford N.A.
(2011): A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-b-lactamases and
K P C in Klebsiella pneumoniae with the use of meropenem disks supplemented with
aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin Microbiol Infect 17: 552-556.

Hammond, M.L. (2004): Ertapenem: a group 1 carbapenem with distinct antibacterial and
pharmacological properties. J Antimicrob Chemother 2004, 53: ii7-ii9.

Hall B.G., Barlow M . (2005): Revised Ambler classification of P-lactamases. J Antimicrob

Chemother 55: 1050-1051.
43
Hauser, A.R. (2012): Antibiotic basics for clinicians: The ABCs of choosing the right
antibacterial agent- second edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 336 s,
ISBN: 14-511-12211.

Héritier C , Poirel L . , Lambert T., Nordmann P. (2005): Contribution of acquired

carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter Baumannii.
Antimicrob Agents Chemother 49: 3198-3202.

Hrabák J., Fridrichova M . , Štolbová M . , Bergerová T., Zemlickova H. and Urbasková

P. (2009a): First identification of metallo-beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa
in the Czech Republic.
Eurosurveillance 14 [online] [citované dna 2015-4-17]. Dostupné na
<http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId= 19102 >

Hrabák J., Bergerová T, Žemličková H., Urbášková P. (2009b): Detekce širokospektrých

ß-laktamaz (ESBL), ß-laktamaz AmpC, metalo-ß-laktamaz (MBL) a karbapenemáz K P C u
gramnegativních tyček. ZPRÁVY EPIDEMIOLOGIE A MIKROBIOLOGIE (SZÚ, PRAHA)
18:100-106.

Hrabák J., Niemczyková J., Chudáčkova E., Fridrichova M . , Študentova V., Červená
D., Urbášková P. and Žemličková H . (2011): KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
isolated from a Czech patient previously hospitalized in Greece and in vivo selection of
Colistin resistance. Folia Microbiol (Praha) 56:361-365.

Hrabák J., Walková R., Žemličková H., Bergerova T., Urbášková P. (2012): Detekce
karbapenemáz u enterobakterií pomocí M A L D I - T O F hmotnostní spektrometrie (MS),
fenotypových inhibičních testů a molekulárně-mikrobiologickými technikami. Zprávy Centra
epidemiologie a mikrobiologie (SZÚ, PRAHA) 21:148-156.

Hrabák J., Papagiannitsis C.C., Študentova V., Jakubu V., Fridrichova M . , Zemlickova
H. (2013): Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in the Czech Republic in 2011,
Eurosurveillance 18 [online] [citované dna 2015-4-17]. Dostupné na
<http://www. eurosurveillance. or g/ViewArticle, aspx ?ArticleId=20626 >

Chau S.L., Chu Y.W., Houang E.T. (2004): Novel resistance-nodulation-cell division efflux
system AdeDE in Acinetobacter genomic D N A group 3. Antimicrob Agents Chemother
48.-4054-4055.

44
Iaconis J P, Sanders C.C.(1990): Purification and characterization of inducible beta-
lactamases in Aeromonas spp. Antimicrob Agents Chemother 34: 44-51.

Iraz M . , Duzgun A.O., Cicek A.C., Bonnin R.A., Ceylan A., Sarai A., Nordmann P.,
Sandalli C. (2014): Characterization of novel V I M carbapenemase, VIM-38, and first
detection of GES-5 carbapenem-hydrolyzing ß-lactamases in Pseudomonas aeruginosa in
Turkey. Diagn Microbiol Infect Dis 78:0732-8893.

Izdebski R., Fiett J., Hryniewicz W., Gniadkowski M.(2012): Molecular analysis of
Acinetobacter baumannii isolates from invasive infections in 2009 in Poland. 7 Clin
Microbiol 50: 3813-3815.

Jeannot K., Poirel L . , Robert-Nicoud M . , Cholley P., Nordmann P., Plesiat, P. (2012).
IMP-29, a Novel EVIP-Type Metallo-ß-Lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob
Agents Chemother 56:2187-2190.

Jeon B . - C , Jeong S. H., Bae I. K., Kwon S. B., Lee K., Young D., Lee J.H., Song J.S.,
Lee, S. H . (2005): Investigation of a nosocomial outbreak of imipenem-resistant
Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 B-lactamase in Korea. 7 Clin Microbiol 43:
2241-2245.

Kaase M , Szabados F, Pfennigwerth N, Anders A, Geis G, Pranada AB, Rößler S, Lang

U, Gatermann, SG. (2014): Description of the metallo-ß-lactamase GIM-1 in Acinetobacter
pittii. J Antimicrob Chemother 69:81-84.

Katayama Y., Zhang H.-Z., Chambers H . F. (2004): PBP 2a Mutations Producing Very-
High-Level Resistance to Beta-Lactams. Antimicrob Agents Chemother 48: 453-459.

Koga T., Sugihara C , Kakuta M., Masuda N., Namba E., Fukuoka T. (2009): Affinity of
tomopenem (CS-023) for penicillin-binding proteins in Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, and Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 53: 1238-1241.

Köhler T., Michea-Hamzehpour M . , Epp S. F., Pechere J.-C. (1999): Carbapenem

activities against Pseudomonas aeruginosa: respective contributions of OprD and efflux
systems. Antimicrob Agents Chemother 43: 424-427.

Kuwabara S, Abraham EP. (1967): Some properties of two extracellular beta-lactamases

from Bacillus cereus 569/H. Biochem Journal 103:27C-30C.

Lauretti L . , Riccio M . L . , Mazzariol A., Cornaglia G., Amicosante G., Fontana R.,
Rossolini G.M. (1999): Cloning and characterization of blavm, a new integron-borne
45
metallo-B-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolate. Antimicrob
Agents Chemother 43: 1584-1590.

Lee K., Chong Y., Shin H.B., Kim Y.A., Yong D., Yum J.H.(2001): Modified Hodge and
EDTA-disk synergy tests to screen metallo-ß-lactamase-producing strains of Pseudomonas
and Acinetobacter species. Clinical Microbiology and Infection, 7: 88-91.

Lee K., Yum J.H., Yong D., Lee H . M . , Kim H . D., Docquier J.-D., Rossolini G.M,
Chong Y. (2005): Novel acquired metallo-beta-lactamase gene, blasm-i, in a class 1 integron
from Acinetobacter baumannii clinical isolates from Korea. Antimicrob Agents Chemother
49: 4485-4491.

Limansky A.S., Mussi M.A., Viale A.M.(2002): Loss of a 29-kilodalton outer membrane
protein in Acinetobacter baumannii is associated with imipenem resistance. 7 Clin Microbiol
40:4776-4778.

Martinez-Martinez L., Vila J., Pachon J., Cisneros J.M., Rodriguez-Bano J., Pascual A.,
Bou G., Tomas M . , on behalf of the Spanish Group of Nosocomial Infections and
Mechanisms of Action and Resistance to Antimicrobials (GEIH-GEMARA) from the
Spanish (2013): Contribution of efflux pumps, porins, and ß-lactamases to multidrug
resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 57:
5247-5257.

Mascaretti O.A. (2003): Bacteria versus antibacterial agents. Washington, Amer Society for
Microbiology, 420 s., ISBN:1555812589.

Mazel D. (2006): Integrons: agents of bacterial evolution. Nature 4:608-620.

Medeiros A.A. (1997): Evolution and dissemination of /3-Lactamases accelerated by

generations of beta-lactam antibiotics. : Clin Infect Dis 24: S19-45.

Mendes R.E., Toleman M.A., Ribeiro J., Sader H.S., Jones R.N., Walsh T.R. (2004): .
Integron carrying a novel metallo-ß-lactamase gene, blamp-i6, and a fused form of
aminoglycoside-resistant gene aac(6')-30/aac(6')-Ib': Report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program. Antimicrob. Agents Chemother 48:4693-4702.

Metzgar D., Bacher J. M., Pezo V., Reader J., Döring V., Schimmel P., Marliere P., de
Crecy-Lagard V. (2004): Acinetobacter sp. ADP1: an ideal model organism for genetic
analysis and genome engineering. Nucleic Acids Res 32: 5780-5790.

46
Naas, T., L . Vandel, W. Sougakoff, D. M . Livermore, and P. Nordmann. (1994): Cloning
and sequence analysis of the gene for a carbapenem-hydrolyzing class A P-lactamase, Sme-1,
from Serratia marcescens S6. Antimicrob Agents Chemother 38:1262-1270.

Naas T, Nordmann P, Vedel G, Poyart C. (2005): Plasmid-mediated carbapenem-

hydrolyzing beta-lactamase K P C in a Klebsiella pneumoniae isolate from France. Antimicrob
Agents Chemother 49:4423-4424.

Nemec A., Krížová L., Maixnerová M., Diancourt L., van der Reijden T. J. K., Brisse S.,
van den Broek P., Dijkshoorn L . (2008): Emergence of carbapenem resistance in
Acinetobacter baumannii in the Czech Republic is associated with the spread of multidrug-
resistant strains of European clone II. 7 Antimicrob Chemother 62: 484-489.

Nemec A., Krížová L . , Maixnerová M . and Šmejcová A. (2011): Multirezistentní

Acinetobacter baumannii nesoucí geny pro karbapenemázy NDM-1 a OXA-23 importovaný
do České republiky. Zprávy Centra Epidemiologie a Mikrobiologie 220: 295-298.

Neuwirth C , Siébor E., Duez J. M . , Péchinot A. Kazmierczak, A. (1995): Imipenem

resistance in clinical isolates of Proteus mirabilis associated with alterations in penicillin-
binding proteins. J Antimicrob Chemother 36, 335-342

Nordmann P., Mariotte S., Naas T., Labia R., Nicolas, M.H. (1993): Biochemical
properties of a carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase from Enterobacter cloacae and
cloning of the gene into Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 37: 939 946.

NordmannP., PoirelL., DortetL. (2012): Rapid detection of carbapenemase-producing

Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis 18 [online] [citované dňa 2015-4-19]. Dostupné na
<http://wwwnc.cdc.gOv/eid/article/18/9/12-0355_article >

Norrby S.R., Finch R.G., Glauser. (1993): Monotherapy in serious hospital-acquired

infections: a clinical trial of ceftazidime versus imipenem/cilastatin. J Antimicrob Chemother
31:927-937.

Ochs M.M., McCusker M.P., Bains M . , Hancock R.E. (1999): Negative regulation of the
Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin OprD selective for imipenem and basic
amino acids. Antimicrob Agents Chemother 43:1085-1090.

Oteo J ; Delgado-Iribarren A., Vega D., Bautista V., Rodriguez M - C , Velasco M . ,

Saavedra J.M, Perez-Vazquez M . , García-Cobos S., Martinez-Martinez L., Campos
J. (2008): Emergence of imipenem resistance in clinical Escherichia coli during
47
therapy.Emergence of imipenem resistance in clinical Escherichia coli during therapy. Int J
Antimicrob Agents 32:534-537.

Papp-Wallace, K . M . , Endimiani, A., Taracila, M.A., & Bonomo, R.A. (2011):

Carbapenems: Past, Present, and Future. Antimicrob Agents Chemother 55:4943-4960.

Paton R., Miles R.S., Hood J., Amyes S.G. (1993): A R I 1: beta-lactamase-mediated
imipenem resistance in Acinetobacter baumannii. Int J Antimicrob Agents 2: 81-87.

Peirano G., Bradford P.A., Kazmierczak K.M., Badal R.E., Hackel M . , Hoban D.J.,
Pitout J.D.D. (2014): Global incidence of carbapenemase-producing Escherichia coli ST131.
Emerg Infect Dis 20 [online] [citované dňa 2015-4-22]. Dostupné na
<http://wwwnc.cdc.gOv/eid/article/20/ll/14-1388_article#suggestedcitation >

Phoenix: telefonicky zdelené, stav k 10.4.2015.

Piddock L.J.V. (2006): Clinically Relevant Chromosomally Encoded Multidrug Resistance

Efflux Pumps in Bacteria. Clin Microbiol Rev. 19: 382-402.

Poirel L., Le Thomas I., Naas T., Karim A., Nordmann P.(2000a): Biochemical sequence
analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum ß-lactamase, and the class 1 integron
In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 44: 622 632.

Poirel L., Naas T., Nicolas D., Collet L., Bellais S., Cavallo J.-D., Nordmann P. (2000b):
Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-ß-lactamase and its plasmid-
and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France.
Antimicrob Agents Chemother 44: 891-897.

Poirel L., Héritier C , Tolün V., Nordmann P. (2004): Emergence of oxacillinase-mediated

resistance to imipenem in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 48:15-22.

Poirel L., Rodriguez-Martinez J.-M., Al Naiemi N., Debets-Ossenkopp Y. J., Nordmann

P. (2010). Characterization of DIM-1, an integron-encoded metallo-beta-lactamase from a
Pseudomonas stützen clinical isolate in the Netherlands. Antimicrob Agents Chemother 54:
2420-2424.

Poirel L., Walsh T.R.,Cuvillier V., Nordmann P. (2011a): Multiplex PCR for detection of
acquired carbapenemase genes. Diagn Microbiol Infect Dis 70: 119 125.

Poirel L . , Castanheira M . , Carrer A., RodriguezC.P., Jones R.N., Smayevsky J . ,

Nordmann P. (2011b): OXA-163, and OXA-48-related class D beta-lactamase with extended

48
activity toward expanded-spectrum cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother 55: 2546-
2551

Poirel L . , Bonnin R.A., Boulanger A., Schrenzel J., Kaase M . , Nordmann P.(2012):
Tnl25-Related Acquisition of WaNDM-Like Genes in Acinetobacter baumannii. Antimicrob
Agents Chemother 56: 1087-1089.

Pollini S., Maradei S., Pecile P., Olivo G., Luzzaro F., Docquier J . D., Rossolini G-M.
(2012): FIM-1, a new acquired metallo-beta-lactamase from a Pseudomonas aeruginosa
clinical isolate from Italy. Antimicrob Agents Chemother 57: 410 416.

Pournaras S., Protonotariou E., Voulgari E., Kristo I., Dimitroulia E., Vitti D., Tsalidou
M., Maniatis A.N., Tsakris A., Sofianou D. (2009): Clonal spread of KPC-2
carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae strains in Greece. 7 Antimicrob Chemother
64: 348-352.

Quale J., Bratu S., Landman D., Heddurshetti R. (2003): Molecular epidemiology and
mechanisms of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii endemic in New York
City. Clin Infect Dis 37:214-220.

Quale, J., Bratu S., Gupta J., Landman D. (2006): Interplay of efflux system, AmpC, and
OprD expression in carbapenem resistance of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates.
Antimicrob Agents Chemother 50: 1633-1641.

Queenan A.M., ShangW., SchreckenbergerP., LolansK., BushK., QuinnJ.(2006): SME-3,

a novel member of the Serratia marcescens S M E family of carbapenem-hydrolyzing ß-
lactamases. Antimicrob Agents Chemother 50: 3485-3487.

Saino Y., Kobayashi F., Inoue M . , Mitsuhashi S. (1982): Purification and properties of
inducible penicillin beta-lactamase isolated from Pseudomonas maltophilia. Antimicrob
Agents Chemother 22: 564-570.

Scoulica E.V., Neonakis I.K., Gikas A.I., Tselentis Y.J. (2004): Spread of blavm-i-
producing E. coli in a university hospital in Greece. Genetic analysis of the integron carrying
the blavm-i metallo-ß-lactamase gene. Diagn Microbiol Infect Dis 48: 167-172.

Sekiguchi J., Morita K., Kitao T., Watanabe N., Okazaki M . , Miyoshi-Akiyama T.,
Kanamori M . , Kirikae T. (2008): K H M - 1 , a novel plasmid-mediated metallo-ß-lactamase
from a Citrobacter freundii clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 52: 4194-4197.

49
Shahcheraghi F., Abbasalipour M., Feizabadi M., Ebrahimipour G., Akbari N. (2011):
Isolation and genetic characterization of metallo-ß-lactamase and carbapenamase producing
strains of Acinetobacter baumannii from patients at Tehran hospitals. Iran J Microbiol 3: 68
74.

Schindler J . (2014) '.Mikrobiologie: Pro studenty zdravotnických oborů, 2., doplněné a

přepracované vydání. Praha: Grada Publishing a.s., 248 s., ISBN: 978-80-247-4771-2.

Shigemoto N., Kuwahara R., Kayama S., Shimizu W., Onodera M . , Yokozaki M . ,
Hisatsune J., Kato F., Ohge H., Sugai M.(2012): Emergence in Japan of an imipenem-
susceptible, meropenem-resistant Klebsiella pneumoniae carrying blamp-6 Diagn Microbiol
Infect Dis 72: 0732-8893.

SeputieneV., PovilonisJ., SuziedelieneE. (2012): Novel variants of AbaR resistance islands

with a common backbone in Acinetobacter baumannii isolates of European clone II.
Antimicrob Agents Chemother 56, 1969 1973.

Sole M., Pitart C , Rosa I., Fabrega A., Salvador P., Munoz L . , Oliveira I., Gascon J.,
Marco F., Vila J. (2011): First description of an Escherichia Coli strain producing NDM-1
carbapenemase in Spain. Antimicrob Agents Chemother 55: 4402-4404.

Song W., Hong S.G., Yong D., Jeong S.H., Kim H.S., Kim H.S., Kim J.S., Bae I.K.
(2015): Combined use of the modified Hodge test and carbapenemase inhibition test for
detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae and metallo-ß-lactamase-
Producing Pseudomonas spp. Ann Lab Med 35: 212-219.

Studentova V., Chudáčkova E., Bergerova T., Hrabak J., Radej J., Novak I. (2013):
Identification of a New Delhi metallo-beta-lactamase-4 (NDM-4) - producing Enterobacter
cloacae from Czech patient previously hospitalized in Sri lanka. Folia microbiol 58:547-549.

Šenkyříková M., Chromá M., Husičková V., Htoutou M., Kolář M . (2012): Acinobacter
baumannii nesoucí gen OXA-23 v České republice. Zprávy centra epidemiologie a
mikrobiologie (SZÚ,PRAHA) 21: 384-386.

Tada, T., Miyoshi-Akiyama, T., Shimada, K., Kirikae, T. (2014): Biochemical analysis of
metallo-ß-lactamase NDM-3 from a multidrug-resistant Escherichia coli strain isolated in
Japan. Antimicrob Chemother 58: 3538-3540.

Toleman M.A., Simm A.M., Murphy T.A., Gales A.C., Biedenbach D J . , Jones R.N.,
Walsh T.R. (2002): Molecular characterization of SPM-1, a novel metallo-beta-lactamase
50
isolated in Latin America: report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme. J.
Antimicrob Chemother 50: 673-679.

Trias J., Dufresne J., Levesque R.C., Nikaido H . (1989): Decreased outer membrane
permeability in imipenem-resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents
Chemother 33:1202-1206.

Trias, J., Nikaido, H . (1990): Protein D2 channel of the Pseudomonas aeruginosa outer
membrane has a binding site for basic amino acids and peptides. 7 Biol Chem 265:15680-
15684.

Tsakris A., Ikonomidis A., Pournaras S., Tzouvelekis L . S., Sofianou D., Legakis N. J.,
Maniatis A. N. (2006): VIM-1 metallo-ß-lactamase in Acinetobacter baumannii. Emerg
Infect Dis 12: 981-983.

Tysall L., W. Stockdale M.W., Chadwick P.R., Palepou M-F.L, Towner K.J., Livermore
D.M., Woodford N. (2002): IMP-1 carbapenemase detected in an Acinetobacter clinical
isolate from the U K . J Antimicrob Chemother 49: 217-218.

Ulyashova M.M., Khalilova Y.I., Rubtsova M.Y., Edelstein M . V., Alexandrova I.A.,
Egorov A.M. (2010): Oligonucleotide microarray for the identification of carbapenemase
genes of molecular classes A , B, and D. Acta Naturae 2: 101 109.

Van Bambeke F., Glupczynski Y., Plésiat P., Pechěre J.C., Tulkens P.M. (2003)
Antibiotic efflux pumps in prokaryotic cells: occurence, impact on resistance and strategies
for the future of antimicrobial therapy. J Antimicrob Chemother 51: 1055-1065.

Villegas M.V., Lolans K., Correa A., Kattan J.N., Lopez J. A., Quinn J. P. (2007). First
Identification of Pseudomonas aeruginosa Isolates Producing a KPC-Type Carbapenem-
Hydrolyzing ß-Lactamase. Antimicrob Agents Chemother 51: 1553-1555.

Votava, M . (2005) Lékařská mikrobiologie obecná, 2. přepracované vydání. Brno: Neptun,

352 s., ISBN: 8086850005.

Votava, M . (2006) Lékařská mikrobiologie špeciálni, Brno: Neptun, 495 s., ISBN:
8090289665.

Wachino J., Yoshida EL, Yamane K., Suzuki S., Matsui M., Yamagishi T., Tsutsui A.,
Konda T., Shibayama K., Arakawa Y. (2011): SMB-1, a novel subclass B3 metallo-beta-
lactamase, associated with ISCRl and a class 1 integren, from a carbapenem-resistant
Serratia marcescens clinical isolate. Antimicrob Agents Chemothe. 55: 5143-5149.
51
Walsh T.R., Bolmström A., Qwärnström A., Gales A. (2002): Evaluation of a New Etest
for Detecting Metallo-ß-Lactamases in Routine Clinical Testing. 7 Clin Microbiol 40: 2755-
2759.

Walsh T.R., Weeks J., Livermore D.M., Toleman M.A. (2011): Dissemination of NDM-1
positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an
environmental point prevalence study. Lancet Infect Dis 11: 355-362.

Watanabe M., Iyobe S., Inoue M.,Mitsuhashi S. (1991): Transferable Imipenem Resistance
in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 35:147-151.

Wendel A.F., Brodner A.H.B., Wydra S., Ressina S., Henrich B., Pfeffer K., Toleman
M.A., MacKenzie C.R (2013): Genetic characterization and emergence of the metallo-ß-
lactamase GIM-1 in Pseudomonas spp. and Enterobacteriaceae during a long-term outbreak.
Antimicrob Agents Chemother 57: 5162-5165.

Wexler H.M., Molitoris D., Finegold S.M. (2000): In vitro activities of MK-826 (L-
749,345) against 363 strains of anaerobic bacteria. Antimicrob Agents Chemother 44: 2222-
2224.

Woodford N., Zhang J., Warner M . , Kaufmann M.E., Matos J., MacDonald A.,
Brudney D., Sompolinsky D., Navon-Venezia S., Livermore D.M. (2008): Arrival of
Klebsiella pneumoniae producing K P C carbapenemase in the United Kingdom. 7 Antimicrob
Chemother 62: 1261-1264.

Wong E.W., Yusof M.Y., Mansor M.B., Anbazhagan D., Ong S.Y., Sekaran S.D. (2009):
Disruption of adeB gene has a greater effect on resistance to meropenems than adeA gene in
Acinetobacter spp. isolated from University Malaya Medical Centre. Singapore Med J
50:822-826.

Yang, Y., P. Wu, and D. M . Livermore. (1990): Biochemical characterization of a ß-

lactamase that hydrolyzes penems and carbapenems from two Serratia marcescens isolates.
Antimicrob Agents Chemother 34:755-758.

Yigit H., Queenan A. M., Anderson G. J., Domenech-Sanchez A., Biddle J.W., Steward
C. D., Alberti S., Bush K., Tenover F.C. (2001): Novel carbapenem-hydrolyzing b-
lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob
Agents Chemother 45:1151-1161.

52
Yong D., Toleman M.A., Giske CH.G., Cho H.S., Sundman K., Lee K., Walsh T.R.
(2009): Characterization of a new metallo-ß-lactamase gene, WÖNDM-I, and a novel
erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae
sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother 53: 5046-5054.

Yu Y.-S., Du X . - X . , Zhou Z.-H., Chen Y.-G., Li L.-J. (2006): First Isolation of blami-i'm an
Enterobacter cloacae Clinical Isolate from China. Antimicrob Agents Chemother 50: 1610
1611.

53
Internetové zdroje

Lahey. [online] [citované dňa 2015-4-29]. Dostupné na <http://www.lahey.org/Studies/ >

Legal Force-Trademarkia. Finibax. [online] [citované dňa 2015-4-10]. Dostupné

<http://www.trademarkia.com/finibax-76679887.html >

WHO. [online] [citované dňa 2015-4-9]. Dostupné na <http://www.who.int/en >

Wikipedia. Beta-lactam antibiotic. [online] [citované dňa 2015-4-29]. Dostupné

<http://en.wikipedia.org/wiki/%CE%92-lactam_antibiotic >

54