Zeynep Özsalman

2100004647
MBG5012- Kök Hücre Biyolojisi
mTOR Sinyal Yolağı
•mTOR yolağı, hücresel büyüme, çoğalma, hayatta kalma ve
metabolizma gibi bir dizi temel hücresel süreci düzenleyen bir
sinyal yoludur. mTOR, bir serin/treonin protein kinazıdır. Hücre
içinde bir dizi sinyal ile aktive olan mTOR, hücresel ortama ve
enerji durumuna duyarlıdır.
•mTOR ve otofaji, birbirlerini negatif olarak düzenler. Aktif
mTOR, otofaji sürecini baskılar, çünkü mTOR'un aktif olması,
hücrenin anabolik faaliyetleri üzerinde baskın bir etkiye sahiptir
ve enerji harcamayı teşvik eder.

Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(3), 1693; https://doi.org/10.3390/ijms23031693

• Besin algılama, stres ve otofaji
ilişkili bir transkripsiyon faktörü
olan TFE3, farelerde saf
pluripotensinin korunmasında kritik
bir rol oynar. Fare epiblastlarının,
primed hESC'lerin ve insan kaynaklı
pluripotent kök hücrelerin
sitoplazmasında bulunur. Ancak
naive mESC'lerin çekirdeğinde
bulunur.

Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka; A developmental framework for induced

pluripotency. Development 1 October 2015; 142 (19): 3274–3285.
doi: https://doi.org/10.1242/dev.114249
Geçici Torin1 tedavisi hPSC'lerin primed durumdan naive pluripotensiteye dönüştürülmesi.

A-H) Belirtilen süreler boyunca 10 μM Torin1 ile tedavi edilen prime edilmiş H9 hESC'lerde TFE3'ün lokalizasyonu.
I-L) Primed H9 (I), (J)'deki protokolle kolonilere (kırmızı oklar) dönüştürüldü. Bunlar toplandı ve pasajlandı (L).
M-T) 2iLI ortamında kültürlenen nH9'da pluripotency işaretleyicilerinin ifadesi.
U-X) 2iLI ortamında, primed H9 farklılaştı (U) ve pluripotency işaretleyicilerinin ifadesini kaybetti.
Y) NH9'un in vitro olarak embriyoid cisimcikler.
Z-AB) NH9'un üç germ katmanının hücrelerine spontan farklılaşması.
AC -AE) Şiddetli kombine bağışıklık yetersizliği olan (SCID) farelerin böbrek kapsüllerine aşılanan saf H9, teratomlar
üretti.
Saf hPSC'lerin hücresel özellikleri.

ROCK inhibitörü yokluğunda (A ve C) veya varlığında (B ve D) %5 O2 (A ve B) veya %21 O2 (C ve D)

içinde kültürlenen saf ve prime edilmiş H9 ve RUES2'nin klonal verimlilikleri .
E) Primed ve naive H9 ve RUES2'nin büyüme eğrisi ve hücre ikiye katlanma süresi.
Primed H9 ve naive H9 hücreleri canlı olarak mitokondriyal iç zar potansiyelini tespit etmek için TMRE (F ve G) veya mitokondriyi görüntülemek için MitoTracker (H
ve I) ile boyandı.
Primed ve naive H9 (J) veya RUES2 (K) hESC'lerde mitokondriyal solunum, bir Seahorse analizöründe ölçüldü (L ve M). OCR, oksijen tüketim oranı; FCCP, karbonil
siyanür p- triflorometoksifenilhidrazon; ATP, adenosin 5'-trifosfat.
Naive hPSC'lerin transkriptomik özellikleri

A) Primed H9 ve nH9'da OCT4 distal arttırıcının (DE) ve proksimal arttırıcının (PE) kullanımı.
B ve C) Naive ve primed H9 ve RUES2'den elde edilen RNA sekans verilerinin insan geç blastosistleri verileri ile PCA (B) ve kümeleme analizi (C).
D) H9 ve RUES2 arasında, diğer naive ve primed hPSC'lerdeki ekspresyon modelleriyle karşılaştırıldığında farklı şekilde
eksprese edilen kodlama genleri.
E) Diğer saf ve astarlanmış hPSC'lerdeki ifade desenleriyle karşılaştırıldığında naive ve primed H9 ve RUES2 arasında
diferansiyel olarak ifade edilen transposable elemanlar.
F ) Naive hücrelerde HERVK ve LTR5_H'ler gibi TE'lerin ekspresyonunun primed hPSC'lerle karşılaştırılması.
Dişi saf hPSC'lerde X ile inaktive edilmiş genlerin reaktivasyonu

Primed RUES2’de (A-D) X kromozomu inaktivasyonu ve naive RUES2'de (E-H) yeniden aktivasyon. XIST RNA FISH ya
da H3K27me3, NANOG ve DAPI ile birleştirilmiş görüntüleri.
 Saf hPSC'lerde DNA hipometilasyonu

A-B‴ ) Primed H9 ve nH9'da 5mC, 5hmC ve DAPI boyaması.

C-F ) Primed ve naive H9 mESC'den izole edilen genomik DNA'daki 5mC ve 5hmC
seviyelerinin nokta lekeleri ve miktarının belirlenmesi.
Saf hPSC'ler tarafından fare embriyolarında üç germ katmanının tamamının olgun insan
hücrelerinin üretilmesi

( A ) GFP etiketli saf iPSC'ler enjekte edilen fare

blastosistlerinden türetilmiş bir fare embriyosunda
büyük miktarlarda GFP + insan hücresi bulundu.
Bu embriyonun iki bölümü, anti-GFP ile DAB ile (B)
veya H&E (C) ile boyandı .
Kimerik embriyonun germ tabakası oluşturma yeterliliği.

G’) hRBC (mezoderm),

H’) Band 3 anyon taşıyıcısı (mezoderm),
I’) AFP (endoderm)
J’) Fotoreseptör işaretleyici Recoveryin (ektoderm).
Özet
Torin1 ile mTOR'un kısa süreli inhibisyonunun, hPSC'leri prime edilmiş
durumdan naive pluripotensiteye dönüştürdüğü bulundu. Naive hPSC'ler, fare
embriyonik kök hücreleriyle aynı durumda tutuldu ve yüksek klonojenlik, hızlı
çoğalma, mitokondriyal solunum, X kromozomu yeniden aktivasyonu, DNA
hipometilasyonu ve insan blastosistlerininkilerle benzerlik paylaşan
transkriptomlar sergiledi. Fare blastosistlerine aktarıldığında, saf hPSC'ler,
büyük miktarda çekirdeği çıkarılmış kırmızı kan hücreleri de dahil olmak üzere
üç germ katmanının tümünde %0,1 ila %4 oranında insan hücresi oluşturdu;
bu, fare embriyolarında hPSC gelişiminde belirgin bir hızlanma olduğunu
ortaya koydu. Torin1, TFE3'ün nükleer translokasyonunu indükledi. Kimera
yetkinliğine sahip saf hPSC'lerin üretimi, memelilerdeki saf pluripotensin bazı
ortak özelliklerini birleştirir ve hayvanlarda insan organı üretimi gibi
uygulamaları mümkün kılabilir.