Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii

Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu,

unaczynienia i progresji nowotworowej
jasnokomórkowego raka nerki

Paulina Marona

Rozprawa doktorska wykonana pod opieką

Dr hab. Katarzyny Miękus

W Zakładzie Biochemii Ogólnej,
Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytetu Jagiellońskiego

Recenzenci:
Dr hab. Anna Żaczek
Prof. dr hab. n. med. Piotr Widłak

Kraków 2020

1
Pracę dedykuję Rodzicom i Dziadkowi

2
 Szczególnie pragnę podziękować Pani Promotor dr hab. Katarzynie
Miękus za jej nieustające wsparcie, cenne wskazówki zarówno merytoryczne
jak i praktyczne i pomoc w rozwiązywaniu problemów nie tylko badawczych,
a także za możliwość realizacji badań zawartych w niniejszej rozprawie
doktorskiej.

Pragnę podziękować Pani prof. dr hab. Jolancie Jurze za cenne uwagi i

pomoc oraz za możliwość pracy w Zakładzie Biochemii Ogólnej i stworzenie
dobrej i kreatywnej atmosfery pracy.

Dziękuję bardzo Pani dr hab. Annie Żaczek i Panu prof. dr hab. n. med.
Piotrowi Widłakowi za podjęcie się recenzji niniejszej pracy oraz wszystkie
cenne uwagi i komentarze.

Dziękuję wszystkim koleżankom i kolegom z Zakładu z którymi miałam

okazję współpracować, przede wszystkim Judycie oraz Oliwii, a także
Beacie, Magdzie, Piotrkowi, Mateuszowi, Natalii, Róży, Jurkowi, Agacie,
Darkowi – za pomoc w wykonywaniu doświadczeń, ciekawe dyskusje i miłą
atmosferę.

Dziękuję koleżankom i kolegom z innych Zakładów Wydziału Biochemii,

Biofizyki i Biotechnologii za wszelką pomoc.

Rodzicom, Rodzinie i Przyjaciołom serdecznie dziękuję za ich wsparcie w

realizacji swojej pasji, dobre słowa i wiarę we mnie.

3
FINANSOWANIE

Badania wykonane w ramach rozprawy doktorskiej były współfinansowane ze

środków Narodowego Centrum Nauki, w ramach projektu Preludium 13: „Rola
białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej
jasnokomórkowego raka nerki” – UMO-2017/25/N/NZ5/03014 – P. Marona,
Sonata 5: „Analiza molekularna progresji jasnokomórkowego raka nerki w
aspekcie poszukiwania czynników predykcyjnych przed planowanym
leczeniem” – UMO-2013/09/D/NZ5/00249 – K. Miękus, Opus 10: „Rola białka
MCPIP1 w procesach wzrostu, progresji i unaczynienia jasnokomórkowego
raka nerki” – UMO-2015/19/B/NZ5/01405 – K. Miękus.
Autorka rozprawy doktorskiej jest stypendystką programów: Etiuda 6
przyznanym przez Narodowe Centrum Nauki – UMO-2018/28/T/NZ5/00347,
stypendium START 2018 przyznanym przez Fundację na rzecz Nauki
Polskiej oraz stypendium L’Oreal- UNESCO, Dla Kobiet i Nauki 2019.
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego był
członkiem Konsorcjum, które uzyskało status Krajowego Naukowego
Ośrodka Wiodącego (KNOW).

4
 Spis treści
1 Rozwinięcie skrótów ..................................................................................................... 8
2 Streszczenie ................................................................................................................. 11
3 Summary ...................................................................................................................... 13
4 Wstęp teoretyczny ....................................................................................................... 15
4.1 Jasnokomórkowy rak nerki ................................................................................ 15
4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki ....................................... 15
4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki.............................. 16
4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki .............................. 17
4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu ........... 19
4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy .................................................... 19
4.2.2 Etapy angiogenezy...................................................................................... 20
4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC ........................................................ 23
4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met .............................................................. 23
4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki ...................................................................... 26
4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno-
mezenchymalnego (EMT) .......................................................................................... 27
4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu ...... 30
4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki .................................................... 31
4.3.6 Oporność na inhibitory angiogenezy ........................................................ 32
4.3.7 Receptor c-Met, a nabywanie oporności na leki celowane ................... 33
4.4 Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia......... 34
4.4.1 Procesy zapalne w chorobie nowotworowej ........................................... 34
4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1 ..................................... 35
4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1 ......................................................... 37
4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik
homeostazy .................................................................................................................. 38
4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu ............................................. 40
5 Cel pracy doktorskiej .................................................................................................. 42
6 Materiały i metody ....................................................................................................... 43
6.1 Materiały ............................................................................................................... 43
6.1.1 Materiał ludzki .............................................................................................. 43
6.1.2 Materiał zwierzęcy ....................................................................................... 43
6.1.3 Materiał biologiczny..................................................................................... 43
6.1.4 Odczynniki .................................................................................................... 44
6.1.5 Przeciwciała ................................................................................................. 46

5
 6.1.6 Startery.......................................................................................................... 47
6.2 Metody .................................................................................................................. 48
6.2.1 Hodowle komórkowe................................................................................... 48
6.2.2 Przejściowa transfekcja małym interferującym RNA (siRNA) .............. 49
6.2.3 Stabilna transdukcja za pomocą wektorów wirusowych ....................... 49
6.2.4 Stymulacja komórek .................................................................................... 50
6.2.5 Analiza mikromacierzy ................................................................................ 51
6.2.6 Izolacja i analiza poziomu białek metodą western blot.......................... 51
6.2.7 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym ....................................... 52
6.2.8 Test redukcji MTT ........................................................................................ 53
6.2.9 Test proliferacji ............................................................................................ 54
6.2.10 Test migracji – zarastanie rany ................................................................. 54
6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych .... 54
6.2.12 Test fibrynowy .............................................................................................. 55
6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) .............................................................................................. 55
6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych ................. 56
6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym .............................................................. 56
6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal ................. 56
6.2.17 Analiza cyklu komórkowego ...................................................................... 57
6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek ................................... 57
6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo ................................................................. 57
6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości ....... 59
6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii
przepływowej................................................................................................................ 59
6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków
mrożeniowych .............................................................................................................. 59
6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych ................ 60
6.2.24 Analiza statystyczna ................................................................................... 60
7 Wyniki ............................................................................................................................ 61
7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji
nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki ............................................................ 61
7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację
komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo ................ 61
7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów
w warunkach in vivo .................................................................................................... 63
7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w
warunkach in vivo ........................................................................................................ 65

6
 7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń
międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i tworzenie
naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro................................................. 68
7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników
proangiogennych w komórkach nowotworowych ................................................... 71
7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF-
1/CXCR4....................................................................................................................... 72
7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje
nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC .................................. 75
7.1.8 Aktywność RNazy MCPIP1 reguluje fosforylację receptora c-Met ...... 77
7.2 Poziom białka MCPIP1 w próbkach klinicznych pacjentów z ccRCC ......... 79
7.3 Poziom białka MCPIP1, a oporność na terapie celowane w
jasnokomórkowym raku nerki ........................................................................................ 82
7.3.1 Sunitinib i sorafenib wpływają na potencjał proliferacyjny i cykl
komórkowy ccRCC...................................................................................................... 82
7.3.2 Stymulacja sunitinibem i sorafenibem wpływa na fenotyp komórek
ccRCC i zmienia ich profil białkowy .......................................................................... 84
7.3.3 Oporność na sunitinib i sorafenib wpływa na progresję ccRCC w
warunkach in vivo ........................................................................................................ 87
7.3.4 Białko GSK3β reguluje poziom receptora c-Met oraz białka MCPIP1 90
8 Dyskusja ....................................................................................................................... 92
8.1 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje proliferację i żywotność ...................... 93
8.2 Poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na
aktywność komórek śródbłonka i angiogenezę .......................................................... 95
8.3 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną i progresję
nowotworu ........................................................................................................................ 99
8.4 Białko MCPIP1 stanowi czynnik prognostyczny w ccRCC ......................... 102
8.5 Oporność na sunitinib i sorafenib jest regulowana przez białko MCPIP1 i
receptor c-Met ................................................................................................................ 104
9 Wnioski końcowe ....................................................................................................... 110
10 Bibliografia .............................................................................................................. 112

7
1 Rozwinięcie skrótów
Akt (ang. Protein Kinase B) – kinaza białkowa Akt

AP-1 (ang. Activator Protein 1) - Czynnik transkrypcyjny

BAP1 (ang. BRCA1 associated protein-1)

BCA (ang. Bicinchonic acid) – kwas bicynchoniowy

BSA (ang. Bovine serum albumin) – albumina z surowicy wołowej

CBP (ang. CREB binding protein) – białko wiążące CREB

ccRCC (ang. Clear cell renal cell carcinoma) – jasnokomórkowy rak nerki

CD31 (ang. Cluster of differentiation 31, PECAM- Platelet endothelial cell adhesion molecule) antygen
różnicowania komórkowego 31, cząsteczka adhezji komórkowej płytek I śródbłonka

c/EBP β (ang. CCAAT/enhancer binding protein b) – białko wiążące sekwencję CCAATβ

cDNA (ang. Complementary DNA) – komplementarny DNA

CDK (ang. Cyklin-dependent kinase) – kinaza zależna od cyklin

Ct (ang. Cycle treshold) – numer cyklu reakcji qPCR w którym fluorescencja emitowana przez próbkę
osiągnęła wartość progową

CTC (ang. Circulating tumor cells) – krążące komórki nowotworowe

CSC (ang.Cancer stem cells) - nowotworowe komórki macierzyste

CXCL (ang. CXC Ligand) - chemokina o motywie Cysteina-Aminokwas-Cysteina

CXCR4 (ang. Chemokine receptor 4) – receptor dla chemokin 4

DAPI (ang. 4’-6-diamidino-2-phenylindole) – 4'-6-diamidyno-2-fenyloindol

DMSO (ang. Dimethyl sulfoxide) – dimetylosulfotlenek

DNA (ang. Deoxyrybonucleic acid) – kwas deoksyrybonukleinowy

dNTP (ang. Deoxynucleosides triphosphate) - trifosforany deoksyrybonukleozydów

EC (ang. Endothelial cell) – komórka endotelialna

e-kadheryna (ang. Epithelial cadherin)

EDTA (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid) - Kwas etylenodiaminotetraoctowy

EF2 (ang. Elongation factor-2) – czynnik elongacyjny-2

EGF (ang. Epidermal Growth Factor) - Epidermalny czynnik wzrostu

ELISA (ang. Enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymatyczny

Elk-1 (ang. ETS domain-containing protein 1)

EMT (ang. Epithelial-mesenchymal transition) - przejście epitelialno-mezenchymalne

EpCAM (ang. Epithelial cell adhesion molecule) – cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych

EPO Erytropoetyna

ERK (ang. Extracellular Signal-Regulated Kinase) - Kinazy białkowe aktywowane czynnikami

zewnątrzkomórkowymi

FAK (ang. Focal adhesion kinase) – kinaza ogniskowo-adhezyjna

FBS (ang. Fetal bovine serum) – bydlęca surowica płodowa

8
GAB1 (ang. GRB2-associated binding protein 1) – białko oddziałujące z GRB2

GAPDH (ang. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) – dehydrogenaza aldehydu 3-

fosfoglicerynowego

GFP (ang. Green fluorescent protein) – zielone białko fluorescencyjne

GLUT-1 (ang. Glucose transporter 1) – transporter glukozy

GSK3β (ang. Glycogen synthase kinase 3 beta) – kinaza syntazy glikogenowej

GRB2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2) – białko wiążące receptor dla czynnika wzrostu
typu 2)

HGF (ang. Hepatocyte growth factor) – czynnik wzrostu hepatocytów

HIF (ang. Hypoxia-inducible factor) – czynnik indukowany przez hipoksję

HMEC-1 (ang. Human microvascular endothelial cells)

HUVEC (ang. Human umbilical vein endothelial cells)

HRE (ang. Hypoxia responsive elelments) – element odpowiedzi na hipoksję

HRP (ang. Horseradish peroxidase) – peroksydaza chrzanowa

IKK (ang. IκB Kinase) - Kompleks o aktywności kinazy dla IκB

IκB Inhibitor κB

IL (ang. Interleukin) – interleukina

INF Interferon

LIF (ang. Leukemia inhibitory factor) – czynnik hamujący białaczkę

LPS (ang. Lipopolisaccharide) - Lipopolisacharyd

MAPK (ang. Mitogen-activated protein kinases) – kinazy białkowe aktywowane mitogenami

MCP-1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1) - Czynnik chemotaktyczny monocytów 1

MCPIP1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induced Protein 1) - Białko indukowane przez
czynnik MCP-1

MET (ang. Mesenchymal-epithelial transition) - przejście mezenchymalno-epitelialne

MMP (ang. Matrix Metalloproteinase) - Metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej

mRNA (ang. Messenger RNA) – matrycowy RNA

mTOR (ang. Mammalian Target Of Rapamycin) - Ssaczy cel Rapamycyny

n-kadheryna (ang. Neural cadherin)

NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – czynnik jądrowy

oddziałujący ze wzmacniaczem sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny w aktywowanych
limfocytach B

PAK (ang. P21-activated kinase) – kinaza aktywowana p21

PBS (ang. Phosphate buffered saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

PCR (ang. Polymerase chain reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy

PDGF (ang. Platelet-derived growth factor) - Płytkopochodny czynnik wzrostu

PI3K (ang. Phosphatidylinositol 3-kinase) - 3-kinaza fosfatydyloinozytolu

PIN (ang. PilT N- Terminus) - Domena homologiczna do N-terminalnego fragmentu białka PilT

9
Rac1 (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – substrat toksyny botulinowej C3 związany z
Ras

RAS (ang. Rat sarcoma viral homolog)

RB1 (ang. Retinoblastoma) - siatkówczak

qRT PCR (ang. Quantitative reverse transcriptase PCR) – ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym

RNA (ang. Rybonucleic acid) – kwas rybonukleinowy

RNaza Rybonukleaza

RT (ang. Reverse transcription) – odwrotna transkrypcja

RTK (ang. Tyrosine kinase receptor) – receptor o właściwościach kinazy tyrozynowej

SDF1 (ang. Stromal cell-derived factor-1 alpha) – czynnik-1 alfa pochodzenia podścieliskowego

SD (ang. Standard deviation) – odchylenie standardowe próby

SEM (ang. Standard error of mean) – błąd standardowy próby

siRNA (ang. Short interfering RNA) – małe interferujące RNA

SOS (ang. Son of Sevenless)

STAT3 (ang. Signal transducer and activator of transcription 3)

TBS (ang. Tris buffered saline) – bufor trisowy

TCF (ang. T-cell factor) – czynnik transkrypcyjny komórek T

TEMED (ang. Tetramethylethylenediamine) – N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina

TGF (ang. Transforming growth factor) – transformujący czynnik wzrostu

TKI (ang. Tyrosine kinase inhibitor) – inhibitor receptorów o właściwości kinazy tyrozynowej

TNF α (ang. Tumor necrosis factor-αlpha) – czynnik martwicy nowotworów alfa

UTR (ang. Untranslated region) – obszar mRNA nie ulegający translacji

VEGF (ang. Vascular endothelial growth factor) – czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego

VE-kadheryna (ang. Vascular endothelial cadherin)

VEGF-R1 (ang. VEGF receptor-1) – receptor 1 czynnika VEGF, inaczej FLT1

VEGF-R2 (ang. VEGF receptor-2) – receptor 2 czynnika VEGF

VHL Białko von Hippel-Lindau

ZEB (ang. Zinc finger E-box binding homeobox)

ZO-1 (ang. Zonula occludens-1)

10
2 Streszczenie
Nowotwory nerki dotykają co roku prawie 300 tysięcy osób, a 120 tysięcy umiera
z powodu tej choroby. Najczęściej spotykanym typem jest jasnokomórkowy rak nerki
który stanowi ok. 80% wszystkich przypadków. Ze względu na brak typowych
objawów w pierwszych stadiach, w chwili wykrycia choroby przerzuty stwierdza się
już u jednej trzeciej pacjentów, a szanse na przeżycie dramatycznie maleją. Obecnie
najczęściej stosowanym leczeniem jest wycięcie guza z fragmentem bądź całą nerką,
a następnie chemio- lub radioterapia, które wiążą się z licznymi skutkami ubocznymi.
Ze względu na wysoki stopień unaczynienia guzów, w stadium zaawansowanym,
terapia opiera się na nowych lekach antyangiogennych blokujących receptory
niektórych kinaz tyrozynowych. Niestety, taka forma terapii nie jest w pełni
satysfakcjonująca ponieważ wydłuża czas przeżycia chorych jedynie o kilka miesięcy
co więcej, nowotwór bardzo szybko wykształca oporność na stosowane leki.

ccRCC tworzy guzy silnie unaczynione, ze względu na częste mutacje genu

supresorowego von Hippel-Lindau i nadmierne wydzielanie czynników
proangiogennych. Nabywanie przez komórki umiejętności do opuszczania
pierwotnego ogniska, aktywnej migracji i osiedlania się w odległych narządach,
warunkowana jest wieloma czynnikami m. in. stopniem unaczynienia, obecnością
komórek układu immunologicznego, a także nabieraniem przez komórki epitelialne
właściwości i fenotypu komórek mezenchymalnych. Istotną rolę, zarówno w procesie
angiogenezy jak i przejścia epitelialno-mezenchymalnego pełni receptor c-Met,
ponieważ stymuluje proliferację i hamuje apoptozę oraz reguluje szereg czynników
odpowiedzialnych za przerzutowanie.

Procesy zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w procesie wzrostu i rozwoju

nowotworu. Jednym z modulatorów odpowiedzi zapalnej jest białko MCPIP1,
kodowane przez gen ZC3H12A. Białko to zaangażowane jest w negatywną regulację
stanu zapalnego dzięki aktywności RNazy, która pozwala na degradację transkryptów
cytokin prozapalnych. Rosnąca liczba publikacji naukowych sugeruje, że białko
MCPIP1 może istotnie wpływać na rozwój nowotworu, poprzez pośrednią lub
bezpośrednią regulację czynników zaangażowanych w procesy wzrostu, proliferacji
czy śmierci komórkowej. Co więcej, wykazano że poziom MCPIP1 w tkance
nowotworowej jest znacząco niższy w porównaniu z otaczającą zdrową, a także może
regulować poziom czynników proangiogennych takich jak VEGF czy HIF.

Celem niniejszej pracy doktorskiej było określenie roli białka MCPIP1 w

procesach wzrostu, unaczynienia i progresji jasnokomórkowego raka nerki, a także

11
jego wpływ na nabieranie przez komórki nowotworowe oporności na leki celowane
sunitinib i sorafenib.

W pierwszym etapie badań wykorzystano linie komórkowe Caki-1 oraz Caki-2 z

obniżonym poziomem białka MCPIP1, a także ze stabilną nadekspresją dzikiej lub
zmutowanej formy MCPIP1. Wykazano, że niski poziom białka MCPIP1 lub
zahamowanie jego aktywności RNazy prowadzi do zwiększenia potencjału
proliferacyjnego komórek nowotworowych oraz przyspieszenia wzrostu guzów in
vivo. Dodatkowo, brak białka MCPIP1 wpływa na wzrost ilości funkcjonalnych naczyń
krwionośnych w porównaniu z kontrolą. Nadekspresja dzikiej formy MCPIP1
spowalnia wzrost guzów i zmniejsza unaczynienie in vivo. W toku doświadczeń
wykazano również, że od poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych
zależy aktywacja komórek endotelialnych. Zarówno komórki ccRCC z wyciszeniem
jak i mutacją w domenie RNazowej MCPIP1 wydzielają zdecydowanie więcej
czynników proangiogennych w porównaniu z komórkami kontrolnymi czy z
nadekspresją dzikiej formy MCPIP1, co w konsekwencji wpływa na rozluźnianie
połączeń komórkowych przez internalizację VE-kadheryny i aktywuje komórki
endotelialne do migracji. Równocześnie, po obniżeniu aktywności MCPIP1, dochodzi
do zwiększenia ekspresji genów CXCR4, SDF-1 czy c-Met, odpowiedzialnych za
podziały komórkowe i przerzutowanie. Co istotne, nadekspresja MCPIP1 zmniejsza
ilość powstających przerzutów oraz hamuje proces EMT.

Analizując próbki kliniczne pacjentów w różnym stadium zaawansowania ccRCC

wykazano, że razem z obniżającym się poziomem białka MCPIP1 w kolejnych
stadiach choroby, rośnie poziom receptora c-Met oraz innych białek zaangażowanych
w progresję nowotworową.

W ostatnim etapie badań zaobserwowano, że mechanizm oporności na leki

sunitinib i sorafenib może polegać na podwyższeniu aktywności receptora c-Met z
jednoczesnym obniżeniem poziomu białka MCPIP1, co zwiększa agresywność
komórek nowotworowych, ilość przerzutów oraz zmienia ich fenotyp.

Podsumowując, białko MCPIP1 może być markerem zaawansowania choroby

nowotworowej oraz pełnić kluczową rolę w rozwoju ccRCC, poprzez kontrolę procesu
proliferacji, progresji oraz wydzielania czynników proangiogennych. Uzyskane wyniki
wskazały także na zależną regulację białka MCPIP1 i receptora c-Met oraz ich wpływ
na lekooporność komórek ccRCC. Biorąc pod uwagę wyniki przedstawione w
niniejszej pracy i opublikowane przez inne zespoły badawcze, można zasugerować,
że MCPIP1 może być uniwersalnym białkiem supresorowym.

12
3 Summary
Every year, kidney cancers affect nearly 300 000 people, and 120 000 die of this
disease. The most common type is clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) which
comprises 80% of all cases. Due to the lack of typical symptoms in the first stages, at
the time of diagnosis, metastases are found in one-third of patients, and the chances
of survival are dramatically reduced. Currently, the most commonly used treatment is
tumor excision with partial or total nefrectomy, followed by chemo- or radiotherapy,
which are associated with numerous side effects. Due to high level of tumor
vasculature, therapy of more advanced stages of ccRCC is based on new
antiangiogenic drugs, which inhibit multiple tyrosine kinase receptors such as VEGFR
or PDGFR. Treatment with small molecules showed in approximately 38% of patients
significant tumor control. However, despite of the efficacy of therapy, ccRCC often
develops drug resistance, and the majority of patients who receive such treatment
exhibit progressive disease after one year.

Formation of new blood vessels is a critical step during tumorigenesis and

metastatic spread. ccRCC develops highly vascularized tumors due to common
mutation in von Hippel-Lindau gene and overexpression of proangiogenic factors. The
ccRCC ability to leave primary site, active migration and settle in distant organs, is
orchestrated by many factors such as angiogenesis, presence of immune cells and
acquisition of the properties of more aggressive, mesenchymal phenotype. C-Met
receptor plays an important role in both angiogenesis and epithelial to mesenchymal
transition. It stimulates proliferation, inhibits apoptosis and regulates a number of
factors responsible for metastasis.

Inflammatory processes play a significant role in ccRCC growth and

development. One of the negative modulators of the inflammatory response is the
MCPIP1 protein, encoded by the ZC3H12A gene. MCPIP1 acts as an endonuclease
due to RNase activity, which allows degradation of mRNA coding proinflammatory
cytokines. Recent reports suggests that the MCPIP1 protein may significantly affect
tumor development through direct or indirect regulation of factors involved in the
processes of growth, proliferation or cell death. Moreover, it has been shown that
MCPIP1 affects expression of proangiogenic factors such as VEGF or HIFs, and its
level in tumor is lower than in adjacent healthy tissue.

The main aim of doctoral dissertation research was to determine the role of
MCPIP1 protein in the processes of growth, vascularization and progression of clear

13
cell renal cell carcinoma, as well as its effect on acquiring resistance to targeted drugs
sunitinib and sorafenib.

In the first stage of the study, Caki-1 and Caki-2 cell lines with downregulation of
MCPIP1 protein, as well as with stable overexpression of the wild type MCPIP1 and
mutation in PIN domain which completely abolishes endonuclease activity were used.
The following work demonstrates that low level of MCPIP1 or inhibition of its RNase
activity lead to an increase in the proliferative potential of tumor cells and tumor growth
in vivo. In addition, lack of MCPIP1 protein increases the number of functional blood
vessels compared to control. In contrast, overexpression of the MCPIP1 slows tumor
growth and reduces vascularization in vivo. Conducted experiments showed that
activation of endothelial cells depends on the level of MCPIP1 protein in cancer cells.
Both, inhibition and mutation of MCPIP1 in ccRCC increased secretion of
proangiogenic factors such as IL-6, IL-8 and VEGF compared to control or MCPIP1
overexpressed cells. In consequence, this leads to internalization of VE-cadherin,
relaxation of cell-cell junctions and activation of endothelial cells migratory potential.
Concominantly, MCPIP1 level affects the expression of CXCR4, SDF-1 and c-Met
genes, which are responsible for cell division and metastasis. Importantly, MCPIP1
overexpression reduces the number of lung micrometastases and inhibits the EMT
process.

Further analysis of clinical samples of patients at various stages of ccRCC, has

shown that MCPIP1 protein level decreases with cancer progression. Furthermore,
the level of c-Met receptor and other factors involved in cancer progression increase
with successive stages of the disease.

In the last part of the study, it was observed that therapy with small molecules
such as sunitinib and sorafenib increases the aggressiveness of cancer cells and
amount of lung metastases. Moreover, elevated phosphorylation of c-Met receptor
with simultaneous decrease in the level of MCPIP1 may be a potential mechanism of
resistance to sunitinib and sorafenib treatment.

In summary, the MCPIP1 protein can be one of the factors modulating tumor
development and marker of ccRCC progression. MCPIP1 controls cell proliferation,
migration and secretion of proangiogenic factors. Furthermore, dependent regulation
of MCPIP1 protein and c-Met receptor and their effect on drug resistance has been
proven during research. Considering the results presented in this dissertation and
published by other researchers, it is plausible that MCPIP1 may act as universal tumor
suppressor.

14
4 Wstęp teoretyczny
4.1 Jasnokomórkowy rak nerki
4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki
Rak nerki (ang. Renal Cell Carcinoma, RCC), wywodzi się z komórek epitelialnych
kanalików nerkowych i jest najczęstszym nowotworem nerek (ok. 90% wszystkich
przypadków), znajdującym się w pierwszej dziesiątce najczęściej diagnozowanych
nowotworów złośliwych (1,2). Odsetek zachorowań na raka nerki wzrósł o 30% w
ciągu ostatnich 20 lat, co może być spowodowane zmianą trybu życia jak również
udoskonaleniem metod obrazowania i diagnostyki. Według klasyfikacji histologicznej
wyróżnić można kilka różnych typów (3,4):

• Jasnokomórkowy rak nerki (ok. 80% przypadków)

• Rak brodawkowaty (10-15% przypadków)
• Rak chromofobowy (5% przypadków)
• Rak z cewek zbiorczych (1-2% przypadków)
• Rak sarkomatoidalny (1% przypadków)
• Niesklasyfikowany rak nerki

Wymienione rodzaje raka nerki różnią się etiologią, molekularnym charakterem

zmian prowadzących do powstania nowotworu, przebiegiem oraz agresywnością
(2,5,6). Jasnokomórkowy rak nerki (ang. Clear cell renal cell carcinoma, ccRCC),
który jest najczęstszym i bardzo agresywnym typem RCC, występuje zazwyczaj w
korze nerki, makroskopowo ma wygląd żółtawych nacieków z występującymi
miejscami nekrotycznymi i krwotocznymi, a jego komórki charakteryzują się jasną
cytoplazmą, przez nagromadzenie dużej ilości lipidów (5). Prawidłowa klasyfikacja
histologiczna jest niezwykle istotna dla oceny prognozy oraz dobrania właściwej
terapii leczniczej (7). Dowiedziono, że wykrycie choroby we wczesnych stadiach
zaawansowania klinicznego znacząco zwiększa odsetek przeżyć pięcioletnich,
natomiast szanse na przeżycie pacjentów w ostatnich stadiach choroby, wiążących
się z wysokim stopniem inwazji i obecnością przerzutów, maleją prawie trzykrotnie.
Ocena rokowania dokonywana jest zazwyczaj na podstawie klasyfikacji TNM, gdzie
T - oznacza opis wielkość guza pierwotnego i inwazję okolicznych żył, N – oznacza
zajęcie okolicznych węzłów chłonnych, a M – oznacza obecność odległych
przerzutów (3).

Niezależną klasyfikacją histologiczną jest skala Fuhrman, gdzie ocenie

poddawane są jądra komórkowe (8,9):

• Stadium 1 - Okrągłe jądra o średnicy ok. 10 μm, bez lub z bardzo małym
jąderkiem

15
 • Stadium 2 - Nieco nieregularne, średnica ok. 15 μm, jąderko widoczne przy
powiększeniu 400x
• Stadium 3 - Średnio lub bardzo nieregularne kontury jąder, średnica ok. 20
μm, z dużym jąderkiem widocznym pod powiększeniem 100x
• Stadium 4 - Jądro podobne do stadium 3, często komórki wielojądrzaste, z
dużymi fragmentami chromatyny

Co roku wykrywanych jest ok. 300 tysięcy nowych przypadków ccRCC, a 120
tysięcy osób umiera z powodu tej choroby (2,5). Wysoka śmiertelność spowodowana
jest zwykle zbyt późną diagnostyką. W początkowych stadiach nie występuje
klasyczna triada objawów: ból w okolicy lędźwiowej, wyczuwalny guz i krwiomocz. Z
tego względu, nowotwór często wykrywany jest przez przypadek podczas badań
obrazowych, zazwyczaj z współistniejącymi przerzutami. Ryzyko choroby rośnie wraz
z wiekiem, a szczyt zachorowań przypada między szóstą i siódmą dekadą życia,
dodatkowo predyspozycje rodzinne zwiększają ryzyko wystąpienia około dwukrotnie
(4). Mężczyźni zapadają na ten nowotwór prawie dwukrotnie częściej niż kobiety (5).

4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki

Czynnikami zwiększającymi ryzyko zapadalności na jasnokomórkowego raka
nerki są m. in. palenie papierosów, otyłość czy nadciśnienie tętnicze oraz
predyspozycje genetyczne. Analiza genomowa oraz analiza transkryptomu setek
próbek od pacjentów ze zdiagnozowanym ccRCC wykazała, że najczęściej
występującą zmianą genetyczną w jasnokomórkowym raku nerki jest delecja
chromosomu 3p (10,11). Te same badania wykazały utratę heterozygotyczności 3p
(ang. Loss of heterozygosity, LOH) u ponad 90% przebadanych przypadków (10,11).
Większość zaobserwowanych zmian na chromosomie 3p obejmowała delecje,
mutacje lub metylacje. Supresorami nowotworzenia okazały się 4 najbardziej
zmutowane geny: PBRM1, BAP1, SETD2 oraz VHL znajdujące się blisko siebie na
chromosomie 3p (10,11). PBRM1, SETD2 i BAP1 pełnią funkcję modulatorów
chromatyny oraz histonów (12). Natomiast VHL jest niezwykle istotnym regulatorem
angiogenezy i czynników indukowanych przez hipoksję (ang. Hypoxia inducible
factors, HIFs) (12). Co ciekawe, mediana przeżycia pacjentów z mutacją genu BAP1
była zdecydowanie niższa w porównaniu z pacjentami z mutacją genu PBRM1 (13).
Inne zmiany genetyczne, obserwowane w 28% przypadków ccRCC, to utrata
fragmentów chromosomów 6q, 8p12, 9p21-22, 10q (4,6) oraz mutacje genu TP53
oraz genów ścieżki sygnalizacyjnej PI3K-Akt-mTOR (10,11). Dodatkowo, często
występujące mutacje genu MTOR prowadzą do aktywacji wielu ścieżek
zaangażowanych m.in. w proliferację, angiogenezę i metabolizm komórek.

16
 Powyższe badania podkreślają jak istotna, oprócz oceny histologicznej jest
charakterystyka molekularna zmian w celu odpowiedniej klasyfikacji pacjentów i
zaproponowania najbardziej efektywnej terapii.

4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki

Białko von Hippel-Lindau (VHL), kodowane przez gen VHL, jest kluczowym
modulatorem odpowiedzi komórki na niedobór tlenu - hipoksję. Gen VHL jest
zaliczany do genów supresorowych, a jego mutacje sprzyjają powstawaniu silnie
unaczynionych nowotworów (14). Ekspresja genu VHL występuje we wszystkich
tkankach i tak jak wspomniano w poprzednim akapicie, jego locus znajduje się na
ramieniu krótkim chromosomu 3p25-26. Natomiast białko VHL wykazuje
specyficzność tkankową, największa jego ilość występuje kolejno w nerkach, wątrobie
i trzustce (15).

Główną funkcją białka VHL jest regulacja poziomu czynnika transkrypcyjnego

HIF1α. Działanie VHL polega na tworzeniu kompleksu VBC, razem z elonginą B i C,
kulliną i acetylotransferazą SSAT2, który posiada aktywność ligazy E3 ubikwityny i
rozpoznaje substrat, którym jest czynnik transkrypcyjny HIF1α (po hydroksylacji
proliny) (14,16–18). W wyniku tego HIF1α jest ubikwitynowany, a następnie ulega
degradacji w proteasomie. W sytuacji niedoboru tlenu lub mutacji VHL kompleks VBC
nie rozpoznaje białka HIF1α, którego poziom gwałtownie rośnie. Następnie, HIF1α
jest stabilizowany i przeniesiony z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie łączy się
z drugim, niewrażliwym na poziom tlenu, białkiem HIF1β oraz białkami CBP i p300
(14,16–18). Cały kompleks wiąże się z sekwencją HRE co powoduje ekspresję genów
zaangażowanych w odpowiedzi na hipoksję takich jak: czynnik wzrostu śródbłonka
naczyniowego (ang. Vascular endothelial growth factor, VEGF), transporter glukozy
1 (ang. Glucose transporter 1, GLUT-1), płytkopochodny czynnik wzrostu (ang.
Platelet-derived growth factor, PDGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (ang.
Transforming growth factor alpha, TGFα), czynnik-1 alfa pochodzenia
podścieliskowego (ang. Stromal-derived growth factor 1, SDF-1) czy erytropoetyna
(EPO) (Rycina 4.1.) (14,19–22). Wiele ścieżek sygnałowych zaangażowanych w
rozwój nowotworów jest także aktywowanych hipoksją m.in. ścieżka PI3K-Akt-mTOR,
Ras-Raf-ERK czy HGF-c-Met (6,23–25)

Zespół von Hippel-Lindau (VHL) jest schorzeniem dziedziczonym

autosomalnie dominująco, znacząco zwiększającym ryzyko zachorowania na
jasnokomórkowego raka nerki (26). Najczęstszymi mutacjami prowadzącymi do
choroby VHL są przesuwające ramkę odczytu delecje i insercje oraz mutacje zmiany

17
sensu genu VHL, które prowadzą do powstania niefunkcjonalnego produktu (27).
Większość pacjentów dziedziczy zmienioną kopię genu od jednego z rodziców, ale
ok. 20% przypadków jest spowodowanych spontaniczną mutacją zazwyczaj w fazie
wczesnej embriogenezy (28). Zmiana drugiego allelu nabywana jest spontanicznie w
trakcie życia, co w efekcie prowadzi do ujawnienia zespołu VHL, powstawania cyst i
zmian nowotworowych. Mutacja germinalna jednego allelu, a następnie somatyczna
drugiego jest określana jako utrata heterozygotyczności (29). Hipermetylacja w
promotorze genu VHL także powoduje jego inaktywację i jest obserwowana od 5 do
20% przypadków ccRCC (6).

Rycina 4.1. Schemat ilustrujący działanie białka VHL w warunkach normalnego poziomu
tlenu (normoksja), głodu tlenowego (hipoksja) oraz przy mutacji genu VHL.
Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (14-22).

Przy zespole VHL obserwuje się większą predyspozycję do nowotworów nerek

(przede wszystkim ccRCC), nadnerczy, siatkówki czy móżdżku, dodatkowo ich
objawy pojawiają się wcześniej, niż u osób nieobarczonych zespołem von Hippel-
Lindau (30). Kliniczna klasyfikacja choroby von Hippel-Lindau obejmuje 2 główne
grupy, z których każda wiąże się z inną etiologią i predyspozycją do konkretnego
rodzaju nowotworu. Grupa pierwsza charakteryzuje się głównie mutacjami
nonsensownym i delecjami VHL oraz niskim ryzykiem wystąpienia guza

18
chromochłonnego, natomiast grupa druga mutacją zmiany sensu genu VHL i wysoką
predyspozycją rozwinięcia guza chromochłonnego (30,31). Dodatkowo grupę drugą
dzieli się na 3 podtypy 2A, 2B i 2C. Chorzy z typem 1 i 2B są obarczeni wysokim
ryzykiem zachorowania na jasnokomórkowego raka nerki, natomiast pacjenci z typem
2A posiadają niskie predyspozycje do ccRCC (30,31). W komórkach epitelialnych
kanalików nerkowych pacjentów z zespołem VHL rozwijają się zmiany
nienowotworowe i łagodne zmiany nowotworowe w postaci cyst i torbieli, które z
czasem przekształcają się w zmiany złośliwe. Inaktywacja VHL, akumulacja HIFα w
warunkach normoksji i hipoksji oraz ekspresja czynników proangiogennych
powodują, że rozwijające się guzy są ekstremalnie unaczynione, przez co stosowanie
inhibitorów angiogenezy stało się głównym celem terapeutycznym w ccRCC. Kolejną
ważną cechą czynników HIFα i białka VHL w komórkach ccRCC jest regulacja
poziomu cykliny D1 która wraz z kinazami zależnymi od cyklin (ang. Cyclin dependent
kinase, Cdk) cdk4 i cdk6 stymuluje proliferację komórek nowotworowych (32,33).
Linie komórkowe RCC, negatywne względem genu VHL charakteryzowały się
wysokim poziomem cykliny D1 oraz brakiem zdolności do wyjścia z cyklu
komórkowego. Przywrócenie normalnego poziomu VHL w warunkach
doświadczalnych powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i areszt w fazie G0
(32,33). Co ciekawe, niektóre dane literaturowe sugerują, że hipoksja wraz z
czynnikami HIF hamują proliferację poprzez aktywację białka Rb, utratę Cdk i
obniżenie poziomu cyklin (34), jednak w przypadku komórek raka nerki z defektem
genu VHL, które zasadniczo są niewrażliwe na zmiany stężenia tlenu, sytuacja
wydaje się odwrotna.

4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu

4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy
Angiogeneza jest procesem tworzenia się nowych naczyń krwionośnych z już
istniejących. W warunkach fizjologicznych zachodzi przede wszystkim w rozwoju
embrionalnym razem z waskulogenezą (tworzeniem naczyń de novo), oraz w trakcie
gojenia się ran czy regeneracji endometrium w trakcie cyklu miesięcznego u kobiet
(35). Angiogeneza jest też krytycznym krokiem podczas przemiany łagodnego
nowotworu w złośliwy, gdy zostaje zachwiana równowaga między czynnikami
stymulującymi, a hamującymi rozwój unaczynienia (36). Gwałtownie dzielące się
komórki nowotworowe do swojego wzrostu potrzebują tlenu i substancji odżywczych
dostarczonych z krwią. Małe skupiska komórek nowotworowych, nie przekraczające
2 mm3, pobierają tlen na drodze dyfuzji z okolicznych naczyń krwionośnych (37,38).

19
Rozrost tkanki nowotworowej powoduje hipoksję i kwasicę, poprzez brak usuwania
resztek przemiany materii, co prowadzi do aktywacji czynników HIFα (37).

Istnieją trzy formy HIFα z czego najlepiej poznanymi są HIF1α i HIF2α, które
działają podobnie w odpowiedzi na zmiany stężenia tlenu (39). Co ciekawe,
wykazano, że w przypadku ccRCC to właśnie poziom izoformy HIF2α jest krytycznym
czynnikiem stymulującym wzrost i rozwój guzów VHL-/-, a jej zahamowanie powoduje
znaczące spowolnienie wzrostu guzów in vivo (40–43). W raku nerki obarczonym
mutacją genu VHL, HIFα jest akumulowany nawet w warunkach normoksji i powoduje
wzmożoną ekspresję czynników proangiogennych: PDGFβ, czynnika wzrostu
hepatocytów (ang. Hepatocyte growth factor, HGF), angiopoetyny-2, epidermalnego
czynnika wzrostu (ang. Epidermal growth factor, EGF), oraz głównego stymulatora
neowaskularyzacji – VEGF (30,43–45).

Do rodziny VEGF należy 6 czynników (od A do E oraz czynnik wzrostu łożyska

- PlGF), z których VEGFA jest najlepiej poznanym. W wyniku alternatywnego
składania, powstają izoformy różniące się ilością aminokwasów w łańcuchu
polipeptydowym, które cechuje różne powinowactwo do heparyny i biodostępność.
VEGFA działa przez wiązanie się do jednego ze swoich receptorów (ang, VEGF
receptor, VEGFR1, VEGFR2) znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonka i
aktywacji dalszych ścieżek przekazu sygnału (46,47).

4.2.2 Etapy angiogenezy

W wyniku martwicy i niedotlenienia, w komórkach nowotworowych dochodzi do
przełączenia angiogennego (ang. angiogenic switch). Przełączenie to powoduje
niekontrolowaną produkcję wcześniej wymienionych czynników proangiogennych,
które wiążąc się ze swoimi receptorami na komórkach śródbłonka, aktywują kinazy
białkowe i powodują wzrost przepuszczalności naczyń oraz redystrybucję
międzykomórkowych białek adhezyjnych m.in. CD31 czy VE-kadheryny (Ryc. 4.2. A)
(36,47).

VE-kadheryna tworzy połaczenia pomiędzy komórkami endotelialnymi

zapewniając integralność śródbłonka (48,49). Komórki nowotworowe wydzielają
czynnik VEGFA, który łączy się ze swoim receptorem na powierzchni komórki
endotelialnej. Następnie, dochodzi do autofosforylacji receptora VEGF i przeniesienia
reszty fosforanowej z VEGFR2 przez kinazy Src, PAK, kinazę ogniskowo-adhezyjną
(ang. Focal andhesion kinase, FAK) oraz substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany
z Ras (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1) na VE-kadherynę (50).
Fosforylowana VE-kadheryna ulega internalizacji i translokacji w inne miejsce, bądź

20
degradacji co prowadzi do destabilizacji połączeń międzykomórkowych, rearanżacji
cytoszkieletu i w konsekwencji zwiększonej przepuszczalności naczyń (48–50). Co
więcej, wykazano, że nie tylko stymulacja VEGF powoduje osłabienie połączeń
komórkowych, ale również wydzielane przez komórki nowotworowe metaloproteinazy
(ang. Metalloproteinase, MMP), zwłaszcza MMP2 oraz MMP9 (51). W tym przypadku
jednak nie dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a odcięcia jej
zewnątrzkomórkowej domeny i destabilizacji połączeń komórka-komórka (51,52).
Metaloproteinazy biorą również udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej
co przyczynia się do proliferacji i migracji komórek endotelialnych (ECs) (35).

Rozwojowi guza towarzyszy przewlekły stan zapalny i napływ komórek układu

odpornościowego. Wykazano, że nadekspresja VEGF powoduje wzrost czynnika
SDF-1 co z kolei wpływa na rekrutację komórek mieloidalnych posiadających na
powierzchni receptor dla chemokin 4 (ang. Chemokine receptor 4, CXCR4) (53).
Oprócz komórek nowotworowych, także komórki układu odpornościowego, a przede
wszystkim makrofagi są istotnym źródłem cytokin i chemokin prozapalnych, które
pełnią również istotną funkcję w promocji neowaskularyzacji (54). Dobrze poznaną
chemokiną proangiogenną, syntetyzowaną przez komórki nowotworowe, jest IL-8,
która aktywuje nie tylko neutrofile, ale również makrofagi, komórki tuczne i komórki
endotelialne (54,55). VEGF, IL-8 oraz SDF-1 stymulują komórki endotelialne do
migracji przez zdegradowaną macierz otaczającą śródbłonek w stronę gradientu
czynników wzrostowych i w ten sposób rozpoczyna się proces kiełkowania (ang.
Sprouting) naczyń krwionośnych (Ryc. 4.2. B). Ważną rolę podczas migracji i
kiełkowania naczyń pełnią receptory integrynowe, których ekspresję stymuluje VEGF,
czynnik martwicy nowotworów alfa (ang. Tumor necrosis factor alpha,TNF-α) oraz
sama IL-8 (37).

Ostatnim etapem angiogenezy nowotworowej jest dojrzewanie powstałych

naczyń, w którym biorą udział m.in. czynniki antyangiogenne oraz PDGFβ który
stymuluje komórki otaczające komórki śródbłonka, tzw. perycyty, do osiadania i
stabilizowania powierzchni nowych naczyń (45,56). Dobrze rozwinięty system naczyń
krwionośnych w guzie jest istotną składową procesu przerzutowania, czyli
opuszczenia pierwotnego ogniska przez agresywne komórki nowotworowe i migracji
z krwioobiegiem w poszukiwaniu nowej niszy (Ryc. 4.2. C).

21
Rycina 4.2. Schemat procesu angiogenezy w obrębie guza nowotworowego.
Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (36, 37).

Sieć naczyń krwionośnych obecna w guzie nowotworowym ze względu na brak

równowagi między czynnikami pro i antyangiogennymi różni się od unaczynienia
fizjologicznego. Naczynia krwionośne w guzie tworzą chaotyczny układ, który ciągle
ulega przebudowie. Posiada nieregularne, często ślepo zakończone naczynia, z
których większość jest niefunkcjonalna oraz charakteryzuje się zwiększoną
przepuszczalnością powodującą drobne, lecz liczne krwotoki (38). Naczynia
nowotworowe nie dostarczają komórkom guza odpowiedniej ilości tlenu, co skutkuje
niedotlenieniem i obumarciem części tkanki. Słaba jakość naczyń krwionośnych jest
również spowodowana tym, że budują je oprócz wyspecjalizowanych komórek
śródbłonka, także komórki nowotworowe. Zjawisko przejmowania przez agresywne
komórki nowotworowe fenotypu i właściwości komórek endotelialnych i formowania
de novo sieci tubularnych struktur, połączonych z właściwymi naczyniami
krwionośnymi nosi nazwę mimikry naczyniowej (57). Wykazano, iż również komórki
ccRCC posiadają zdolność formowania naczynio-podobnych struktur (58–60).

Oprócz typowych receptorów kinaz tyrozynowych takich jak VEGFR czy

PDGFR, w proces angiogenezy nowotworowej zaangażowany jest także receptor c-
Met. Receptor ten, działając na szereg białek wpływa na stabilizację HIF1α oraz,
niezależnie od stężenia tlenu, aktywuje czynniki transkrypcyjne STAT w efekcie
stymulując ekspresję VEGF (61). Podobne działanie wykazuje IL-6, która łącząc się
parakrynnie lub autokrynnie ze swoim receptorem, fosforyluje białko STAT3 (ang.
Signal transducer and activator of transcription 3), które następnie ulega dimeryzacji
i translokacji do jądra. Ścieżka sygnałowa IL-6/STAT3 stymuluje ekspresję VEGF

22
oraz metaloproteinaz MMP2 i MMP9 (62,63). Ekspresję VEGF regulują również
receptor CXCR4 wraz ze swoim ligandem SDF1, który jest silnym chemoatraktantem
dla endotelialnych komórek progenitorowych migrujących ze szpiku kostnego (64,65).

Wysoki poziom VEGF w guzie jest zazwyczaj złym czynnikiem prognostycznym

w wielu typach nowotworów, także w ccRCC i świadczy on o skłonności komórek
nowotworowych do progresji i tworzenia przerzutów. Analiza próbek pacjentów w
różnych stadiach zaawansowania choroby wykazała, że wraz z progresją ccRCC
rośnie ekspresja czynników stymulujących rozwój unaczynienia (66). Ze względu na
częste mutacje genu VHL, akumulację HIF oraz nadekspresję wielu stymulatorów
angiogenezy, jasnokomórkowy rak nerki tworzy silnie ukrwione guzy i logicznym
wydało się wprowadzenie terapii opartych o leki celujące zarówno w sam VEGF jak i
receptory kinaz tyrozynowych zaangażowanych w rozwój unaczynienia. Stosowanie
inhibitorów kinaz tyrozynowych (ang. Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) początkowo
daje zadowalające efekty, jednak w trakcie długotrwałej terapii ich skuteczność jest
kwestionowana ze względu na wykształcanie na nie mechanizmów oporności.

4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC

Rozsiew komórek nowotworowych i powstanie odległego przerzutu jest
długotrwałym i wieloetapowym procesem. Niezbędny do tego jest rozwój
unaczynienia w obrębie ogniska pierwotnego guza nowotworowego oraz nabycie
przez komórkę nowotworową szeregu cech, które pozwolą jej na aktywną migrację,
przeżycie w krwioobiegu, a następnie umożliwią przedostanie się przez ścianę
naczynia i osiedlenie w nowej niszy. Jednym z dobrze poznanych czynników
zaangażowanych w progresję nowotworową, jest receptor c-Met wraz ze swoim
ligandem HGF. Nadekspresja lub konstytutywna fosforylacja receptora c-Met
prowadzi do aktywacji wielu szlaków przekazu sygnału i w konsekwencji do
zwiększonej proliferacji, migracji i inwazyjności komórek nowotworowych (67).

4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met

Błonowy receptor c-Met, produkt proto-onkogenu MET, jest obecny głównie
na powierzchni komórek epitelialnych, podczas gdy ekspresja jego ligandu, HGF,
zachodzi selektywnie, w komórkach pochodzenia mezenchymalnego (67). W
warunkach fizjologicznych receptor c-Met bierze udział w embriogenezie i
organogenezie, różnicowaniu czy gojeniu ran (68–70). C-Met jest zaliczany do
receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej i składa się z podjednostki α oraz β
połączonych mostkami disiarczkowymi. Podjednostka α znajduje się po zewnętrznej
stronie błony komórkowej, natomiast podjednostka β przechodzi przez błonę

23
komórkową i po stronie wewnątrzkomórkowej zawiera kilka miejsc fosforylacji oraz
domenę kinazy tyrozynowej (Y1234, Y1235), regulującą aktywność receptora (67,71).

Przyłączenie ligandu HGF, powoduje homodimeryzację receptora i krzyżową

fosforylację reszt tyrozynowych Y1234 i Y1235. Następnie, fosforylacji ulegają
tyrozyny Y1349 i Y1356, które aktywują pośrednio, przez białko oddziałujące z GRB2
(ang. GRB2-associated-binding protein 1, GAB1), lub bezpośrednio białka: wiążące
receptor dla czynnika wzrostu typu 2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2,
GRB2), 3-kinazę fosfatydyloinozytolu (ang. Phosphoinositide 3-kinase, PI3K),
czynnik transkrypcyjny STAT3 czy kinazy Src oraz SHP2 (ang. Src homology region
2 domain-containing phosphatase-2) (67,70,71). Receptor c-Met może aktywować
kilka ścieżek sygnalizacyjnych zaangażowanych w regulację angiogenezy, migracji,
różnicowania czy proliferacji. Na skutek aktywacji przez receptor c-Met, białko GRB2
wiąże się z czynnikiem SOS (ang. Son of sevenless), po czym następuje przekaz
sygnału na białko Ras (ang. Rat sarcoma viral homolog) oraz RAF i dalsza aktywacja
szlaku kinaz MAPK regulujących m.in. proliferację komórek i różnicowanie (72).
Dodatkowo, białko Ras jest czynnikiem aktywującym inne małe GTPazy: Rac1 (ang.
Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) i Cdc42 (ang. Cell division control protein
42 homolog) zaangażowane w rearanżację cytoszkieletu aktynowego, przejście
epitelialno-mezenchymalne (ang. Epithelial to mesenchymal transition, EMT) i
migrację (73). Z kolei, poprzez aktywację białka PI3K następuje przekaz sygnału na
kinazę Akt i mTOR, które w głównej mierze odpowiedzialne są za przeżywalność
komórek (74). Jednocześnie z PI3K, kinaza Src aktywuje kinazę ogniskowo-
adhezyjną (ang. Focal adhesion kinase, FAK) regulującą ruchliwość i inwazyjność
komórek, w odpowiedzi na fosforylację receptora c-Met (75). W końcu, przekaz
sygnału z receptora c-Met na czynnik STAT3 powoduje jego dimeryzację i
translokację do jądra, gdzie reguluje transkrypcję wielu genów m.in. HIF1α (76) (Ryc.
4.3.).

24
Rycina 4.3. Schemat budowy receptora c-Met i szlaki przekazu sygnału aktywowane
osią HGF/c-Met. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (67).

Tak szerokie spektrum działania receptora c-Met powoduje, że jego

nadmierna aktywacja ma bardzo istotny wpływ na rozwój i progresję wielu typów
nowotworów. Wykazano, że wzmożona amplifikacja genu MET powoduje
nadekspresję białka c-Met i jego konstytutywną fosforylację w nowotworach wątroby,
żołądka, piersi, mózgu czy nerki (77–80). Co więcej, oprócz autokrynnej bądź
parakrynnej aktywacji zależnej od liganda, może dochodzić do transaktywacji
receptora poprzez współdziałanie z innymi receptorami błonowymi m.in. CD44,
EGFR, CXCR4 czy receptorami integrynowymi, często bez udziału HGF (67,81–84).

25
Hipoksja także jest jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za ekspresję c-Met
zarówno w warunkach in vitro oraz in vivo (85). Badania nad rakiem trzustki wykazały,
że czynnik transkrypcyjny HIF1α wiążąc się do promotora MET aktywuje jego
transkrypcję pod wpływem hipoksji (86). Co więcej, poziom c-Met różni się w obrębie
tkanki nowotworowej, obszary guza objęte hipoksją charakteryzują się nadekspresją
c-Met w porównaniu z fragmentami z rozwiniętym unaczynieniem (85).

4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki

W zdrowej nerce receptor c-Met znajduje się głównie w epitelialnych
komórkach kanalików nerkowych i bierze udział w stymulacji tych komórek do
tworzenia rozgałęzień kanalików w trakcie rozwoju nerki i jej regeneracji po urazie
bądź nefrektomii (87,88).

W 1996 r. po raz pierwszy wykazano, że poziom receptora c-Met rośnie w

tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową nerką (89). Natali i wsp. przebadali,
za pomocą barwień immunohistochemicznych (IHC), 50 próbek od pacjentów z
różnymi typami raka nerki i zaobserwowali wysoki poziom c-Met w 87% próbek
nowotworowych, podczas gdy w zdrowej nerce sygnał był bardzo słaby i ograniczony
jedynie do kanalików dystalnych (89). Rok później, potwierdzono te wyniki i
dodatkowo powiązano wzrastający poziom receptora c-Met z progresją choroby i
obecnością przerzutów (90). W stadium 1 i 2 wg skali Fuhrman, receptor c-Met
wykryto jedynie w 8 na 17 przypadków, podczas gdy w stadium 3 i 4 aż 20 próbek na
24 było pozytywne dla c-Met (90). Badania prowadzone przez koreańską grupę Choi
i wsp. wykazały, że ponad 90% próbek brodawkowatego raka nerki posiadało silny
sygnał receptora c-Met podczas barwienia IHC, podczas gdy próbki raka
jasnokomórkowego jedynie 45% (91). Brodawkowaty rak nerki (ang. papillary RCC,
pRCC) charakteryzuje się częstymi mutacjami w obrębie chromosomu 7, na którym
zlokalizowane jest locus genu MET (7q31) (92). Trisomia chromosomu 7 występująca
w typie sporadycznym pRCC powoduje zwiększoną ilość kopii MET, co zazwyczaj
przekłada się na podwyższoną ilość białka (92). Dodatkowo, zarówno w dziedzicznym
jak i sporadycznym pRCC zaobserwować można mutacje typu brak sensu głównie w
domenie kinazy tyrozynowej prowadzące do konstytutywnej fosforylacji receptora c-
Met, nawet przy braku HGF, i w konsekwencji aktywacji szlaków przekazu sygnału
omówionych w poprzednim podrozdziale (80,91,92).

W przypadku ccRCC, Choi i wsp. wykazali, że ekspresja c-Met pozytywnie

koreluje ze stopniem zaawansowania choroby wg skali Fuhrman oraz z innymi
czynnikami zaangażowanymi w inwazyjność i agresywność nowotworu (91). Inne

26
zespoły potwierdziły, na większej grupie pacjentów, wysoki poziom receptora c-Met
w tkance nowotworowej w porównaniu z otaczającą zdrową oraz wzrost ekspresji
MET wraz z progresją nowotworową (93,94). Co więcej, receptor c-Met uznano, za
negatywny wskaźnik predykcyjny związany z agresywnym fenotypem i niekorzystnym
rokowaniem dla pacjenta (93,94). Zwiększająca się ilość kopii genu MET była wykryta
w ponad 310 przypadkach na 572 i korelowała z większą objętością guza, zajęciem
okolicznych węzłów chłonnych i obecnością odległych przerzutów (93). Dodatkowo,
Miyata i wsp. jako pierwsi powiązali fosforylację receptora c-Met na tyrozynie Y1349
ze stadium zaawansowania klinicznego i przeżywalnością (95). W przypadku ccRCC
istotną rolę w utrzymaniu konstytutywnej fosforylacji c-Met pełni białko VHL.
Wykazano, że w liniach komórkowych ccRCC z mutacją w genie VHL, receptor c-Met
był konstytutywnie aktywowany nawet w przypadku braku ligandu HGF (96).
Natomiast, przywrócenie prawidłowego poziomu VHL w komórkach, powodowało
spadek fosforylacji c-Met (96).

4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno-

mezenchymalnego (EMT)
Proces EMT charakteryzuje się zmianą fenotypu komórki z epitelialnego na
mezenchymalny. W jego wyniku komórka stopniowo traci zdolność do połączeń
międzykomórkowych oraz adhezji do błony podstawnej na rzecz zwiększonej
ruchliwości i inwazyjności (97,98). Podobnie jak w przypadku angiogenezy, EMT
może zachodzić w warunkach fizjologicznych podczas embriogenezy i tworzenia
narządów (typ pierwszy EMT) oraz w dorosłym organizmie w trakcie regeneracji,
gojenia ran i fibrozy (typ drugi EMT). W takcie rozwoju nowotworu, trzeci typ EMT,
jest inicjowany szeregiem czynników m. in. hipoksją, degradacją macierzy
zewnątrzkomórkowej czy wydzielaniem cytokin. EMT pełni kluczową rolę w
nabywaniu przez ccRCC zdolności do aktywnej migracji i stanowi jeden z
podstawowych mechanizmów progresji nowotworowej (98,99).

Komórki epitelialne charakteryzuje obecność różnego rodzaju białek

budujących połączenia międzykomórkowe oraz przytwierdzających komórkę do błony
podstawnej. W pierwszym etapie EMT zmniejsza się ekspresja białek fenotypu
epitelialnego e-kadheryny, ZO-1, cytokeratyny, cząsteczki adhezji komórek
nabłonkowych (ang. Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) czy lamininy-1.
Główny składnik obwódek przylegania i najważniejszy marker komórek epitelialnych,
e-kadheryna, zastępowana jest przez n-kadherynę (99). E-kadheryna jest zaliczana
do białek supresorowych, ponieważ jej spadek związany jest ze wzrostem
agresywności nowotworu i gorszymi rokowaniami. Do tej pory odkryto wiele

27
czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za obniżenie ekspresji e-kadheryny.
Należą do nich białka z rodziny Snail, ZEB czy Twist (100,101). Czynniki te wiążą się
z różnym powinowactwem do sekwencji E-box w promotorze genu CDH1 kodującego
e-kadherynę hamując jej ekspresję (100). Część badaczy sugeruje, że największe
powinowactwo do promotora e-kadheryny ma Snail1, który w warunkach
fizjologicznych nie jest obecny w komórkach endotelialnych, występuje natomiast w
komórkach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego (102). Niedawno wykazano,
że Snail1 może być negatywnym czynnikiem prognostycznym w ccRCC
wskazującym na możliwość nawrotu choroby po wycięciu guza oraz u pacjentów
chorych na raka piersi czy pęcherza moczowego (103–105).

Następnie, dochodzi do utraty połączeń komórka-komórka oraz zmiany

polaryzacji apikalno-bazalnej na rzecz polaryzacji tył-przód. Wzrasta także poziom
markerów charakterystycznych dla komórek mezenchymalnych: wimentyny, β-
kateniny oraz fibronektyny (97–99). W kolejnym etapie dochodzi do rearanżacji
cytoszkieletu, przebudowy i polimeryzacji filamentów aktynowych. Komórka zmienia
swoją morfologię na podłużną i wrzecionowatą i traci zdolność do zahamowania
kontaktowego. W końcowym etapie następuje protruzja, czyli formowanie wypustek
cytoplazmatycznych umożliwiających ruch i wydzielanie metaloproteinaz
degradujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Zwiększa się aktywność
migracyjna komórek, które stymulowane czynnikami wzrostu przemieszczają się w
stronę zwiększającego się gradientu chemoatraktantów. Komórki opuszczają guz
pierwotny i przedostają się przez błonę podstawną do naczyń krwionośnych bądź
limfatycznych (Ryc. 4.4.) (98,99,101).

Rycina 4.4. Schemat procesu przejścia epitelialno-mezenchymalego. Zaadaptowano i

zaprojektowano na podstawie (97, 98).

28
 Przejście epitelialno-mezenchymalne regulowane jest przez wiele szlaków
sygnalizacyjnych m.in. TGF-β, Wnt czy Notch, aktywowanych przez mikrośrodowisko
nowotworu, stan zapalny, a także hipoksję (106–109).

Receptor c-Met zaangażowany jest w regulację wielu procesów komórkowych

biorących udział w inicjacji, progresji i przerzutowaniu nowotworu. Z tego względu,
może stanowić nadrzędny modulator czynników biorących udział w EMT.

Aktywacja c-Met angażuje szlaki sygnalizacyjne MAPK, FAK czy PI3K-Akt-

mTOR i w sposób pośredni prowadzi do rearanżacji cytoszkieletu i zmiany fenotypu
komórki na mezenchymalny, a także zwiększa aktywność ruchową i inwazyjność,
czyli reguluje wszystkie procesy charakterystyczne dla EMT (110). Z kolei wykazano,
że receptor c-Met bezpośrednio wpływa na aktywację kluczowego szlaku
indukującego EMT, czyli Wnt/β-katenina (111). Aktywacja szlaku Wnt przez
fosforylację i inaktywację GSK3β, prowadzi do stabilizacji cytoplazmatycznej β-
kateniny, która ulega translokacji do jądra, gdzie łączy się z czynnikami
transkrypcyjnymi TCF/LEF (107). Powoduje to zwiększoną transkrypcję genów
zaangażowanych w progresję i przeżywalność, ale także wyższą ekspresję cykliny
D1, VEGF oraz IL-8 dzięki czemu szlak Wnt/β-katenina promuje również proliferację
i angiogenezę. Dodatkowo, β-katenina stabilizuje poziom Snail1 przez blokowanie
jego fosforylacji i degradacji (107). W przypadku komórek glioblastomy wykazano, że
zastosowanie specyficznego inhibitora receptora c-Met - SU11274 powoduje
obniżenie ilości β-kateniny w jądrze komórkowym. Natomiast stymulacja HGF
spowodowała translokację β-kateniny do jądra wskazując na istotną rolę c-Met w
regulacji szlaku Wnt (111). W badaniach nad rakiem piersi wykazano, że
współdziałanie receptora c-Met i szlaku Wnt/β-katenina prowadzi do nabierania
agresywnego fenotypu i tworzenia przerzutów (112). Co ciekawe, w przypadku
hepatocytów, ich stymulacja czynnikiem HGF indukowała translokację β-kateniny do
jądra komórkowego, niezależnie od ścieżki Wnt (113).

Oprócz wpływu na szlak Wnt/β-katenina, istnieją również inne mechanizmy

aktywujące proces EMT, zależne od receptora c-Met. Badania nad rakiem szyjki
macicy wykazały, że receptor c-Met wraz z CXCR4 negatywnie regulują poziom e-
kadheryny, natomiast pozytywnie czynnik Slug (84). Wyniki przedstawione przez
grupę badaczy z Chin potwierdziły, że receptor c-Met może działać synergistycznie
lub addytywnie z CXCR4 aktywując czynnik transkrypcyjny STAT3, który z kolei
reguluje ekspresję ZEB1 w raku żołądka (114). Z kolei w raku płuc, wykorzystanie
inhibitora c-Met hamowało EMT, poprzez obniżanie poziomu czynnika Snail i

29
podwyższenie e-kadheryny (115). Także wśród pacjentów ze zdiagnozowanym
rakiem żołądka, wykazano negatywną korelację pomiędzy receptorem c-Met i e-
kadheryną, gdzie niski poziom e-kadheryny i wysoki c-Met był złym czynnikiem
prognostycznym (116,117).

4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu

Pomimo nabrania przez komórki nowotworowe nowych cech mających im
pomóc w utworzeniu przerzutu, niewiele komórek jest w stanie samodzielnie przeżyć
w krwioobiegu, wydostać się z niego i osiedlić w nowej niszy.

Dzięki wysokiej plastyczności i adaptacji do gwałtownie zmieniających się

warunków i otaczającego mikrośrodowiska komórki nowotworowe przedostaja się do
światła naczynia, przemieszczają z krwią, a następnie osadzaja w odległych
naczyniach włosowatych. Fenotyp mezenchymalny pozwala nowotworowym
komórkom krążącym (ang. Circulating tumor cells, CTCs) na ucieczkę przed anoikis
czyli apoptozą spowodowaną brakiem adhezji do podłoża (118). Po wydostaniu się z
krwioobiegu do nowej tkanki, komórki przechodzą proces odwrotny do EMT czyli
przejście mezenchymalno-epitelialne (ang. Mesenchymal to epithelial transition
MET), który ułatwia osiedlenie się w nowej niszy i formowanie ogniska wtórnego
(119).

Jednym z wielu czynników zaangażowanych w tworzenie odległych

przerzutów, jest receptor c-Met, który regulując poziom i fosforylację wielu białek w
tym Ras i Rac1 oraz kinaz Src i FAK stymuluje ruchliwość komórek nowotworowych
(75,120). Jak pokazano w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi,
wyciszenie c-Met zmniejszało ruchliwość komórek i ilość przerzutów do węzłów
chłonnych (121). Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad mięsakiem
prążkowanokomórkowym gdzie niski poziom receptorów c-Met i CXCR4 wpływał na
zmniejszenie ruchliwości i agresywności komórek (122).

Pojedyncze komórki nowotworowe, po migracji do krwioobiegu, narażone są

na stres oksydacyjny i atak ze strony układu immunologicznego. Z tego względu,
wykształciły mechanizm pozwalający im przetrwać w niekorzystnym środowisku,
polegający na łączeniu się w klastry. Pierwotnie klaster zbudowany jest z różnych
typów komórek, zarówno epitelialnych jak i mezenchymalnych oraz komórek
wykazujących stadia pośrednie między fenotypem epitelialnym, a mezenchymalnym.
Takie epitelialno-mezenchymalne hybrydy, przechodzą niepełne EMT oraz posiadają
markery charakterystyczne zarówno dla nabłonka jak i komórek mezenchymalnych
(123). Co więcej, w takich klastrach, komórki nie tracą połączeń komórka-komórka,

30
ale zyskują zdolność do aktywnej, kolektywnej migracji. Po opuszczeniu pierwotnej
niszy, do klastra dołączają płytki krwi i komórki podścieliska, które pełnią rolę
ochronną oraz wydzielają czynniki wzrostu i chemokiny. Klastry występują rzadziej
niż pojedyncze CTCs, natomiast ich potencjał inwazyjny i przerzutowania jest
zdecydowanie wyższy. Tworzony przez klaster mikroprzerzut jest także bardziej
heterogenny niż przerzut utworzony przez wzrost klonalny pojedynczej komórki, a co
za tym idzie bardziej oporny na stosowane terapie (123). Dodatkowo, obecność we
krwi klastrów jest negatywnym czynnikiem prognostycznym w wielu typach
nowotworów w tym także w raku nerki (124). Co ciekawe, wykazano, że po stymulacji
HGF, receptor c-Met aktywuje komórki wątroby do łączenia się w grupy i kolektywnej
migracji, a także zwiększa ich inwazyjność przez zwiększenie ekspresji MMP3, MMP9
i MMP10 (125).

4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki

Ze względu na stopień zaawansowania choroby i podłoże genetyczne możemy
wyróżnić kilka możliwości terapeutycznych proponowanych pacjentom ze
zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki. Są to: postępowanie chirurgiczne
wraz z radioterapią lub farmakoterapia, do której zaliczamy chemioterapię, inhibitory
kinazy mTOR oraz inhibitory angiogenezy.

Obecnie, podstawową strategią leczniczą pacjentów z rakiem nerki w postaci

ograniczonej jest chirurgiczne usunięcie guza. W zależności od wielkości guza oraz
zajęcia okolicznych węzłów chłonnych, operacja wycięcia obejmuje część lub całą
nerkę. Dodatkowo, uzupełniająco stosuje się radioterapię w celu usunięcia
pozostałych komórek nowotworowych (126,127). Z kolei w przypadku choroby
rozsianej stosuje się chemioterapię skojarzoną z interferonem alfa (IFNα). Jednak ze
względu na szybkie wykształcanie oporności na cytostatyki terapię tę stosuje się
rzadko gdy inne formy leczenia nie dają rezultatów (128).

W przypadku pacjentów w stadiach zaawansowanych, z guzem

nieoperowalnym lub choroby rozsianej stosuje się terapie celujące w aktywność
kinazy mTOR lub inhibitory angiogenezy. Ze względu na częste mutacje w obrębie
genu MTOR obecne w ccRCC, u pacjentów z rakiem nerki niewrażliwych na inhibitory
angiogenezy, stosuje się inhibitory blokujące kinazę mTOR – temsirolimus i
ewerolimus (129). Leki działają poprzez związanie się z receptorem FKB12, co z kolei
hamuje aktywację mTOR. W rezultacie dochodzi do zatrzymania cyklu komórkowego
i zahamowania wzrostu guza. Inhibitory stosuje się zarówno w monoterapii jak i terapii
łączonej z IFNα. Inhibitory kinazy mTOR, oprócz działania na proliferację komórek,

31
negatywnie regulują proces angiogenezy, poprzez zahamowanie syntezy VEGF
(130).

Największą grupę leków celowanych stanowią inhibitory angiogenezy z których

można wyróżnić przeciwciała monoklonalne i inhibitory kinaz tyrozynowych (ang.
Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) (131). Humanizowane przeciwciała monoklonalne –
bevacizumab i nivolumab, są skierowane przeciwko VEGF i receptorowi
programowanej śmierci 1 (ang. Programmed death 1, PD-1) (131,132). Natomiast do
inhibitorów kinaz tyrozynowych zalicza się sunitinib, sorafenib, pazopanib, axitinib,
lenvantinib oraz cabozantinib. Terapia z udziałem inhibitorów kinaz tyrozynowych
opiera się na blokowaniu wielu receptorów z różnym powinowactwem oraz ścieżek
sygnalizacyjnych przez nie kontrolowanych (131). Najczęściej stosowany sunitinib
jest zalecany zazwyczaj jako lek I rzutu w ostatnim stadium zaawansowania choroby.
Oprócz wszystkich receptorów VEGF oraz receptora PDGF, lek blokuje kinazę Raf,
receptory Flt3 i RET (133). Sorafenib stosowany jest jako lek II rzutu i wykazuje
aktywność podobną do sunitinibu (134,135). Ze względu na kluczową rolę receptora
c-Met w rozwoju wielu typów nowotworów, również on stał się interesującym celem
terapeutycznym, także w przypadku ccRCC. Jednym z niedawno opracowanych
małocząsteczkowych inhibitorów kinaz tyrozynowych jest cabozantinib, który blokuje,
oprócz typowych receptorów zaangażowanych w proces angiogenezy, receptor c-Met
(136).

4.3.6 Oporność na inhibitory angiogenezy

Wiele typów nowotworów pomimo pierwszej, dobrej odpowiedzi na
zastosowane leki, z czasem wykształca mechanizmy obronne, które zmuszają
lekarzy do zmian w strategii terapeutycznej. Oporność komórek nowotworowych jest
zjawiskiem powszechnie znanym i jest definiowana jako progresja choroby, pomimo
zastosowanej terapii (137).

Terapie antyangiogenne, oparte na inhibitorach kinaz tyrozynowych takich jak

sunitinib czy sorafenib, wykazują istotne znaczenie w redukcji unaczynienia i
wielkości guza, zwłaszcza u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki. Niemniej,
długa ekspozycja na TKIs w większości przypadków powoduje nabywanie oporności
poprzez przejście na alternatywne ścieżki sygnalizacyjne, które będą promować
angiogenezę (138,139). Stopniowe zwiększanie dawki leku może opóźnić pojawienie
się oporności. W przypadku sunitinibu wykazano, że oporność może być odwracalna,
a zwiększenie dawki powoduje przywrócenie wrażliwości komórek nowotworowych
(140). O ile stosowanie sunitinibu w wyższych dawkach może być skuteczne, to w

32
przypadku sorafenibu wysoka dawka powoduje zdecydowanie wyższą toksyczność i
brak zadowalających efektów (141).

Mechanizmy leżące u podstaw oporności to przede wszystkim neutralizacja

leku, aktywacja alternatywnych szlaków sygnalizacyjnych, modyfikacja i adaptacja
komórek na działania leku, a także przejście epitelialno-mezenchymalne, które w
znacznym stopniu ułatwia komórce adaptację do niekorzystnych warunków (139).
Wyniki przedstawione przez Hammers i wsp. sugerują, że komórki oporne na
sunitinib, pochodzące z przerzutu posiadają kształt podobny do fibroblastów oraz
bardzo wysoki poziom HIF1α oraz wimentyny – głównego markera EMT (142).
Kolejnym procesem odgrywającym istotną rolę w rozwoju oporności jest aktywacja
alternatywnych szlaków sygnalizacyjnych. Komórka, zmuszona jest do kompensacji
zablokowanych receptorów i rozpoczyna przekaz sygnału innymi ścieżkami, które w
efekcie, będą prowadzić do utrzymania unaczynienia i proliferacji na wysokim
poziomie (139). Co więcej, aktywacja nowych czynników nie tylko może podtrzymać
angiogenezę, ale dodatkowo jest w stanie doprowadzić do stymulacji innych
procesów korzystnych dla komórki nowotworowej, w tym zwiększonej inwazyjności,
ruchliwości czy przeżywalności. Dowiedziono, że zahamowanie angiogenezy za
pomocą sunitinibu prowadzi do nadmiernego wydzielania IL-8, istotnego czynnika
zaangażowanego w rozwój unaczynienia, który kompensuje blokadę receptorów
VEGF (143).

4.3.7 Receptor c-Met, a nabywanie oporności na leki celowane

Szlak syngalizacyjny HGF/c-Met odgrywa istotną rolę zarówno w komórkach
nowotworowych jak i komórkach śródbłonka, gdzie działa jako czynnik
proangiogenny. Jak dotąd opublikowano kilka badań potwierdzających rolę receptora
c-Met w nabieraniu oporności na TKIs w różnych typach nowotworów oraz w raku
nerki (144–148). Shojaei i wsp. jako pierwsi wykazali, że receptor c-Met jest
aktywowany w guzach opornych na sunitinib i przejmuje rolę VEGFR. Co więcej,
zaobserwowali zwiększoną ekspresję HGF przez komórki stromy pochodzenia
mezenchymalnego, który powodował fosforylację receptora c-Met znajdujący się na
powierzchni komórek endotelialnych (148). Podobne wyniki przedstawiły inne grupy
wskazując, że oporność na sunitinib była powodowana aktywacją receptorów c-Met
oraz AXL i promowała nie tylko angiogenezę ale także EMT, inwazję i przerzutowanie
(145–147). Receptor c-Met został również zaproponowany jako marker
prognostyczny dla pacjentów RCC leczonych sunitinibem (149). Wydaje się, że
receptor c-Met ulega fosforylacji w komórkach nowotworowych opornych na inhibitory
kinaz tyrozynowych jako efekt kompensacji po zablokowaniu receptorów

33
odpowiedzialnych za angiogenezę. Niestety aktywacja alternatywnej ścieżki
prowadzącej do zwiększenia ekspresji czynnika VEGF, może prowadzić do indukcji
szlaków sygnalizacyjnych regulowanych przez receptor c-Met zaangażowanych w
proliferację, przeżywalność, migrację czy przerzutowanie. Dlatego niezbędnym stało
się opracowanie terapii, która jednocześnie zatrzyma proces angiogenezy oraz
zablokuje receptor c-Met.

Okazało się, że jednoczesne zastosowanie specyficznego inhibitora c-Met z

sunitinibem bądź axitinibem powodowało zahamowanie wzrostu guzów, mniejsze
unaczynienie i ilość przerzutów oraz zwiększało przeżywalność myszy (144,145,147).
W ten sposób rozpoczęto badania nad nową generacją TKIs, celujących także w
receptor c-Met, które wydają się być odpowiedzią na problem oporności.
Cabozantinib jest stosunkowo nowym (zaakceptowanym przez FDA w 2016)
inhibitorem kinaz tyrozynowych, który blokuje VEGFR-2, c-Met, AXL, RET, KIT, Flt3
oraz Tie-2 hamującym zarówno proces angiogenezy jak i przerzutowanie czy inwazję
nowotworową (150). Wydaje się, że cabozantinib jest bardzo dobrym lekiem
wykazującym podobną tolerancję jak starsze inhibitory kinaz tyrozynowych, ale
zdecydowanie lepszą skuteczność we wszystkich próbach klinicznych (151–153).

4.4 Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia

4.4.1 Procesy zapalne w chorobie nowotworowej
Zapalenie stanowi kluczowy element w ochronie organizmu przed
patogenami, a także podczas regeneracji tkanek, gojeniu ran i utrzymaniu
homeostazy. Ze względu na podobieństwo zachodzących procesów i zaangażowanie
tych samych komórek i szlaków metabolicznych biorących udział w chronicznym
zapaleniu, nowotwór jest nazywany raną, która nigdy się nie goi w której toczą się
ciągłe procesy zapalne i przebudowa tkanek (154). Zapalenie pełni główną rolę w
tworzeniu mikrośrodowiska sprzyjającego wzrostowi guza, w efekcie promując
angiogenezę i powstawanie odległych przerzutów (155). Co więcej, przewlekłe
zapalenie obserwowane między innymi w wątrobie towarzyszące wrzodom żołądka,
niealkoholowemu stłuszczeniu wątroby, czy fibrozie może bezpośrednio wpływać na
powstawanie nowotworu (156–158). Oddziaływanie między makrofagami,
neutrofilami limfocytami, komórkami podścieliska, fibroblastami i komórkami
nowotworowymi, zachodzi przy udziale wielu czynników w tym interleukin, oraz
metaloproteinaz (159). Jednym z głównych modulatorów odpowiedzi zapalnej w
obrębie nowotworu jest czynnik transkrypcyjny NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-
light-chain-enhancer of activated B cells), który reguluje ekspresję cytokin
prozapalnych i czynników wzrostu wydzielanych przez komórki układu
34
odpornościowego oraz podścieliska, modulując ekspresję wielu genów
zaangażowanych w rozwój nowotworu i unaczynienie (160).

Proces zapalny reguluje inwazję, EMT i migrację na kilku poziomach.

Wydzielane cytokiny TNF oraz IL-1β indukują ekspresję czynników transkrypcyjnych
Twist i Slug (161). Komórki mieloidalne wpływają na produkcję metaloproteinaz i
degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (162). Produkcja IL-6 powoduje aktywację
ścieżki sygnalizacyjnej czynnika transkrypcyjnego STAT3 i ekspresję genów
zaangażowanych w angiogenezę, transformację nowotworową, przeżywalność i
dalszą produkcję cytokin (163). Większość komórek układu odpornościowego
stymuluje także napływ subpopulacji fibroblastów związanych z rakiem (ang. Cancer-
associated fibroblasts, CAFs), które stanowią składową mikrośrodowiska guza
sprzyjając wzrostowi komórek nowotworowych, nasilają angiogenezę i przebudowę
macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, CAFs regulują infiltrację komórek
mieloidalnych i limfocytów T i produkują czynniki zaangażowane w różnicowanie
komórek odpornościowych (164). Obecne w dużych ilościach w obrębie nowotworu
makrofagi, także produkują cytokiny m.in. IL-17, która nasila produkowanie innych
interleukin: IL-1β, IL-6 czy IL-8 oraz TNFα. To z kolei zwiększa napływ neutrofili i
komórek śródbłonka w obręb guza (165). Makrofagi swoiste dla guza (ang. Tumor-
associated macrophages, TAM) wydzielają m.in. czynniki o działaniu angiogennym
oraz główny induktor EMT – TGFβ (166).

Przewlekły stan zapalny predysponuje do rozwoju nowotworu i towarzyszy

wszystkim jego etapom, począwszy od inicjacji aż po tworzenie odległych przerzutów.
Jednym z regulatorów stan zapalnego jest białko indukowane przez czynnik MCP-1
(ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1-Induced Protein, MCPIP1). Białko to jest
zaangażowane w degradację transkryptów prozapalnych cytokin, takich jak IL-1β, IL-
2 czy IL-6 (167–169). Ostatnie badania wskazują na rolę białka MCPIP1 w rozwoju
wielu typów nowotworów, w tym jasnokomórkowego raka nerki.

4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1

Białko MCPIP1, znane również pod nazwą Regnaza-1, składa się z 599
aminokwasów, natomiast jego masa cząsteczkowa wynosi 66 kDa (170). Białko to,
kodowane jest przez gen ZC3H12A, znajdujący się na chromosomie 1 i należy do
rodziny białek MCPIP, w skład której wchodzą jeszcze trzy izoformy: MCPIP2,
MCPIP3 i MCPIP4 (171). Białko MCPIP1 wykazuje budowę domenową która
determinuje jego funkcje. Wyróżniamy N-końcową domenę (ang. N-terminal domain,
NTD) oddziałującą z domeną PIN i zawierającą domenę wiążącą ubikwitynę (ang.

35
Ubiquitin association domain, UBA), następnie region bogaty w prolinę (ang. Proline
rich region, PRR), domenę katalityczną o aktywności RNazy PIN (ang. PilT N-terminal
(PIN)-like RNase domain), która determinuje aktywność białka MCPIP1, motyw palca
cynkowego typu CCCH (ang. Zinc finger, ZF) który bierze udział w bezpośrednim
wiązaniu RNA, region natywnie nieuporządkowany NDR i region bogaty w prolinę
oraz konserwatywny region C-końcowy (ang. Conservative c-terminal region,
CCR)(Ryc. 4.5.) (168,172–176).

Rycina 4.5. Schemat budowy domenowej białka MCPIP1. Zaadaptowano i

zaprojektowano na podstawie (168, 172-176).

Pierwsze doniesienia opisujące białko MCPIP1 pojawiły się w 2006 roku i

dotyczyły badań na kardiomiocytach, gdzie wykazano, że aktywność MCP-1 indukuje
nieznany czynnik transkrypcyjny o aktywności proapoptotycznej (177). Dalsze
badania wskazały, że MCPIP1 może działać jako deubikwitynaza białek z rodziny
TRAF (ang. TNF receptor associated factor), w tym TRAF2, TRAF3 oraz TRAF6, a
także białek RIP (ang. Receptor-interacting protein) i NEMO (ang. NF-kappa-B
essential modulator), czego efektem jest negatywna regulacja szlaków JNK i NF-κB
(178). Kolejne Badania wskazały, że MCPIP1 pośredniczy w procesie usuwania
ubikwityny z białka NEMO, poprzez współpracę z deubikwitynazą USP10 (ang.
Ubiquiting specific peptidase 10) (179).

Jednak główną i najlepiej poznaną funkcją białka MCPIP1 jest degradacja

transkryptów wielu prozapalnych cytokin i negatywna regulacja stanu zapalnego
dzięki aktywności RNazy. Mechanizm działania endonukleazy MCPIP1 polega na
rozpoznawaniu i wiązaniu się do II-rzędowych struktur mRNA typu „spinki do włosów”
w rejonie 3’UTR (ang. Untranslated region) i ich destabilizacji (172). Dodatkowo
wykazano, że MCPIP1 rozpoznaje trzynukleotydowy motyw pętli struktury spinki:
pirymidyna-puryna-pirymidyna (YRY) (180). Inne badania sugerują jednak, że
obecność motywu YRY nie jest niezbędna do rozpoznania i degradacji mRNA przez
MCPIP1. Przykładami takich transkryptów jest IL-2, BIRC3 (ang. Baculoviral IAP
Repeat Containing 3) czy BCL2L1 (ang. Bcl-2-like protein 1) (167,181). Co ciekawe,

36
analiza przeprowadzona w 2018 roku pokazała, że MCPIP1 może rozpoznawać kilka
rodzajów pętli w regionie 3’UTR oraz jednoniciowy RNA (ang. Single stranded RNA,
ssRNA) (172). Prawdopodobnie, białko MCPIP1 ulega także homooligomeryzacji w
obecności substratu. Wiązanie mRNA zachodzi poprzez dwie związane domenami
PIN cząsteczki MCPIP1 (dimer), które łączą się, w obecności substratu mRNA z
kolejnym dimerem tworząc pierścieniowy tetramer (172). Obecność aktywnej domeny
PIN jest niezbędna do degradacji mRNA, natomiast wiązanie MCPIP1 z helikazą
UPF1 (ang. Upframeshift 1) powoduje oddziaływanie domeny NTD z domeną PIN
zwiększając aktywność enzymatyczną białka (180). Analiza krystalograficzna
potwierdziła, że domena PIN determinuje funkcje białka MCPIP1, wskazała także
które aminokwasy są niezbędne do zachowania aktywności enzymatycznej. Dodatnio
naładowane reszty kwasu asparaginowego znajdujące się w obrębie domeny PIN:
D141, D225, D226 oraz D244 oddziałują z ujemnie naładowanymi grupami
fosforanowymi mRNA (173). Mutageneza ukierunkowana powodująca pojedynczą
mutację poprzez zmianę kwasu asparaginowego w pozycji 141 na asparaginę
(D141N) prowadziła do powstania nieaktywnego enzymatycznie białka MCPIP1
(168,169). Wykazano także, że do degradacji mRNA przez MCPIP1, niezbędny jest
fragment około 20 nukleotydów między kodonem STOP, a strukturą spinki, w regionie
terminacji translacji (180). Substratami dla białka MCPIP1 są m. in. IL-1β, IL-6, IL-8,
c-Rel, Ox40 czy Gata3 (167–169,182) oraz białko wiążące sekwencję CCAATβ (ang.
CCAAT/enhancer binding protein b, c/EBPβ) czyli czynnik transkrypcyjny kontrolujący
szerokie spektrum genów (183). Podobieństwo w strukturze „spinki” prekursorowych
cząteczek mikroRNA (pre-miRNA) z regionami 3’UTR transkryptów rozpoznawanych
przez MCPIP1, czynią je potencjalnym substratem dla jego aktywności RNazy.
Rzeczywiście, wykazano, że MCPIP1 negatywnie reguluje dojrzewanie wielu miRNA,
w tym miR-21, miR-155, miR-135b, miR-200 czy miR-146a, działając jako
antagonista dla białka Dicer (175,180).

4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1

Ze względu na szerokie spektrum działania białka MCPIP1 i udział w
utrzymaniu homeostazy, jego ekspresja jest ściśle kontrolowana zarówno na
poziomie transkrypcyjnym jak i translacyjnym.

Ekspresja genu ZC3H12A jest szybko indukowana po stymulacji: MCP-1 (w

monocytach krwi obwodowej, ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (ang.
Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) czy mysich fibroblastach
zarodkowych 3T3-L1) (184–186), IL-1β (w makrofagach, linii komórkowej raka
wątroby HepG2 oraz liniach komórkowych THP-1 i U937) (169,171,187,188),

37
lipopolisacharydem (w makrofagach) (169,171), TNFα (liniach THP-1 i U937 oraz
pierwotnych mysich hepatocytach) (169,171) czy IL-17 (w pierwotnych
keratynocytach mysich i ludzkich) (189,190). Dodatkowo, w odpowiedzi na
rozpoznanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (and. Pathogen-
associated molecular patterns, PAMP) przez receptory TLR (ang. Toll-like receptor),
dochodzi do ekspresji MCPIP1 w ludzkich makrofagach pochodzenia monocytarnego
(191). Wykazano także, że aktywacja NF-κB, zwiększa ekspresję MCPIP1 pod
wpływem stymulacji IL-1β. Podobnie czynniki Elk-1 (ang. ETS domain-containing
protein 1) i SRF (ang. Serum response factor), biorą udział w indukcji MCPIP1 po
stymulacji LPS i IL-1β (192). Co ciekawe, sam transkrypt MCPIP1 tworzy pętlę w
rejonie 3’UTR której obecność powoduje, że staje się substratem dla własnego białka.
W efekcie dochodzi do sprzężenia zwrotnego i negatywnej regulacji poziomu MCPIP1
(169). Dodatkowe badania pokazały, że poziom transkryptu MCPIP1 jest także
regulowany przez miR-9 w komórkach mikrogleju i ludzkich chondrocytach (193,194).

Na poziomie potranslacyjnym, regulacja poziomu białka MCPIP1 polega na

jego fosforylacji i degradacji proteasomalnej. Wykazano, że pod wpływem stymulacji
IL-1β następuje aktywacja kinazy inhibitora NF-κB (IKK), która z kolei powoduje
fosforylację MCPIP1 w pozycji S435 i 439, ubikwitynację i w efekcie degradację przez
proteasom (195). Nieco inny mechanizm degradacji MCPIP1 przedstawiono w
limfocytach T, gdzie aktywacja receptorów TCR prowadzi do cięcia białka MCPIP1 w
pozycji R111 pomiędzy domenami NTD i PIN, przez parakaspazę MALT-1 (ang.
Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1) (196).

4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik

homeostazy
Białko MCPIP1 jest uważane przede wszystkim za negatywny regulator stanu
zapalnego ze względu na jego aktywność RNazy wobec transkryptów cytokin
prozapalnych. Jego wysoką ekspresję obserwować można przede wszystkim w
komórkach układu odpornościowego takich jak makrofagi, gdzie degraduje mRNA
takich cytokin jak IL-6 i IL-12b (po indukcji receptorów TLR), a także transkryptów
zaangażowanych w aktywację limfocytów T i TREG, takich jak c-Rel, Icos, Ox40 i IL-2
(168,196). Co więcej, wykazano, że MCPIP1 hamuje ekspresję IL-6, IκBNS i IκBζ
zaangażowanych w proces różnicowania limfocytów Th17 (180,197). Kolejne badania
wskazały na rolę MCPIP1 w negatywnej regulacji szlaku IL-17, który bierze udział w
odpowiedzi na infekcje grzybiczne oraz chorobach autoimmunologicznych w tym w
łuszczycy, poprzez degradację mRNA receptorów IL-17Ra i IL-17Rc (190). Z kolei
badania naszej grupy przedstawiają rolę białka MCPIP1 w regulowaniu stanu

38
zapalnego indukowanego promieniowaniem UVB (198). Dalsze wyniki potwierdziły,
że podwyższenie poziomu MCPIP1 w ludzkich keratynocytach powoduje obniżenie
stanu zapalnego w skórze działając na ścieżkę IL-36/IL-36R (199). Myszy
charakteryzujące się brakiem ZC3H12A w naskórku rozwijały różnego rodzaju
choroby skórne i trudno gojące się rany (200). Jak ważna jest rola białka MCPIP1 w
procesach zapalnych obrazują badania z udziałem myszy pozbawionych genu
ZC3H12A w całym organizmie, które rozwijają ogólnoustrojowe zapalenie,
splenomegalię, podwyższoną produkcję cytokin i upośledzenie narządów
limfoidalnych co w konsekwencji prowadziło do przedwczesnej śmierci do 12 tygodnia
życia (201). Badania in vivo z udziałem zwierząt z delecją MCPIP1 w limfocytach T
prowadziło do aktywacji zarówno komórek T jak i B oraz indukcji choroby
autoimmunologicznej (196). Co ciekawe, MCPIP1 negatywnie reguluje ścieżkę
sygnałową NF-κB, zaangażowaną w indukcję genów odpowiedzi zapalnej, na
zasadzie sprzężenia zwrotnego (176). Podobne obserwacje poczyniono po stymulacji
LPS i TNFα, gdzie MCPIP1 hamował aktywację NF-κB i AP-1, przez co pośrednio
wpływał na szereg procesów komórkowych takich jak proliferacja czy różnicowanie
(176,178).

Oprócz regulacji procesów zapalnych, białko MCPIP1 jest również

zaangażowane w procesy fizjologiczne takie jak adipogeneza, angiogeneza czy
różnicowanie. Badania prowadzone na linii 3T3-L1 sugerują, że nadekspresja
MCPIP1 zaburza adipogenezę przez degradację transkryptu c/EBPβ i obniżenie
PPARγ, które niezbędne są podczas różnicowania pre-adipocytów do dojrzałych
adipocytów (202,203). Z kolei inna grupa, przedstawiła przeciwstawne wyniki, gdzie
wysoki poziom MCPIP1, aktywuje czynniki transkrypcyjne c/EBPα, c/EBPβ i c/EBPδ
(184).

Szereg prac naukowych pokazuje rolę białka MCPIP1 w różnicowaniu wielu

typów komórek. Podczas biogenezy osteoklastów wykazano, że stymulacja MCP-1
ludzkich monocytów szpiku kostnego powodowała różnicowanie do prekursorów
osteoklastów za pośrednictwem MCPIP1 (204). Delecja MCPIP1 w keratynocytach
powodowała utratę kontroli nad ich proliferacją i różnicowaniem co rozwijało lokalny
stan zapalny i choroby skóry (200). Inne badania pokazały, że mysie MSC
posiadające nadekspresję MCPIP1 posiadały wyższy poziom transkryptów Nkx2.5,
Gata-4, Myl-2 i Myh6 w porównaniu z kontrolą i rozpoczynały różnicowanie
kardiomiogenne (205). Dodatkowo, białko MCPIP1 indukowało różnicowanie ludzkich
monocytów w komórki o fenotypie endotelialnym promując w ten sposób angiogenezę
(185).

39
 Pierwsze doniesienia dotyczące udziału MCPIP1 w angiogenezie pojawiły się
w 2008 roku, gdzie wykazano, że indukcja MCPIP1 w komórkach HUVEC za pomocą
MCP-1 powodowała formowanie struktur przypominających kapilary. Przejściowe
wyciszenie MCPIP1, przy pomocy specyficznych siRNA, hamowało ekspresję genów
zaangażowanych w angiogenezę: VEGF i HIF1α (206). Dalsze badania tego samego
zespołu potwierdziły rolę MCPIP1 w indukcji angiogenezy, pokazując mechanizm
bazujący na rozpoznawaniu przez MCPIP1 dwóch miRNA zaangażowanych w
hamowanie angiogenezy: miR20b oraz miR34a, które tłumią translację odpowiednio
HIF1α i SIRT-1 (ang. Silent information regulator) (207). Wykorzystane w badaniach
komórki HUVEC z mutacją D141N nie były w stanie tworzyć tubularnych struktur, a
poziom obu miRNA nie ulegał zmianie co wskazało, na istotną rolę aktywności RNazy
MCPIP1 w kontroli angiogenezy (207). Kolejne doniesienia wykazały, że
mezenchymalne komórki macierzyste (ang. Mesenchymal stem cells MSC)
pochodzące z mysiego szpiku kostnego transdukowane wektorem retrowirusowym z
nadekspresją MCPIP1 zaczynały różnicować w komórki endotelialne, tworzące
struktury kapilarne z dużą ilością rozgałęzień. Dodatkowo, podwyższony poziom
MCPIP1 korelował z wyższym poziomem markerów związanych z angiogenezą, w
tym vWF, Tie-2 czy VE-kadheryną (205). Co ciekawe, ze względu na swoją
aktywność enzymatyczną względem transkryptu IL-8, można zasugerować, że
MCPIP1 negatywnie kontroluje rozwój unaczynienia (182).

4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu

Kontrola odpowiedzi immunologicznej, proliferacji komórkowej i różnicowania
sprawiła, że białko MCPIP1 stało się obiektem wielu badań dotyczących rozwoju
nowotworów. Po raz pierwszy rolę MCPIP1 w raku piersi przedstawiono w 2015 roku,
gdzie MCPIP1 stabilizował poziom białka RGS2 (ang. Regulator of G protein signaling
2), którego poziom był zdecydowanie niższy w tkance nowotworowej i linii MCF7 w
porównaniu z tkanką prawidłową i normalną linią komórek piersi MCF10A (208). Rok
później wykazano niższy poziom MCPIP1 w tkankach nowotworowych w porównaniu
ze zdrowymi, który silnie korelował z niską przeżywalnością i gorszymi rokowaniami
pacjentek z rakiem piersi (181). Indukowana doksycykliną nadekspresja MCPIP1 w
komórkach raka piersi MDA-MB-231 i 4T12 zwiększała apoptozę komórek, gdzie
obserwowano wzrost ekspresji kaspazy 3 oraz PARP1, a także obniżało ilość
przerzutów w badaniach in vivo w porównaniu z kontrolą. Dodatkowo, MCPIP1
negatywnie regulował szereg antyapoptotycznych genów Bcl2L1, Bcl2A1, Birc3, RelB
i Bcl3. Z kolei obniżenie poziomu białka MCPIP1 promowało proliferację komórek
nowotworowych (181). Podobne wyniki otrzymano w badaniach nad neuroblastomą,

40
gdzie linie komórkowe ludzkiej neuroblastomy charakteryzowały się znikomym
poziomem zarówno transkryptu jak i białka MCPIP1 (209,210). Stabilna nadekspresja
MCPIP1 w linii BE(2)-C powodowała znaczący spadek ekspresji MYCN wraz z
potencjałem proliferacyjnym oraz żywotnością (210). W komórkach raka trzustki,
białko MCPIP1 obniżało poziom miR-200, które jest zaangażowane w regulację EMT
(211).

Wyniki naszej grupy wskazały podobnie jak w przypadku raka piersi czy
neuroblastomy, że poziom MCPIP1 znacząco spada w tkance nowotworowej w
porównaniu z otaczającą zdrową u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki
(212). Doświadczenia przeprowadzone na linii komórkowej Caki-1 pokazały, że
ekspresja MCPIP1 zależy od aktywności proteasomu oraz hipoksji. Co ciekawe,
białko MCPIP1 negatywnie regulowało poziom HIF1α oraz HIF2α, a jego
nadekspresja powodowała obniżenie transkryptów VEGFA, GLUT1 oraz IL-6 przez
co pośrednio kontrolowało rozwój i angiogenezę ccRCC (212). Sekwencjonowanie
nowej generacji komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy
MCPIP1 ujawniło zmiany w wielu procesach w tym w cyklu komórkowym, replikacji i
naprawie DNA (213). Walidacja wyników RNAseq wykazała, że nadekspresja dzikiej
formy białka MCPIP1 powodowała wzrost poziomu białka p21 zaangażowanego w
kontrolę cyklu komórkowego oraz spadek genów zaangażowanych w angiogenezę w
tym VEGFA, AGR2 czy MMP2 (213). Najnowsza analiza mikromacierzy próbek od
pacjentów z ccRCC wykazała spadek genów supresorowych PTEN, RECK i TIMP3
wraz z progresją nowotworu (214). Nadekspresja MCPIP1 w komórkach Caki-1 i
Caki-2 powodowała wzrost ich transkryptów in vitro oraz in vivo. Co ciekawe,
zaobserwowano, że wysoki poziom MCPIP1 powoduje spadek ekspresji MMP2,
MMP9, które dodatkowo są negatywnie regulowane przez TIMP3 i RECK (214).
Powyższe prace sugerują, że białko MCPIP1 może regulować rozwój nowotworów na
wielu poziomach, z jednej strony promując ekspresję genów supresorowych i
proapoptotycznych, z drugiej degradując transkrypty czynników zaangażowanych w
proliferację, angiogenezę.

41
5 Cel pracy doktorskiej
Jasnokomórkowy rak nerki jest najczęściej występującym typem wśród
nowotworów nerek, opornym na stosowane inhibitory angiogenezy takie jak sunitinib
czy sorafenib. Nowotwór ten tworzy silnie ukrwione guzy, a w chwili diagnozy,
przerzuty stwierdza się już u 30% pacjentów. Istotną rolę w procesie rozwoju
jasnokomórkowego raka nerki oprócz angiogenezy, odgrywają procesy zapalne.
Białko MCPIP1 jest istotnym regulatorem stanu zapalnego, odpowiedzialnym za
utrzymanie homeostazy, a poprzez swoje właściwości proapoptotyczne jest uważane
za potencjalne białko supresorowe, które może w przyszłości stanowić istotny
element terapii.

Głównym celem niniejszej pracy doktorskiej było wyjaśnienie znaczenia

białka MCPIP1 w progresji i rozwoju jasnokomórkowego raka nerki.

Szczegółowe zadania badawcze obejmowały:

• Zbadanie czy istnieje związek między poziomem bądź aktywnością białka

MCPIP1, a proliferacją komórek nowotworowych in vitro oraz in vivo
• Wyjaśnienie wpływu białka MCPIP1 na poziom wydzielanych czynników
proangiogennych, zachowanie komórek endotelialnych i proces angiogenezy
in vivo
• Analizę próbek od pacjentów w różnych stadiach zaawansowania klinicznego
jasnokomórkowego raka nerki pod kątem zmian w poziomie białka MCPIP1 i
jego korelacja z poziomem receptora c-Met
• Zbadanie mechanizmu odpowiedzialnego za nabywanie oporności na
stosowane w terapii jasnokomórkowego raka nerki leki: sunitinib i sorafenib
oraz ocena roli białka MCPIP1 w tym procesie

42
6 Materiały i metody
6.1 Materiały
6.1.1 Materiał ludzki
Tkanka nowotworowa wykorzystana w badaniach, została pobrana od
pacjentów ze zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki w Centrum Onkologii
im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie. Badanie zostało zatwierdzone
przez Lokalną Komisję Bioetyczną (nr zgody 68/KBL/OIL/2011), a od pacjentów
uzyskano pisemne zgody na wykorzystanie materiału. Wszystkie próbki zostały
poddane histologicznej ocenie przez lekarzy patologów oraz sklasyfikowane wg
wytycznych Światowej Organizacji Zdrowia, a następnie podzielone na cztery grupy
(I-IV) w skali Fuhrman. Każda próbka została podzielona i zamrożona w ciekłym
azocie, a następnie przechowywana w -80 ᵒC do czasu izolacji białka, lub inkubowana
przez noc w RNA-later w 4 ᵒC i przeniesiona do -80 ᵒC do czasu izolacji RNA.

6.1.2 Materiał zwierzęcy

Wszystkie doświadczenia z użyciem zwierząt laboratoryjnych były
prowadzone zgodnie ze standardami krajowymi i europejskimi, za zgodą II Lokalnej
Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (zgoda nr 20/2017
oraz 21/2017) oraz Lokalnej Komisji Etycznej przy Collegium Medicum UJ (zgoda nr
117/2014). Do doświadczeń wykorzystano immunokompetentne myszy szczepu
Foxn1nu/Foxn1nu (Envigo) oraz NOD-SCID (Charles River Laboratories). Myszy były
przechowywane w klatkach w standardzie SPF, z dostępem do wody i pożywienia ad
libitum. W rozdziale „Wyniki” opisano do jakiego doświadczenia i dlaczego został
wykorzystany konkretny szczep myszy

6.1.3 Materiał biologiczny

W badaniach wykorzystano linie komórkowe ludzkiego jasnokomórkowego
raka nerki: pochodzące z przerzutu Caki-1 (ATCC; 2011) oraz pochodzące z guza
pierwotnego Caki-2 (Sigma; 2015). Do badań nad angiogenezą wykorzystano
komórki HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells, ATCC; 2016) oraz
komórki HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, otrzymane z Zakładu
Transplantologii Collegium Medicum UJ).

43
6.1.4 Odczynniki
Tabela 1. Zestawienie odczynników wykorzystanych w trakcie doświadczeń.

Odczynnik Producent
Pożywka hodowlana McCoy 5A Lonza
Pożywka hodowlana Eagle minimal essential medium Lonza
(EMEM)
Zmodyfikowana pożywka Eagle’a (DMEM) z wysoką Lonza
zawartością glukozy
Pożywka hodowlana MCDB 131 Lonza
Pożywka hodowlana Endothelial Basal Medium (EBM-2) Lonza
EGM-2 MV SingleQuots (suplementy do pożywki EBM-2) Lonza
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Bioshop
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Sigma Aldrich
Surowica kozia Sigma Aldrich
Trypsyna Lonza
Penicylina i Streptomycyna Lonza
Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) Lonza
Puromycyna InvivoGen
Doksycyklina Bioshop
Woda wolna od RNaz i DNaz Sigma Aldrich
L-glutamina Lonza
Epidermalny czynnik wzrostu (EGF) Sigma Aldrich
Hydrokortyzon Sigma Aldrich
Hydroksymocznik Sigma Aldrich
Kulki lateksowe Sigma Aldrich
Fibrynogen Sigma Aldrich
Trombina Sigma Aldrich
ludzka IL8 DuoSet ELISA R&D Systems
ludzki VEGF DuoSet ELISA R&D Systems
ludzka IL6 DuoSet ELISA R&D Systems
ludzki SDF-1 DuoSet ELISA R&D Systems
Proteom Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit R&D Systems
(Macierze do analizy fosforylowanych kinaz białkowych)
10% obojętna zbuforowana formalina Chempur
Alkohol etylowy POCH

44
Alkohol metylowy POCH
Formaldechyd Chempur
Hoechst 33258 Thermo Fischer
Medium do zatapiania wodnych preparatów (Glycerol Dako
Mounting Medium)
Medium do zatapiania preparatów fluorescencyjnych Dako
(Fluorescent Mounting Medium)
Medium do zatapiania preparatów fluorescencyjnych z Invitrogen
DAPI (Gold antifade reagent)
Medium do zamrażania preparatów tkankowych (O.C.T.) Tissue-Tek
Zestaw do izolacji i oczyszczania RNA (Eurx Universal EURx
RNA Purification Kit
Zestaw do analizy mikromacierzy (Affymetrix Gene-Chip Affymetrix
WT PLUS Reagent Kit)
Izofluran Baxter
Fenozol A&A Biotechnology
Master mix SYBR Green qPCR A&A Biotechnology
Odwrotna transkryptaza M-MLV Promega
Oligo(dT) 15 primer Promega
Taq PCR Master Mix EURx
Mammalian Protein Extraction Reagent (M-PER) Thermo Fischer
Bufor do lizy Protein Lysis buffer 6 R&D Systems
Jet Prime transfection reagent Polyplus Transfection
Membrana PVDF Merck Millipore
Tween 20 Sigma Aldrich
Immobilon Western HRP substrate Merck Millipore
Roztwór MTT Sigma Aldrich
Chlorowodór (HCl) POCH
Izopropanol Chempur
Matrigel BD Biosciences
Kalceina AM Sigma Aldrich
Bufor do lizy czerwonych krwinek High-Yield Lyse Life Technologies
Fixative-Free Lysing Solution
Triton X-100 Sigma Aldrich
SU11274 Selleckchem
Sunitinib LC Laboratories

45
 Sorafenib LC Laboratories
U0126 Sigma Aldrich
Ly294002 Sigma Aldrich
Chlorek litu LiCl Sigma Aldrich
Dimetylosulfotlenek (DMSO) BioShop
Akutaza Sigma Aldrich
Jodek propidyny Life Technologies
RNaza A Sigma Aldrich
Zestaw do barwienia SA β-gal Cell Signaling
Sondy do ludzkiego i mysiego GAPDH Life Technologies
siRNA 1-6, siRNA Negative low, med GC Invitrogen

6.1.5 Przeciwciała
Tabela 2. Wykaz przeciwciał wykorzystanych do doświadczeń.

Przeciwciało Rozcieńczenie Producent Nr

katalogowy
Mysie α-tubulina 1:1000 (WB) Calbiochem CP06
Królicze GAPDH 1:1000 (WB) Cell Signaling 5174
Mysie β-aktyna 1:1000 (WB) Sigma 1978
Królicze MCPIP1 1:1000 (WB) GeneTex gtx110807
Królicze Src 1:1000 (WB) Cell Signaling 2123T
Królicze p-Src (Y416) 1:1000 (WB) Cell Signaling 2101S
Mysie β-katenina 1:1000 (WB) BD Biosciences 610154
1:100 (IF)
Królicze e-kadheryna 1:1000 (WB) Abcam ab40772
1:100 (IF)
Królicze c-Met 1:1000 (WB) Santa Cruz sc-10
1:100 (IF) Biotechnology
Królicze p-c-Met 1:1000 (WB) Cell Signaling 3077S
(Y1234/1235)
Królicze STAT3 1:1000 (WB) Cell Signaling 4904S
Mysie p-STAT3 (Y705) 1:1000 (WB) Cell Signaling 4113S
Królicze IKKβ 1:1000 (WB) GeneTex gtx634834
Królicze p-IKKα/β 1:1000 (WB) Cell Signaling 2078T
(S176/S180)
Królicze Fibronektyna 1:1000 (WB) Abcam ab23750

46
 Królicze GSK3β 1:1000 (WB) GeneTex gtx133372
Królicze GSK3β (S9) 1:1000 (WB) Cell Signaling 9336S
Królicze VE-kadheryna 1:1000 (WB) Abcam ab33168
1:100 (IF)
Królicze p-VE- 1:1000 (WB) Abcam ab119785
kadheryna (Y685)
Królicze Akt 1:1000 (WB) Cell Signaling 4685S
Królicze p-Akt (S473) 1:1000 (WB) Cell Signaling 4685S
Królicze wimentyna 1:1000 (WB) Cell Signaling 3932
Królicze CEBPβ 1:1000 (WB) Cell Signaling 90081
Szczurze CD31 1:50 (IF) BD Pharmingen 4234535
Kozie anty-mysie Alexa 1:1000 (IF) Invitrogen A11001
Fluor 488
Kozie anty-królicze 1:1000 (IF) Invitrogen A11007
Alexa Fluor 594
Kozie anty-szczurze 1:1000 (IF) Invitrogen A11035
Alexa Fluor 546
Kozie anty-królicze 1:1000 (IF) Invitrogen A21241
Alexa Fluor 647
Kozie anty-królicze IgG- 1:4000 Santa Cruz Sc-2004
HRP Biotechnology
Kozie anty-mysie IgG- 1:4000 Santa Cruz Sc-2005
HRP Biotechnology
Szczurze IgG2α κ 1:50 BD Pharmingen 4234535
Kontrola izotypowa
Falloidyna (rodamina) 1:100 (IF) Abcam Ab235138

6.1.6 Startery
Tabela 3. Wykaz ludzkich starterów wykorzystanych do doświadczeń

Gen Sekwencja Temperatura Długość

przyłączenia produktu
starterów [nt]
ZC3H12A F 5’ GGAAGCAGCCGTGTCCCTATG 3’ 62 °C 226
R 5’ TCCAGGCTGCACTGCTCACTC 3’
MET F 5’ CATCTCAGAACGGTTCATGCC 3’ 62 °C 193
R 5’ TGCACAATCAGGCTACTGGG 3’

47
 EF2 F 5’ GACATCACCAAGGGTGTGCAG 3’ 62 °C 215
R 5’ TTCAGCACACTGGCATAGAGGC 3’
SDF-1 F 5’ CGAAAGCCATGTTGCCAGAG 3’ 62 °C 121
R 5’ CTTCGGGTCAATGCACACTTG 3’
CXCR4 F 5’ TGCTTGCTGAATTGGAAGTG 3’ 62 °C 229
R 5’ GGTAACCCATGACCAGGATG 3’
IL-8 F 5’ ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT 3’ 62 °C 292
R 5’ TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC 3’
VEGF F 5’ AGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTC 3’ 62 °C 155
R 5’GCCTCGGCTTGTCACATCTGCAA 3’
IL-6 F 5’ GGTACATCCTCGACGGCATCT 3’ 62 °C 81
R 5’ GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC 3’
Snail F 5’ GCACATCCGAAGCCACAC 3’ 62 °C 226
R 5’ GGAGAAGGTCCGAGCACA 3’
ZEB2 F 5’ CGGTGCAAGAGGCGCAAACA 3’ 62 °C 183
R 5’ GGAGGACTCATGGTTGGGCA 3’
CEBPβ F 5’ AGCGACGAGTACAAGATCCG 3’ 62 °C 148
R 5’ GCTGCTCCACCTTCTTCTGC 3’

6.2 Metody
6.2.1 Hodowle komórkowe
Linie komórkowe ludzkiego jasnokomórkowego raka nerki Caki-1 były
hodowane w pożywce EMEM, natomiast Caki-2 w pożywce McCoy 5A, obie z
dodatkiem 10% FBS. Komórki HMEC-1 były hodowane w pożywce MCDB 131 z
dodatkiem 10% FBS, L-glutaminy (2mmol/L), EGF (10ng/ml) oraz hydrokortyzonem
(1μg/ml). Komórki HUVEC były hodowane w pożywce EBM-2 z dodatkiem
suplementu EGM-2 MV SingleQuots. Wszystkie linie komórkowe były hodowane nie
dłużej niż piętnaście kolejnych pasaży i były rutynowo sprawdzane na obecność
mykoplazmy co trzy miesiące. Komórki były hodowane do osiągnięcia ok. 80%
gęstości, przepłukiwane roztworem PBS z 0,02% EDTA, a następnie zalewane
roztworem trypsyny z 0,02% EDTA i inkubowane od 30 sek-3 min w 37 ᵒC. Trypsynę
inaktywowano pożywką hodowlaną z dodatkiem 10% FBS, a zawiesinę komórek
przenoszono do probówki i wirowano przez 5 minut przy 1200 rpm. Osad komórek
zawieszano w 1 ml właściwej pożywki hodowlanej, następnie komórki liczono i
wysiewano na poszczególne doświadczenie. Wszystkie linie komórkowe hodowano
w temperaturze 37 ᵒC, w atmosferze 5% CO2 i 95% wilgotności.

48
 W celu zebrania medium warunkowanego z linii Caki-1 oraz Caki-2 komórki
były hodowane przez 48 godzin w warunkach normalnego poziomu tlenu (normoksji
- 21% tlenu) bądź głodu tlenowego (hipoksji - 1% tlenu) w pożywce z dodatkiem 0,5%
BSA.

6.2.2 Przejściowa transfekcja małym interferującym RNA (siRNA)

W celu obniżenia poziomu MCPIP1 sprawdzono sześć różnych siRNA (ang.
Small interfering RNA) wraz z odpowiednimi kontrolami (kontrola negatywna ze
średnią zawartością GC do si 1, 2, 3, kontrola negatywna z niską zawartością GC do
si 4, 5, 6). Komórki Caki-1 wysiewano 24 godziny przed transfekcją na 12-dołkową
płytkę w gęstości 60%. Transfekcję przeprowadzano z wykorzystaniem zestawu
JetPrime zgodnie z instrukcją producenta. Kolejnego dnia, zmieniano pożywkę
hodowlaną. Po kolejnych 48 godzinach analizowano wydajność transfekcji przy
pomocy metody western blot.

6.2.3 Stabilna transdukcja za pomocą wektorów wirusowych

W celu określenia roli białka MCPIP1 w rozwoju ccRCC, użyto trzech różnych
wektorów wirusowych. Aby stabilnie obniżyć poziom białka MCPIP1 wykorzystano
wektor lentiwirusowy przeciw sekwencji genu ZC3H12A kodującej białko MCPIP1
(shMCPIP1) wraz z wektorem kontrolnym (shCtrl)(Sigma Aldrich) kodującym jedynie
oporność na puromycynę. W celu podwyższenia poziomu białka MCPIP1
zastosowano system TetON zależny od doksycykliny, gdzie pLIX MCPIP1 był
wektorem zawierającym enzymatycznie aktywną formę MCPIP1, a pLIX PURO
wektorem kontrolnym opornym na puromycynę. W badaniach został także użyty
wektor pLIX D141N zawierający enzymatycznie nieaktywny MCPIP1, w którym
wprowadzono mutację punktową w domenie RNazowej (168,169). Aby rozpocząć
ekspresję MCPIP1 w systemie TetON, do pożywki hodowlanej dodawano 1μg/ml
doksycykliny na 48 godzin. Dodatkowo, w celu uzyskania nadekspresji genu
ZC3H12A użyto system retrowirusowy, gdzie dla zwiększenia ekspresji użyto wektor
pMX MCPIP1, a jako kontroli użyto pusty wektor pMX PURO. Aby uzyskać ekspresję
białka zielonej fluorescencji (ang. Green fluorescence protein, GFP), użyto wektora
lentiwirusowego, shGFP.

Komórki wysiewano na płytkę 6-dołkową w gęstości 50%, po 24 godzinach

pożywkę zmieniano na świeżą z dodatkiem polibrenu w stężeniu 6μg/ml w celu
ułatwienia wnikania wirusa. Po 15 minutach dodawano odpowiednie wektory
wirusowe. Komórki umieszczano w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotność),
następnie by zwiększyć wydajność transdukcji po 24 godzinach czynność

49
powtarzano. MOI (ang. multiplicity of infection – wielokrotność infekcji) dodawanych
na komórki wektorów wirusowych wynosiło 50. Po kolejnych 24 godzinach pożywka
z wirusami była zmieniana na świeżą, a po dodatkowych 24 godzinach dodawana
była puromycyna (1μg/ml) w celu rozpoczęcia selekcji.

6.2.4 Stymulacja komórek

Stymulacja komórek nowotworowych lekami. Inhibitory użyte w
doświadczeniach zostały przygotowane w następujący sposób: SU11274, sunitnib,
sorafenib oraz Ly294002 użyte w doświadczeniach, zostały rozpuszczone w DMSO,
LiCl został rozpuszczony w wodzie. Następnie stężone roztwory zostały rozcieńczone
w pożywce hodowlanej w celu stymulacji komórek nowotworowych tak, by końcowe
stężenie wynosiło odpowiednio: SU11274 - 2,5μM, sunitnib - 5μM, sorafenib - 2,5μM,
Ly294002 – 10μM, a LiCl – 10mM. Jako kontroli użyto DMSO, którego końcowe
stężenie w pożywce hodowlanej nie przekraczało 0.1% (v/v). Komórki były traktowane
lekami od 24 godzin do 5 tygodni. Pożywka hodowlana była wymieniana na świeżą z
dodatkiem leków co 48 godzin.

Indukcja fosforylacji IKK za pomocą IL-1β. Do analizy poziomu i fosforylacji

kinazy IKK, komórki Caki-1 wysiewano na 6-dołkową płytkę w gęstości 300 000
komórek na dołek. Po 24 godzinach pożywka była zmieniana na EMEM z 0,5% BSA.
Następnego dnia, komórki traktowano IL-1β w stężeniu 10 ng/ml w EMEM z 0,5%
BSA i inkubowano w 37ᵒC przez 5 min, 15 min, 30 min, 1 godz. i 2 godz.

Przygotowanie medium warunkowanego. W celu przygotowania medium

warunkowanego, transdukowane komórki Caki-1 lub Caki-2, z różnym poziomem
MCPIP1 były wysiewane na płytki 6-dołkowe (Caki-1: 300 000; Caki-2: 200 000
komórek na dołek) we właściwym medium. Po 48 godzinach, gdy osiągnęły pełną
gęstość, pożywka była zmieniana na 1 ml pożywki EMEM/MCCoy 5A z dodatkiem
0,5% BSA, po uprzednim przepłukaniu komórek PBS. Komórki były dalej hodowane
w warunkach normoksji lub hipoksji i po 24 godzinach pożywka znad komórek była
zbierana, odwirowywana 5 minut 300 rpm z resztek komórkowych i przechowywana
w -20ᵒC do dalszych analiz.

Komórki HMEC-1 oraz HUVEC przed stymulacją medium warunkowanym były

wysiewane na płytki 12 lub 24-dołkowe i hodowane do uzyskania pełnej gęstości.
Następnie, pożywka hodowlana była zmieniana na nową z dodatkiem 0.5% BSA. Po
24 godzinach pożywka była usuwana, komórki przepłukiwano PBS i zalewano
medium warunkowanym, a następnie inkubowano 3 godziny w inkubatorze (37ᵒC,

50
5%CO2, 95% wilgotność). Po tym czasie przeprowadzano barwienia
immunofluorescencyjne lub izolowano białko do dalszych analiz.

6.2.5 Analiza mikromacierzy

Analiza mikromacierzy została przeprowadzona z użyciem mikromacierzy
Affymetrix HuGene ST 2.1 na próbkach pobranych od pacjentów z ccRCC. Próbki
zostały podzielone na 4 grupy zgodnie ze skalą Fuhrman. Całkowite RNA zostało
wyizolowane za pomocą zestawu Eurx Universal Purification Kit, zgodnie z
protokołem producenta. Jakość wyizolowanego RNA została następnie sprawdzona
za pomocą elektroforezy na 1% żelu denaturującym. Stężenie RNA zostało
zmierzone przy pomocy spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Fischer
Scientific). Do dalszej syntezy i amplifikacji ss-CDNA wykorzystano 100ng
całkowitego RNA. Następnie wykonano fragmentację i znakowanie biotyną wg
zaleceń producenta. 10μg otrzymanego cRNA zostało poddane 16 godzinnej
hybrydyzacji w 48ᵒC w Affymetrix HuGene2.1 ST Array Strip, następnie przepłukane
i barwione w Affymetrix Gene Atlas Fluidics Station. Każda macierz została
przeskanowana przez GeneAtlas Imaging Station. Otrzymane wyniki zostały
znormalizowane przy użyciu oprogramowania Expression Console Software 1.4.1 (z
użyciem algorytmu RMA), a następnie analizowane przy pomocy oprogramowania
Affymetrix Transcriptome Analysis Console (TAC) 3.1. Do analizy statystycznej
została wykorzystana jednokierunkowa ANOVA (niesparowana). Dodatkowo, surowe
dane zostały umieszczone w bazie danych Gene Expression Omnibus (GEO) z
numerem dostępu GSE89563.

6.2.6 Izolacja i analiza poziomu białek metodą western blot

Hodowane komórki zostały przepłukane zimnym roztworem PBS, zalane
buforem M-PER (z dodatkiem inhibitorów proteaz i fosfataz) lub Lysis Buffer 6 i
przeniesione do probówek typu eppendorf. Po 10 minutowej inkubacji na lodzie, lizaty
zostały zwirowane przez 20 min, 11 000 g, 4ᵒC a otrzymany nadsącz przeniesiono do
nowych probówek. W przypadku tkanek, zamrożony fragment był zawieszany w 400μl
buforu M-PER i poddawany homogenizacji przy użyciu ręcznego homogenizatora
(Miccra D1). Resztki komórkowe były odwirowywane (11 000 g, 4ᵒC), a nadsącz
przenoszono do nowych probówek. Analizę stężenia całkowitego białka
przeprowadzono za pomocą metody BCA (kwas bicynchoninowy i siarczan miedzi).
Na podstawie otrzymanego wyniku na 10% żel poliakrylamidowy nakładano, w
zależności od doświadczenia, równo między 20 a 40 μg białka zmieszanego z
buforem obciążającym (0,375 M Tris-HCl, pH 6,8, 12% SDS, 60 % glicerolu 0,6 M
DTT, 0,06% błękitu bromofenolowego) i prowadzono elektroforezę SDS-PAGE przez

51
1,5 godziny. Transfer białek z żelu na membranę PVDF przeprowadzano przy
pomocy aparatu do mokrego transferu (Bio-Rad). Membranę blokowano przez
godzinę w temperaturze pokojowej w odpowiednim buforze (3% BSA lub 5%
odtłuszczone mleko w TBS z 0,1% Tween-20), następnie membrany inkubowano w
roztworze przeciwciał pierwszorzędowych w buforze do blokowania, przez noc w
temperaturze 4ᵒC na kołysce laboratoryjnej (Tabela 2). Kolejnego dnia membrany
przepłukiwano 3 x 10min w buforze TBS z dodatkiem 0,1% Tween-20. Po tym czasie
membrany inkubowano w roztworze odpowiednich drugorzędowych przeciwciał HRP
(Tabela 2) rozpuszczonych w buforze do blokowania. Niezwiązane przeciwciała
odpłukiwano 3 x 10min w buforze TBS+0,1% Tween-20. Detekcja sygnału była
przeprowadzana po 5 minutowej inkubacji z substratem Immobilon Western HRP przy
pomocy systemu ChemiDoc (Bio-Rad). Analizę densytometryczną przeprowadzno z
użyciem oprogramowania ImageLab. Lista przeciwciał i rozcieńczeń została
przedstawiona w Tabeli 2.

Analiza densytometryczna była przeprowadzana poprzez przyrównanie

wartości densytometrycznej danego prążka do odpowiadającej mu kontroli ilościowej
według wzoru W śr = W badane / Wkontrola, gdzie W śr to średnia wartość densytometryczna,
Wbadane wartość densytometryczna badanego białka, a W kontrola wartość
densytometryczna odpowiedniej kontroli. W przypadku białek fosforylowanych,
najpierw wartość densytometryczna formy fosforylowanej jak i całkowitej zostały
przyrównane do odpowiedniej kontroli ilościowej, a następnie uzyskane średnie
wartości densytometryczne formy fosforylowanej do formy całkowitej według wzoru:
Wśr = (W fosforylowane/W kontrola) / (W całkowite/W kontrola).

6.2.7 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym

Całkowite RNA z linii komórkowych było izolowane przy pomocy zestawu Eurx
Universal Purification Kit zgodnie z protokołem producenta. RNA z tkanek
zwierzęcych izolowano przy pomocy zmodyfikowanej metody Chomczyńskiego
używając odczynnika Fenozol. Czystość i stężenie całkowitego RNA mierzono za
pomocą spektrofotometru NanoDrop 1000, natomiast jakość i ewentualne
zanieczyszczenie DNA sprawdzano poprzez elektroforezę w 1% żelu denaturującym.

Do reakcji odwrotnej transkrypcji używano 1μg całkowitego RNA, 0,25μg

oligo(dT) i odwrotnej transkryptazy M-MLV. Uzyskane cDNA 5-krotnie rozcieńczano
wodą przed użyciem do reakcji PCR w czasie rzeczywistym, którą prowadzono z
użyciem odczynnika SybrGreen Master Mix i urządzenia Quant Studio 3 (Applied
Biosystems) lub Eco (Illumina). Etapy reakcji i temperatury zostały podane poniżej.

52
Tabela 4. Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Etap Temperatura Czas Il. cykli

Wstępna denaturacja 95ᵒC 5 minut 1
Denaturacja 95ᵒC 20 sekund
Przyłączanie starterów 62ᵒC 20 sekund 40
Synteza produktu 72ᵒC 25 sekund
Końcowe wydłużanie 72ᵒC 10 minut 1

Ekspresja genów została znormalizowana do genu referencyjnego EF2 (ang.

Elongation factor-2), a każdą próbkę analizowano w duplikacie. Aby określić
specyficzność powstałego produktu wykreślono krzywą topnienia, charakterystyczną
dla danego zestawu starterów. Względną ekspresję (gen badany/gen referencyjny)
obliczono na podstawie wzoru: ΔΔCT=2-ΔCT. Sekwencję starterów i ich temperatury
przyłączania zostały przedstawione w Tabeli 3.

W celu oceny ilości przerzutów do płuc izolowanych z myszy, użyto

specyficznych sond dla ludzkiego i mysiego GAPDH oraz Taq PCR Master Mix.
Poszczególne etapy reakcji i temperatury zostały podane w Tabeli 5. Ekspresję
ludzkiego GAPDH znormalizowano do genu referencyjnego mysiego GAPDH.
Względną ekspresję (gen badany/gen referencyjny) obliczono na podstawie wzoru:
ΔΔCT=2-ΔCT. Etapy reakcji i temperatury zostały podane poniżej.

Tabela 5. Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym z użyciem sond.

Etap Temperatura Czas Il. cykli

Wstępna denaturacja 95ᵒC 3 minut 1
Denaturacja 95ᵒC 30 sekund
Przyłączanie starterów 95ᵒC 30 sekund 50
Synteza produktu 95ᵒC 60 sekund

6.2.8 Test redukcji MTT

Pomiar aktywności mitochondrialnych dehydrogenaz wykorzystano w celu
oceny żywotności komórek zarówno po zmianie ilości białka MCPIP1 jak i po
zastosowaniu inhibitorów angiogenezy. Komórki ccRCC wysiewano w ilości 3 000
(Caki-2) lub 5 000 (Caki-1) na płytkę 96-dołkową w 100μl pożywki hodowlanej.
Następnie, dodawano 0,5 mg/ml roztworu MTT (sól tetrazolowa) w pożywce, na 2
godziny, po ukazaniu się kryształków formazanu reakcję zatrzymywano przez
dodanie 5mmol/L HCl w izopropanolu i wytrząsano płytkę przez 30 min. Absorbancja
była mierzona przy użyciu czytnika mikropłytek Tecan Spectra Fluor Plus (Tecan

53
Group) przy długości fali 570 nm wraz z referencją o długości 500 nm. Pomiary były
wykonywane 24, 48, 72, 96 godzin po wysianiu, lub 1, 2, 4 oraz 7 dni po pierwszej
stymulacji inhibitorami. Doświadczenie zostało powtórzone trzy razy w tryplikacie.

6.2.9 Test proliferacji

Linie komórkowe Caki-1 oraz Caki-2 z różnym poziomem białka MCPIP1 były
wysiewane w ilości 20 000 komórek na dołek, na płytki 24-dołkowe. Po 24, 48, 72 i
96 godzinach od wysiania, komórki były trypsynizowane i liczone w komorze Burkera.
Doświadczenie zostało powtórzone trzy razy w tryplikacie. Wynik został
przedstawiony jako ilość komórek w 1ml pożywki.

6.2.10 Test migracji – zarastanie rany

Komórki ccRCC zostały wysiane na płytkę 24-dołkową i hodowane do
osiągnięcia pełnej gęstości. Tuż przed rozpoczęciem doświadczenia do pożywki
hodowlanej został dodany 10 mmol/L hydroksymocznik, w celu zahamowania
proliferacji. Rana została zrobiona przy pomocy małej końcówki do pipety. Następnie,
płytkę przeniesiono do komory inkubacyjnej (37ᵒC, 5%CO2) znajdującej się w obrębie
mikroskopu. Zdjęcia każdego dołka były wykonywane co 10 minut przez 16 godzin,
w powiększeniu 10x, przy pomocy mikroskopu odwróconego Leica DMI6000B
wyposażonego w cyfrową kamerę CCD Leica DFC360 FX (Leica Microsystems).
Zdjęcia były analizowane przy pomocy oprogramowania Leica LAS X oraz Hiro v.
1.0.0.4.

6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych

W celu oceny wpływu obecności i poziomu białka MCPIP1 w komórkach
nowotworowych na rozwój unaczynienia in vitro, analizowano zachowanie komórek
endotelialnych HMEC-1 wysianych na warstwę Matrigelu. Płytki 96-dołkowe były
pokrywane Matrigelem w ilości 50 μl bez dodatku czynników wzrostu i inkubowane
przez 30 minut w 37ᵒC aby zestalić Matrigel. Na warstwę Matrigelu wysiewano 10 000
komórek HMEC-1 w 200μl medium warunkowanym z komórek Caki-1 shCtrl lub
shMCPIP1. Komórki inkubowano przez 4 godziny w 37ᵒC i 5%CO2, 95% wilgotności.
Następnie, komórki wybarwiano barwnikiem przyżyciowym Kalceina AM (1μmol/L).
Zdjęcia poszczególnych dołków wykonywano przy pomocy odwróconego mikroskopu
fluorescencyjnego Olympus IX50 (Olympus) z użyciem suchego obiektywu 4x.
Rozwój sieci unaczynienia i tworzenie punktów rozgałęzień analizowano przy pomocy
oprogramowania ImageJ i dodatku Angiogenesis Analyzer (Carpentier G.,
Angiogenesis Analyzer for ImageJ; dostępnych online:
http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolstes/Angiogenesis%20Analyzer.txt).

54
6.2.12 Test fibrynowy
Test fibrynowy został zaprojektowany do badań nad angiogenezą in vitro i
polega na współhodowli komórek endotelialnych wysianych na kulki lateksowe, w
macierzy trójwymiarowej z komórkami nowotworowymi Caki-1. Kulki lateksowe, po
przygotowaniu wg zaleceń producenta, aktywowano przepłukując ciepłą pożywką
hodowlaną. Linię komórkową HMEC-1 trypsynizowano, następnie wirowano (5 minut,
1200 rpm), osad zawieszano w pożywce i komórki liczono w komorze Burkera.
Odpowiednią ilość komórek mieszano z zawiesiną kulek lateksowych tak aby na
jedną kulkę przypadało 400 komórek endotelialnych. Taką mieszaninę inkubowano 6
godzin w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotności), mieszając ją co 20 minut tak,
by zapewnić odpowiednie pokrycie kulek komórkami. Po tym czasie, zawiesinę
przeniesiono do butelki hodowlanej T-25cm2 i zostawiono na noc w inkubatorze, by
komórki niezwiązane z kulkami przyczepiły się do dna naczynia.

Poprzez rozpuszczenie fibrynogenu (2mg/ml) w pożywce hodowlanej z

dodatkiem 0,5% BSA przygotowywano żel fibrynowy. Do roztworu fibrynogenu,
dodawano przepłukaną zawiesinę kulek lateksowych opłaszczonych komórkami
endotelialnymi. Na płytkę 24-dołkową dodano po 0,625U/ml roztworu trombiny a
następnie mieszaninę fibrynogenu z kulkami. Całość wymieszano kilkukrotnie przez
pipetowanie tak, by nie utworzyć bąbelków. Aby przyspieszyć polimeryzację, płytkę
umieszczono na 20 minut w inkubatorze. W tym czasie przygotowywano komórki
Caki-1 kontrolne (shCtrl) oraz komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1
(shMCPIP1). Komórki te wysiewano następnie na górę spolimeryzowanego żelu w
ilości 30 000 komórek na dołek w medium zawierającym 0,5% BSA. Komórki
hodowano w inkubatorze i zmieniano medium co 48 godzin. Aby ocenić stopień
migracji komórek endotelialnych w żelu fibrynowym i tworzenie tubularnych struktur,
przez sześć dni robiono zdjęcia przy pomocy mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S (Nikon)
z użyciem suchego obiektywu 10x. Do analizy migracji i mierzenia powierzchni
zajmowanej przez komórki HMEC-1 użyto oprogramowania ImageJ (NIH, Bethseda).

6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)
Ocena ilościowa poziomu białek sekrecyjnych uwalnianych do pożywki
hodowlanej, została przeprowadzona przy użyciu testów immunoenzymatycznych
typu ELISA. Oznaczenie poziomu IL-6, IL-8 oraz VEGF przeprowadzono zgodnie z
protokołem producenta oraz znormalizowano do poziomu białka całkowitego
pochodzącego z lizatów komórkowych z których zebrane zostało medium
warunkowane. Poziom czynnika SDF-1 wydzielanego przez ludzkie komórki

55
nowotworowe do mysiego osocza oznaczono według protokołu producenta.
Absorbancja była mierzona przy długości 450 nm wraz z referencją o długości 540
nm przy użyciu czytnika mikropłytek Tecan Spectra Fluor Plus. Doświadczenie
wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach w tryplikacie.

6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych

Poziom fosforylowanych kinaz w materiale od pacjentów z ccRCC oraz w
komórkach Caki-1 po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem
został zbadany przy pomocy zestawu macierzy białkowych Proteome Profiler Human
Phospho-Kinase Array Kit, według protokołu producenta. Komórki Caki-1
przepłukano zimnym buforem PBS, lizowano przy pomocy dołączonego do zestawu
buforu lizującego (Lysis buffer 6) i inkubowano 30 minut na lodzie. W przypadku
próbek klinicznych, zamrożony kawałek tkanki został zalany buforem lizującym (400
μl), a następnie homogenizowany homogenizatorem ręcznym. Lizaty następnie
wirowano przez 5 minut, 15 000g w 4ᵒC. Dalej przeprowadzono pomiar ilości białka
w lizacie przy pomocy metody BSA i na każdy zestaw membran nałożono po 600 μg
lizatu. Chemiluminescencja była mierzona po 10 minutach inkubacji membran z
substratem Chemi Reagent Mix znajdującym się w zestawie przy użyciu urządzenia
ChemiDoc. Wartości densytometryczne każdego duplikatu kropek obecnych na
membranie były mierzone przy pomocy oprogramowania Image Lab 5.2.1.

6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym

Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 po 96 godzinnej stymulacji SU11274,
sunitinibem lub sorafenibem zostały przepłukane buforem PBS i utrwalone 5 minut w
temperaturze pokojowej 100% metanolem. Po ściągnięciu metanolu komórki
barwiono 20% roztworem fioletu krystalicznego w metanolu (20 minut, temperatura
pokojowa). Następnie, każdy dołek przepłukiwano co najmniej 3 razy buforem PBS.
Wysuszone płytki analizowano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S z suchymi
obiektywami 10x, 20x oraz 40x. Do analizy długości i powierzchni komórek użyto
oprogramowania ImageJ.

6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal

Komórki Caki-1 zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na
dnie szkiełkami podstawowymi. Po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub
sorafenibem komórki zostały wybarwione przy pomocy zestawu SA β-gal Staining Kit
według protokołu producenta. Po odpłukaniu pożywki, komórki zostały utrwalone przy
użyciu Fixative Solution w temperaturze pokojowej. Następnie dodano β-gal Staining
Solution, a płytki zabezpieczono parafilmem i inkubowano przez noc w suchym

56
inkubatorze z temperaturą 37ᵒC. Następnego dnia wyjęto szkiełka z wybarwionymi
komórkami i zaklejono przy pomocy medium do preparatów wodnych (Glycergel
Mounting Medium). Zdjęcia szkiełek zrobiono przy pomocy mikroskopu
fluorescencyjnego Leica DM6 B (Leica Microsystems) z użyciem suchego obiektywu
10x i oprogramowania Leica LAS X.

6.2.17 Analiza cyklu komórkowego

Po siedmiodniowym traktowaniu komórek ccRCC SU11274, sunitinibem lub
sorafenibem, komórki odczepiono od naczynia hodowlanego przy pomocy akutazy i
policzono. 100 000 komórek utrwalono w zimnym 70% etanolu przez 30 minut w 4ᵒC.
Następnie, komórki zostały zwirowane przez 3 minuty w 3 000 rpm, przepłukane
buforem PBS i ponownie zwirowane w tych samych warunkach. Dalej, osad
zawieszono w 250 μl roztworu barwiącego (zawierającego 1μl jodku propidyny
(50mg/ml) i 25 μl Rnazy A (100mg/ml) w 10 ml PBS). Próbki inkubowano 30 minut w
37ᵒC. Pomiar wykonano przy użyciu cytometru przepływowego Attune NxT Acousting
Focusing wraz z oprogramowaniem Attune v2.4.

6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek

W celu analizy immunocytofluorescencyjnej, komórki ccRCC jak i komórki
HUVEC zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na dnie szkiełkami
podstawowymi. Po zakończeniu stymulacji (Caki-1 lub Caki-2) lub osiągnięciu pełnej
gęstości (HUVEC) komórki utrwalano poprzez 15 minutową inkubację w 4%
paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej. Następnie, przeprowadzano
permabilizację błony i blokowanie w buforze blokującym (1% BSA, 0,3% Triton X-100
w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Preparaty inkubowano z
przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4ᵒC w buforze 1% BSA
w PBS. Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty
inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor lub barwnikiem falloidyna
(1:1 000) wraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po
godzinnej inkubacji w ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą
destylowaną i zaklejono medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów
prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi
obiektywami 10x i 20x oraz obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych
przeciwciał zostały przedstawione w Tabeli 2.

6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo

Do badania roli białka MCPIP1 we wzroście i progresji guzów wykorzystano
sześciotygodniowe samice myszy szczepów Foxn1nu/Foxn1nu oraz NOD-SCID, o

57
upośledzonym układzie odpornościowym. Myszom została podana zawiesina
komórek Caki-1 lub Caki-2 ze stabilną nadekspresją (pMX MCPIP1, pLIX MCPIP1),
mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) i właściwymi komórkami kontrolnymi (pMX
PURO, pLIX PURO), a także wyciszeniem białka MCPIP1 (shMCPIP1) i kontrolą
(shCtrl). Komórki zostały podane podskórnie w okolicę tylnej pachwiny (2 500 000
komórek w 200μl PBS – Caki-1; 5 000 000 komórek w 200μl PBS – Caki-2). Myszy z
podanymi komórkami w systemie TetON były pojone wodą z dodatkiem doksycykliny
oraz sacharozy (1%) przez cały okres trwania doświadczenia. Wzrost guzów był
monitorowany przez 6 tygodni (shCtrl, shMCPIP1, pLIX PURO, pLIX MCPIP1, pLIX
D141N) lub 8 tygodni (pMX PURO, pMX MCPIP1).

Do badania wpływu oporności na SU11274, sunitinib i sorafenib wykorzystano

sześciotygodniowe samice myszy szczepu NOD-SCID. Myszom zostały podane
komórki Caki-1 przygotowane w następujący sposób. Komórki wysiewano na duże
butelki T-75 cm2 w gęstości ok. 60%, po 24 godzinach do pożywki hodowlanej
dodawano DMSO, SU11274, sunitinib lub sorafenib (stężenia podano w podpunkcie
6.2.3 Stymulacja komórek) i hodowano przez kolejne 3 tygodnie. Co 48 godzin
medium było zmieniane na świeże, komórki rozsiewano co 7 dni na nowe butelki. Po
okresie 21 dni nastąpiła 7 dniowa przerwa w stymulacji w celu namnożenia komórek,
po której wznowiono stymulację przez kolejny tydzień. Następnie zbierano i liczono
komórki oporne. Sześciotygodniowym samicom szczepu NOD-SCID podawano
zawiesinę komórek Caki-1GFP (kontrolne - traktowane DMSO oraz oporne na
SU11274, sunitinib lub sorafenib) zmieszanych w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami
Caki-1. Wzrost guzów był monitorowany przez 6 tygodni. Schemat doświadczenia
został przedstawiony na rycinie 6.1.

A. zbieranie B. oporne
wysiewanie przerwa w wznowienie opornych Caki 1
Caki 1 stymulacji stymulacji komórek Caki 1
stymulacja (1:1)
DMSO/SU11274/sunitinib/sorafenib
injekcja podskórna
0 21d 28d 35d

kontrola SU11274 sunitinib sorafenib

Rycina 6.1. Schemat doświadczeń in vivo z użyciem opornych komórek Caki-1. A.

Schemat otrzymania opornych komórek Caki-1 GFP B. Schemat iniekcji podskórnej. Oporne
komórki Caki-1 GFP mieszano w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. Taką mieszaninę
w PBS wstrzykiwano podskórnie do czterech grup myszy szczepu NOD-SCID.

Wzrost guzów był mierzony przy pomocy suwmiarki 2 razy w tygodniu a

otrzymane wartości przeliczono wg wzoru: objętość = szerokość x głębokość2.
Dodatkowo, w przypadku myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu wykonywano pomiary
metodą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości 3D (raz w tygodniu). Po zakończeniu

58
doświadczeń zwierzęta poddano eutanazji, a tkankę nowotworową, płuca i krew
pobrano do dalszych analiz. Guzy nowotworowe podzielono, połowa została poddana
analizie histologicznej lub immunohistologicznej, z drugiej połowy wyizolowano RNA
oraz białko.

6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości

Obrazowanie wzrostu guza i rozwoju naczyń krwionośnych w jego obrębie
wykonano za pomocą ultrasonografu 3D wysokiej rozdzielczości VEVO2100
(VisualSonics) z głowicą z funkcją PowerDoppler dzięki której można monitorować
unaczynienie. Pomiary wykonywano na myszach szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, które
pozbawione były sierści. Przed pomiarem zwierzęta były usypiane wziewnie za
pomocą 2% izofluranu (przepływ powietrza 0,5 L/min). Wyniki były analizowane w
trybie 3D przy pomocy oprogramowania VEVO 2100.

6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii

przepływowej
Ilość krążących we krwi komórek nowotworowych Caki-1 transdukowanych
wektorem lentiwirusowym GFP kontrolnych oraz z wyciszeniem białka MCPIP1,
została oceniona przy pomocy metod cytometrii przepływowej. 6 tygodni po podaniu
komórek nowotworowych do myszy szczepu NOD-SCID wyizolowano ich krew
obwodową i analizowano ilość komórek pozytywnych dla GFP. Krew została poddana
lizie w celu usunięcia erytrocytów przy pomocy buforu lizującego High-Yeld Lyse
Fixative-Free Lysing Solution (30 minut, temperatura pokojowa), rozcieńczona 100
razy w buforze PBS i 10 ml każdej próbki zostało poddane analizie cytometrem
przepływowym Attune NxT Acousting Focusing wraz z oprogramowaniem Attunev2.4.

6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków mrożeniowych

Aby przygotować mrożeniowe preparaty histologiczne, tkankę utrwalono w
roztworze 4% paraformaldehydu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, po
przepłukaniu w buforze PBS, tkanki przeniesiono do 30% roztworu sacharozy i
inkubowano przez noc w 4ᵒC. Następnie, tkanki ponownie przepłukano w buforze
PBS oraz zatopiono w medium do zamrażania O.C.T. (ang. Optimal Cutting
Temperature Embedding Medium). Preparaty krojono przy użyciu kriostatu na
skrawki o grubości 9 μm.

9 μm skrawki tkanki umieszczone na pokrytych poli-L-lizyną szkiełkach zostały

wyjęte z -80ᵒC i rozmrożone w temperaturze pokojowej. Po uwodnieniu w buforze
PBS, preparaty permeabilizowano (0,1% Triton X-100 w PBS) 20 minut i blokowano
(5% BSA, 2% odtłuszczone mleko w PBS) przez kolejną godzinę w temperaturze

59
pokojowej. Próbki tkankowe obrysowano pisakiem PAP PEN tworzącym hydrofobową
barierę dookoła skrawka. Następnie, preparaty inkubowano przez noc z
przeciwciałami pierwszorzędowymi przygotowanymi w 1% BSA w PBS, w 4ᵒC.
Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty
inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor wraz barwnikiem
jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po godzinnej inkubacji w
ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą destylowaną i zaklejono
medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów prowadzono przy użyciu
mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi obiektywami 10x i 20x oraz
obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych przeciwciał zostały
przedstawione w Tabeli 2.

6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych

Barwienie hematoksyliną i eozyną zostało wykorzystane by ocenić morfologię
tkanki. W tym celu usuwano parafinę i uwadniano preparaty parafinowe.
Odzyskiwanie antygenu przeprowadzano poprzez inkubację w 95ᵒC buforze
cytrynianowym przez 30 minut. Preparaty schładzano i przepłukiwano w buforze PBS.
Preparaty barwiono hematoksyliną, a następnie dobarwiano eozyną. Do barwienia
unaczynienia użyto króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-CD31 (1:50, Abcam)
oraz zestawu EnVision Detection Systems Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse (Dako)
zgodnie z protokołem producenta. Szkiełka zaklejano medium do preparatów
bezwodnych. Analizę prowadzono przy użyciu mikroskopu odwróconego Leica
DMI6000B wyposażonego w kamerę CCD Leica DFC360 FX (Leica Microsystems).
Zdjęcia analizowano za pomocą oprogramowani Leica LAS X.

6.2.24 Analiza statystyczna

Wszystkie doświadczenia in vitro były przeprowadzone co najmniej trzy razy.
Ilość użytych w poszczególnych doświadczeniach zwierząt lub próbek klinicznych
została przedstawiona w podpisach do rycin. Wyniki przedstawiono jako średnia ±
SD, z wyjątkiem niektórych doświadczeń z użyciem zwierząt, gdzie wyniki
przedstawiono jako średnia ± SEM. Do przygotowania wykresów i analizy
statystycznej użyto oprogramowania GraphPad Prism 7, poza wykresem
okrągłości/powierzchni komórek, który przygotowano w programie Origin 2019b. Do
porównania dwóch grup badawczych użyto niesparowanego testu t-Studenta
(unpaired two-tailed t-test). W przypadku trzech lub więcej grup użyto jedno- lub
dwukierunkowego testu ANOVA z testem post hoc Bonferroni. Wartości p są
oznaczone gwiazdkami na wykresach gdzie (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001;
****, P < 0.0001 vs kontrola).

60
7 Wyniki
7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji
nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki
Jasnokomórkowy rak nerki jest najczęściej występującym typem raka nerki
tworzącym silnie unaczynione guzy. Proces zapalny jest kluczowym elementem
rozwoju nowotworu, jednak jego regulacja jest słabo poznana. Białko MCPIP1, jest
kluczowym modulatorem zaangażowanym w kontrolę stanu zapalnego i utrzymanie
homeostazy, a także, może odgrywać ważną rolę w rozwoju nowotworu. W
pierwszym etapie badań sprawdzono: i) jak zmiana poziomu lub aktywności białka
MCPIP1 w komórkach ccRCC, wpłynie na proliferację i rozwój guzów in vivo, ii) czy
poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC wpłynie na aktywność komórek
endotelialnych i rozwój unaczynienia, iii) czy poziom lub aktywność RNazy białka
MCPIP1 reguluje aktywność migracyjną komórek nowotworowych, proces przejścia
epitelialno-mezenchymalnego oraz tworzenie się przerzutów w warunkach in vivo.

7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację

komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo
Do oceny przejściowego obniżenia poziomu białka MCPIP1 w komórkach
nowotworowych, wykorzystano sześć różnych siRNA (nazwane kolejno 1-6)
wyciszających MCPIP1, wraz z dwoma siRNA kontrolnymi (z niską oraz średnią
zawartością reszt GC). Wykazano najwyższą wydajność transfekcji siRNA-4, -5 oraz
-6 (Ryc. 7.1. A). Następnie, wykorzystano sekwencje siRNA4 oraz siRNA5 na
podstawie których, otrzymano wektory lentiwirusowe nazwane odpowiednio
shMCPIP1#4 oraz shMCPIP1#5, z których nr 5 wykazywał lepszą skuteczność w
obniżeniu poziomu MCPIP1 (Ryc. 7.1. B). Do dalszych analiz wykorzystano
shMCPIP1#5, które dla uproszczenia, w dalszej części pracy, nazwano shMCPIP1.
Komórki Caki-1 i Caki-2 zostały poddane transdukcji, a po kilkudniowej selekcji
puromycyną sprawdzono poziom transkryptu i białka MCPIP1. Zaobserwowano 20-
50% spadek ilości transkryptu MCPIP1 w zależności od badanej linii komórkowej
(Ryc. 7.1. C, E), oraz obniżenie poziomu białka MCPIP1 o ponad 50% w stosunku do
kontroli (shCtrl) w obu liniach (Ryc. 7.1. D, F).

61
Rycina 7.1. Poziom MCPIP1 w komórkach ccRCC po transfekcji i transdukcji. A,
Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po przejściowym wyciszeniu białka
MCPIP1 za pomocą siRNA, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową B, Reprezentatywny wynik
western blot na komórkach Caki-1 po stabilnym wyciszeniu białka MCPIP1 wektorami
lentiwirusowymi, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. C, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej
transdukcji komórek Caki-1 wektorami lentiwirusowymi D, Reprezentatywny wynik western
blot na komórkach Caki-1 po wyciszeniu białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.
E, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej transdukcji komórek Caki-2 wektorami lentiwirusowymi
F, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-2 po wyciszeniu białka MCPIP1 z
α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech
niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Aby określić, czy wyciszenie białka MCPIP1 wpływa na żywotność i

proliferację komórek, komórki linii Caki-1 i Caki-2 hodowano przez okres 4 dni, po
czym wykonano test redukcji MTT oraz test proliferacji. Wykazano, że obniżenie
poziomu białka MCPIP1 w obu liniach powoduje istotny wzrost żywotności i
potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych (Ryc. 7.2. A, B). Największa
różnica pomiędzy kontrolą, a wyciszeniem białka MCPIP1 była widoczna po 96
godzinach co sugerowało, że dalsza hodowla mogłaby pogłębić zaobserwowane
różnice.

Rycina 7.2. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na proliferację i żywotność

komórek ccRCC. A i B, Test redukcji MTT (żywotność) i analiza proliferacji komórek linii Caki-

62
1 (A) i Caki-2 (B) po 96 godzinnej hodowli. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech
niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Aby potwierdzić wyniki uzyskane w hodowlach in vitro, wskazujące na

znaczenie białka MCPIP1 w proliferacji komórek ccRCC, wykorzystano modele
zwierzęce. Kontrolne komórki ccRCC (Caki-1 shCtrl) oraz komórki z niskim poziomem
MCPIP1 (Caki-1 shMCPIP1) podano podskórnie do myszy z upośledzonym układem
odporności szczepu NOD-SCID. Użycie myszy immunokompetentnych,
pozbawionych komórek T oraz B było niezbędne, żeby ludzkie komórki nowotworowe
nie zostały odrzucone przez organizm gospodarza. Pomiary wzrostu guzów były
wykonywane co tydzień, przez okres 6 tygodni. Wykazano, że już po dwóch
tygodniach od podania, komórki z obniżonym poziomem MCPIP1 rosły szybciej
tworząc większe guzy (Ryc. 7.3. A). Po zakończeniu doświadczenia różnica w
objętości była znacząca, podobnie waga guzów była około trzykrotnie większa w
grupie traktowanej komórkami shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.3. B).
Dodatkowo, na przekroju poprzecznym guzów wybarwionych hematoksyliną i eozyną
widać było znaczącą różnicę wielkości, guzy kontrolne charakteryzowały się małym
przekrojem w porównaniu do guzów tworzonych przez komórki Caki-1 shMCPIP1
(Ryc. 7.3. C).

Rycina 7.3. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na wzrost guzów in vivo. A, Pomiar
wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki wykonywany tygodniowo przez okres 6 tygodni po
podaniu podskórnym komórek Caki-1 z obniżonym poziomem białka MCPIP1. B, Waga guzów
po zakończeniu doświadczenia. C, Reprezentatywne zdjęcia przekroju guzów, po
wybarwieniu hematoksyliną/eozyną. Do badania wykorzystano 30 myszy szczepu NOD-SCID:
Caki-1 shCtrl, n=14; Caki-1 shMCPIP1, n=16. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD,
wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów

w warunkach in vivo
W celu sprawdzenia czy aktywność RNazy MCPIP1 ma znaczenie w procesie
wzrostu guza, przygotowano komórki ccRCC z nadekspresją funkcjonalnej formy
dzikiej białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej, pozbawionej aktywności

63
RNazy (pLIX D141N). Indukcja nadekspresji odpowiedniej formy białka MCPIP1
następowała po dodaniu doksycykliny. Najwyższy wzrost poziomu MCPIP1 był
obserwowany po 48 godzinach, inkubacji z doksycykliną, zarówno w komórkach Caki-
1 (Ryc. 7.4. A) jak i Caki-2 (Ryc.7.4. B). Dodatkowo, najwyższy poziom MCPIP1
można było zaobserwować w przypadku formy zmutowanej, która została
pozbawiona aktywności RNazy (Ryc. 7.4.).

Rycina 7.4. Poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC po transdukcji lentiwirusowej.

A, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej (pLIX MCPIP1) i
zmutowanej (pLIX D141N) MCPIP1 w komórkach Caki-1, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.
B, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej i zmutowanej MCPIP1
w komórkach Caki-2, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową.

Po podaniu komórek Caki-1 pLIX do myszy szczepu NOD-SCID,

zaobserwowano najwolniejszy wzrost guzów i najniższą ich wagę w grupie z
podwyższonym poziomem białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1), podczas gdy komórki
kontrolne (pLIX PURO) i z nadekspresją formy zmutowanej (pLIX D141N) rosły
podobnie (Ryc. 7.5. A, B). Linia Caki-2 została podana do bezgrasiczych myszy
szczepu Foxn1nu/Foxn1nu. Komórki linii Caki-2 z nadekspresją białka MCPIP1
zachowywały się podobnie do komórek Caki-1 tworząc najmniejsze guzy. Największe
guzy były utworzone przez komórki Caki-2 z mutacją białka MCPIP1 pozbawionego
aktywności RNazy (Ryc.7.5. C, D). Wyniki te potwierdziły, że niski poziom białka
MCPIP1, lub brak aktywności enzymatycznej białka MCPIP1 przyspiesza wzrost
guzów in vivo.

Rycina 7.5. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na wzrost
guzów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki przez okres 6 tygodni po

64
podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy białka
MCPIP1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badania wykorzystano 18
myszy szczepu NOD-SCID, grupa pLIX PURO n=5, grupa pLIX D141N n=5, grupa pLIX
MCPIP1 n=8. C, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki przez okres 6 tygodni po
podaniu podskórnym komórek Caki-2 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy białka
MCPIP1. D, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badania wykorzystano 9 myszy
szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, gdzie n=3 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM,
wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <
0.001; MCPIP1 vs kontrola; #, P < 0.05; ##, P < 0.01; MCPIP1 vs D141.

7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w

warunkach in vivo
W celu zbadania poziomu unaczynienia guzów nowotworowych z różnym
poziomem białka MCPIP1, przeanalizowano poziom białka CD31 będącego
markerem komórek śródbłonka. Wykazano, że guzy grupy z wyciszeniem białka
MCPIP1, posiadały bardzo dobrze rozwinięte unaczynienie (Ryc. 7.6. A). Guzy te,
charakteryzował znaczący wzrost ilości komórek pozytywnych dla antygenu CD31
oraz funkcjonalnych naczyń posiadających światło naczynia, w porównaniu z grupą
kontrolną (Ryc. 7.6. B). Dodatkowo, za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzono
powierzchnię naczyń i zaobserwowano, że w guzach z obniżonym poziomem białka
MCPIP1 powierzchnia naczyń była prawie trzykrotnie wyższa niż w guzach
kontrolnych (Ryc. 7.6. C).

Rycina 7.6. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na poziom CD31 in vivo. A,

Reprezentatywne zdjęcia tkanek nowotworowych po barwieniu CD31 - markera naczyń
krwionośnych, po podaniu podskórnym komórek Caki-1 shCtrl i z obniżonym poziomem białka
MCPIP1 Caki-1 shMCPIP1. B, Wykres przedstawiający ilość funkcjonalnych (zawierających
światło naczynia) naczyń krwionośnych CD31 . C, Wykres przedstawiający powierzchnię
światła naczyń CD31 . Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=6
na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy
pomocy testu t-Studenta.

Wykorzystanie myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu ze względu na brak sierści,

pozwoliło na monitorowanie rozwoju unaczynienia w czasie wzrostu guzów. Guzy
poddano analizie przy pomocy ultrasonografu 3D i zaobserwowano, że w trakcie
wzrostu, znacznie lepiej rozwijało się unaczynienie w guzach z niskim poziomem
MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.7. A, B).

65
 Wyniki te, potwierdzono za pomocą barwień immunofluorescencyjnych dla
CD31. W trakcie wzrostu guzów, zdecydowanie więcej naczyń krwionośnych
zaobserwować można było w guzach shMCPIP1 (Ryc. 7.7. C).

Rycina 7.7. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A,

Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B,
Reprezentatywne zdjęcia wykonane za pomocą ultrasonografu VEVO2100 gdzie kolorem
czerwonym są zaznaczone funkcjonalne naczynia krwionośne, a biała przerywana linia
oznacza granice guza. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu Foxn1 nu/Foxn1nu, Caki-1
shCtrl, n=5; Caki-1 shMCPIP1, n=10. C, Immunofluorescencyjne barwienie CD31 tkanek
nowotworowych. Reprezentatywne zdjęcia rozwoju unaczynienia po 21, 28, 35 i 41 dniach od
podania podskórnego komórek Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do badania
wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako
średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Barwienie immunohistochemiczne CD31 tkanek z nadekspresją formy dzikiej

i pozbawionej funkcji RNazy białka MCPIP1 i wskazało, jak istotna jest funkcja
enzymatyczna białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych dla rozwoju
unaczynienia in vivo (Ryc. 7.8. A). Guzy utworzone przez komórki Caki-1 z
nieaktywną formą białka MCPIP1 (pLIXD141N) charakteryzowały się najlepiej
rozwiniętym unaczynieniem, podobnie, jak guzy z obniżonym poziomem MCPIP1
(Ryc. 7.8. A, B). Natomiast, wysoki poziom MCPIP1 w przypadku komórek Caki-1 nie

66
powodował zmian w ilości funkcjonalnych naczyń krwionośnych w porównaniu z
kontrolą (Ryc. 7.8. A, B).

Rycina 7.8. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na poziom CD31. A, Reprezentatywne

zdjęcia przedstawiające wynik barwienia immunohistochemicznego dla CD31 na tkankach
nowotworowych po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX
MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Wykres przedstawiający średnią
powierzchnię naczyń o średnicy ≥ 200μm. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-
SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały
obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Dalsza analiza unaczynienia, w guzach utworzonych przez komórki Caki-2 w

modelu Foxn1nu/Foxn1nu potwierdziła, że unaczynienie rozwijało się najlepiej w grupie
z formą zmutowaną białka MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (pLIX PURO) (Ryc. 7.9.
A, B). Co ciekawe, w tym modelu najsłabsze unaczynienie występowało wśród guzów
z nadekspresją funkcjonalnej, dzikiej formy MCPIP1 (Ryc. 7.9. A, B), co wskazało, że
zarówno poziom białka MCPIP1 jak i jego aktywność RNazy, w komórkach
nowotworowych, miały istotny wpływ na rozwój nowych naczyń krwionośnych w
obrębie guza.

Rycina 7.9. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A,

Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B,
Reprezentatywne zdjęcia USG guzów utworzonych przez komórki Caki-2 z nadekspresją
formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Do badania wykorzystano 9 myszy szczepu
Foxn1nu/Foxn1nu, gdzie n=3 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p
zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

67
7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń
międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i
tworzenie naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro
Kolejnym etapem badań było poszukiwanie mechanizmów odpowiedzialnych
za zaobserwowany w badaniach in vivo wpływ braku aktywnego białka MCPIP1 na
wzrost guzów i rozwój ich unaczynienia. W celu wyjaśnienia uzyskanych wyników, w
pierwszej kolejności analizowano potencjalne oddziaływanie komórek ccRCC na
komórki endotelialne. Oceniono zdolność do migracji komórek endotelialnych w żelu
fibrynowym w trakcie współhodowli z komórkami ccRCC. W teście tym, opłaszczające
kulki lateksowe, komórki endotelialne HMEC-1 zostały poddane wpływowi komórek
nowotworowych Caki-1 kontrolnych (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem białka
MCPIP1 (shMCPIP1) znajdujących się na powierzchni żelu fibrynowego (Ryc. 7.10.
A, B). Zaobserwowano, że komórki endotelialne pod wpływem komórek Caki-1
shMCPIP1 zaczęły wykształcać naczyniopodobne struktury (tubule), podczas gdy
hodowla HMEC-1 z nowotworowymi komórkami kontrolnymi posiadała tych struktur
istotnie mniej (Ryc. 7.10. A). Przeanalizowano obszar migracji komórek HMEC-1 i
okazało się, że jest on znacząco większy pod wpływem hodowli z komórkami z niskim
poziomem MCPIP1 w porównaniu z hodowlą w obecności nowotworowych komórek
kontrolnych (Ryc. 7.10. B). Aby sprawdzić, czy pożywka hodowlana zebrana znad
komórek nowotworowych (tzw. medium warunkowane) może wpływać na ilość
tworzących się rozgałęzień między komórkami endotelialnymi, komórki HMEC-1
wysiano w Matrigelu, a następnie stymulowano zebranym medium warunkowanym.
Dodatkowo, dla lepszego zobrazowania komórki śródbłonka wybarwiono kalceiną.
Wykazano, że po stymulacji medium warunkowanym znad komórek Caki-1
shMCPIP1 wzrasta ilość rozgałęzień pomiędzy komórkami HMEC-1 tworząc lepiej
rozbudowaną i zorganizowaną sieć (Ryc. 7.10. C, doświadczenie przeprowadzone
przez dr hab. Katarzynę Miękus, natomiast przeanalizowane przez P. Maronę).

68
Rycina 7.10. Efekt wyciszenia białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na komórki
endotelialne HMEC-1. A, Wykres przedstawiający procent naczyniopodobnych struktur
utworzonych przez komórki HMEC-1 w przeliczeniu na wszystkie kulki lateksowe. Komórki
HMEC-1 hodowano w żelu fibrynowym w ko-kulturze z komórkami Caki-1 shCtrl lub
shMCPIP1. Po prawej, reprezentatywne zdjęcia kulek lateksowych, strzałkami zaznaczono
naczyniopodobne struktury, w które formują się komórki HMEC-1. B, Wykres przedstawiający
średnią powierzchnię migracji komórek HMEC-1 w żelu fibrynowym. Po prawej,
reprezentatywne zdjęcia kulek z zaznaczoną białą linią granicą migrujących komórek. C,
Wykres średniej ilości rozgałęzień utworzonych przez komórki HMEC-1 hodowanych w
Matrigelu i stymulowanych medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 po wyciszeniu
białka MCPIP1. Pod wykresem reprezentatywne zdjęcia wybarwionych kalceiną komórek
HMEC-1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy
testu t-Studenta.

Przepuszczalność naczyń jest regulowana przez wiele różnych białek, z

których VE-kadheryna pełni jedną z bardziej istotnych funkcji. VE-kadheryna znajduje
się na powierzchni komórek śródbłonka. W wyniku stymulacji komórek czynnikami
proangiogennymi dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, przez co
integralność połączeń jest zaburzona, a komórki zaczynają migrować (48–50). 3-
godzinna stymulacja komórek endotelialnych HUVEC medium warunkowanym znad
komórek Caki-1 oraz Caki-2 z wyciszonym białkiem MCPIP1 spowodowała znaczący
wzrost fosforylacji VE-kadheryny bez zmian w jej całkowitym poziomie, względem
kontroli (Ryc. 7.11. A). Odwrotną sytuację można było zaobserwować po stymulacji
medium znad komórek z nadekspresją funkcjonalnej formy MCPIP1. Poziom
fosforylacji VE-kadheryny w komórkach HUVEC po stymulacji medium
warunkowanym znad komórek ccRCC z nadekspresją MCPIP1 był niższy, niż w
komórkach stymulowanych medium znad kontrolnych komórek ccRCC. Poziom
aktywacji VE-kaheryny w komórkach HUVEC stymulowanych medium znad dwóch
różnych linii ccRCC, Caki-1 jak i Caki-2 był podobny (Ryc. 7.11. A). W celu oceny

69
wpływu medium kondycjonowanego znad komórek nowotworowych na integralność
warstwy komórek endotelialnych oraz lokalizację VE-kadheryny wykonano barwienie
immunofluorescencyjne komórek HUVEC (Ryc. 7.11. B). Media izolowane znad
komórek z wyciszonym białkiem MCPIP1 (Caki-1 i Caki-2) powodowały utratę
połączeń komórkowych i internalizację VE-kadheryny z błony komórkowej do wnętrza
komórki (zaznaczono strzałkami) w porównaniu z kontrolą. Natomiast, po stymulacji
medium znad komórek po nadekspresji MCPIP1 nie obserwowano zmian w
wyglądzie komórek i zmian w lokalizacji VE-kadheryny względem kontroli (Ryc. 7.11.
B). Otrzymane wyniki wykazały, że poziom białka MCPIP1 w komórkach
nowotworowych wpływa na wydzielanie przez nie czynników zaangażowanych w
aktywację komórek endotelialnych, fosforylację VE-kadheryny i tracenie kontaktów
komórka-komórka.

Rycina 7.11. Wpływ różnego poziomu białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na VE-
kadherynę. A, Reprezentatywny wynik western blot dla VE-kadheryny (forma całkowita i
fosforylowana) w komórkach HUVEC po 3 godzinnej stymulacji medium kondycjonowanym
znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z wyciszeniem bądź nadekspresją białka MCPIP1, z α-
tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywne zdjęcia komórek HUVEC po barwieniu
immunofluorescencyjnym dla VE-kadheryny po 3 godzinnej stymulacji medium
kondycjonowanym znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z różnym poziomem białka MCPIP1.
Strzałkami zaznaczono przerwy w ciągłości warstwy komórek.

70
7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników
proangiogennych w komórkach nowotworowych
Hipoksja jest jednym z czynników promujących angiogenezę. W celu
sprawdzenia czy poziom i aktywność białka MCPIP1 w komórkach ccRCC reguluje
wydzielanie czynników proangiogennych, wpływających na komórki endotelialne,
komórki linii Caki-1 i Caki-2, kontrolne (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem MCPIP1
(shMCPIP1), inkubowano w warunkach normoksji (21% O2) lub hipoksji (0,5% O2)
przez 48 godzin. Po tym czasie sprawdzono ekspresję i ilość wydzielonych białek
proangiogennych, takich jak VEGF, IL-6 oraz IL-8 (Ryc. 7.12. A-C). Za pomocą reakcji
PCR w czasie rzeczywistym wykazano istotny wzrost poziomu transkryptów dla IL-6,
IL-8 i VEGF w komórkach z wyciszonym poziomem MCPIP1. Obserwowany wzrost
ekspresji był szczególnie istotny w warunkach hipoksji dla obu badanych linii. W
warunkach normoksji, wyższy poziom transkryptów badanych czynników
proangiogennych charakteryzował również komórki linii Caki-2 z wyciszonym
poziomem MCPIP1. (Ryc. 7.12. A-C). Podobne różnice obserwowano w poziomie
wydzielanych białek, gdzie w warunkach hipoksji gwałtownie rosło wydzielanie
badanych czynników proangiogennych do pożywki przez komórki z wyciszonym
białkiem MCPIP1 (Ryc. 7.12. A-C).

Rycina 7.12. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z wyciszeniem

MCPIP1. Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 z obniżonym poziomem białka MCPIP1 hodowano

71
przez 48 godzin w warunkach hipoksji i normoksji. Poziom mRNA IL8 (A), VEGF (B), i IL6 (C),
został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Poziom mRNA próbek
Caki shCtrl w warunkach normoksji został przyrównany do 1. Poziom wydzialanych czynników
został zmierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki przedstawiono
jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Białko MCPIP1 rozpoznaje i degraduje transkrypty dla wielu cytokin w tym IL-
6 oraz IL-8 (182,187). Dlatego, kolejnym krokiem było sprawdzenie czy w komórkach
ccRCC białko MCPIP1, dzięki swojej aktywności RNazy, może regulować poziom
czynników proangiogennych. W tym celu wykorzystano komórki ccRCC z
nadekspresją (pLIX MCPIP1) i mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) (Ryc. 7.13. A,
B). Wykazano, że w warunkach hipoksji, komórki z nieaktywnym białkiem MCPIP1
(pLIXD141N) posiadały najwięcej transkryptów dla analizowanych czynników oraz
wydzielały najwięcej białek sekrecyjnych do pożywki, w porównaniu z komórkami
kontrolnymi czy z nadekspresją MCPIP1 (Ryc. 7.13. A, B). Nadekspresja MCPIP1
powodowała jedynie nieznaczny (nieistotny statystycznie) spadek poziomu
transkryptów i białek sekrecyjnych wydzielanych do pożywki względem komórek
kontrolnych (pLIX PURO) (Ryc. 7.13. A, B).

Rycina 7.13. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z nadekspresją

MCPIP1. A, Poziom mRNA czynników proangiogennych w komórkach Caki-1 z formą dziką
(pLIX MCPIP1) i zmutowaną (pLIX D141N) białka MCPIP1. Poziom mRNA próbek Caki-1 pLIX
PURO w warunkach normoksji został przyrównany do 1. B, Poziom wydzielniczych czynników
został zmierzony testem immunoenzymatycznym ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnia
± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF-

1/CXCR4
Jednym z czynników wpływającym na zwiększona ekspresje VEGF jest SDF-
1 wraz ze swoim receptorem CXCR4. SDF-1 i VEGF mogą indukować rozwój
unaczynienia w guzach, a oś SDF-1-CXCR4 wpływa na zwiększenie inwazyjności

72
komórek nowotworowych i tworzenie przerzutów w wielu typach nowotworów
(64,65,84). Dlatego, w kolejnych doświadczeniach sprawdzono poziom tych
czynników w komórkach ccRCC z różnym poziomem białka MCPIP1.
Zaobserwowano znacząco zwiększony poziom SDF-1 w komórkach Caki-1 z
obniżonym poziomem białka MCPIP1, podobnie, poziom transkryptu dla CXCR4 był
dwukrotnie wyższy w komórkach Caki-1 shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc.
7.14. A). Następnie, sprawdzono poziom SDF-1 w komórkach z nadekspresją
MCPIP1 i nieaktywną formą MCPIP1, pozbawioną aktywności Rnazy i wykazano, że
pod wpływem nadekspresji MCPIP1 poziom mRNA dla SDF-1 istotnie obniża się
(Ryc. 7.14. A, trzeci wykres). Podobne wyniki otrzymano dla drugiej z badanych linii
komórkowych ccRCC, Caki-2, zarówno po wyciszeniu, jak i nadekspresji MCPIP1
(Ryc. 7.14. B). Dodatkowo, sprawdzono poziom mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w guzach
otrzymanych po podskórnym podaniu do myszy komórek ccRCC. Zaobserwowano
wzrost, zarówno SDF-1 jak i CXCR4 w grupie guzów z wyciszeniem białka MCPIP1
(Ryc. 7.14. C). Następnie, zbadano poziom wydzielonego ludzkiego SDF-1 do osocza
myszy i zaobserwowano jego wyższe stężenie w osoczu myszy, którym podano
komórki Caki-1 shMCPIP1 (Ryc. 7.14. D).

Rycina 7.14. Białko MCPIP1 reguluje oś SDF1-CXCR4. A, Poziom ekspresji mRNA dla
SDF-1 i CXCR4 w komórkach Caki-1 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX
MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-
1 i CXCR4 w komórkach Caki-2 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1)
lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. C, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4
w guzach został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Do
doświadczenia użyto 15 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=5; Caki-1
shMCPIP1, n=10. D, Poziom wydzielonego do osocza SDF-1 u myszy szczepu
Foxn1nu/Foxn1nu, mierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki in vitro
przedstawiono jako średnia ± SD, natomiast in vivo jako średnia ± SEM, wartości p zostały
obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

73
 Jednym z czynników transkrypcyjnych regulujących poziom ekspresji SDF-1
jest c/EBPβ, który z kolei jest degradowany przez białko MCPIP1 (183,215). Ze
względu na to, zdecydowano sprawdzić czy białko MCPIP1 w sposób pośredni, przez
c/EBPβ, może regulować poziom SDF-1. Wykazano, że zarówno poziom transkryptu
jak i białka c/EBPβ w komórkach Caki-1 z wyciszeniem MCPIP1 był dwukrotnie
wyższy niż w komórkach kontrolnych (Ryc. 7.15. A). Natomiast, w przypadku
nadekspresji MCPIP1, poziom c/EBPβ spadał w stosunku do kontroli (Ryc. 7.15. B).
Co ciekawe, najwyższe poziomy były obserwowane w komórkach z mutacją w
domenie RNazowej MCPIP1 co potwierdziło, że aktywność RNazy MCPIP1,
pośrednio przez c/EBPβ, pełni istotną funkcję w regulacji poziomu białka SDF-1.

Rycina 7.15. Białko MCPIP1 reguluje poziom c/EBPβ. A, Poziom ekspresji c/EBPβ
mierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym.
Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w
komórkach Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji c/EBPβ mierzony przy
pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym.
Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w
komórkach Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Wyniki
przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń.

Wysoki poziom SDF-1 wiąże się z wysoką inwazyjnością, skłonnością

komórek nowotworowych do migracji i przerzutowania. Dlatego, w celu oceny wpływu
białka MCPIP1 na potencjał do tworzenia przerzutów przeprowadzono analizę
krążących komórek nowotworowych. W tym celu, do myszy szczepu NOD-SCID
podano podskórnie ludzkie komórki Caki-1 kontrolne (shCtrl) i z wyciszeniem MCPIP1
(shMCPIP1). Komórki te były dodatkowo transdukowane białkiem zielonej
fluorescencji, GFP. Analizie poddano zarówno krew myszy jak i płuca, w których
komórki nowotworowe mogły potencjalnie tworzyć przerzuty. Wykazano, że
wyciszenie białka MCPIP1 zwiększyło ilość ludzkich krążących komórek
nowotworowych w mysim krwioobiegu (Ryc. 7.16. A), a następnie osadzanie się w
płucach, co obserwowano przez 6 tygodni trwania doświadczenia (Ryc. 7.16. B). Po
zakończeniu doświadczenia, zaobserwowano znacząco wyższą ilość
mikroprzerzutów tworzonych przez komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1
w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. C). Nadekspresja MCPIP1 powodowała z kolei,
spadek ilości mikroprzerzutów w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. D).

74
Rycina 7.16. Białko MCPIP1 wpływa na oś SDF-1/CXCR4 oraz proces przerzutowania.
A, Analiza cytometryczna poziomu krążących komórek nowotworowych, po 28, 35 i 41 dniach
od podania podskórnego komórek Caki-1 GFP z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom
ekspresji ludzkiego GAPDH w RNA izolowanym z mysich płuc na przestrzeni 6 tygodni. Do
doświadczeń wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. C, Poziom
ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek
nowotworowych Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do doświadczeń wykorzystano 8
myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę oraz 10 myszy szczepu Foxn1 nu/Foxn1nu,
Caki-1 shCtrl, n=4; Caki-1 shMCPIP1, n=6. D, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego
w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych Caki-1 z
nadekspresją białka MCPIP1. Jako referencję wykorzystano mysi GAPDH. Do doświadczeń
wykorzystano 10 myszy szczepu NOD-SCID, Caki-1 pLIX PURO/MCPIP1 n=5 na grupę.
Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-
Studenta.

7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje

nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC
Skłonność komórek nowotworowych do tworzenia odległych przerzutów
spowodowana jest między innymi ich wyższą aktywnością migracyjną. Aby
sprawdzić, czy białko MCPIP1 wpływa na ruchliwość komórek analizowano ścieżki,
po których poruszały się losowo wybrane komórki nagrywane przez 16 godzin
podczas testu zarastania rany, (Ryc.7.17. A-D). Wykazano, że zarówno w przypadku
komórek linii Caki-1 jak i Caki-2, po wyciszeniu białka MCPIP1, komórki poruszały się
znacząco szybciej i przebywały 20-40% dłuższą drogę niż komórki kontrolne
(Ryc.7.17. E-F).

75
Rycina 7.17. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na aktywność ruchową komórek.
A, B, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające proces zarastania rany w komórkach Caki-1
(A) oraz Caki-2 (B) z wyciszeniem białka MCPIP1. Zdjęcia zrobione w momencie zrobienia
rysy, oraz po 8 godzinach trwania doświadczenia. C, D, Mapy przedstawiające ścieżki
migracyjne pojedynczych komórek w czasie 16-godzinnego nagrywania. N=18 komórek dla
każdego warunku. E, F, Analiza przebytej odległości oraz średnia szybkość komórek w trakcie
16 godzinnego doświadczenia. Wyniki są przedstawione jako średnia z 3 niezależnych
doświadczeń z liczbą analizowanych komórek n=100 dla każdego warunku. Wyniki
przedstawiono jako średnia ± SD, z trzech niezależnych doświadczeń. Wartości p zostały
obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Zmiany w aktywności migracyjnej oznaczają zazwyczaj zmiany w organizacji

cytoszkieletu i nabywanie przez komórki fenotypu mezenchymalnego, który
charakteryzuje się utratą e-kadheryny i podwyższonym poziomem białek związanych
z EMT takich jak wimentyna, n-kadheryna czy β-katenina oraz czynników
regulujących EMT np. Snail, Slug,czy bialka Zeb (98). Za pomocą techniki western
blot, potwierdzonej dalszą analizą densytometryczną zbadano poziom tych
czynników w kontrolnych komórkach ccRCC oraz komórkach z obniżonym poziomem
białka MCPIP1. Wykazano, że niski poziom MCPIP1 wpływa na znacząco niższy
poziom e-kadheryny i wzrost β-kateniny, wimentyny, a także kinazy Src oraz
receptora c-Met, zarówno formy całkowitej jak i fosforylowanej (Ryc. 7.18. A).
Następnie, przeanalizowano poziom mRNA dla czynników transkrypcyjnych Snail i
ZEB2 które jednocześnie biorą udział w negatywnej regulacji poziomu e-kadheryny
(100). Zaobserwowano wzrost poziomu mRNA dla obu czynników w komórkach
ccRCC z wyciszeniem białka MCPIP1 (Ryc. 7.18. B).

76
Rycina 7.18. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na markery EMT. A, Analiza
markerów EMT, reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po
obniżeniu poziomu MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Po prawej wykresy z analizą
densytometryczną dla co najmniej trzech niezależnych doświadczeń. B, Poziom ekspresji
mRNA dla genów Snail oraz ZEB2 z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 oraz Caki-2 po
wyciszeniu białka MCPIP1, mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki
przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu
t-Studenta.

7.1.8 Aktywność RNazy MCPIP1 reguluje fosforylację receptora c-Met

Wyciszenie białka MCPIP1 w kom ccRCC spowodowało zmiany poziomu i
fosforylacji receptora c-Met dlatego, w dalszej części badań, skupiono się na
sprawdzeniu wpływu białka MCPIP1 na poziom receptora c-Met, który zaangażowany
jest w regulację procesu angiogenezy, proliferację komórek, i regulację czynników
odpowiedzialnych za przerzutowanie nowotworu (67). Wykazano, że komórki z
nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) i zmutowanej (pLIX D141N) białka
MCPIP1 różniły się znacząco poziomem receptora c-Met. Brak aktywności RNazy
MCPIP1 w komórkach pLIX D141N powodował wzrost poziomu receptora c-Met,
zarówno jego formy całkowitej jak i fosforylowanej (Ryc. 7.19. A, B). Podobne wyniki
uzyskano dzięki analizie PCR w czasie rzeczywistym, gdzie zaobserwowano
najwyższy poziom ekspresji MCPIP1 i c-Met w komórkach Caki-1 pLIX D141N (Ryc.
7.19. C).

77
Rycina 7.19. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na poziom
receptora c-Met. A, Reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 z nadekspresją
formy dzikiej (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1 z α-tubuliną jako
kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna. C, Poziom ekspresji mRNA dla MCPIP1 i c-
Met z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 z nadekspresją lub mutacją białka MCPIP1,
mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia
± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Nadekspresja MCPIP1 powodowała istotny spadek poziomu nie tylko

receptora c-Met, ale również kinazy Src jak i czynnika transkrypcyjnego STAT3, który
regulowany jest m. in. przez receptor c-Met (Ryc. 7.20. A, B). Dodatkowo,
przeprowadzono analizę poziomu mRNA czynników transkrypcyjnych Snail i ZEB2
zaangażowanych w EMT i wykazano istotnie niższą ich ekspresję w komórkach z
nadekspresją dzikiej formy MCPIP1 w porównaniu z kontrolą oraz komórkami z
mutacją (Ryc. 7.20. C).

Rycina 7.20. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 na poziom czynników

zaangażowanych w aktywność migracyjną. A, Reprezentatywny wyniki western blot dla
komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej (pLIX D141N)
białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna poziomu
czynników Src i STAT3. C, Poziom ekspresji mRNA dla genów Snail oraz ZEB2 z EF2 jako
referencją w komórkach Caki-1 z nadekspresją lub mutacją białka MCPIP1, mierzone za
pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie
n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Podsumowując, wyniki uzyskane w tej części pracy doktorskiej wykazały, że

poziom i aktywność białka MCPIP1 w komórkach jasnokomórkowego raka nerki ma
istotne znaczenie w regulacji poziomu czynników zaangażowanych w potencjał
proliferacyjny, tworzeniu unaczynienia zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo, a
także, wpływa na aktywność migracyjną komórek i nabywanie fenotypu

78
mezenchymalnego, co bezpośrednio przekłada się na szybkość wzrostu guzów i
rozwoju przerzutów.

Niski poziom MCPIP1 lub brak aktywności RNazy tego białka powoduje także
wzrost ilości i fosforylację receptora c-Met, który jest kluczowym białkiem
zaangażowanym w rozwój nowotworów i proces tworzenia przerzutów.

7.2 Poziom białka MCPIP1 w próbkach klinicznych pacjentów z ccRCC

Wyniki badań in vivo oraz in vitro wskazały na istotne znaczenie poziomu białka
MCPIP1 na szybkość rozwoju, unaczynienie i tworzenie przerzutów przez komórki
ccRCC. W kolejnym etapie pracy doktorskiej skupiono się na zbadaniu poziomu
białka MCPIP1, receptora c-Met oraz czynników zaangażowanych w rozwój i
unaczynienie nowotworu w próbkach klinicznych.

Przeanalizowano 60 tkanek nowotworowych pobranych od pacjentów ze

zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki. Próbki zostały przebadane przez
patomorfologa i podzielone według skali Fuhrman. Analiza tkanek nowotworowych
wykonana metodą western blot wykazała spadek poziomu białka MCPIP1 wraz ze
wzrostem zaawansowania choroby (Ryc. 7.21. A, B). Następnie, próbki od pacjentów
zbadano za pomocą analizy mikromacierzy, pod kątem ekspresji genów związanych
z progresją nowotworową jak i rozwojem unaczynienia (Ryc. 7.21. C, D).
Zaobserwowano stosunkowo niski poziom transkryptu MCPIP1 (gen ZC3H12A) we
wszystkich próbkach, co potwierdziło wynik przedstawiony przez Ligęzę i in. 2016,
gdzie poziom białka i transkryptu MCPIP1 był istotnie niższy w tkance nowotworowej
u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki w porównaniu z otaczającą ją tkanką
zdrową (212). Następnie wykazano, że poziom czynników zaangażowanych w
inwazyjność komórek nowotworowych takich jak HGF, MET, SRC, ZEB2, IL6 oraz
LIF rósł wraz z progresją nowotworową. Część powyższych czynników
zaangażowana jest również w rozwój unaczynienia razem z VEGFA, FLT1, CDH5
czy EPAS1 których poziom był generalnie wysoki we wszystkich stadiach klinicznych
(Ryc. 7.21. C, D).

79
Rycina 7.21. Białko MCPIP1 w próbkach klinicznych. A, Analiza poziomu białka MCPIP1
w próbkach klinicznych, reprezentatywny wynik western blot 12 próbek z białkiem GAPDH
jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna 60 próbek klinicznych, podzielonych na
4 grupy zgodnie ze stadium zaawansowania klinicznego (I-IV). Czerwony kolor oznacza próbki
analizowane następnie przy pomocy mikromacierzy. C, Mapa przedstawiająca poziom
ekspresji poszczególnych genów zaangażowanych w procesy angiogenne oraz
przerzutowanie ccRCC. Każda kolumna przedstawia pojedynczą próbkę. Wynik
przedstawiono za pomocą skali logarytmicznej z poziomem ekspresji genów od 2.03 do 10.98.
D, Wykres średniej ekspresji genów przedstawionych na mapie dla próbek stadium I II (n=8)
i III IV (n=8). Statystyka została przeprowadzona jednokierunkowym, niesparowanym testem
ANOVA pomiędzy podmiotami.

Wyniki otrzymane z analizy mikromacierzy wskazujące na wzrost poziomu

receptora c-Met wraz z progresją choroby, potwierdzono metodą western blot z
analizą densytometryczną i wykazano istotny statystycznie wzrost poziomu białka
zarówno formy całkowitej jak i fosforylowanej (Y1234/1235) receptora c-Met, wraz z
progresją nowotworu (Ryc. 7.22. A). Następnie, przeprowadzono analizę stosunku
poziomu białka MCPIP1 do poziomu dwóch form receptora c-Met i wykazano ich
negatywną korelację zarówno w przypadku formy całkowitej jak i fosforylowanej
receptora c-Met (Ryc. 7.22. B).

Rycina 7.22. Korelacja między białkiem MCPIP1, a receptorem c-Met w próbkach

80
klinicznych. A, Analiza densytometryczna poziomu białka c-Met (lewy wykres) oraz jego
formy fosforylowanej (prawy wykres) w 60 próbkach klinicznych. B, Analiza negatywnej
korelacji poziomu białka MCPIP1 oraz receptora c-Met (lewy wykres) lub jego formy
fosforylowanej (prawy wykres) w próbkach klinicznych. Wyniki przedstawiono jako średnia
±SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Ostatnim etapem tej części pracy była analiza fosforylacji kinaz białkowych u
pacjentów z ccRCC w różnym stopniu zaawansowania choroby. Wykorzystując
macierze białkowe, wykazano wzrost poziomu białek zaangażowanych w rozwój
unaczynienia i inwazyjność w próbkach od pacjentów z bardziej zaawansowanym
stadium choroby (stadia III-IV). Zaobserwowano wyższy poziom białek takich jak Src,
Yes, β-katenina, FAK, Pyk2 czy STAT3 (Ryc. 7.23).

Rycina 7.23. Analiza poziomu fosforylowanych kinaz, przy pomocy zestawu Proteome
Profiler, w próbkach klinicznych, gdzie stadium I II n=10, a stadium III IV n=9. Pod każdym
wykresem znajdują się reprezentatywne zdjęcia kropek (w duplikacie) odpowiadających
danemu białku (lewa strona: grupa I+II, prawa strona: grupa III+IV). Wyniki przedstawiono jako
średnia ±SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta.

Podsumowując, uzyskane w tej części pracy wyniki wykazały, iż poziom

MCPIP1 spada wraz z rozwojem nowotworu, co w rezultacie może wpłynąć na wzrost
inwazyjności i unaczynienia, a w konsekwencji gorsze rokowania u pacjentów.

81
7.3 Poziom białka MCPIP1, a oporność na terapie celowane w
jasnokomórkowym raku nerki
Ze względu na silny rozwój unaczynienia, terapie jasnokomórkowego raka nerki
opierają się często na wykorzystaniu inhibitorów kinaz tyrozynowych w tym,
receptorów VEGF czy PDGF takich jak m.in. sunitinib oraz sorafenib. Jednak podczas
stosowania leków celowanych, często obserwowanym zjawiskiem jest wykształcanie
oporności i nawrót choroby. Dodatkowo wykazano, że zahamowanie niektórych
receptorów powoduje wzrost fosforylacji receptora c-Met i aktywację innych ścieżek
zaangażowanych w unaczynienie (145,216). Dlatego, w ostatniej części pracy
doktorskiej, zbadano molekularne podłoże nabywania oporności na sunitinib i
sorafenib, określono znaczenie białka MCPIP1 w tym procesie i sprawdzono rolę
receptora c-Met w progresji nowotworu.

7.3.1 Sunitinib i sorafenib wpływają na potencjał proliferacyjny i cykl

komórkowy ccRCC
Sunitinib i sorafenib są obecnie jednymi z najczęściej używanych inhibitorów
receptorów kinaz tyrozynowych wykorzystywanych w terapii ccRCC. Jednak spora
grupa pacjentów wykształca silną oporność podczas stosowania tych związków
(139). Dlatego tak istotne jest poznanie mechanizmów wpływających na nabywanie
oporności na stosowane terapie. W pierwszej części badań, sprawdzono, czy
stymulacja komórek ccRCC sunitinibem, sorafenibem lub specyficznym inhibitorem
receptora c-Met – SU11274 wpłynie na ich żywotność. W tym celu wykonano test
redukcji MTT (Ryc. 7.24. A). Wykazano, że w komórkach Caki-1 jedynie stymulacja
sunitinibem powodowała spadek żywotności komórek w porównaniu z kontrolą (Ryc.
7.24. A). Większe różnice zaobserwować można było w komórkach linii Caki-2 gdzie
żywotność spadała nie tylko po stymulacji sunitinibem, ale także inhibitorem c-Met –
SU11274. Sorafenib nie wpływał na zmianę żywotności komórek (Ryc. 7.24. A).
Podobne wyniki można było zaobserwować po barwieniu komórek fioletem
krystalicznym, gdzie istotny spadek ilości można było zaobserwować jedynie wśród
komórek stymulowanych sunitinibem zarówno w linii Caki-1 jak i Caki-2 (Ryc. 7.24.
B). Aby wytłumaczyć różnice w proliferacji komórek, wykonano barwienie jodkiem
propidyny po tygodniowej stymulacji komórek lekami, a następnie przeanalizowano
komórki przy pomocy cytometru przepływowego (Ryc. 7.24. C). Zaobserwowano
zmiany w procentowym rozkładzie komórek między kolejnymi fazami cyklu pomiędzy
badanymi warunkami. Zarówno w linii Caki-1, jak i Caki-2, po stymulacji sunitinibem
rosła ilość komórek w fazie apoptotycznej, natomiast spadała w fazie G2/M.
Odwrotnie reagowały komórki oporne na sorafenib, których ilość rosła w fazie G2/M

82
w porównaniu z innymi warunkami. Stymulacja SU11274 powodowała z kolei, wzrost
ilości komórek w fazie G0/G1 (Ryc. 7.24. C).

Rycina 7.24. Wpływ SU11274, sunitinibu i sorafenibu na żywotność, proliferację i cykl

komórkowy. A, Test redukcji MTT dla komórek Caki-1 i Caki-2 w trakcie 7 dniowej hodowli z
lekami B, Barwienie fioletem krystalicznym komórek Caki-1 i Caki-2 po 96 godzinnej stymulacji
lekami. Zdjęcia reprezentatywne. C, Analiza cyklu komórkowego po 7 dniowej stymulacji
lekami komórek Caki-1 oraz Caki-2. Wykresy przedstawiają procentowy rozkład komórek
pomiędzy poszczególnymi fazami cyklu komórkowego.

Stymulacja lekami nie tylko zmieniała potencjał proliferacyjny i cykl

komórkowy, ale w wyraźny sposób wpływała na morfologię komórek. Podczas gdy
komórki stymulowane SU11274 nie różniły się znacząco od komórek kontrolnych,
stymulacja sunitinibem powodowała, że komórki stawały się bardziej zaokrąglone i
lepiej przytwierdzone do podłoża, natomiast hodowla w obecności sorafenibu
powodowała, że komórki wydłużały się i przybierały wrzecionowaty kształt (Ryc. 7.25.
A, B).

Dodatkowo, oporne komórki Caki-1 wysiano w ilości 1 000 komórek na dołek

6-dołkowej płytki, by zaobserwować czy mają one zdolność do tworzenia kolonii.
83
Komórki oporne na sorafenib miały najniższy potencjał klonogenny w porównaniu z
resztą badanych grup, gdzie ilość powstałych klonów była podobna (Ryc. 7.25. C).

Rycina 7.25. Wpływ leków na morfologię. A, Wykres przedstawiający średnią kolistości

komórek Caki-1 po 7-dniowej hodowli w obecności leków. Wyniki przedstawiono jako średnia
± SD. Wartości p zostały obliczone przy pomocy jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc
Bonferroni). B, Porównanie kolistości komórek Caki-1 do ich powierzchni po 7 dniach
stymulacji lekami. Każdy punkt oznacza pojedynczą komórkę. Do każdego warunku została
dopasowana elipsa z 95% prawdopodobieństwem, n=30 komórek na grupę. C,
Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające ilość powstałych klonów po 2-tygodniowej hodowli,
przed którą komórki Caki-1 były traktowane 7 dni lekami, a następnie wysiane na płytkę 6-
dołkową w gęstości 1 000 komórek na dołek.

7.3.2 Stymulacja sunitinibem i sorafenibem wpływa na fenotyp komórek

ccRCC i zmienia ich profil białkowy
Podwyższenie poziomu receptora c-Met może pełnić istotną rolę w nabywaniu
oporności na sunitinib (145). Wykonana analiza western blot komórek ccRCC po 24-
godzinnej stymulacji lekami wykazała, że nie tylko sunitinib, ale również sorafenib
powodował wzrost fosforylacji receptora c-Met (Ryc. 7.26. A). Co ciekawe,
zahamowanie aktywności receptora c-Met specyficznym inhibitorem SU11274
powodował prawie dwukrotny wzrost ilości białka MCPIP1 (Ryc. 7.26. A). Efekt
działania inhibitorów na poziom receptora c-Met i białka MCPIP1 utrzymywał się
nawet po 3 tygodniowej ciągłej stymulacji komórek Caki-1 jak i Caki-2 (Ryc. 7.26. B).
Obserwowano wysoki poziom MCPIP1 po działaniu inhibitora fosforylacji receptora c-
Met i spadek poziomu tego białka po działaniu sunitinibu i sorafenibu wraz ze
wzrostem poziomu całkowitego receptora c-Met (Ryc. 7.26. B). Dodatkowo,
zaobserwowano znaczący wzrost e-kadheryny w komórkach stymulowanych
sunitinibem (Ryc. 7.26. B).

W celu zobrazowania cytoszkietu i morfologii, komórki Caki-1 po tygodniowej

stymulacji lekami, wybarwiono falloidyną, dzięki której uwidoczniono filamenty
aktynowe cytoszkieletu komórki. Zaobserwowano, że stymulacja SU11274 nie

84
zmieniła fenotypu komórek (Ryc. 7.26. C). Komórki oporne na sunitinib ściśle do
siebie przylegały, formując owalne, przypominające klony kształty, a stymulacja
sorafenibem powodowała znaczące wydłużanie się komórek, które przybierały
wrzecionowaty kształt (Ryc. 7.26. C), potwierdzając wcześniejsze obserwacje (7.25
B). Dodatkowe barwienia receptora c-Met, e-kadheryny potwierdziły wcześniej
uzyskane wyniki metodą western blot, wskazując ich podwyższony poziom po
stymulacji sunitinibem (Ryc. 7.26.C). Również poziom β-kateniny rósł w komórkach
opornych na sunitinib (Ryc. 7.26.C).

Po tygodniowej hodowli komórek Caki-1 z lekami przeprowadzono również

analizę fosforylowanych kinaz przy pomocy macierzy białkowych (Ryc. 7.26. D).
Zaobserwowano między innymi, że fosforylacja białek z rodziny STAT rosła po
stymulacji lekami, podobnie jak EGFR, JNK, FAK, c-Jun. Wzrastał również poziom
całkowitej formy β-kateniny zaangażowanej m.in. w rearanżację cytoszkieletu jak i
przekaz sygnału (Ryc. 7. 26. D).

Rycina 7.26. Wpływ leków na poziom MCPIP1 oraz receptora c-Met. A, Reprezentatywny
wynik western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po 24-godzinnej stymulacji lekami z α-
tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1

85
oraz Caki-2 po 3-tygodniowej stymulacji lekami z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. C,
Barwienie immunofluorescencyjne komórek Caki-1 po 7 dniowej stymulacji lekami. Kolorem
niebieskim wybarwione są jądra wybarwione przy pomocy barwnika Hoechst, czerwonym
badane białka. D, Mapa przedstawiająca analizę densytometryczną poziomu fosforylowanych
kinaz mierzonych przy pomocy zestawu Proteome Profiler, przed izolacją komórki były
traktowane lekami przez 7 dni. Każde doświadczenie przeprowadzono co najmniej 3 razy.

Z uwagi na ciekawe obserwacje uzyskane po stymulacji pojedynczymi lekami,

komórki Caki-1 potraktowano kombinacjami leków, aby sprawdzić jak połączenie
inhibitora receptora c-Met, który podwyższa poziom MCPIP1, z inhibitorami
angiogenezy wpłynie na komórki nowotworowe (Ryc. 7.27.). Kombinacja sunitinibu i
inhibitora SU11274 miała bardzo toksyczny wpływ na komórki (apoptoza komórek po
ok. tygodniu hodowli). Natomiast połączenie sorafenibu z SU11274 obniżało
fosforylację receptora c-Met, ale poziom białka MCPIP1 był niewykrywalny (Ryc.
7.27.). Wyniki tego doświadczenia wskazały, iż kombinacje leków są albo zbyt
toksyczne i mogą zaszkodzić prawidłowym komórkom, albo nieskuteczne i należy
szukać innych rozwiązań problemu lekooporności.

Rycina 7.27. Wpływ mieszanki leków na poziom

MCPIP1 oraz receptora c-Met. Reprezentatywny
wynik western blot dla komórek Caki-1 po 3-
tygodniowej stymulacji lekami lub kombinacją leków z
α-tubuliną jako kontrolą ilościową.

Obniżenie potencjału proliferacyjnego, zmiany w cyklu komórkowym oraz

morfologii i migracji mogą być oznakami uśpienia (senesencji) komórek (217). Z tego
powodu przeprowadzono barwienie β-galaktozydazy zestawem SA-β-gal (ang.
Senescence-associated β-galactosidase activity). Wykazano, że stymulacja
sunitinibem powodowała istotny wzrost β-gal pozytywnych komórek (kolor niebieski),
co sugerowało, że mechanizm oporności na sunitinib może polegać na wprowadzeniu
komórek w stan uśpienia (Ryc. 7.28.).

86
Rycina 7.28. Wpływ leków na uśpienie komórek Caki-1. Reprezentacyjne zdjęcia po
barwieniu przy pomocy zestawu SA β-gal komórek Caki-1 po 7-dniowej stymulacji lekami.
Kolor niebieski oznacza komórki uśpione.

7.3.3 Oporność na sunitinib i sorafenib wpływa na progresję ccRCC w

warunkach in vivo
Aby zbadać wpływ oporności na sunitinib, sorafenib oraz SU11274 na rozwój
guzów in vivo, komórki Caki-1 ze stabilną ekspresją GFP hodowano w obecności
leków przez okres 5 tygodni. Po tym czasie zmieszano oporne komórki Caki-1GFP z
komórkami dzikimi Caki-1 w stosunku 1:1 i podano podskórnie
immunokompetentnym myszom szczepu NOD-SCID (schemat doświadczenia na
rycinie 6.1.). Po 6 tygodniach od podania komórek zaobserwowano, że największą
objętość i wagę osiągnęły guzy tworzone przez komórki oporne na sorafenib, podczas
gdy najmniejsze, były w grupie traktowanej sunitinibem (Ryc. 7.29. A, B). Wyniki te,
pokrywały się z rezultatami otrzymanymi w badaniach in vitro w testach redukcji MTT.
Co ciekawe, najwięcej mikroprzerzutów w płucach mierzonych za pomocą reakcji
PCR w czasie rzeczywistym tworzyły komórki oporne na sunitinib tworzące
najmniejsze guzy i komórki oporne na sorafenib, dające największe guzy (Ryc. 7.29.
C). Najmniej przerzutów było w grupie traktowanej SU11274, co może wskazywać na
ochronną rolę MCPIP1 (Ryc. 7.29. C). Analiza tkanek nowotworowych pobranych od
myszy wykazała, że najwięcej sygnału zielonej fluorescencji, wskazującego na
obecność komórek opornych, znajdowało się w centrum guzów. Dodatkowo, guzy z
grupy traktowanej sorafenibem posiadały najwyższy sygnał GFP, co znaczy, że
komórki oporne miały wyższy potencjał proliferacyjny niż podane razem z nimi
komórki dzikie (Ryc. 7.29. D, E).

87
Rycina 7.29. Efekt oporności na leki na wzrost guzów i ilość przerzutów in vivo. A,
Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki po 6 tygodniach od podania podskórnego
komórek Caki-1GFP opornych na SU11274, sunitinib lub sorafenib, zmieszanych w stosunku
1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badań
wykorzystano 66 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie Caki-1 kontrola, n=18; SU11274, n=14;
sunitinib, n=16; sorafenib, n=18. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały
obliczone przy pomocy jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc Bonferroni). C, Poziom
ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek
nowotworowych. D, Analiza skorygowanej całkowitej fluorescencji białka GFP w guzach. Do
badania wykorzystano 12 myszy, gdzie n=3 na grupę. E, Reprezentatywne zdjęcia przekrojów
guzów w jasnym polu z nałożoną fluorescencją pochodzącą od komórek GFP pozytywnych.

W kolejnym etapie, za pomocą techniki western blot oraz analizy

densytometrycznej, przeanalizowano tkanki nowotworowe w celu oceny poziomu
białek c-Met, MCPIP1 oraz e-kadheryny (Ryc. 7.30. A, B). W grupach traktowanych
sunitinibem i sorafenibem obserwowano najwyższy poziom fosforylowanego
receptora c-Met i najniższy białka MCPIP1. Grupa traktowana SU11274,
charakteryzowała się najwyższym poziomem białka MCPIP1, a traktowana
sunitinibem najwyższym poziomem e-kadheryny (Ryc. 7.30. A, B).

88
Rycina 7.30. Efekt oporności na leki na poziom MCPIP1 i c-Met in vivo. A,
Reprezentatywny wynik western blot dla 20 próbek nowotworowych z GAPDH jako kontrolą
ilościową. B, Analiza densytometryczna wszystkich próbek nowotworowych uzyskanych
metodą western blot. Do badań wykorzystano 66 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie Caki-1
kontrola, n=18; SU11274, n=14; sunitinib, n=16; sorafenib, n=18. W przypadku analizy
densytometrycznej e-kadheryny wykorzystano 32 myszy, gdzie n=8 na grupę. Wyniki
przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy
jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc Bonferroni).

Uzyskane wyniki wskazują, że poziom MCPIP1 oraz receptora c-Met w

komórkach opornych ma istotne znaczenie zarówno dla wzrostu i rozwoju guzów jak
i dla procesu przerzutowania in vivo.

89
7.3.4 Białko GSK3β reguluje poziom receptora c-Met oraz białka MCPIP1
Ostatnim etapem badań było wyjaśnienie, w jaki sposób regulowany jest
poziom białek MCPIP1 i c-Met w opornych komórkach nowotworowych.

W 2011 roku pojawiło się doniesienie, że pod wpływem stymulacji IL1β,

fosforylowana kinaza IKKβ rozpoznaje motyw DSGXXS białka MCPIP1, które ulega
fosforylacji, a następnie ubikwitynacji i degradacji w proteasomie (195). Inna
publikacja wskazała, że receptor c-Met reguluje aktywację IKKβ, przez co, w sposób
pośredni, mógłby regulować poziom białka MCPIP1 (218). Dlatego sprawdzono, czy
w komórkach jasnokomórkowego raka nerki, po stymulacji IL-1β, rośnie poziom
kinazy IKK przy jednoczesnym spadku poziomu białka MCPIP1. Badania wykazały,
że już po 5 minutach stymulacji IL-1β, IKK było fosforylowane, jednak nie wpływało to
na poziom MCPIP1 (Ryc. 7.31.).

Rycina 7.31. Wpływ fosforylacji kinazy IKK na

białko MCPIP1. Reprezentatywny wynik western
blot dla komórek Caki-1 po stymulacji IL1β, z β-
aktyną jako kontrolą ilościową.

Otrzymany wynik spowodował rozpoczęcie poszukiwań innego czynnika,

który rozpoznaje motyw DSGXXS białka MCPIP1. Wykorzystując bazę danych
NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) udało się wykazać, że
czynnikiem tym może być białko GSK3β, które przez fosforylację może kierować inne
białka na drogę degradacji (107). Aby sprawdzić, czy GSK3β reguluje poziom
MCPIP1 użyto jego specyficznego inhibitora LiCl. Zaobserwowano, że po 24
godzinach inkubacji komórek Caki-1 z inhibitorem LiCl, poziom MCPIP1 w komórkach
Caki-1 znacząco wzrastał. Zastosowanie inhibitora LiCl powodowało wzrost poziomu
MCPIP1 nawet w obecności w sunitinibu i sorafenibu (Ryc. 7.32. A). Co więcej,
poziom formy całkowitej i fosforylowanej receptora c-Met oraz fibronektyny obniżał
się w obecności tego inhibitora (Ryc. 7. 32. A).

Dodatkowo, oprócz zastosowania inhibitora GSK3β komórki traktowano

inhibitorem szlaku sygnalizacyjnego PI3K-Akt – Ly294002, który jednak nie wpłynął
ani na poziom receptora c-Met, ani MCPIP1 (Ryc. 7.32. A). Co ciekawe, zwłaszcza
po stymulacji sunitinibem, zaobserwować można było wzrost poziomu β-kateniny,
która zazwyczaj związana jest z e-kadheryną tworząc z nią połączenia

90
międzykomórkowe oraz fibronektyny, zaangażowanej w rearanżację macierzy
zewnątrzkomórkowej (Ryc. 7.32. A).

Po 7 dniach stymulacji lekami sprawdzono poziom GSK3β i wykazano, że jego

poziom istotnie rośnie w komórkach traktowanych sunitinibem i sorafenibem, co może
być przyczyną niskiego poziomu MCPIP1 i wzrostu fosforylacji receptora c-Met w
komórkach opornych na te inhibitory (Ryc. 7.32. B).

Następnie, komórki Caki-1 poddane stabilnej transdukcji wektorami

lentiwirusowymi z nadekspresją MCPIP1, poddano stymulacji lekami i wykazano, że
wysoki poziom MCPIP1 istotnie może pełnić rolę ochronną, poprzez obniżenie
poziomu fosforylacji receptora c-Met, kinazy Src czy czynnika transkrypcyjnego
STAT3 (Ryc. 7.32. C).

Rycina 7.32. Wpływ białka GSK3β na poziom MCPIP1. A, Reprezentatywny wynik western
blot dla komórek Caki-1 po 24-godzinnej stymulacji sunitinibem, sorafenibem, Ly294002 lub
LiCl z β-aktyną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywny wynik western blot poziomu
GSK3β dla komórek Caki-1 po 7-dniowej stymulacji lekami z β-aktyną jako kontrolą ilościową.
C, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 po stabilnej transdukcji wektorami
lentiwirusowymi w celu nadekspresji białka MCPIP1. Po indukcji nadekspresji doksycykliną
komórki były traktowane lekami przez 24 godziny. Każde doświadczenie przeprowadzono co
najmniej 3 razy.

Uzyskane w tej części pracy doktorskiej wyniki wskazują, że białko MCPIP1

może działać jako supresor nowotworzenia, a poznanie mechanizmów jego działania
i współdziałania z lekami może być kluczowe podczas tworzenia nowych leków
celowanych.

91
8 Dyskusja
Rozwój nowotworu jest wieloetapowym procesem który obejmuje inicjację,
promocję i progresję. Każdy z tych etapów zależy od szeregu czynników
zaangażowanych w różne procesy i szlaki metaboliczne w tym stan zapalny,
angiogenezę, apoptozę, proliferację czy regulację aktywności migracyjnej. W
przypadku jasnokomórkowego raka nerki opisano dotychczas szereg genów i ich
produktów białkowych mających istotne znaczenie w powstawaniu i rozwoju choroby
(10,11). U pacjentów z ccRCC dochodzi do częstych mutacji genu supresorowego
VHL, które powodują zachwianie równowagi pomiędzy ekspresją czynników pro i
antyangiogennych, a formowane guzy charakteryzują się silnie rozwiniętą siecią
naczyń krwionośnych (12,14). Bardzo dobre ukrwienie guzów nerki połączone z
umiejętnością komórek nowotworowych do nabywania bardziej agresywnego
fenotypu sprawia, że podczas detekcji przerzuty stwierdza się już u 30% pacjentów
(219). Obecnie, główną strategią terapeutyczną stosowaną w leczeniu nowotworów
nerki jest chirurgiczne wycięcie guza, w zależności od stopnia zaawansowania
choroby: nerkooszczędzające bądź radykalne (z całą nerką i okolicznymi węzłami
chłonnymi) (220). Od kilku lat powstaje jednak coraz więcej leków celowanych,
blokujących aktywność przede wszystkim receptorów kinaz tyrozynowych
zaangażowanych w rozwój angiogenezy w tym receptory VEGF czy PDGF (127).
Terapie te, pomimo że początkowo skuteczne, niosą jednak pewne ograniczenia,
związane głównie ze zdolnością komórek nowotworowych do adaptacji do
niekorzystnego środowiska i wykształcania przez nie oporności (221).

Kolejnym, niezwykle istotnym procesem zaangażowanym w karcynogenezę

jest chroniczne zapalenie, które nie tylko bierze udział w tworzeniu mikrośrodowiska
sprzyjającego wzrostowi guza, ale także promuje angiogenezę, EMT czy inwazyjność
(222). Odpowiedź zapalna jest pewnego rodzaju strażnikiem homeostazy organizmu,
która jest ściśle kontrolowana przez wiele czynników, w tym białko MCPIP1 (223).
Podczas rozwoju nowotworu, kontrola stanu zapalnego jest mocno zaburzona, m.in.
przez aktywację onkogenów czy obniżenie poziomu genów supresorowych. Białko
MCPIP1, ze względu na swoją funkcję negatywnego regulatora stanu zapalnego,
stało się interesującym obiektem badań dotyczących jego potencjalnej roli w rozwoju
nowotworów (223). Wykazano, że MCPIP1, oprócz regulowania stabilności
transkryptów dla typowych czynników i cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-2
czy IL-6, negatywnie wpływa na czynniki zaangażowane w apoptozę, proliferację oraz
angiogenezę w komórkach nowotworowych (181,210,212).

92
 W niniejszej pracy podjęto próbę oceny roli białka MCPIP1 podczas rozwoju i
progresji jasnokomórkowego raka nerki zarówno in vitro wykorzystując ludzkie linie
ccRCC: Caki-1 oraz Caki-2 jak i in vivo, a także tkanki pobrane od pacjentów ze
zdiagnozowaną chorobą. Dodatkowo, scharakteryzowano wpływ poziomu i
aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych oddziałujących na
komórki śródbłonka HUVEC i HMEC-1. Zbadano także rolę MCPIP1 i receptora c-
Met w procesie wykształcania oporności przez komórki ccRCC, na stosowane
inhibitory kinaz tyrozynowych: sunitinib i sorafenib.

8.1 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje proliferację i żywotność

Zwiększony, nie poddający się regulacji podział komórkowy, stanowi
podstawę w rozwoju nowotworów. Do tej pory wykazano, że białko MCPIP1
negatywnie reguluje żywotność, proliferację i cykl komórkowy w liniach komórkowych
HeLa, HepG2, neuroblastomy i MDA-MB-231, a także ccRCC
(181,188,210,212,213).

W pierwszym etapie pracy doktorskiej wykorzystano dwie ludzkie linie

jasnokomórkowego raka nerki: Caki-1, pochodzące z przerzutu oraz Caki-2 z guza
pierwotnego, które zostały stabilnie transdukowane wektorami lentiwirusowymi w celu
obniżenia poziomu MCPIP1. Wykazano, że komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1
rosły szybciej i miały wyższą żywotność w porównaniu z komórkami kontrolnymi.
Uzyskane wyniki w badaniach in vitro, potwierdzono również na modelu mysim, gdzie
zaobserwowano znacząco szybszy wzrost guzów i większą wagę guzów z niskim
poziomem MCPIP1. Uzyskane wyniki w zestawieniu z danymi literaturowymi
wskazują, że konstytutywnie niski poziom białka MCPIP1 indukuje czynniki
zaangażowane w regulację cyklu komórkowego i proliferacji. W przypadku badań nad
rakiem piersi, naukowcy wykazali, że wyciszenie MCPIP1 specyficznym shRNA
zwiększało zarówno proliferację i żywotność jak również ekspresję genów
antyapoptotycznych (181). Natomiast, podskórne podanie komórek MDA-MB-231 z
nadekspresją białka MCPIP1, do myszy z upośledzonym układem odporności, po
indukcji doksycykliną, skutkowało spadkiem objętości guza, aż do jego kompletnego
zaniku w niespełna dwa tygodnie (181). Z kolei Ligęza i wsp. oraz Lichawska-Cieślar
i wsp. wykazali, że komórki Caki-1 z nadekspresją MCPIP1 aktywowaną doksycykliną
w systemie TetON, charakteryzowały się niższą żywotnością i akumulacją ATP w
stosunku do kontroli, zarówno w warunkach hipoksji jak i normoksji (212,213).
Powyższe wyniki potwierdzają przedstawione w pracy badania in vivo, gdzie komórki
nowotworowe posiadające podwyższony poziom MCPIP1 osiągały najmniejsze
rozmiary. Co ciekawe, wprowadzona do komórek Caki-2 punktowa mutacja D141N,

93
która całkowicie znosi aktywność RNazy białka, prowadziła do powstania
największych guzów, co sugeruje, że negatywna rola MCPIP1 w kontroli proliferacji
może zależeć od jego funkcji enzymatycznej.

Jednym z mechanizmów tłumaczącym, w jaki sposób białko MCPIP1 może

kontrolować proliferację, jest regulacja transkryptów biorących udział w cyklu
komórkowym. Badania z udziałem ludzkich keratynocytów transfekowanych
specyficznym siMCPIP1 wykazały, że spadek MCPIP1 powodował wzrost poziomu
cykliny D1 i fosforylację ERK1/2 oraz obniżał poziom p21 i fosforylację p53, po
traktowaniu komórek promieniowaniem UVB (198). Sekwencjonowanie nowej
generacji komórek Caki-1, a następnie walidacja wyników metodą PCR w czasie
rzeczywistym, wykazały najwyższą ekspresję mRNA dla p21Cip1 w komórkach z
nadekspresją dzikiej formy MCPIP1, w porównaniu z komórkami kontrolnymi i
komórkami niosącymi mutacją punktową w domenie PIN (213). Należące do rodziny
inhibitorów Cip/Kip, zaangażowanych w negatywną regulację cyklu komórkowego,
białko p21Cip1 hamuje tworzenie kompleksów CDK-Cyklina i prowadzi do zatrzymania
cyklu w fazach G1, S i G2 (224). Z kolei białko to jest degradowane między innymi
podczas fazy S przez kompleks ligazy E3 CUL4B-DDB1-CDT2 (224). Wykazano, że
poziom DDB1 (ang. DNA damage-binding protein 1) spadał w komórkach
posiadających nadekspresję MCPIP1 co sugeruje, że może być substratem dla
aktywności enzymatycznej MCPIP1 (213). Prawdopodobnie, wysoki poziom MCPIP1
powoduje degradację DDB1, przez co kompleks ligazy E3 nie jest w stanie
rozpoznawać białka p21, które hamuje cykl komórkowy, co w konsekwencji prowadzi
do spadku proliferacji. Najnowsze badania potwierdziły powyższe wyniki i pokazały,
że nadekspresja MCPIP1 w dwóch liniach neuroblastomy powoduje spadek
proliferacji i ekspresji cyklin A2, B1, D1, D3 i E2, a także spadek fosforylowanych
kinaz CDK2 i CDK3 oraz białka Rb, czego efektem jest blokada w punkcie kontrolnym
G1/S i areszt komórek w fazie G1 (209).

Wysoka ekspresja głównego markera komórek dzielących się – Ki67

zazwyczaj stanowi negatywny czynnik prognostyczny. Co ciekawe, Ki67 jest
powiązane także z promocją EMT i progresją złośliwych nowotworów (225). Także w
przypadku ccRCC przedstawiono, że pacjenci z wysoką ekspresją Ki67
charakteryzowali się gorszym wynikiem przeżywalności. Dodatkowo, poziom Ki67
korelował ze stadium zaawansowania choroby zarówno w skali TNM jak i Fuhrman
(226). Analiza RNAseq wykazała pięciokrotnie wyższą ekspresję Ki67 w komórkach
z mutacją D141N w porównaniu z komórkami z nadekspresją MCPIP1 (213). Wynik

94
ten nie jest istotny statystycznie, ale sugeruje, że ekspresja Ki67 może być
regulowana przez białko MCPIP1.

Co ciekawe, białko MCPIP1 może negatywnie regulować proliferację

komórek, także w sposób pośredni, przez degradowanie miR155, nazywanego
również oncomiR155 (175). Dowiedziono, że miR155 zaangażowany jest w kontrolę
apoptozy, proliferacji oraz cyklu komórkowego, a jego wzmożona ekspresja
występuje w wielu typach nowotworów w tym w ccRCC (227). Do tej pory
przedstawiono wiele mechanizmów działania miR155 na proliferację. W przypadku
raka wątroby miR155 zwiększa ekspresję ARID2 (ang. AT-rich interactive domain 2)
oraz powoduje wzrost poziomu Cykliny D1 i fosforylacji kinazy Akt (228). Z kolei, w
ccRCC, nadekspresja miR155 powodowała wzrost proliferacji i agresywności
komórek 786-O i ACHN, a także indukowała EMT przez spadek e-kadheryny i wzrost
n-kadheryny i wimentyny zarówno in vitro jak i in vivo. Autorzy tych badań sugerowali,
że w obserwowanych zmianach pośredniczyło białko E2F2, posiadające miejsce w
regionie 3’UTR, rozpoznawane przez miR155 (229). Białka z rodziny E2F tworzą
kompleks z białkiem Rb i modulują ekspresję genów zaangażowanych w cykl
komórkowy. Głównym wnioskiem wysnutym przez autorów było uznanie E2F2 za gen
supresorowy ccRCC negatywnie regulowany przez miR155 (229).

Obserwowane zmiany w żywotności komórek i wzroście guzów in vivo mogą

również wynikać ze zmian w regulacji apoptozy. Badania prowadzone przy
wykorzystaniu linii komórkowej MDA-MB-231 wykazały, że białko MCPIP1 rozpoznaje
i degraduje transkrypty antyapoptotycznych genów Bcl2L1, Bcl2A1, RelB, Birc3 i Bcl3
(181). Wynika z tego, że komórki nowotworowe posiadające niski poziom MCPIP1
charakteryzują się wysokim poziomem przedstawionych genów i zaburzonym
procesem programowanej śmierci. Uzyskane przez nas wyniki mogą być
addytywnym efektem zwiększonej proliferacji oraz zablokowanej apoptozy przy
wyciszeniu bądź mutacji białka MCPIP1. Dłużej żyjące i ciągle dzielące się komórki z
wysoką ekspresją genów antyapoptotycznych, tworzą większą masę guza oraz
wykazują większą żywotność w testach MTT. Z kolei, nadekspresja MCPIP1 wzmaga
apoptozę komórek co może prowadzić nie tylko do spadku masy i objętości guzów,
ale i do całkowitej ich regresji.

8.2 Poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na

aktywność komórek śródbłonka i angiogenezę
Zdolność do tworzenia naczyń krwionośnych w obrębie guza nowotworowego
umożliwia jego dalszy wzrost dzięki dostarczaniu składników odżywczych oraz tlenu,

95
a także prowadzi do dalszej progresji i tworzenia odległych przerzutów (36). Pomimo
udziału tych samych czynników jak w angiogenezie fizjologicznej, naczynia w obrębie
guza różnią się od prawidłowych budową ściany i jej rozmiarami. Naczynia w guzie
są także nieregularne i niedojrzałe oraz posiadają dużą przepuszczalność (37).
ccRCC tworzy guzy silnie unaczynione, charakteryzujące się wysoką ekspresją
czynników angiogennych, w tym HIF1α czy VEGF (43). Chroniczne zapalenie jest
procesem istotnie zaangażowanym w rozwój angiogenezy. Z jednej strony,
wydzielane przez komórki nowotworowe i odpornościowe, czynniki i cytokiny
prozapalne mogą rekrutować komórki śródbłonka oraz modulować ekspresję wielu
genów zaangażowanych w degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, migrację i
kiełkowanie nowych naczyń. Z drugiej, aktywacja wielu typów komórek przez te same
czynniki, w tym makrofagów, fibroblastów może stabilizować nowo powstałe naczynia
(230,231). Białko MCPIP1, jako negatywny regulator stanu zapalnego, może
pośrednio kontrolować rozwój unaczynienia. Jednakże, wyniki badań dotyczących
aktywności RNazy MCPIP1 w angiogenezie,nie zawsze są jednoznaczne, ze względu
na zróżnicowane działanie MCPIP1 w zależności od warunków fizjologicznych lub
patologicznych w jakich badanie było prowadzone.

W prawidłowych komórkach śródbłonka HUVEC, indukcja ekspresji MCPIP1

czynnikami prozapalnymi, MCP-1, TNFα, IL-1β czy IL-8, powodowała formowanie
struktur kapilarnych, przypominających naczynia włosowate (186,206). Z kolei,
zastosowanie specyficznego siRNA wyciszającego ekspresję MCPIP1, hamowało
ekspresję VEGF i HIF1α oraz formowanie tubul (186,206). Dalsze badania wskazały
mechanizm działania białka MCPIP1 w komórkach HUVEC. Roy i wsp. dowiedli, że
MCPIP1 rozpoznaje dwa antyangiogenne miRNA miR20b i miR34a, których
substratami są odpowiednio HIF1α i SIRT-1 (207). Wykorzystane w doświadczeniach
komórki z mutacją punktową D141N, pozbawione aktywności RNazy, nie tworzyły
kapilar, a poziom badanych miRNA nie ulegał zmianie w stosunku do kontroli (207).
Związek pomiędzy angiogenezą, a białkiem MCPIP1 został zaobserwowany także w
mezenchymalnych komórkach macierzystych, pochodzących z mysiego szpiku
kostnego, które po nadekspresji MCPIP1 zaczynały różnicować w komórki o fenotypie
endotelialnym, wykazujące wysoką ekspresję czynnika von Willebranda, Tie-2 oraz
VE-kadheryny. Co ciekawe, wraz ze zwiększonym poziomem MCPIP1 w MSC i
stopniem ich zróżnicowania, zmniejszała się proliferacja tych komórek (205).
Podobny mechanizm przedstawił Niu i wsp. na ludzkich monocytach pochodzących
ze szpiku kostnego po stymulacji MCP-1 bądź transdukcji wektorem niosącym
nadekspresję MCPIP1. Komórki traciły ekspresję swoich typowych markerów CD11b

96
i CD14, a nabierały cech komórek endotelialnych z wysokim poziomem Flt-1, Flk-1,
CD31 i Tie-2. Przeszczepienie takich komórek do kończyny z niedokrwieniem
powodował proces odtworzenia uszkodzonych naczyń krwionośnych (185). Wydaje
się, że wysoki poziom białka MCPIP1 w prawidłowych komórkach endotelialnych
pełni rolę induktora angiogenezy, poprzez pozytywne regulowanie wielu markerów
typowych dla śródbłonka i hamowanie inhibitorowych miRNA.

Aby określić związek pomiędzy poziomem białka MCPIP1 w komórkach

nowotworowych, a rozwojem unaczynienia, komórki Caki-1 i Caki-2 podano
podskórnie do myszy z upośledzonym układem odporności. Rozwój unaczynienia
obserwowano zarówno w trakcie trwania doświadczenia, za pomocą ultrasonografii
wysokiej rozdzielczości, jak i po jego zakończeniu, wykorzystując metody barwienia
markera naczyń CD31. Guzy, z wyciszonym poziomem białka MCPIP1 lub jego
nieaktywną formą charakteryzował znaczący rozwój unaczynienia, który sugerował,
że MCPIP1 reguluje ekspresję i sekrecję ważnych w procesie angiogenezy
czynników. W obrębie guza ze względu na niekontrolowane podziały komórkowe i
niewystarczające unaczynienie często dochodzi do spadku stężenia tlenu, czego
efektem jest hipoksja, lokalna nekroza i naciek komórek układu immunologicznego
(37). Wyniki uzyskane przez Ligeze i wsp. wskazały, że hipoksja, wpływa na spadek
poziomu białka MCPIP1 w komórkach Caki-1 (212). Być może, zwiększony napływ
komórek immunologicznych jest efektem obniżenia poziomu MCPIP1 w warunkach
hipoksji. Kwestią wymagającą dalszego wyjaśnienia pozostaje pytanie, czy komórki
nowotworowe pozbawione ekspresji MCPIP1, w sposób niekontrolowany wydzielają
cytokiny takie jak IL-6 oraz IL-1β, które rekrutują makrofagi lub limfocyty w miejsce
hipoksji.

Kolejne przeprowadzone doświadczenia wykazały, że medium znad komórek

nowotworowych posiadających obniżony poziom MCPIP1, aktywowało śródbłonek do
migracji, tworzenia kapilarnych struktur i fosforylacji głównego markera integralności
naczyń VE-kadheryny. Z kolei, wysoki poziom MCPIP1 w komórkach nowotworowych
nie wpływał istotnie na komórki endotelialne. Na podstawie otrzymanych wyników,
można wysnuć wniosek, że poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych ma
istotne znaczenie w regulacji wydzielania cytokin zaangażowanych w aktywację
komórek śródbłonka i proces angiogenezy.

Powyższą hipotezę potwierdzają wyniki Ligęzy i wsp., gdzie wykazano, że

MCPIP1 negatywnie reguluje poziom czynników i cytokin proangiogennych w
warunkach głodu tlenowego. Dodatkowo, wraz z obniżeniem ilości tlenu rosła

97
ekspresja VEGFA, GLUT1, IL-6 i IL-8 (212). Dalsze badania pokazały, że
nadekspresja MCPIP1 w warunkach hipoksji hamuje produkcję zarówno HIF1α jak i
HIF2α, a także ekspresję IL6, VEGFA i GLUT1. Obserwowany spadek poziomu
VEGFA i GLUT1 mógł być spowodowany bezpośrednio aktywnością RNazy MCPIP1,
lub wynikiem obniżenia poziomu czynników HIF, które regulują ich transkrypcję w
warunkach hipoksji. Co ciekawe, autorzy wykazali, że HIF2α, negatywnie regulował
poziom MCPIP1 w warunkach hipoksji (212). Analiza wyników RNA-Seq wykazała,
że poziom VEGF znacząco spadał w komórkach posiadających podwyższony poziom
MCPIP1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (213). Dalsze badania wykazały, że
MCPIP1 negatywnie reguluje transkrypty czynników odpowiedzi na hipoksję w tym
SPHK1 ((and. Sphingosine Kinase 1), który promuje proliferację komórek, a podczas
hipoksji reguluje poziom HIF1α i HIF2α), ENPP2 ((ang. Ectonucleotide
Pyrophopsphatase/Phosphodiesterase damily member 2) również stymuluje
proliferację, a także chemotaksję i angiogenezę w odpowiedzi na hipoksję), PLOD2
(ang. Procollagen-Lysine 2-Oxoglutarate 5-Dioxygense 2) i MMP2. MMP2 wraz z
PLOD2 degradują macierz zewnątrzkomórkową co sprzyja rozwojowi unaczynienia,
progresji i przerzutowaniu (213). Ostatnie badania przedstawione przez Górkę i wsp.
pokazały, że MCPIP1 pozytywnie reguluje ekspresję genów supresorowych RECK,
PTEN i TIMP3 z których RECK i TIMP3 negatywnie kontrolują angiogenezę przez
obniżanie szeregu metaloproteinaz, VEGF i VEGFR2. Autorzy wykazali następnie, że
nadekspresja MCPIP1 powodowała spadek MMP2 i MMP9 in vivo (214). Warunki
hipoksyjne promują nowotworzenie oraz pomagają utrzymać cechy nowotoworowych
komórek macierzystych (232). Co więcej, aktywowane w hipoksji czynniki HIF mogą,
w przypadku wielu nowotworów złośliwych, promować przejście komórki z
metabolizmu tlenowego na glikolizę (efekt Warburga), (233).

W dalszym etapie badań potwierdzono obserwacje Ligęzy i wsp. i wykazano,

na liniach Caki-1 i Caki-2, że spadek MCPIP1 powoduje wzrost ekspresji IL-6, IL-8 i
VEGF i wyższy poziom białek wydzielanych do pożywki (212). Podobnie,
nadekspresja białka nieaktywnego enzymatycznie prowadziła do podwyższonego
poziomu ekspresji i sekrecji IL-6, IL-8 i VEGF w warunkach normalnego stężenia tlenu
i niedotlenienia. Czynniki te mogą odgrywać istotną rolę w procesie ukrwienia
jasnokomórkowego raka nerki. VEGF należy do typowych czynników
proangiogennych, a IL-8 może, niezależnie od obecności VEGF, łączyć się z
receptorem VEGFR2 i prowadzić do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a w
konsekwencji do migracji komórek endotelialnych i wzmożonej angiogenezy (234).
Regulowana przez białko MCPIP1, prozaplana IL-6, stymuluje angiogenezę w

98
pośrednio przez aktywację czynnika transkrypcyjnego STAT3, który reguluje
transkrypcję wielu genów w tym VEGF (62).

Innym znanym induktorem angiogenezy, zaangażowanym również w progresję

nowotworu jest SDF-1, którego ekspresję reguluje m.in. VEGF, HIF1α oraz czynnik
transkrypcyjny c/EBPβ (20,53,215). Wykazano, że SDF-1 powoduje rekrutację
komórek mieloidalnych CXCR4 ze szpiku kostnego oraz komórek progenitorowych
śródbłonka indukując w ten sposób angiogenezę nowotworową (65). Rezultatem
obniżenia poziomu MCPIP1 w komórkach ccRCC, była podwyższona ekspresja SDF-
1 i CXCR4 in vitro oraz in vivo. Co ciekawe, nadekspresja dzikiej formy MCPIP1
hamowała ekspresję SDF-1, podczas gdy mutacja D141N nie wpływała na poziom
SDF-1, co sugeruje, że białko MCPIP1 nie reguluje bezpośrednio ekspresji SDF-1.
Otrzymane wyniki wskazują, że MCPIP1 dzięki swojej aktywności RNazy reguluje
poziom czynnika transkrypcyjnego c/EBPβ, który kontroluje ekspresję SDF-1.

Kwestią wymagającą wyjaśnienia pozostało pytanie, jak zmienia się poziom

MCPIP1 w komórkach śródbłonka po stymulacji medium kondycjonowanym znad
komórek nowotworowych. Takie doświadczenie stanowiłoby most łączący dane
literaturowe dotyczące roli MCPIP1 w komórkach śródbłonka jako induktora
angiogenezy, z wynikami przedstawionymi w niniejszej pracy pokazującymi, że niski
poziom MCPIP1 w komórkach nowotworowych zwiększa ekspresję czynników
proangiogennych. Najprawdopodobniej, komórki nowotworowe charakteryzujące się
niskim poziomem MCPIP1 wydzielają cytokiny indukujące ekspresję MCPIP1 w
komórkach endotelialnych, aktywując je do migracji i angiogenezy. Jednak
przedstawiona hipoteza wymaga dalszych badań.

8.3 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną i

progresję nowotworu
Zdolność komórek nowotworowych do aktywnej migracji i tworzenia odległego
przerzutu w nowej niszy jest ich najniebezpieczniejszą cechą i jednocześnie główną
przyczyną śmierci pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą. Nabywanie przez komórkę
epitelialną specyficznego fenotypu mezenchymalnego i cech umożliwiających
migrację i inwazję jest znane jako przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) (98).
Pierwszym etapem EMT jest utrata połączeń międzykomórkowych i spadek ekspresji
e-kadheryny, która z kolei jest negatywnie kontrolowana przez szereg czynników
transkrypcyjnych należących do rodziny ZEB i Snail. Następnie, dochodzi do zmiany
polaryzacji komórki, ekspresji czynników zaangażowanych w ruchliwość i rearanżację
cytoszkieletu: wimentyny, n-kadheryny czy β-kateniny (235). Zmiany powodowane

99
EMT mają charakter przejściowy opierający się głównie na zmianach
epigenetycznych i modyfikacjach potranskrypcyjnych, często zależnych od warunków
otaczającego mikrośrodowiska (236). Tak więc, gdy komórka znajdzie się w
odpowiedniej niszy, może wystąpić proces odwrotny do EMT, czyli przejście
mezenchymalno-epitelialne, co sprzyja tworzeniu nowego, wtórnego ogniska.

Badania in vivo wykazały, że obniżony poziom MCPIP1, aktywuje komórki do

opuszczenia pierwotnego guza i migracji do krwioobiegu, co w konsekwencji
powoduje powstawanie większej ilości przerzutów w płucach. Z kolei, ilość przerzutów
obserwowanych w grupie z nadekspresją białka MCPIP1 była najmniejsza. Podobne
wyniki wskazali Lu i wsp. na komórkach MDA-MB-231, które podane do myszy
immunokompetentnych, po indukcji nadekspresji MCPIP1 doksycykliną,
charakteryzowały się ok 75% spadkiem ilości przerzutów do płuc (181). Wyniki
zamieszczone w pracy wykazują, że komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1 migrują
szybciej w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Dodatkowe wyniki przedstawione
przez naszą grupę ujawniły, że nadekspresja MCPIP1 powodowała spadek
ruchliwości o ponad 90% w porównaniu z kontrolą (237). Kolejne doniesienie
potwierdziło, iż białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną zarówno
w warunkach in vitro jak i in vivo. Autorzy zidentyfikowali gen ZC3H12A jako istotnie
zaangażowany w kontrolę ruchliwości i dowiedli negatywną korelację pomiędzy
bazowym poziomem MCPIP1, a aktywnością migracyjną w różnych liniach
komórkowych raka piersi (238). Co więcej, po wprowadzeniu wektora z nadekspresją
MCPIP1 do linii MDA-MB-231 odsetek komórek o wysokim potencjale migracyjnym
drastycznie spadał. Dodatkowo, wysoki poziom MCPIP1 powodował spadek genów
zaangażowanych w ścieżkę sygnalizacyjną TGFβ, w tym NOG, ID4, SMAD4 i SMAD5
co sugeruje, że supresja mobilności komórek może zależeć od, negatywnie
regulowanej przez MCPIP1, ścieżki TGFβ (238). Należy zaznaczyć, że aktywacja
szlaku TGFβ odgrywa kluczową rolę w procesie EMT, regulując ekspresję czynników
transkrypcyjnych Snail, oraz markerów fenotypu mezenchymalnego N-CAD, FN1, czy
VIM oraz aktywując szlak kinaz MAPK i PI3K/Akt (106).

Jednym z czynników odpowiedzialnych za przerzutowanie wielu typów

nowotworów jest receptor c-Met. Zwiększona aktywność migracyjna komórek i
wyższa ilość przerzutów w płucach po wyciszeniu MCPIP1 może wynikać z aktywacji
procesu EMT oraz z aktywacji receptora c-Met.

Otrzymane wyniki wskazały, że badane linie komórkowe ccRCC, po

wyciszeniu MCPIP1, charakteryzowały się spadkiem e-kadheryny i wyższym

100
poziomem β-kateniny, wimentyny, kinazy Src i receptora c-Met, a także czynników
transkrypcyjnych Snail i ZEB2 w porównaniu z kontrolą. Dalsze badania wykazały, że
podobne zmiany zachodzą również w prawidłowych komórkach HEK293, co
sugeruje, że brak białka MCPIP1 może prowadzić do nabywania przez komórki
agresywnego fenotypu i w konsekwencji aktywować proces inicjacji nowotworowej
(237). Z kolei, wysoki poziom MCPIP1 pełni rolę protekcyjną zmniejszając ekspresję
markerów EMT, ruchliwość i ilość przerzutów (237). Liczne doniesienia wskazują, że
kluczowe białko odpowiedzi zapalnej NF-κB, odgrywa istotną rolę w procesie EMT m.
in. poprzez wiązanie się do promotora wimentyny (108). Można przypuszczać, że
białko MCPIP1 rozpoznając i degradując NF-κB, w sposób pośredni przyczynia się
do spadku poziomu wimentyny.

Receptor c-Met, w wyniku stymulacji swoim ligandem HGF, aktywuje wiele

procesów komórkowych m.in. proliferację, migrację czy utrzymanie
niezróżnicowanego fenotypu komórek macierzystych (218). Gen MET jest zaliczany
do protoonkogenów, a jego nadekspresja jest obserwowana w wielu typach
nowotworów (77,78,80). Receptor c-Met został również pokazany jako aktywator
procesu EMT działając na szlaki sygnalizacyjne MAPK i PI3K/Akt czy bezpośrednio
na szlak Wnt/β-katenina (239). Wykazano także, że obniżenie poziomu receptora c-
Met indukuje ekspresję e-kadheryny, głównego markera fenotypu epitelialnego (84).
Zaobserwowane zmiany w poziomie i fosforylacji receptora c-Met pod wpływem
białka MCPIP1 pozwalają przypuszczać, że jego transkrypt może stanowić substrat
dla aktywności RNazy MCPIP1. Istotnie, obecność mutacji w domenie PIN białka
MCPIP1, która całkowicie znosi jego aktywność enzymatyczną, prowadziła do
wzrostu poziomu transkryptu i białka dla c-Met. Co więcej, istnieją doniesienia
wskazujące na możliwość zaangażowania szlaków receptorów c-Met i CXCR4 w
proces EMT. Dowiedziono, że oba receptory negatywnie regulują poziom e-
kadheryny i powodują wzrost ekspresji Slug. Receptory te również, wspólnie
zwiększają poziom czynnika STAT3, który reguluje transkrypcję ZEB1 (114). Sama
oś SDF-1/CXCR4, także wpływa na powstawanie przerzutów (240). W świetle
powyższych danych, MCPIP1 wydaje się być nadrzędnym regulatorem EMT.
Uzyskane wyniki wskazują na szerokie działanie MCPIP1, który regulując poziom
receptorów CXCR4, c-Met, oraz czynnika transkrypcyjnego STAT3 może wpływać na
fenotyp komórek nowotworowych i w konsekwencji ich dalsze losy.

Co ciekawe, także hipoksja może stymulować EMT, głównie przez aktywację

czynników transkrypcyjnych HIFα (109). Wykazano, że HIF1α aktywuje TGFβ w
komórkach wątroby podczas fibrozy oraz szlak Wnt/β-katenina w raku wątroby

101
(241,242). HIF1α, przez wiązanie się do fragmentu HRE promotora czynników
transkrypcyjnych Twist, Snail, Slug, ZEB1 i ZEB2, promuje ich ekspresję
(109,243,244). Dodatkowo, Cheng i wsp. wykazali, że NF-κB jest aktywowany przez
HIF1α w warunkach hipoksji, co z kolei, promowało związany z EMT spadek e-
kadheryny i wzrost n-kadheryny w raku trzustki (245). Również szlak sygnalizacyjny
Notch, który także jest zaliczany do głównych induktorów EMT, promuje tworzenie
przerzutów zależnie od aktywności HIFα, STAT3 oraz miR200 (246–248), które są
negatywnie regulowane przez MCPIP1.

Powyższe obserwacje sugerują, że białko MCPIP1 pełni bezpośrednią rolę w

kontroli progresji nowotworowej, migracji i EMT przez regulację poziomu transkryptów
czynników wpływających na progresję nowotworu: c-Met, CXCR4, NF-κB, STAT3 czy
HIFα. Co więcej, MCPIP1 może działać również pośrednio, przyczyniając się do
regulacji poziomu białek i czynników transkrypcyjnych charakterystycznych dla EMT
w tym: wimentyny, e-kadheryny, β-kateniny, Snail i ZEB2.

8.4 Białko MCPIP1 stanowi czynnik prognostyczny w ccRCC

Do tej pory ukazało się kilka prac wskazujących na rolę białka MCPIP1 w
procesie nowotworzenia. W raku piersi wykazano znaczący spadek ekspresji
MCPIP1 w tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową (181). Dalsza analiza
wykazała, że guzy potrójnie negatywne (ER-/PR-/HER2-) charakteryzujące się
gorszymi rokowaniami posiadały mniej MCPIP1 niż potrójnie pozytywne (181).
Podobne wyniki przedstawił Ligęza i wsp. w jasnokomórkowym raku nerki, gdzie
zarówno poziom transkryptu, jak i białka MCPIP1 w tkance nowotworowej był
znacząco niższy w porównaniu z odpowiadającą mu tkanką prawidłową (212). Analizy
wielu nowotworowych linii komórkowych wykazały, że charakteryzowały się one
niskim, często wręcz znikomym poziomem MCPIP1, a wraz ze spadkiem poziomu
MCPIP1 rosła ich agresywność (210,249).

W kolejnym etapie pracy doktorskiej, sprawdzono, jak zmienia się poziom białka
MCPIP1 wraz z progresją ccRCC. Wykazano, że wraz z zaawansowaniem choroby
poziom białka MCPIP1 maleje. Dodatkowo, poziom genu ZC3H12A był na bardzo
niskim poziomie we wszystkich badanych próbkach niezależnie od stopnia progresji.
Natomiast, ekspresja genów zaangażowanych w EMT, migrację i inwazyjność takich
jak? HGF, IL6, LIF, ZEB2 oraz MET, a także fosforylacja białek Src, Yes, β-katenina
i STAT3 rosły wraz z postępem choroby. Górka i wsp. wykazali, że u pacjentów z
ccRCC wraz z rozwojem nowotworu spada poziom genów supresorowych TIMP3,
RECK i PTEN, a ich ekspresja jest pozytywnie regulowana przez białko MCPIP1

102
zarówno in vitro jak i in vivo (214). W świetle uzyskanych wyników i dostępnych
danych literaturowych, można zasugerować, że ZC3H12A pełni rolę genu
supresorowego, który ulega znaczącemu obniżeniu w tkance nowotworowej oraz że
białko MCPIP1 może pełnić rolę czynnika prognostycznego stanowiącego o
przyszłych rokowaniach pacjentów.

Dane literaturowe wskazują, że stadium zaawansowania choroby koreluje z

proliferacją komórek śródbłonka i powierzchnią naczyń. Także wyniki naszej grupy
pokazują, że na każdym etapie progresji, guzy jasnokomórkowego raka nerki
posiadają wysoki poziom markera naczyń CD31, a wraz z rosnącym stadium rozwoju
ccRCC wg skali Fuhrman, rośnie powierzchnia światła naczyń. Dodatkowo, czwarte
stadium zaawansowania klinicznego charakteryzowało się największą ilością
funkcjonalnych naczyń krwionośnych z wysoką ekspresją CD31 (237). Yao i wsp. na
podstawie swoich badań zasugerowali, że w przypadku ccRCC, markerem
prognostycznym nie może być tylko ilość CD31 czy gęstość mikronaczyń, ale także
stopień ich zróżnicowania i dojrzałości. Wskazali, że obecność zróżnicowanych
naczyń CD31+CD34+, pokrytych perycytami, które biorą udział w dojrzewaniu i
stabilizacji naczyń krwionośnych jest pozytywnym czynnikiem prognostycznym dla
pacjentów z ccRCC. Natomiast, duża ilość niefunkcjonalnych naczyń
(niezróżnicowanych) pozytywnych dla CD31, z małym lub bez niego, oraz nie
posiadających perycytów na powierzchni, charakteryzuje guzy o wyższym stopniu
zaawansowania i gorszymi rokowaniami (250). Nasze badania wskazują co prawda,
na korelację ilości naczyń i wielkości światła z progresją choroby, jednak na podstawie
uzyskanych wyników nie można stwierdzić, czy należą one do grupy zróżnicowanych,
dojrzałych naczyń (237). Dalsza analiza wyników mikromacierzy wykazała, że poziom
genów zaangażowanych w unaczynienie jest generalnie wysoki we wszystkich
próbkach, ale najwyższy w początkowych stadiach, co może sugerować, że
stosowanie inhibitorów angiogenezy jako terapii leczniczej powinno rozpocząć się w
momencie diagnozy.

Obecność receptora c-Met jest uznawana za zły czynnik prognostyczny w

przypadku wielu typów nowotworów, w tym ccRCC. W rozwoju mięsaka
prążkowanokomórkowego (RMS) autorzy wykazali, że wysoka aktywność HGF i
receptora c-Met prowadzi do zwiększonej proliferacji oraz przerzutowania przy
jednoczesnym zahamowaniu apoptozy (122). Podobnie, w wynikach Cieśli i wsp.
pokazano, że c-Met, HGF a także CXCR4 i SDF-1 są znacząco wyższe w bardziej
agresywnej linii RMS (251). Co więcej, w ccRCC wysoki poziom c-Met jest powiązany
z progresją choroby i obecnością przerzutów (90). W przypadku badanej puli

103
pacjentów wykazano, że wraz z progresją choroby rośnie poziom receptora c-Met jak
również jego fosforylacji. Negatywna korelacja obserwowana między receptorem c-
Met i białkiem MCPIP1 w próbkach pacjentów z ccRCC, może być wynikiem
rozpoznawania przez MCPIP1 transkryptu genu MET jako specyficznego substratu,
co potwierdzają przedstawione wcześniej wyniki uzyskane w badaniach na linii
komórkowej Caki-1. Przypuszczalnie jednak, nie jest to główny mechanizm w wyniku
którego MCPIP1 obniża poziom c-Met w ccRCC. Czynnik transkrypcyjny NF-κB, który
jest negatywnie regulowany przez białko MCPIP1, kontroluje ekspresję c-Met poprzez
wiązanie się do promotora genu MET i aktywację transkrypcji (176,252). Można więc
sądzić, że receptor c-Met jest regulowany przez MCPIP1 bezpośrednio dzięki
aktywności RNazy lub pośrednio przez czynnik transkrypcyjny NF-κB.

8.5 Oporność na sunitinib i sorafenib jest regulowana przez białko

MCPIP1 i receptor c-Met
Unaczynienie guza jest krytycznym krokiem podczas rozwoju nowotworu
ponieważ promuje miejscową progresję guza i rozprzestrzenianie się przerzutów. Z
powodu częstych mutacji genu supresorowego VHL, ccRCC tworzy zazwyczaj
niezwykle unaczynione guzy, głównie ze względu na akumulację czynników
transkrypcyjnych HIFs i nadmiernego wydzielania czynników proangiogennych,
niezależnie od warunków tlenowych (10). W przypadku ccRCC opisano dotychczas
szereg genów, mających istotne znaczenie w rozwoju choroby, które mogą stanowić
potencjalny cel terapeutyczny (10). Indywidualne podejście do pojedynczych
przypadków klinicznych i dobieranie terapii celowanych pod konkretnego pacjenta
można już zaobserwować śledząc badania dotyczące terapii przeciwnowotworowych.

Zdolność do tworzenia naczyń krwionośnych przez guz nowotworowy, może

być wykorzystywana do jego niszczenia, poprzez zastosowanie leków hamujących
działalność czynników angiogennych. Do tej pory, opracowano i dopuszczono do
użytku kilka leków działających przede wszystkim jako inhibitory angiogenezy (127).
Sunitinib i sorafenib blokują liczne receptory kinaz tyrozynowych, które biorą udział w
angiogenezie, wzroście i progresji nowotworowej. Sunitinib (STUTENT®, Pfizer In.)
został zaprojektowany jako inhibitor receptorów PDGFRα, PDGFRβ, VEGFR1,
VEGFR2 i VEGFR3, receptorów czynnika komórek pnia (ang. KIT Proto-Oncogen,
KIT), kinazy tyrozynowej podobnej do Fms-3 (ang. Fms Related Receptor Tyrosine
Kinase 3, FLT3), receptorów czynnika powstawania kolonii (ang. Colony Stimulating
Factor 1 Receptor, CSF-1R) i receptorów glejopochodnego czynnika neutroficznego
(ang. Ret proto-oncogene, RET) (253). Sorafenib (NEXAVAR®, Bayer HealthCare) z
kolei, hamuje aktywność czynników zlokalizowanych w komórkach nowotworowych
104
CRAF, BRAF, c-KIT i FLT3, oraz w komórkach śródbłonka CRAF, VEGFR2, VEGFR3
i PDGFRβ (134). Pomimo hamowania specyficznych szlaków sygnałowych w
komórkach nowotworowych, mediana czasu przeżycia wolnego od choroby (ang.
Progression-free survival, PFS) pacjentów z ccRCC, podczas stosowaniu sunitinibu
wynosi jedynie 11,4 miesiąca, a w grupie placebo 5,5 miesiąca oraz 5,6 miesiąca w
grupie otrzymującej sorafenib w porównaniu do 2,9 miesiąca w grupie przyjmującej
placebo (133,135). Ponadto, znacząca grupa pacjentów z ccRCC nie reaguje na
terapie celowane, podczas gdy w innych przypadkach, po początkowym okresie
poprawy, następuje nawrót choroby spowodowany wykształceniem silnej oporności
na leki. Głównymi mechanizmami leżącymi u podstaw oporności są zmiany
epigenetyczne i mutacje zachodzące w komórkach nowotworowych prowadzące do
zmian konformacyjnych białek rozpoznawanych przez lek, jak również aktywacja
alternatywnych szlaków sygnałowych, będąca metodą kompensacji zablokowanych
receptorów (139).

W ostatniej części pracy doktorskiej zbadano jaki może być potencjalny

mechanizm nabierania oporności przez komórki ccRCC, na stosowane w terapii
sunitinib i sorafenib. Ze względu na częste mutacje genu MET i nadmierną
fosforylację receptora c-Met w ccRCC, oraz z uwagi na fakt, iż c-Met pełni istotną rolę
w nabieraniu oporności na sunitinib, w badaniach użyto również jego specyficznego
inhibitora, SU11274. Wykazano, że 7-dniowe traktowanie komórek lekami bądź
inhibitorem c-Met, jedynie w przypadku sunitinibu powoduje istotny spadek
żywotności w obu badanych liniach komórkowych. Nieznaczny spadek można było
również zaobserwować po inhibicji fosforylacji receptora c-Met. Jednak stymulacja
sorafenibem komórek Caki-2 nie wpływała w żaden sposób na spadek żywotności
czy proliferacji, co jest o tyle zaskakujące, że sorafenib powinien mieć działanie
przeciw-proliferacyjne, ze względu na blokowanie białek RAF i hamowanie dalszej
ścieżki kinaz MAPK (134). Dalsza analiza cyklu komórkowego wykazała, najwyższy
odsetek komórek w fazie G2/M w grupie traktowanej sorafenibem. Tymczasem w
fazie sub-G0 (apoptotycznej) najwyższy odsetek komórek obserwowany był w grupie
stymulowanej sunitnibem, co może sugerować, że komórki wchodzą w stan uśpienia
(senesencji) (254).

Kolejne doświadczenia wykazały znaczące zmiany w morfologii komórek po

zastosowaniu sunitinibu i sorafenibu. Komórki po stymulacji sunitinibem zaokrąglały
się oraz rosły w zwartych grupach przypominających klony posiadając fenotyp
epitelialny. Co ciekawe, otrzymane wyniki stanowią przeciwieństwo danych
literaturowych. Hwang i wsp. oraz Hammers i wsp. wykazali, że oporność komórek

105
raka nerki na sunitinib jest spowodowana zmianą fenotypu na mezenchymalny i
zwiększoną ekspresją genów związanych z EMT: CD44, SNAI2, CLDN1, ZEB1,
ZEB2 i TWIST (142,255). Z kolei, zastosowanie sorafenibu, miało zupełnie inny efekt
na fenotyp komórek ccRCC, które charakteryzowały się bardzo wydłużonym
kształtem przypominającym fibroblasty. Komórki oporne na sorafenib także
niechętnie się łączyły preferując indywidualną migrację. W komórkach raka wątroby
wykazano, że mechanizm oporności na sorafenib także opierał się na zmianie
fenotypu na mezenchymalny, spadkiem poziomu e-kadheryny i wzrostem wimentyny,
Snail a także MMP9 w komórkach raka wątroby (256).

Dostępne dane literaturowe wskazują, że jednym z głównych czynników

zaangażowanych w rozwój oporności na badane leki jest receptor c-Met. Jak
wspomniano wcześniej, receptor c-Met bierze udział w kontroli licznych procesów
takich jak EMT, przerzutowanie oraz angiogeneza. Wykazano, że receptor ten
kontroluje ekspresję VEGF przez aktywację ścieżek sygnalizacyjnych IL-6/STAT3,
PI3K/Akt oraz kinaz MAPK (61). Wydaje się więc, że podczas stosowania inhibitorów
angiogenezy, następuje aktywacja alternatywnych receptorów w tym c-Met, jako
mechanizmu kompensacyjnego. Istnieje szereg doniesień wskazujących na
aktywację receptora c-Met w komórkach opornych na sunitinib. Zazwyczaj wraz z
fosforylacją c-Met obserwowano także wzrost markerów EMT oraz zwiększoną
inwazyjność in vivo oraz in vitro (144,147,148). Co ciekawe, również komórki
podścieliska odpowiadały na stosowany sunitinib poprzez zwiększoną ekspresję HGF
(148). Z kolei, zastosowanie kombinacji sunitinibu ze specyficznym inhibitorem c-Met,
bądź wyciszeniem c-Met, uwrażliwiało komórki na lek co wskazało, że oporność na
sunitinib jest zależna od receptora c-Met. Zaobserwowano także równoczesną
aktywację receptorów AXL oraz EGFR wraz z c-Met (145,257). Pinato i wsp. wykazali,
że podobnie może wyglądać mechanizm oporności na sorafenib, który polegał na
aktywacji receptorów AXL i c-Met, a komórki charakteryzowały się wysokim
poziomem markerów EMT (216). Wyniki przedstawione w niniejszej pracy
potwierdziły, że zarówno stymulacja sunitinibem jak i sorafenibem charakteryzowała
się wysoką fosforylacją receptora c-Met. Jednak nowością było wykazanie spadku
poziomu MCPIP1 w komórkach opornych in vitro jak i in vivo. Co niezwykle
interesujące, zastosowanie inhibitora receptora c-Met, SU11274, oprócz hamowania
fosforylacji receptora, powodowało wzrost poziomu białka MCPIP1, co wskazuje na
zależność MCPIP1 od aktywności c-Met. Ciekawym wynikiem, wymagającym jednak
dalszych badań jest efekt połączenia SU11274 wraz z sorafenibem, który powodował
całkowity brak fosforylacji receptora c-Met. Być może, zastosowanie cabozantinibu,

106
który wykazuje podobną specyficzność substratową co sunitinib czy sorafenib oraz
dodatkowo blokuje receptor c-Met, spowodowałoby wzrost poziomu MCPIP1 i lepszą
odpowiedź nowotworu na terapię. Wydaje się więc, że komórka nowotworowa w
obecności leków próbuje zwiększyć swoje szanse na przeżycie przez aktywację
receptora, który jest istotnie zaangażowany w progresję choroby oraz znaczącą
redukcję białka odpowiedzialnego za utrzymanie homeostazy.

Istotną rolę w oporności na sorafenib może pełnić również ścieżka IL-6/STAT3

(258). Oporne na sorafenib komórki raka wątroby nie tylko wykazywały spadek e-
kadheryny oraz wzrost markerów EMT, ale także wzrost markerów macierzystych
komórek nowotworowych (ang. Cancer Stem Cells, CSC) CD44 i Oct3/4 oraz IL-6 i
STAT3. Dodatkowo, wyciszenie IL-6 w komórkach opornych powodowało spadek
poziomu wymienionych białek i wolniejszy wzrost guzów in vivo. Autorzy wysunęli
wniosek, że zablokowanie IL-6 wraz z zastosowaniem sorafenibu ma efekt przeciw-
nowotworowy (258). Wiedząc, że białko MCPIP1 negatywnie reguluje zarówno IL-6
jak i STAT3, można uznać, że to właśnie spadek białka MCPIP1 w komórkach
opornych na sorafenib wpływa na wzrost ekspresji IL-6 i aktywację dalszej kaskady
sygnałowej.

Wiele badań dotyczących oporności na sunitinib pokazuje, że komórki tracą

ekspresję e-kadheryny, a zyskują ekspresję markerów mezenchymalnych (255,259).
Tymczasem, w przedstawionych wynikach zarówno in vitro jak i in vivo, poziom e-
kadheryny gwałtownie rośnie, a razem z nim poziom β-kateniny. Co ciekawe, oprócz
puli cytoplazmatycznej β-kateniny zaangażowanej w szlak Wnt, występuje również
pula błonowa, gdzie β-katenina, wchodzi wraz z e-kadheryną i α-kateniną w skład
kompleksu budującego połączenia międzykomórkowe (260). Wysoki poziom e-
kadheryny i lokalizacja błonowa β-kateniny mogą powodować obserwowane zmiany
w fenotypie komórek po stymulacji sunitinibem. Obserwowane zmiany w proliferacji,
cyklu komórkowym i fenotypie w komórkach traktowanych sunitinibem, mogą
świadczyć o wejściu komórki w stan uśpienia. W 1965 roku L. Hayflick wykazał, że
prawidłowe komórki mają ograniczoną zdolność do podziałów, po których następuje
zatrzymanie cyklu komórkowego. To zjawisko zostało nazwane uśpieniem (ang.
Senescence) (261). Co ciekawe, uśpienie komórek może również wpływać na rozwój
nowotworów, poprzez regulację mikrośrodowiska oraz być sposobem ucieczki przed
radio- lub chemioterapią (217). Komórki, które weszły w stan uśpienia, pozostają
żywe, ale nie dzielą się. Obserwuje się również pojawienie specyficznego fenotypu
sekrecyjnego (ang. Senescence-associated secreted phenotype, SASP), który
moduluje mikrośrodowisko guza. Uśpione komórki mogą wydzielać także

107
metaloproteinazy promujące inwazję i tworzenie przerzutów. Cechami komórek
uśpionych jest wzrost poziomu inhibitorów cyklu komórkowego p21 lub p16 oraz
aktywności enzymu lizosomalnego β-galaktozydazy (ang. Senescent-associated β-
galactosidase, SA-β-gal) (217). W przedstawionych badaniach wykazano, iż komórki
oporne na sunitinib posiadają bardzo wysoki sygnał po barwieniu SA-β-gal. Wynik ten
potwierdził, że stymulacja sunitinibem prowadzi do uśpienia komórek. Być może,
obserwowany spadek poziomu białka MCPIP1 również sprzyja uśpieniu, przez brak
kontroli nad ekspresją najważniejszych SASP: IL-1β, IL-6 oraz IL-8. Co ciekawe,
SASP jest regulowany również przez czynniki transkrypcyjne NF-κB oraz c/EBPβ,
które stanowią substrat dla aktywności RNazy białka MCPIP1 (262,263).

Zarówno uśpienie i obecność SASP, jak i fenotyp mezenchymalny oraz

fosforylacja receptora c-Met istotnie wpływają na progresję nowotworową i tworzenie
odległych przerzutów. Obserwowany wzrost ilości mikroprzerzutów do płuc w grupie
opornej na sorafenib jest spowodowany głównie wzrostem poziomu receptora c-Met,
EMT i wzrostem aktywności proliferacyjnej. Pomimo, iż populacja komórek GFP +
opornych na sunitinib jest dużo mniejsza niż komórek dzikich w guzie, ilość
przerzutów rośnie w porównaniu z grupą kontrolną. Wynik ten sugeruje, że komórki
oporne wydzielają duże ilości czynników modulujących mikrośrodowisko guza i
sprzyjających angiogenezie i migracji. Dodatkowo, zmiany w morfologii wpływające
na formowanie struktur przypominających klony może także ułatwiać osiedlenie się w
nowej niszy. Jak wspomniano w części „Wstęp”, klastry komórkowe posiadają wysoki
potencjał inwazyjny ułatwiający przerzutowanie i składają się zarówno z komórek o
fenotypie epitelialnym jak i mezenchymalnym. Dzięki obecności białek regulujących
połączenia komórkowe, takich jak e-kadheryna, klaster nie rozpada się, natomiast
komórki mezenchymalne stanowią jego siłę napędową (123). Większa ilość
przerzutów oraz łączenie się komórek w grupy sugeruje, że komórki oporne na
sunitinib migrują kolektywnie w klastrach posiadających wysoki poziom e-kadheryny
i fosforylację receptora c-Met, który zwiększa inwazyjność grupy.

Obserwowany spadek poziomu białka MCPIP1 w komórkach opornych na

sunitinib i sorafenib, skłonił do poszukiwania czynnika, który jest odpowiedzialny za
przedstawione zmiany. Iwasaki i wsp. wykazali nowy mechanizm degradacji białka
MCPIP1, polegający na rozpoznawaniu przez kinazę IKKβ motywu DGSXXS białka
MCPIP1, które następnie ulegało fosforylacji w pozycjach S435 oraz S439,
ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej (195). Jednakże, przedstawione w pracy
doktorskiej wyniki nie potwierdziły opublikowanych doniesień. Stymulacja IL-1β
powodowała wzrost fosforylacji kinazy IKKβ, ale również wzrost poziomu białka

108
MCPIP1. Enzym GSK3β, który zaangażowany jest w negatywną regulację wielu
białek w tym β-kateniny, również rozpoznaje motyw DGSXXS białka MCPIP1 (264).
Po zastosowaniu specyficznego inhibitora GSK3β – LiCl wykazano znaczący wzrost
poziomu MCPIP1 i spadek fosforylacji receptora c-Met nawet w obecności sunitinibu
lub sorafenibu. Dodatkowo, tygodniowa stymulacja lekami powodowała wzrost
poziomu GSK3β. Powyższe wyniki sugerują, iż aktywne białko GSK3β negatywnie
reguluje poziom MCPIP1. W ostatnim etapie badań, zaobserwowano, że
nadekspresja białka MCPIP1 powoduje spadek poziomu receptora c-Met, czynnika
STAT3 i kinazy Src, również po stymulacji sunitinibem i sorafenibem. Wskazuje to na
protekcyjną rolę MCPIP1 i przyszłe możliwości w wykorzystaniu tego białka, jako
metody terapeutycznej.

Obecnie coraz większą uwagę poświęca się badaniu oddziaływań pomiędzy

komórkami nowotworowymi, a komórkami podścieliska, śródbłonka czy układu
immunologicznego, które pełnią istotną rolę w rozwoju i progresji nowotworu.
Poznanie funkcji białek biorących udział w procesach zachodzących w obrębie guza
jest niezbędne do opracowania nowych możliwości terapeutycznych. Przedstawiona
w niniejszej pracy analiza tkanek pacjentów z ccRCC i linii komórkowych pokazała,
że oprócz dobrze poznanej roli MCPIP1 w odpowiedzi zapalnej i utrzymaniu
homeostazy, białko to pełni rolę w rozwoju i progresji nowotworu. Wyniki in vitro i in
vivo wskazują, że MCPIP1 w sposób bezpośredni przez swoją aktywność
enzymatyczną, lub pośredni, działając na szereg czynników zaangażowanych w
proliferację, angiogenezę, proces EMT i przerzutowanie, reguluje rozwój i progresję
nowotworu. Co więcej, poziom MCPIP1 negatywnie koreluje z poziomem i
aktywnością receptora c-Met, który jest nadrzędnym modulatorem progresji
nowotworowej. Dodatkowo, w trakcie rozwoju choroby, poziom białka MCPIP1 spada,
co sugeruje, że może pełnić potencjalną rolę supresora nowotworzenia. Z kolei,
stymulacja komórek inhibitorami angiogenezy powoduje zmiany fenotypu w
proliferacji i cyklu komórkowym, a także morfologii. Mechanizm oporności
najprawdopodobniej polega na wzroście aktywności receptora c-Met i spadku białka
MCPIP1, które jest regulowane przez czynnikiem GSK3β. Wyniki przedstawione w
niniejszej pracy doktorskiej sugerują, że białko MCPIP1 może stanowić potencjalny
czynnik prognostyczny jasnokomórkowego raka nerki, który w przyszłości może mieć
znaczenie terapeutyczne.

109
9 Wnioski końcowe
Wyniki uzyskane w niniejszej rozprawie doktorskiej wskazują, że białko MCPIP1
jest niezwykle istotne podczas rozwoju i progresji jasnokomórkowego raka nerki (Ryc.
9.1.). Na podstawie przedstawionych wyników można stwierdzić, że:

1. Regulacja proliferacji, żywotności i wzrostu guzów in vivo zależy od poziomu

i aktywności RNazy białka MCPIP1.
2. Niski poziom białka MCPIP1 sprzyja rozwinięciu unaczynienia w obrębie guza
in vivo.
3. Białko MCPIP1 negatywnie reguluje ekspresję i sekrecję czynników
proangiogennych w warunkach hipoksji i normoksji. Wydzielane cytokiny
wpływają na fosforylację VE-kadheryny, utratę połączeń międzykomórkowych
i aktywację komórek śródbłonka do migracji.
4. Niski poziom białka MCPIP1, poprzez aktywację osi SDF-1/CXCR4, powoduje
wzrost agresywności komórek nowotworowych i sprzyja powstawaniu
przerzutów.
5. Proces EMT jest regulowany bezpośrednio lub pośrednio przez MCPIP1.
Towarzyszy temu zmiana w poziomie receptora c-Met, Src, STAT3,
wimentyny, β-kateniny i e-kadheryny.
6. Poziom MCPIP1 spada wraz z progresją jasnokomórkowego raka nerki i
negatywnie koreluje z poziomem całkowitego i fosforylowanego receptora c-
Met.
7. Stymulacja sunitinibem i sorafenibem powoduje wzrost fosforylacji receptora
c-Met i spadek białka MCPIP1.
8. Mechanizm oporności na sunitinib polega na wejściu komórek w stan
uśpienia, podczas gdy oporność na sorafenib prowadzi do zmiany fenotypu
komórki na mezenchymalny.
9. Komórki oporne na sunitinib i sorafenib tworzą więcej przerzutów niż komórki
kontrolne.
10. Spadek poziomu białka MCPIP1 po stymulacji sunitinibem lub sorafenibem
może być spowodowany aktywacją GSK3β, który rozpoznaje motyw DSGXXS
i powoduje jego fosforylację i degradację proteasomalną.

110
Rycina 9.1. Podsumowanie roli białka MCPIP1 w rozwoju, angiogenezie i progresji
jasnokomórkowego raka nerki, a także podczas nabywania oporności na sunitinib i
sorafenib.

111
10 Bibliografia
1. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for
Clinicians. 2018;68(1):7–30.
2. Hsieh JJ, Purdue MP, Signoretti S, Swanton C, Albiges L, Schmidinger M, et al. Renal
cell carcinoma. Nature reviews Disease primers. 2017 Mar 9;3:17009.
3. Moch H, Cubilla AL, Humphrey PA, Reuter VE, Ulbright TM. The 2016 WHO
Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs&#x2014;Part
A: Renal, Penile, and Testicular Tumours. European Urology. 2016 Jul 1;70(1):93–105.
4. Lopez-Beltran A, Scarpelli M, Montironi R, Kirkali Z. 2004 WHO Classification of the
Renal Tumors of the Adults. European Urology. 2006 May 1;49(5):798–805.
5. Rini BI, Campbell SC, Escudier B. Renal cell carcinoma. The Lancet. 2009 Mar
28;373(9669):1119–32.
6. Zhou M, He H. Pathology of Renal Cell Carcinoma BT - Renal Cell Carcinoma: Clinical
Management. In: Campbell SC, Rini BI, editors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013. p.
23–41.
7. Muglia VF, Prando A. Renal cell carcinoma: histological classification and correlation
with imaging findings. Radiologia brasileira. 2015;48(3):166–74.
8. Fuhrman SA, Lasky LC, Limas C. Prognostic significance of morphologic parameters
in renal cell carcinoma. The American journal of surgical pathology. 1982 Oct;6(7):655–
63.
9. Lang H, Lindner V, de Fromont M, Molinié V, Letourneux H, Meyer N, et al. Multicenter
determination of optimal interobserver agreement using the Fuhrman grading system
for renal cell carcinoma. Cancer. 2005 Feb 1;103(3):625–9.
10. Creighton CJ, Morgan M, Gunaratne PH, Wheeler DA, Gibbs RA, Gordon Robertson
A, et al. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma.
Nature. 2013;499(7456):43–9.
11. Sato Y, Yoshizato T, Shiraishi Y, Maekawa S, Okuno Y, Kamura T, et al. Integrated
molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 2013;45(8):860–
7.
12. Hakimi AA, Pham CG, Hsieh JJ. A clear picture of renal cell carcinoma. Nature
Genetics. 2013;45(8):849–50.
13. Kapur P, Peña-Llopis S, Christie A, Zhrebker L, Pavía-Jiménez A, Rathmell WK, et al.
Effects on survival of BAP1 and PBRM1 mutations in sporadic clear-cell renal-cell
carcinoma: a retrospective analysis with independent validation. The Lancet Oncology.
2013 Feb 1;14(2):159–67.
14. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang G-W, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, et al.
The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-
dependent proteolysis. Nature. 1999;399(6733):271–5.
15. Tissue @ Www.Proteinatlas.Org. Available from:
http://www.proteinatlas.org/ENSG00000233276-GPX1/tissue
16. Jaakkola P, Mole DR, Tian Y-M, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, et al. Targeting of
HIF-α to the von Hippel-Lindau Ubiquitylation Complex by O2 Regulated Prolyl
Hydroxylation. Science. 2001 Apr 20;292(5516):468 LP – 472.
17. Yu F, White SB, Zhao Q, Lee FS. HIF-1α binding to VHL is regulated by stimulus-
sensitive proline hydroxylation. Proceedings of the National Academy of Sciences.
2001 Aug 14;98(17):9630 LP – 9635.
18. Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, et al. HIFα Targeted for VHL-
Mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing. Science.
2001 Apr 20;292(5516):464 LP – 468.
19. Knebelmann B, Ananth S, Cohen HT, Sukhatme VP. Transforming Growth Factor α Is
a Target for the Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor. Cancer Research. 1998 Jan
15;58(2):226 LP – 231.
20. Zagzag D, Krishnamachary B, Yee H, Okuyama H, Chiriboga L, Ali MA, et al. Stromal
Cell–Derived Factor-1α and CXCR4 Expression in Hemangioblastoma and Clear Cell-
Renal Cell Carcinoma: von Hippel-Lindau Loss-of-Function Induces Expression of a
Ligand and Its Receptor. Cancer Research. 2005 Jul 15;65(14):6178 LP – 6188.

112
21. Gong K, Zhang N, Zhang K, Na Y. The relationship of erythropoietin overexpression
with von Hippel-Lindau tumour suppressor gene mutations between hypoxia-inducible
factor-1alpha and -2alpha in sporadic clear cell renal carcinoma. International journal
of molecular medicine. 2010 Dec;26(6):907–12.
22. Buchler P, Reber HA, Buchler M, Shrinkante S, Buchler MW, Friess H, et al. Hypoxia-
inducible factor 1 regulates vascular endothelial growth factor expression in human
pancreatic cancer. Pancreas. 2003 Jan;26(1):56–64.
23. Kucejova B, Peña-Llopis S, Yamasaki T, Sivanand S, Tran TAT, Alexander S, et al.
Interplay between pVHL and mTORC1 pathways in clear-cell renal cell carcinoma.
Molecular cancer research : MCR. 2011/07/28. 2011 Sep;9(9):1255–65.
24. Koochekpour S, Jeffers M, Wang PH, Gong C, Taylor GA, Roessler LM, et al. The von
Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene Inhibits Hepatocyte Growth Factor/Scatter
Factor-Induced Invasion and Branching Morphogenesis in Renal Carcinoma Cells.
Molecular and Cellular Biology. 1999 Sep 1;19(9):5902 LP – 5912.
25. Hara S, Nakashiro K-I, Klosek SK, Ishikawa T, Shintani S, Hamakawa H. Hypoxia
enhances c-Met/HGF receptor expression and signaling by activating HIF-1alpha in
human salivary gland cancer cells. Oral oncology. 2006 Jul;42(6):593–8.
26. von-hippel-lindau-syndrome @ ghr.nlm.nih.gov. Available from:
https://ghr.nlm.nih.gov/condition/von-hippel-lindau-syndrome#synonyms
27. Calzada MJ. Von Hippel-Lindau syndrome: molecular mechanisms of the disease.
Clinical and Translational Oncology. 2010;12(3):160–5.
28. Richards FM, Payne SJ, Zbar B, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Maher ER. Molecular
analysis of de novo germline mutations in the von Hippel-Lindau disease gene. Human
molecular genetics. 1995 Nov;4(11):2139–43.
29. Lee JY, Dong SM, Park WS, Yoo NJ, Kim CS, Jang JJ, et al. Loss of heterozygosity
and somatic mutations of the VHL tumor suppressor gene in sporadic cerebellar
hemangioblastomas. Cancer research. 1998 Feb;58(3):504–8.
30. Shuin T, Yamasaki I, Tamura K, Okuda H, Furihata M, Ashida S. Von Hippel–Lindau
Disease: Molecular Pathological Basis, Clinical Criteria, Genetic Testing, Clinical
Features of Tumors and Treatment. Japanese Journal of Clinical Oncology. 2006 Jun
1;36(6):337–43.
31. Kaelin WG. The von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Protein and Clear Cell Renal
Carcinoma. Clinical Cancer Research. 2007 Jan 15;13(2):680s LP – 684s.
32. Bindra RS, Vasselli JR, Stearman R, Linehan WM, Klausner RD. VHL-mediated
Hypoxia Regulation of Cyclin D1 in Renal Carcinoma Cells. Cancer Research. 2002
Jun 1;62(11):3014 LP – 3019.
33. Zatyka M, da Silva NF, Clifford SC, Morris MR, Wiesener MS, Eckardt K-U, et al.
Identification of Cyclin D1 and Other Novel Targets for the von Hippel-Lindau Tumor
Suppressor Gene by Expression Array Analysis and Investigation of Cyclin D1
Genotype as a Modifier in von Hippel-Lindau Disease. Cancer Research. 2002 Jul
1;62(13):3803 LP – 3811.
34. Goda N, Ryan HE, Khadivi B, McNulty W, Rickert RC, Johnson RS. Hypoxia-inducible
factor 1alpha is essential for cell cycle arrest during hypoxia. Molecular and cellular
biology. 2003 Jan;23(1):359–69.
35. Conway EM, Collen D, Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth.
Cardiovascular Research. 2001 Feb 16;49(3):507–21.
36. Folkman J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Seminars in
Oncology. 2002;29(6, Supplement 16):15–8.
37. Sacewicz I, Wiktorska M, Wysocki T, Niewiarowska J. [Mechanisms of cancer
angiogenesis]. Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online). 2009 Apr;63:159–
68.
38. Furuya M, Nishiyama M, Kasuya Y, Kimura S, Ishikura H. Pathophysiology of tumor
neovascularization. Vascular health and risk management. 2005;1(4):277–90.
39. Kumar H, Choi D-K. Hypoxia Inducible Factor Pathway and Physiological Adaptation:
A Cell Survival Pathway? Mediators of inflammation. 2015/09/27. 2015;2015:584758.
40. Raval RR, Lau KW, Tran MGB, Sowter HM, Mandriota SJ, Li J-L, et al. Contrasting
Properties of Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-
Associated Renal Cell Carcinoma. Molecular and Cellular Biology. 2005 Jul
1;25(13):5675 LP – 5686.

113
41. Zimmer M, Doucette D, Siddiqui N, Iliopoulos O. Inhibition of hypoxia-inducible factor
is sufficient for growth suppression of VHL-/- tumors. Molecular cancer research : MCR.
2004 Feb;2(2):89–95.
42. Kondo K, Kim WY, Lechpammer M, Kaelin Jr WG. Inhibition of HIF2alpha is sufficient
to suppress pVHL-defective tumor growth. PLoS biology. 2003/12/22. 2003
Dec;1(3):E83–E83.
43. Shen C, Kaelin Jr WG. The VHL/HIF axis in clear cell renal carcinoma. Seminars in
cancer biology. 2012/06/13. 2013 Feb;23(1):18–25.
44. Dorević G, Matusan-Ilijas K, Babarović E, Hadzisejdić I, Grahovac M, Grahovac B, et
al. Hypoxia inducible factor-1alpha correlates with vascular endothelial growth factor A
and C indicating worse prognosis in clear cell renal cell carcinoma. Journal of
experimental & clinical cancer research : CR. 2009 Mar 20;28(1):40.
45. Wang W, Qi L, Tan M, Zhang Z, Du J, Wei X, et al. Effect of platelet-derived growth
factor-B on renal cell carcinoma growth and progression. Urologic Oncology: Seminars
and Original Investigations. 2015;33(4):168.e17-168.e27.
46. Ferrara N, Gerber H-P, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature
medicine. 2003 Jun;9(6):669–76.
47. Carmeliet P, Collen D. Molecular basis of angiogenesis. Role of VEGF and VE-
cadherin. Annals of the New York Academy of Sciences. 2000 May;902:244–9.
48. Dejana E, Bazzoni G, Lampugnani MG. Vascular Endothelial (VE)-Cadherin: Only an
Intercellular Glue? Experimental Cell Research. 1999;252(1):13–9.
49. Dejana E, Orsenigo F, Lampugnani MG. The role of adherens junctions and VE-
cadherin in the control of vascular permeability. Journal of Cell Science. 2008 Jul
1;121(13):2115 LP – 2122.
50. Li X, Padhan N, Sjöström EO, Roche FP, Testini C, Honkura N, et al. VEGFR2 pY949
signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread. Nature
communications. 2016 Mar;7:11017.
51. Herren B, Levkau B, Raines EW, Ross R. Cleavage of β-Catenin and Plakoglobin and
Shedding of VE-Cadherin during Endothelial Apoptosis: Evidence for a Role for
Caspases and Metalloproteinases. Molecular Biology of the Cell. 1998 Jun
1;9(6):1589–601.
52. Vilgrain I, Sidibe A, Polena H, Cand F, Mannic T, Arboleas M, et al. Evidence for Post-
Translational Processing of Vascular Endothelial (VE)-Cadherin in Brain Tumors:
Towards a Candidate Biomarker. PloS one. 2013 Dec 16;8:e80056.
53. Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, et al. VEGF-Induced
Adult Neovascularization: Recruitment, Retention, and Role of Accessory Cells. Cell.
2006 Jan 13;124(1):175–89.
54. Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, et al. Interleukin-
8 as a Macrophage-Derived Mediator of Angiogenesis. Science. 1992 May
12;258(5089):1798–801.
55. Li A, Dubey S, Varney ML, Dave BJ, Singh RK. IL-8 Directly Enhanced Endothelial Cell
Survival, Proliferation, and Matrix Metalloproteinases Production and Regulated
Angiogenesis. The Journal of Immunology. 2003 Mar 15;170(6):3369 LP – 3376.
56. CUMPĂNAS AA, CIMPEAN AM, FERICIAN O, CEAUSU RA, SARB S, BARBOS V, et
al. The Involvement of PDGF-B/PDGFRβ Axis in the Resistance to Antiangiogenic and
Antivascular Therapy in Renal Cancer. Anticancer Research. 2016 May 1;36(5):2291–
5.
57. Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, Seftor EA, Gardner LM, Pe’er J, et al. Vascular channel
formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. The
American journal of pathology. 1999 Sep;155(3):739–52.
58. Lin H, Pan J, Zhang F, Huang B, Chen X, Zhuang J, et al. Matrix metalloproteinase-9
is required for vasculogenic mimicry by clear cell renal carcinoma cells. Urologic
oncology. 2015 Apr;33(4):168.e9-16.
59. Wang X, Yang R, Wang Q, Wang Y, Ci H, Wu S. Aberrant expression of vasculogenic
mimicry, PRRX1, and CIP2A in clear cell renal cell carcinoma and its clinicopathological
significance. Medicine. 2019 Sep;98(36):e17028.
60. Bai J, Yeh S, Qiu X, Hu L, Zeng J, Cai Y, et al. TR4 nuclear receptor promotes clear
cell renal cell carcinoma (ccRCC) vasculogenic mimicry (VM) formation and metastasis
via altering the miR490-3p/vimentin signals. Oncogene. 2018 Nov;37(44):5901–12.

114
61. Matsumura A, Kubota T, Taiyoh H, Fujiwara H, Okamoto K, Ichikawa D, et al. HGF
regulates VEGF expression via the c-Met receptor downstream pathways, PI3K/Akt,
MAPK and STAT3, in CT26 murine cells. International journal of oncology. 2013
Feb;42(2):535–42.
62. Gopinathan G, Milagre C, Pearce OMT, Reynolds LE, Hodivala-Dilke K, Leinster DA,
et al. Interleukin-6 Stimulates Defective Angiogenesis. Cancer research. 2015
Aug;75(15):3098–107.
63. Ishibashi K, Koguchi T, Matsuoka K, Onagi A, Tanji R, Takinami-Honda R, et al.
Interleukin-6 induces drug resistance in renal cell carcinoma. Fukushima journal of
medical science. 2018/10/23. 2018 Dec 8;64(3):103–10.
64. Kijowski J, Baj-Krzyworzeka M, Majka M, Reca R, Marquez LA, Christofidou-Solomidou
M, et al. The SDF-1-CXCR4 axis stimulates VEGF secretion and activates integrins but
does not affect proliferation and survival in lymphohematopoietic cells. Stem cells
(Dayton, Ohio). 2001;19(5):453–66.
65. Zheng H, Fu G, Dai T, Huang H. Migration of endothelial progenitor cells mediated by
stromal cell-derived factor-1alpha/CXCR4 via PI3K/Akt/eNOS signal transduction
pathway. Journal of cardiovascular pharmacology. 2007 Sep;50(3):274–80.
66. Baldewijns MM, Thijssen VL, van den Eynden GG, van Laere SJ, Bluekens AM,
Roskams T, et al. High-grade clear cell renal cell carcinoma has a higher angiogenic
activity than low-grade renal cell carcinoma based on histomorphological quantification
and qRT-PCR mRNA expression profile. British journal of cancer. 2007/05/15. 2007
Jun 18;96(12):1888–95.
67. Organ SL, Tsao M-S. An overview of the c-MET signaling pathway. Therapeutic
advances in medical oncology. 2011 Nov;3(1 Suppl):S7–19.
68. Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, et al. Placental defect and
embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature.
1995;373(6516):702–5.
69. Huh C-G, Factor VM, Sánchez A, Uchida K, Conner EA, Thorgeirsson SS. Hepatocyte
growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and
repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 2004 Mar 30;101(13):4477 LP – 4482.
70. Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, Birchmeier C. Essential role for the c-
met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature.
1995 Aug;376(6543):768–71.
71. Trusolino L, Comoglio PM. Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for
invasive growth. Nature reviews Cancer. 2002 Apr;2(4):289–300.
72. Fixman ED, Fournier TM, Kamikura DM, Naujokas MA, Park M. Pathways downstream
of Shc and Grb2 are required for cell transformation by the tpr-Met oncoprotein. The
Journal of biological chemistry. 1996 May;271(22):13116–22.
73. Ménard L, Parker PJ, Kermorgant S. Receptor tyrosine kinase c-Met controls the
cytoskeleton from different endosomes via different pathways. Nature
Communications. 2014;5(1):3907.
74. Xiao GH, Jeffers M, Bellacosa A, Mitsuuchi Y, vande Woude GF, Testa JR. Anti-
apoptotic signaling by hepatocyte growth factor/Met via the phosphatidylinositol 3-
kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase pathways. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America. 2001 Jan;98(1):247–52.
75. Hui AY, Meens JA, Schick C, Organ SL, Qiao H, Tremblay EA, et al. Src and FAK
mediate cell-matrix adhesion-dependent activation of Met during transformation of
breast epithelial cells. Journal of cellular biochemistry. 2009 Aug;107(6):1168–81.
76. Zhang Y-W, Wang L-M, Jove R, vande Woude GF. Requirement of Stat3 signaling for
HGF/SF-Met mediated tumorigenesis. Oncogene. 2002 Jan;21(2):217–26.
77. Hara T, Ooi A, Kobayashi M, Mai M, Yanagihara K, Nakanishi I. Amplification of c-myc,
K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization.
Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 1998
Sep;78(9):1143–53.
78. Lengyel E, Prechtel D, Resau JH, Gauger K, Welk A, Lindemann K, et al. C-Met
overexpression in node-positive breast cancer identifies patients with poor clinical
outcome independent of Her2/neu. International journal of cancer. 2005
Feb;113(4):678–82.

115
79. Tong CYK, Hui ABY, Yin X-L, Pang JCS, Zhu X-L, Poon W-S, et al. Detection of
oncogene amplifications in medulloblastomas by comparative genomic hybridization
and array-based comparative genomic hybridization. Journal of neurosurgery. 2004
Feb;100(2 Suppl Pediatrics):187–93.
80. Schmidt L, Junker K, Nakaigawa N, Kinjerski T, Weirich G, Miller M, et al. Novel
mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene.
1999;18(14):2343–50.
81. Jo M, Stolz DB, Esplen JE, Dorko K, Michalopoulos GK, Strom SC. Cross-talk between
epidermal growth factor receptor and c-Met signal pathways in transformed cells. The
Journal of biological chemistry. 2000 Mar;275(12):8806–11.
82. Orian-Rousseau V, Morrison H, Matzke A, Kastilan T, Pace G, Herrlich P, et al.
Hepatocyte growth factor-induced Ras activation requires ERM proteins linked to
both CD44v6 and F-actin. Molecular biology of the cell. 2007 Jan;18(1):76–83.
83. Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. A signaling adapter function for alpha6beta4
integrin in the control of HGF-dependent invasive growth. Cell. 2001 Nov;107(5):643–
54.
84. Miekus K, Pawlowska M, Sekuła M, Drabik G, Madeja Z, Adamek D, et al. MET receptor
is a potential therapeutic target in high grade cervical cancer. Oncotarget. 2015
Apr;6(12):10086–101.
85. Pennacchietti S, Michieli P, Galluzzo M, Mazzone M, Giordano S, Comoglio PM.
Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the
met protooncogene. Cancer cell. 2003 Apr;3(4):347–61.
86. Kitajima Y, Ide T, Ohtsuka T, Miyazaki K. Induction of hepatocyte growth factor activator
gene expression under hypoxia activates the hepatocyte growth factor/c-Met system
via hypoxia inducible factor-1 in pancreatic cancer. Cancer science. 2008
Jul;99(7):1341–7.
87. Kawaida K, Matsumoto K, Shimazu H, Nakamura T. Hepatocyte growth factor prevents
acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice. Proceedings of the
National Academy of Sciences. 1994 May 10;91(10):4357 LP – 4361.
88. Nagaike M, Hirao S, Tajima H, Noji S, Taniguchi S, Matsumoto K, et al. Renotropic
functions of hepatocyte growth factor in renal regeneration after unilateral
nephrectomy. The Journal of biological chemistry. 1991 Dec;266(34):22781–4.
89. Natali PG, Prat M, Nicotra MR, Bigotti A, Olivero M, Comoglio PM, et al.
Overexpression of the met/HGF receptor in renal cell carcinomas. International Journal
of Cancer. 1996 Jun 21;69(3):212–7.
90. Pisters LL, El-Naggar AK, Luo W, Malpica A, Lin S-H. C-Met Proto-Oncogene
Expression in Benign and Malignant Human Renal Tissues. The Journal of Urology.
1997;158(3):724–8.
91. Choi JS, Kim M-K, Seo JW, Choi Y-L, Kim DH, Chun YK, et al. MET Expression in
Sporadic Renal Cell Carcinomas. J Korean Med Sci. 2006 Aug;21(4):672–7.
92. Schmidt L, Duh F-M, Chen F, Kishida T, Glenn G, Choyke P, et al. Germline and
somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary
renal carcinomas. Nature Genetics. 1997;16(1):68–73.
93. Macher-Goeppinger S, Keith M, Endris V, Penzel R, Tagscherer KE, Pahernik S, et al.
MET expression and copy number status in clear-cell renal cell carcinoma: prognostic
value and potential predictive marker. Oncotarget. 2017 Jan 3;8(1):1046–57.
94. Gibney GT, Aziz SA, Camp RL, Conrad P, Schwartz BE, Chen CR, et al. c-Met is a
prognostic marker and potential therapeutic target in clear cell renal cell carcinoma.
Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology.
2012/09/28. 2013 Feb;24(2):343–9.
95. Miyata Y, Kanetake H, Kanda S. Presence of Phosphorylated Hepatocyte Growth
Factor Receptor/c-Met Is Associated with Tumor Progression and Survival in Patients
with Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 2006 Aug
15;12(16):4876 LP – 4881.
96. Nakaigawa N, Yao M, Baba M, Kato S, Kishida T, Hattori K, et al. Inactivation of von
Hippel-Lindau Gene Induces Constitutive Phosphorylation of MET Protein in Clear Cell
Renal Carcinoma. Cancer Research. 2006 Apr 1;66(7):3699 LP – 3705.
97. Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial–mesenchymal
transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2014;15(3):178–96.

116
98. Thiery JP, Sleeman JP. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal
transitions. Nature reviews Molecular cell biology. 2006 Feb;7(2):131–42.
99. Nisticò P, Bissell MJ, Radisky DC. Epithelial-mesenchymal transition: general
principles and pathological relevance with special emphasis on the role of matrix
metalloproteinases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2012 Feb
1;4(2):a011908.
100. Peinado H, Portillo F, Cano A. Transcriptional regulation of cadherins during
development and carcinogenesis. The International journal of developmental biology.
2004;48(5–6):365–75.
101. Reinhold WC, Reimers MA, Lorenzi P, Ho J, Shankavaram UT, Ziegler MS, et al.
Multifactorial Regulation of E-Cadherin Expression: An Integrative Study. Molecular
Cancer Therapeutics. 2010 Jan 1;9(1):1 LP – 16.
102. Wang Y, Shi J, Chai K, Ying X, Zhou BP. The Role of Snail in EMT and Tumorigenesis.
Current cancer drug targets. 2013 Nov;13(9):963–72.
103. Liu W, Liu Y, Liu H, Zhang W, An H, Xu J. Snail predicts recurrence and survival of
patients with localized clear cell renal cell carcinoma after surgical resection. Urologic
oncology. 2015 Feb;33(2):69.e1-10.
104. Gou Y, Ding W, Xu K, Wang H, Chen Z, Tan J, et al. Snail is an independent prognostic
indicator for predicting recurrence and progression in non-muscle-invasive bladder
cancer. International urology and nephrology. 2014 Nov 12;47.
105. Muenst S, Daster S, Obermann EC, Droeser RA, Weber WP, von Holzen U, et al.
Nuclear expression of snail is an independent negative prognostic factor in human
breast cancer. Disease markers. 2013;35(5):337–44.
106. Wendt MK, Allington TM, Schiemann WP. Mechanisms of the epithelial-mesenchymal
transition by TGF-beta. Future oncology (London, England). 2009 Oct;5(8):1145–68.
107. MacDonald BT, Tamai K, He X. Wnt/&#x3b2;-Catenin Signaling: Components,
Mechanisms, and Diseases. Developmental Cell. 2009 Jul 21;17(1):9–26.
108. Huber MA, Azoitei N, Baumann B, Grünert S, Sommer A, Pehamberger H, et al. NF-
kappaB is essential for epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a model of
breast cancer progression. The Journal of clinical investigation. 2004 Aug;114(4):569–
81.
109. Tam SY, Wu VWC, Law HKW. Hypoxia-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in
Cancers: HIF-1α and Beyond. Frontiers in oncology. 2020 Apr 8;10:486.
110. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, vande Woude GF. Met, metastasis, motility
and more. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003;4(12):915–25.
111. Kim KH, Seol HJ, Kim EH, Rheey J, Jin HJ, Lee Y, et al. Wnt/β-catenin signaling is a
key downstream mediator of MET signaling in glioblastoma stem cells. Neuro-
oncology. 2012/12/20. 2013 Feb;15(2):161–71.
112. Previdi S, Maroni P, Matteucci E, Broggini M, Bendinelli P, Desiderio MA. Interaction
between human-breast cancer metastasis and bone microenvironment through
activated hepatocyte growth factor/Met and b-catenin/Wnt pathways. European Journal
of Cancer. 2010 Jun 1;46(9):1679–91.
113. Monga SPS, Mars WM, Pediaditakis P, Bell A, Mulé K, Bowen WC, et al. Hepatocyte
Growth Factor Induces Wnt-independent Nuclear Translocation of β-Catenin after Met-
β-Catenin Dissociation in Hepatocytes. Cancer Research. 2002 Apr 1;62(7):2064 LP –
2071.
114. Cheng Y, Song Y, Qu J, Che X, Song N, Fan Y, et al. The Chemokine Receptor CXCR4
and c-MET Cooperatively Promote Epithelial-Mesenchymal Transition in Gastric
Cancer Cells. Translational Oncology. 2018;11(2):487–97.
115. Cañadas I, Rojo F, Taus Á, Arpí O, Arumí-Uría M, Pijuan L, et al. Targeting Epithelial-
to-Mesenchymal Transition with Met Inhibitors Reverts Chemoresistance in Small Cell
Lung Cancer. Clinical Cancer Research. 2014 Feb 15;20(4):938 LP – 950.
116. Yonemura Y, Nojima N, Kaji M, Kawamura T, Fushida S, Fujimura T, et al. E-cadherin
and c-met expression as a prognostic factor in gastric cancer. Oncology reports.
1997;4(4):743–8.
117. Han S-U, Lee H-Y, Lee J-H, Kim W-H, Nam H, Kim H, et al. Modulation of E-cadherin
by hepatocyte growth factor induces aggressiveness of gastric carcinoma. Annals of
surgery. 2005 Nov;242(5):676–83.

117
118. Simpson CD, Anyiwe K, Schimmer AD. Anoikis resistance and tumor metastasis.
Cancer letters. 2008 Dec;272(2):177–85.
119. Chaffer CL, Thompson EW, Williams ED. Mesenchymal to epithelial transition in
development and disease. Cells, tissues, organs. 2007;185(1–3):7–19.
120. Webb CP, Taylor GA, Jeffers M, Fiscella M, Oskarsson M, Resau JH, et al. Evidence
for a role of Met-HGF/SF during Ras-mediated tumorigenesis/metastasis. Oncogene.
1998 Oct;17(16):2019–25.
121. Tao X, Hill KS, Gaziova I, Sastry SK, Qui S, Szaniszlo P, et al. Silencing Met receptor
tyrosine kinase signaling decreased oral tumor growth and increased survival of nude
mice. Oral oncology. 2014 Feb;50(2):104–12.
122. Miekus K, Lukasiewicz E, Jarocha D, Sekula M, Drabik G, Majka M. The decreased
metastatic potential of rhabdomyosarcoma cells obtained through MET receptor
downregulation and the induction of differentiation. Cell death & disease. 2013
Jan;4(1):e459.
123. Yang Y, Zheng H, Zhan Y, Fan S. An emerging tumor invasion mechanism about the
collective cell migration. American journal of translational research. 2019 Sep
15;11(9):5301–12.
124. Santoni M, Cimadamore A, Cheng L, Lopez-Beltran A, Battelli N, Massari F, et al.
Circulating Tumor Cells in Renal Cell Carcinoma: Recent Findings and Future
Challenges. Frontiers in oncology. 2019 Apr 5;9:228.
125. Suárez-Causado A, Caballero-Díaz D, Bertrán E, Roncero C, Addante A, García-
Álvaro M, et al. HGF/c-Met signaling promotes liver progenitor cell migration and
invasion by an epithelial–mesenchymal transition-independent, phosphatidyl inositol-3
kinase-dependent pathway in an in vitro model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Molecular Cell Research. 2015;1853(10, Part A):2453–63.
126. Peczkowski P. The role of radiation therapy in renal cancer. In 2007.
127. Chowdhury N, Drake CG. Kidney Cancer: An Overview of Current Therapeutic
Approaches. The Urologic clinics of North America. 2020 Nov;47(4):419–31.
128. Buti S, Bersanelli M, Sikokis A, Maines F, Facchinetti F, Bria E, et al. Chemotherapy in
metastatic renal cell carcinoma today? A systematic review. Anti-cancer drugs. 2013
Jul;24(6):535–54.
129. Iacovelli R, Cartenì G, Milella M, Berardi R, di Lorenzo G, Verzoni E, et al. Clinical
outcomes in patients with metastatic renal cell carcinoma receiving everolimus or
temsirolimus after sunitinib. Canadian Urological Association journal = Journal de
l’Association des urologues du Canada. 2014;8(3–4):E121–5.
130. Voss MH, Molina AM, Motzer RJ. mTOR inhibitors in advanced renal cell carcinoma.
Hematology/oncology clinics of North America. 2011 Aug;25(4):835–52.
131. Mihaly Z, Sztupinszki Z, Surowiak P, Gyorffy B. A comprehensive overview of targeted
therapy in metastatic renal cell carcinoma. Current cancer drug targets. 2012
Sep;12(7):857–72.
132. George S, Motzer RJ, Hammers HJ, Redman BG, Kuzel TM, Tykodi SS, et al. Safety
and Efficacy of Nivolumab in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma Treated
Beyond Progression: A Subgroup Analysis of a Randomized Clinical Trial. JAMA
oncology. 2016 Sep 1;2(9):1179–86.
133. Motzer RJ, Hutson TE, Tomczak P, Michaelson MD, Bukowski RM, Oudard S, et al.
Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa
in patients with metastatic renal cell carcinoma. Journal of clinical oncology : official
journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009 Aug;27(22):3584–90.
134. Wilhelm SM, Adnane L, Newell P, Villanueva A, Llovet JM, Lynch M. Preclinical
overview of sorafenib, a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF
receptor tyrosine kinase signaling. Molecular Cancer Therapeutics. 2008 Oct
1;7(10):3129 LP – 3140.
135. Escudier B, Eisen T, Stadler WM, Szczylik C, Oudard S, Siebels M, et al. Sorafenib in
advanced clear-cell renal-cell carcinoma. The New England journal of medicine. 2007
Jan;356(2):125–34.
136. Abdelaziz A, Vaishampayan U. Cabozantinib for Renal Cell Carcinoma: Current and
Future Paradigms. Current treatment options in oncology. 2017 Mar;18(3):18.

118
137. Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, et al. New
response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1).
European journal of cancer (Oxford, England : 1990). 2009 Jan;45(2):228–47.
138. Marona P, Górka J, Kotlinowski J, Majka M, Jura J, Miekus K. C-Met as a Key Factor
Responsible for Sustaining Undifferentiated Phenotype and Therapy Resistance in
Renal Carcinomas. Cells. 2019 Mar 22;8(3):272.
139. Bielecka ZF, Czarnecka AM, Solarek W, Kornakiewicz A, Szczylik C. Mechanisms of
Acquired Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors in Clear - Cell Renal Cell Carcinoma
(ccRCC). Current signal transduction therapy. 2014 Dec;8(3):218–28.
140. Adelaiye R, Ciamporcero E, Miles KM, Sotomayor P, Bard J, Tsompana M, et al.
Sunitinib dose escalation overcomes transient resistance in clear cell renal
cell carcinoma and is associated with epigenetic modifications. Molecular cancer
therapeutics. 2015 Feb;14(2):513–22.
141. Houk BE, Bello CL, Poland B, Rosen LS, Demetri GD, Motzer RJ. Relationship between
exposure to sunitinib and efficacy and tolerability endpoints in patients with cancer:
results of a pharmacokinetic/pharmacodynamic meta-analysis. Cancer chemotherapy
and pharmacology. 2010 Jul;66(2):357–71.
142. Hammers HJ, Verheul HM, Salumbides B, Sharma R, Rudek M, Jaspers J, et al.
Reversible epithelial to mesenchymal transition and acquired resistance to sunitinib in
patients with renal cell carcinoma: evidence from a xenograft study. Molecular cancer
therapeutics. 2010 Jun;9(6):1525–35.
143. Huang D, Ding Y, Zhou M, Rini BI, Petillo D, Qian C-N, et al. Interleukin-8 mediates
resistance to antiangiogenic agent sunitinib in renal cell carcinoma. Cancer research.
2010 Feb;70(3):1063–71.
144. Ciamporcero E, Miles KM, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Shen L, Ku S, et al.
Combination strategy targeting VEGF and HGF/c-met in human renal cell
carcinoma models. Molecular cancer therapeutics. 2015 Jan;14(1):101–10.
145. Zhou L, Liu X-D, Sun M, Zhang X, German P, Bai S, et al. Targeting MET and AXL
overcomes resistance to sunitinib therapy in renal cell carcinoma. Oncogene. 2016
May;35(21):2687–97.
146. Rankin EB, Fuh KC, Castellini L, Viswanathan K, Finger EC, Diep AN, et al. Direct
regulation of GAS6/AXL signaling by HIF promotes renal metastasis through SRC and
MET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 2014 Sep;111(37):13373–8.
147. Sennino B, Ishiguro-Oonuma T, Wei Y, Naylor RM, Williamson CW, Bhagwandin V, et
al. Suppression of tumor invasion and metastasis by concurrent inhibition of c-Met
and VEGF signaling in pancreatic neuroendocrine tumors. Cancer discovery. 2012
Mar;2(3):270–87.
148. Shojaei F, Lee JH, Simmons BH, Wong A, Esparza CO, Plumlee PA, et al. HGF/c-Met
acts as an alternative angiogenic pathway in sunitinib-resistant tumors. Cancer
research. 2010 Dec;70(24):10090–100.
149. Peltola KJ, Penttilä P, Rautiola J, Joensuu H, Hänninen E, Ristimäki A, et al. Correlation
of c-Met Expression and Outcome in Patients With Renal Cell Carcinoma Treated With
Sunitinib. Clinical genitourinary cancer. 2017 Aug;15(4):487–94.
150. Choueiri TK, Pal SK, McDermott DF, Morrissey S, Ferguson KC, Holland J, et al. A
phase I study of cabozantinib (XL184) in patients with renal cell cancer. Annals of
oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology. 2014
Aug;25(8):1603–8.
151. Choueiri TK, Escudier B, Powles T, Tannir NM, Mainwaring PN, Rini BI, et al.
Cabozantinib versus everolimus in advanced renal cell carcinoma (METEOR):
final results from a randomised, open-label, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 2016
Jul;17(7):917–27.
152. Lacy SA, Miles DR, Nguyen LT. Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of
Cabozantinib. Clinical pharmacokinetics. 2017 May;56(5):477–91.
153. Choueiri TK, Halabi S, Sanford BL, Hahn O, Michaelson MD, Walsh MK, et al.
Cabozantinib Versus Sunitinib As Initial Targeted Therapy for Patients With Metastatic
Renal Cell Carcinoma of Poor or Intermediate Risk: The Alliance A031203 CABOSUN
Trial. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of
Clinical Oncology. 2017 Feb;35(6):591–7.

119
154. Dvorak HF. Tumors: wounds that do not heal-redux. Cancer immunology research.
2015 Jan;3(1):1–11.
155. Greten FR, Grivennikov SI. Inflammation and Cancer: Triggers, Mechanisms, and
Consequences. Immunity. 2019 Jul 16;51(1):27–41.
156. White DL, Kanwal F, El–Serag HB. Association Between Nonalcoholic Fatty Liver
Disease and Risk for Hepatocellular Cancer, Based on Systematic Review. Clinical
Gastroenterology and Hepatology. 2012 Dec 1;10(12):1342-1359.e2.
157. Pohl C, Hombach A, Kruis W. Chronic inflammatory bowel disease and cancer. Hepato-
gastroenterology. 2000;47(31):57—70.
158. Chandler C, Liu T, Buckanovich R, Coffman LG. The double edge sword of fibrosis in
cancer. Translational Research. 2019;209:55–67.
159. Singh N, Baby D, Rajguru JP, Patil PB, Thakkannavar SS, Pujari VB. Inflammation and
cancer. Annals of African medicine. 2019;18(3):121–6.
160. Tak PP, Firestein GS. NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases. The Journal of
clinical investigation. 2001 Jan;107(1):7–11.
161. Francart M-E, Lambert J, Vanwynsberghe AM, Thompson EW, Bourcy M, Polette M,
et al. Epithelial-mesenchymal plasticity and circulating tumor cells: Travel companions
to metastases. Developmental dynamics : an official publication of the American
Association of Anatomists. 2018 Mar;247(3):432–50.
162. Akkari L, Gocheva V, Kester JC, Hunter KE, Quick ML, Sevenich L, et al. Distinct
functions of macrophage-derived and cancer cell-derived cathepsin Z combine to
promote tumor malignancy via interactions with the extracellular matrix. Genes &
development. 2014 Oct;28(19):2134–50.
163. Grivennikov S, Karin E, Terzic J, Mucida D, Yu G-Y, Vallabhapurapu S, et al. IL-6 and
Stat3 are required for survival of intestinal epithelial cells and development of colitis-
associated cancer. Cancer cell. 2009 Feb;15(2):103–13.
164. Erez N, Truitt M, Olson P, Arron ST, Hanahan D. Cancer-Associated Fibroblasts Are
Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an
NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer cell. 2010 Feb;17(2):135–47.
165. Coffelt SB, Kersten K, Doornebal CW, Weiden J, Vrijland K, Hau C-S, et al. IL-17-
producing γδ T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.
Nature. 2015 Jun;522(7556):345–8.
166. Zhang S, Che D, Yang F, Chi C, Meng H, Shen J, et al. Tumor-associated
macrophages promote tumor metastasis via the TGF-β/SOX9 axis in non-small cell
lung cancer. Oncotarget. 2017 Sep 16;8(59):99801–15.
167. Li M, Cao W, Liu H, Zhang W, Liu X, Cai Z, et al. MCPIP1 down-regulates IL-2
expression through an ARE-independent pathway. PloS one. 2012/11/21.
2012;7(11):e49841–e49841.
168. Matsushita K, Takeuchi O, Standley DM, Kumagai Y, Kawagoe T, Miyake T, et al.
Zc3h12a is an RNase essential for controlling immune responses by regulating
mRNA decay. Nature. 2009 Apr;458(7242):1185–90.
169. Mizgalska D, Wegrzyn P, Murzyn K, Kasza A, Koj A, Jura J, et al. Interleukin-1-inducible
MCPIP protein has structural and functional properties of RNase and participates in
degradation of IL-1beta mRNA. The FEBS journal. 2009 Dec;276(24):7386–99.
170. Jura J, Skalniak L, Koj A. Monocyte chemotactic protein-1-induced protein-1 (MCPIP1)
is a novel multifunctional modulator of inflammatory reactions. Biochimica et
biophysica acta. 2012 Oct;1823(10):1905–13.
171. Liang J, Wang J, Azfer A, Song W, Tromp G, Kolattukudy PE, et al. A novel CCCH-
zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages. The
Journal of biological chemistry. 2008 Mar;283(10):6337–46.
172. Wilamowski M, Gorecki A, Dziedzicka-Wasylewska M, Jura J. Substrate specificity of
human MCPIP1 endoribonuclease. Scientific Reports. 2018;8(1):7381.
173. Xu J, Peng W, Sun Y, Wang X, Xu Y, Li X, et al. Structural study of MCPIP1 N-terminal
conserved domain reveals a PIN-like RNase. Nucleic acids research. 2012/05/04. 2012
Aug;40(14):6957–65.
174. Lin R-J, Chien H-L, Lin S-Y, Chang B-L, Yu H-P, Tang W-C, et al. MCPIP1 ribonuclease
exhibits broad-spectrum antiviral effects through viral RNA binding and degradation.
Nucleic acids research. 2013/01/25. 2013 Mar 1;41(5):3314–26.

120
175. Suzuki HI, Arase M, Matsuyama H, Choi YL, Ueno T, Mano H, et al. MCPIP1
ribonuclease antagonizes dicer and terminates microRNA biogenesis
through precursor microRNA degradation. Molecular cell. 2011 Nov;44(3):424–36.
176. Skalniak L, Mizgalska D, Zarebski A, Wyrzykowska P, Koj A, Jura J. Regulatory
feedback loop between NF-kappaB and MCP-1-induced protein 1 RNase. The FEBS
journal. 2009 Oct;276(20):5892–905.
177. Zhou L, Azfer A, Niu J, Graham S, Choudhury M, Adamski FM, et al. Monocyte
chemoattractant protein-1 induces a novel transcription factor that causes cardiac
myocyte apoptosis and ventricular dysfunction. Circulation research. 2006
May;98(9):1177–85.
178. Liang J, Saad Y, Lei T, Wang J, Qi D, Yang Q, et al. MCP-induced protein 1
deubiquitinates TRAF proteins and negatively regulates JNK and NF-kappaB signaling.
The Journal of experimental medicine. 2010/11/29. 2010 Dec 20;207(13):2959–73.
179. Niu J, Shi Y, Xue J, Miao R, Huang S, Wang T, et al. USP10 inhibits genotoxic NF-κB
activation by MCPIP1-facilitated deubiquitination of NEMO. The EMBO journal.
2013/11/22. 2013 Dec 11;32(24):3206–19.
180. Mino T, Murakawa Y, Fukao A, Vandenbon A, Wessels H-H, Ori D, et al. Regnase-1
and Roquin Regulate a Common Element in Inflammatory mRNAs by Spatiotemporally
Distinct Mechanisms. Cell. 2015 May;161(5):1058–73.
181. Lu W, Ning H, Gu L, Peng H, Wang Q, Hou R, et al. MCPIP1 Selectively Destabilizes
Transcripts Associated with an Antiapoptotic Gene Expression Program in Breast
Cancer Cells That Can Elicit Complete Tumor Regression. Cancer research.
2016/02/01. 2016 Mar 15;76(6):1429–40.
182. Dobosz E, Wilamowski M, Lech M, Bugara B, Jura J, Potempa J, et al. MCPIP-1, Alias
Regnase-1, Controls Epithelial Inflammation by Posttranscriptional Regulation of IL-8
Production. Journal of innate immunity. 2016;8(6):564–78.
183. Lipert B, Wilamowski M, Gorecki A, Jura J. MCPIP1, alias Regnase-1 binds and
cleaves mRNA of C/EBPβ. PloS one. 2017 Mar 22;12(3):e0174381–e0174381.
184. Younce CW, Azfer A, Kolattukudy PE. MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1)-
induced protein, a recently identified zinc finger protein, induces adipogenesis in 3T3-
L1 pre-adipocytes without peroxisome proliferator-activated receptor gamma. The
Journal of biological chemistry. 2009 Oct;284(40):27620–8.
185. Niu J, Wang K, Zhelyabovska O, Saad Y, Kolattukudy PE. MCP-1-induced protein
promotes endothelial-like and angiogenic properties in human bone marrow monocytic
cells. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2013/09/05. 2013
Nov;347(2):288–97.
186. Roy A, Kolattukudy PE. Monocyte chemotactic protein-induced protein (MCPIP)
promotes inflammatory angiogenesis via sequential induction of oxidative stress,
endoplasmic reticulum stress and autophagy. Cellular signalling. 2012
Nov;24(11):2123–31.
187. Jura J, Wegrzyn P, Korostyński M, Guzik K, Oczko-Wojciechowska M, Jarzab M, et al.
Identification of interleukin-1 and interleukin-6-responsive genes in human monocyte-
derived macrophages using microarrays. Biochimica et biophysica acta. 2008;1779(6–
7):383–9.
188. Skalniak L, Koj A, Jura J. Proteasome inhibitor MG-132 induces MCPIP1 expression.
The FEBS journal. 2013/05/07. 2013 Jun;280(11):2665–74.
189. Ruiz-Romeu E, Ferran M, Giménez-Arnau A, Bugara B, Lipert B, Jura J, et al. MCPIP1
RNase Is Aberrantly Distributed in Psoriatic Epidermis and Rapidly Induced by IL-17A.
The Journal of investigative dermatology. 2016 Aug;136(8):1599–607.
190. Monin L, Gudjonsson JE, Childs EE, Amatya N, Xing X, Verma AH, et al.
MCPIP1/Regnase-1 Restricts IL-17A- and IL-17C-Dependent Skin Inflammation.
Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2017 Jan;198(2):767–75.
191. Blazusiak E, Florczyk D, Jura J, Potempa J, Koziel J. Differential regulation by Toll-like
receptor agonists reveals that MCPIP1 is the potent regulator of innate immunity in
bacterial and viral infections. Journal of innate immunity. 2013;5(1):15–23.
192. Kasza A, Wyrzykowska P, Horwacik I, Tymoszuk P, Mizgalska D, Palmer K, et al.
Transcription factors Elk-1 and SRF are engaged in IL1-dependent regulation
of ZC3H12A expression. BMC molecular biology. 2010 Feb;11:14.

121
193. Yao H, Ma R, Yang L, Hu G, Chen X, Duan M, et al. MiR-9 promotes microglial
activation by targeting MCPIP1. Nature communications. 2014 Jul 14;5:4386.
194. Makki MS, Haseeb A, Haqqi TM. MicroRNA-9 promotion of interleukin-6 expression by
inhibiting monocyte chemoattractant protein-induced protein 1 expression in
interleukin-1β-stimulated human chondrocytes. Arthritis & rheumatology (Hoboken,
NJ). 2015 May;67(8):2117–28.
195. Iwasaki H, Takeuchi O, Teraguchi S, Matsushita K, Uehata T, Kuniyoshi K, et al. The
IκB kinase complex regulates the stability of cytokine-encoding mRNA induced
by TLR-IL-1R by controlling degradation of regnase-1. Nature immunology. 2011
Oct;12(12):1167–75.
196. Uehata T, Iwasaki H, Vandenbon A, Matsushita K, Hernandez-Cuellar E, Kuniyoshi K,
et al. Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4(+) helper T cells regulates
immune activation. Cell. 2013 May;153(5):1036–49.
197. Garg A v, Amatya N, Chen K, Cruz JA, Grover P, Whibley N, et al. MCPIP1
Endoribonuclease Activity Negatively Regulates Interleukin-17-Mediated Signaling and
Inflammation. Immunity. 2015/08/25. 2015 Sep 15;43(3):475–87.
198. Bugara B, Konieczny P, Wolnicka-Glubisz A, Eckhart L, Fischer H, Skalniak L, et al.
MCPIP1 contributes to the inflammatory response of UVB-treated keratinocytes.
Journal of dermatological science. 2017 Jul;87(1):10–8.
199. Takaishi M, Satoh T, Akira S, Sano S. Regnase-1, an Immunomodulator, Limits the IL-
36/IL-36R Autostimulatory Loop in Keratinocytes to Suppress Skin Inflammation. Vol.
138, The Journal of investigative dermatology. United States; 2018. p. 1439–42.
200. Konieczny P, Lichawska-Cieslar A, Kwiecinska P, Cichy J, Pietrzycka R, Szukala W, et
al. Keratinocyte-specific ablation of Mcpip1 impairs skin integrity and promotes
local and systemic inflammation. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany).
2019 Dec;97(12):1669–84.
201. Miao R, Huang S, Zhou Z, Quinn T, van Treeck B, Nayyar T, et al. Targeted disruption
of MCPIP1/Zc3h12a results in fatal inflammatory disease. Immunology and cell biology.
2013 May;91(5):368–76.
202. Losko M, Dolicka D, Pydyn N, Jankowska U, Kedracka-Krok S, Kulecka M, et al.
Integrative genomics reveal a role for MCPIP1 in adipogenesis and
adipocyte metabolism. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2020
Dec;77(23):4899–919.
203. Lipert B, Wegrzyn P, Sell H, Eckel J, Winiarski M, Budzynski A, et al. Monocyte
chemoattractant protein-induced protein 1 impairs adipogenesis in 3T3-L1 cells.
Biochimica et biophysica acta. 2014 Apr;1843(4):780–8.
204. Wang K, Niu J, Kim H, Kolattukudy PE. Osteoclast precursor differentiation by MCPIP
via oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and autophagy. Journal of molecular
cell biology. 2011/10/11. 2011 Dec;3(6):360–8.
205. Labedz-Maslowska A, Lipert B, Berdecka D, Kedracka-Krok S, Jankowska U, Kamycka
E, et al. Monocyte Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 (MCPIP1) Enhances
Angiogenic and Cardiomyogenic Potential of Murine Bone Marrow-Derived
Mesenchymal Stem Cells. PloS one. 2015 Jul 27;10(7):e0133746–e0133746.
206. Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, Kolattukudy PE. Monocyte chemotactic
protein (MCP)-1 promotes angiogenesis via a novel transcription factor, MCP-1-
induced protein (MCPIP). The Journal of biological chemistry. 2008/03/24. 2008 May
23;283(21):14542–51.
207. Roy A, Zhang M, Saad Y, Kolattukudy PE. Antidicer RNAse activity of monocyte
chemotactic protein-induced protein-1 is critical for inducing angiogenesis. American
journal of physiology Cell physiology. 2013/09/18. 2013 Nov 15;305(10):C1021–32.
208. Lyu JH, Park D-W, Huang B, Kang SH, Lee SJ, Lee C, et al. RGS2 Suppresses Breast
Cancer Cell Growth via a MCPIP1-Dependent Pathway. Journal of Cellular
Biochemistry. 2015 Feb 1;116(2):260–7.
209. Boratyn E, Nowak I, Karnas E, Ryszawy D, Wnuk D, Polus A, et al. MCPIP1
overexpression in human neuroblastoma cell lines causes cell-cycle arrest by G1/S
checkpoint block. Journal of cellular biochemistry. 2020 Jun;121(5–6):3406–25.
210. Boratyn E, Nowak I, Horwacik I, Durbas M, Mistarz A, Kukla M, et al. Monocyte
Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 Overexpression Modulates Transcriptome,

122
 Including MicroRNA, in Human Neuroblastoma Cells. Journal of cellular biochemistry.
2016 Mar;117(3):694–707.
211. Boudouresque F, Siret C, Dobric A, Silvy F, Soubeyran P, Iovanna J, et al.
Ribonuclease MCPiP1 contributes to the loss of micro-RNA-200 family members
in pancreatic cancer cells. Oncotarget. 2018 Nov;9(89):35941–61.
212. Ligeza J, Marona P, Gach N, Lipert B, Miekus K, Wilk W, et al. MCPIP1 contributes to
clear cell renal cell carcinomas development. Angiogenesis. 2017;20(3).
213. Lichawska-Cieslar A, Pietrzycka R, Ligeza J, Kulecka M, Paziewska A, Kalita A, et al.
RNA sequencing reveals widespread transcriptome changes in a renal carcinoma cell
line. Oncotarget. 2018 Jan 16;9(9):8597–613.
214. Gorka J, Marona P, Kwapisz O, Rys J, Jura J, Miekus K. The anti-inflammatory protein
MCPIP1 inhibits the development of ccRCC by maintaining high levels of tumour
suppressors. European journal of pharmacology. 2020 Sep;888:173591.
215. Calonge E, Alonso-Lobo JM, Escandón C, González N, Bermejo M, Santiago B, et al.
c/EBPbeta is a major regulatory element driving transcriptional activation of
the CXCL12 promoter. Journal of molecular biology. 2010 Feb;396(3):463–72.
216. Pinato DJ, Brown MW, Trousil S, Aboagye EO, Beaumont J, Zhang H, et al. Integrated
analysis of multiple receptor tyrosine kinases identifies Axl as a therapeutic target and
mediator of resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma. British journal of
cancer. 2019/02/15. 2019 Mar;120(5):512–21.
217. Zeng S, Shen WH, Liu L. Senescence and Cancer. Cancer translational medicine.
2018/06/29. 2018;4(3):70–4.
218. Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. MET signalling: principles and functions in
development, organ regeneration and cancer. Nature reviews Molecular cell biology.
2010 Dec;11(12):834–48.
219. Gupta K, Miller JD, Li JZ, Russell MW, Charbonneau C. Epidemiologic and
socioeconomic burden of metastatic renal cell carcinoma (mRCC): a literature review.
Cancer treatment reviews. 2008 May;34(3):193–205.
220. Peycelon M, Hupertan V, Comperat E, Renard-Penna R, Vaessen C, Conort P, et al.
Long-term outcomes after nephron sparing surgery for renal cell carcinoma larger than
4 cm. The Journal of urology. 2009 Jan;181(1):35–41.
221. Rini BI, Atkins MB. Resistance to targeted therapy in renal-cell carcinoma. The Lancet
Oncology. 2009 Oct;10(10):992–1000.
222. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature. 2002 Dec 19;420(6917):860–
7.
223. Takeuchi O. Endonuclease Regnase-1/Monocyte chemotactic protein-1-induced
protein-1 (MCPIP1) in controlling immune responses and beyond. Wiley
interdisciplinary reviews RNA. 2018 Jan;9(1).
224. Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nature
reviews Cancer. 2009 Jun;9(6):400–14.
225. Menon SS, Guruvayoorappan C, Sakthivel KM, Rasmi RR. Ki-67 protein as a tumour
proliferation marker. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry.
2019 Apr;491:39–45.
226. Xie Y, Chen L, Ma X, Li H, Gu L, Gao Y, et al. Prognostic and clinicopathological role
of high Ki-67 expression in patients with renal cell carcinoma: a systematic review and
meta-analysis. Scientific reports. 2017 Mar 13;7:44281.
227. Higgs G, Slack F. The multiple roles of microRNA-155 in oncogenesis. Journal of
clinical bioinformatics. 2013 Sep 28;3(1):17.
228. Zhang L, Wang W, Li X, He S, Yao J, Wang X, et al. MicroRNA-155 promotes tumor
growth of human hepatocellular carcinoma by targeting ARID2. International journal of
oncology. 2016 Jun;48(6):2425–34.
229. Gao Y, Ma X, Yao Y, Li H, Fan Y, Zhang Y, et al. miR-155 regulates the proliferation
and invasion of clear cell renal cell carcinoma cells by targeting E2F2. Oncotarget.
2016 Apr;7(15):20324–37.
230. Albini A, Tosetti F, Benelli R, Noonan DM. Tumor Inflammatory Angiogenesis and Its
Chemoprevention. Cancer Research. 2005 Dec 1;65(23):10637 LP – 10641.
231. Ono M. Molecular links between tumor angiogenesis and inflammation: inflammatory
stimuli of macrophages and cancer cells as targets for therapeutic strategy. Cancer
science. 2008 Aug;99(8):1501–6.

123
232. Mathieu J, Zhang Z, Nelson A, Lamba DA, Reh TA, Ware C, et al. Hypoxia induces re-
entry of committed cells into pluripotency. Stem cells (Dayton, Ohio). 2013
Sep;31(9):1737–48.
233. Lu H, Forbes RA, Verma A. Hypoxia-inducible factor 1 activation by aerobic glycolysis
implicates the Warburg effect in carcinogenesis. The Journal of biological chemistry.
2002 Jun;277(26):23111–5.
234. Petreaca ML, Yao M, Liu Y, Defea K, Martins-Green M. Transactivation of vascular
endothelial growth factor receptor-2 by interleukin-8 (IL-8/CXCL8) is required for IL-
8/CXCL8-induced endothelial permeability. Molecular biology of the cell. 2007/10/10.
2007 Dec;18(12):5014–23.
235. Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal
of clinical investigation. 2009 Jun;119(6):1420–8.
236. Wu C-Y, Tsai Y-P, Wu M-Z, Teng S-C, Wu K-J. Epigenetic reprogramming and post-
transcriptional regulation during the epithelial–mesenchymal transition. Trends in
Genetics. 2012;28(9):454–63.
237. Marona P, Gorka J, Mazurek Z, Wilk W, Rys J, Majka M, et al. MCPIP1 downregulation
in clear cell renal cell carcinoma promotes vascularization and metastatic progression.
Cancer Research. 2017;77(18).
238. Zhuang J, Wu Y, Chen L, Liang S, Wu M, Zhou L, et al. Single-Cell Mobility Analysis of
Metastatic Breast Cancer Cells. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg,
Germany). 2018 Dec;5(12):1801158.
239. Jeon H-M, Lee J. MET: roles in epithelial-mesenchymal transition and cancer
stemness. Annals of translational medicine. 2017 Jan;5(1):5.
240. Kucia M, Reca R, Miekus K, Wanzeck J, Wojakowski W, Janowska-Wieczorek A, et al.
Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve
similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis. Stem cells (Dayton, Ohio).
2005 Aug;23(7):879–94.
241. Copple BL. Hypoxia stimulates hepatocyte epithelial to mesenchymal transition
by hypoxia-inducible factor and transforming growth factor-beta-dependent
mechanisms. Liver international : official journal of the International Association for
the Study of the Liver. 2010 May;30(5):669–82.
242. Zhang Q, Bai X, Chen W, Ma T, Hu Q, Liang C, et al. Wnt/β-catenin signaling enhances
hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via
crosstalk with hif-1α signaling. Carcinogenesis. 2013 May;34(5):962–73.
243. Yang M-H, Wu M-Z, Chiou S-H, Chen P-M, Chang S-Y, Liu C-J, et al. Direct regulation
of TWIST by HIF-1alpha promotes metastasis. Nature cell biology. 2008
Mar;10(3):295–305.
244. Yang M-H, Wu K-J. TWIST activation by hypoxia inducible factor-1 (HIF-1): implications
in metastasis and development. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2008 Jul;7(14):2090–
6.
245. Cheng Z-X, Sun B, Wang S-J, Gao Y, Zhang Y-M, Zhou H-X, et al. Nuclear factor-κB-
dependent epithelial to mesenchymal transition induced by HIF-1α activation in
pancreatic cancer cells under hypoxic conditions. PloS one. 2011;6(8):e23752.
246. Yang Y, Ahn Y-H, Gibbons DL, Zang Y, Lin W, Thilaganathan N, et al. The Notch ligand
Jagged2 promotes lung adenocarcinoma metastasis through a miR-200-dependent
pathway in mice. The Journal of clinical investigation. 2011/03/14. 2011
Apr;121(4):1373–85.
247. Gustafsson M v, Zheng X, Pereira T, Gradin K, Jin S, Lundkvist J, et al. Hypoxia
requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Developmental cell.
2005 Nov;9(5):617–28.
248. Zhang X, Zhao X, Shao S, Zuo X, Ning Q, Luo M, et al. Notch1 induces epithelial-
mesenchymal transition and the cancer stem cell phenotype in breast cancer cells and
STAT3 plays a key role. International journal of oncology. 2015 Mar;46(3):1141–8.
249. Skalniak A, Boratyn E, Tyrkalska SD, Horwacik I, Durbas M, Lastowska M, et al.
Expression of the monocyte chemotactic protein-1-induced protein 1 decreases
human neuroblastoma cell survival. Oncology reports. 2014 May;31(5):2385–92.
250. Yao X, Qian C-N, Zhang Z-F, Tan M-H, Kort EJ, Yang XJ, et al. Two distinct types of
blood vessels in clear cell renal cell carcinoma have contrasting prognostic

124
 implications. Clinical cancer research : an official journal of the American Association
for Cancer Research. 2007 Jan;13(1):161–9.
251. Ciesla M, Marona P, Kozakowska M, Jez M, Seczynska M, Loboda A, et al. Heme
oxygenase-1 controls an HDAC4-MIR-206 pathway of oxidative stress in
rhabdomyosarcoma. Cancer Research. 2016;76(19).
252. Dai JY, DeFrances MC, Zou C, Johnson CJ, Zarnegar R. The Met protooncogene is a
transcriptional target of NF kappaB: implications for cell survival. Journal of cellular
biochemistry. 2009 Aug;107(6):1222–36.
253. Papaetis GS, Syrigos KN. Sunitinib: a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor
in the era of molecular cancer therapies. BioDrugs : clinical immunotherapeutics,
biopharmaceuticals and gene therapy. 2009;23(6):377–89.
254. Wengerodt D, Schmeer C, Witte OW, Kretz A. Amitosenescence and
Pseudomitosenescence: Putative New Players in the Aging Process. Cells. 2019
Nov;8(12).
255. Hwang HS, Go H, Park J-M, Yoon SY, Lee J-L, Jeong SU, et al. Epithelial-
mesenchymal transition as a mechanism of resistance to tyrosine kinase inhibitors in
clear cell renal cell carcinoma. Laboratory Investigation. 2019;99(5):659–70.
256. Dong J, Zhai B, Sun W, Hu F, Cheng H, Xu J. Activation of phosphatidylinositol 3-
kinase/AKT/snail signaling pathway contributes to epithelial-mesenchymal transition-
induced multi-drug resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma cells. PloS one.
2017 Sep 21;12(9):e0185088–e0185088.
257. Mizumoto A, Yamamoto K, Nakayama Y, Takara K, Nakagawa T, Hirano T, et al.
Induction of Epithelial-Mesenchymal Transition via Activation of Epidermal Growth
Factor Receptor Contributes to Sunitinib Resistance in Human Renal Cell Carcinoma
Cell Lines. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2015 Nov
1;355(2):152 LP – 158.
258. Li Y, Chen G, Han Z, Cheng H, Qiao L, Li Y. IL-6/STAT3 Signaling Contributes to
Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma Through Targeting Cancer Stem
Cells. OncoTargets and therapy. 2020 Sep 30;13:9721–30.
259. Tomida C, Yamagishi N, Nagano H, Uchida T, Ohno A, Hirasaka K, et al.
Antiangiogenic agent sunitinib induces epithelial to mesenchymal transition
and accelerates motility of colorectal cancer cells. The journal of medical investigation :
JMI. 2017;64(3.4):250–4.
260. Tian X, Liu Z, Niu B, Zhang J, Tan TK, Lee SR, et al. E-cadherin/β-catenin complex
and the epithelial barrier. Journal of biomedicine & biotechnology. 2011/10/11.
2011;2011:567305.
261. HAYFLICK L. THE LIMITED IN VITRO LIFETIME OF HUMAN DIPLOID CELL
STRAINS. Experimental cell research. 1965 Mar;37:614–36.
262. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LCW, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al.
Oncogene-Induced Senescence Relayed by an Interleukin-Dependent Inflammatory
Network. Cell. 2008 Jun 13;133(6):1019–31.
263. Acosta JC, O’Loghlen A, Banito A, Guijarro M v, Augert A, Raguz S, et al. Chemokine
signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence. Cell. 2008 Jun;133(6):1006–
18.
264. Xu C, Kim N-G, Gumbiner BM. Regulation of protein stability by GSK3 mediated
phosphorylation. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2009 Dec 15;8(24):4032-9

125