VIII.

Morfologia, fizjologia, zasady diagnostyki chorobotwórczych pałeczek Klebsiella pneumoniae

Gram-ujemnych Enterobacterales z rodzajów: Escherichia, Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella
morfologia kolonii……………………………………………
Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama. …………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Opis preparatu: …………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… …………………………………...........................................
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Enterobacter cloaceae

morfologia kolonii……………………………………………
Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na podłożach stałych:
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
a. agar z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK)
…………………………………………………………………………
Escherichia coli …………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
typ hemolizy……………………………………………………… ……………………………………........................................
morfologia kolonii…………………………………………… ...
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… b. Podłoże MacConkey’a
…………………………………………………………………………
Escherichia coli
…………………………………………………………………………
………………………………...........................................
morfologia kolonii……………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Proteus vulgaris …………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
typ hemolizy………………………………………………………
………………………………...........................................
morfologia kolonii……………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… Proteus vulgaris
………………………………………………………………………… morfologia kolonii……………………………………………
………………………………........................................... …………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………...........................................
 Klebsiella pneumoniae a b c d e
Eschericha coli
morfologia kolonii…………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
…………………………..………………………………………………
………………………………………………………………………… Klebsiella pneumoniae
………………………………........................................... ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
Enterobacter cloaceae ………………………………………………………………………………………………

morfologia kolonii…………………………………………… Proteus vulgaris

…………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………...........................................
Enterobacter cloaceae
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………

Ćwiczenie 3. Badanie właściwości biochemicznych pałeczek z rodziny Enterobacterales.
a. podłoże Kliglera – badanie zdolności bakterii do rozkładu cukrów (glukoza, laktoza –
gazowo lub bezgazowo) oraz zdolności redukcji tiosiarczanu do siarkowodoru.
b. woda peptonowa z 10% laktozą pod parafiną – badanie zdolności bakterii do
rozkładu laktozy w warunkach beztlenowych.
c. woda peptonowa z tryptofanem – badanie zdolności bakterii do rozkładu tryptofanu
do indolu. Przed odczytem na powierzchnię podłoża nawarstwić 1-2 krople
odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa.
d. woda peptonowa z mannitolem i rurką Durhama – badanie zdolności bakterii do
gazowego rozkładu mannitolu.
e. podłoże Christensena – badanie zdolności bakterii do wytwarzania ureazy i rozkładu
mocznika.
Ćwiczenie 4. Identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacterales z wykorzystaniem testu
API 20 E.
Zasada metody: Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione
substraty. Integralną częścią testu API 20 E jest też test na oksydazę. Substraty zostają
uwodnione poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również
podłoża do hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują
zmiany koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników.
Odczyt testu:
Dodać do mikroprobówek TDA, VP, IND odpowiednie odczynniki wg schematu:
1. Test TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy
kolor wskazuje na reakcję pozytywną.
2. Test VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH).
Odczekać przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję
pozytywną; jeśli po 10 min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za
negatywną.
3. Test IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej
probówce wskazuje na reakcję pozytywną.
Odczytać pozostałe testy wg załączonej instrukcji, a wyniki wpisać do karty odczytu.
Zinterpretować otrzymane wyniki zgodnie z książką kodową lub odczytem z APIweb.
Ćwiczenie 5. Identyfikacja pałeczek z rodziny Enterobacterales z wykorzystaniem testu
ENTERO-Screen.
Zestaw ENTERO-Screen umożliwia przeprowadzenie ośmiu testów biochemicznych mających
na celu zidentyfikowanie bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: glukoza (beztlenowo),
acetoina, fenyloalanina, indol, sacharoza, ureaza, lizyna i ornityna.
Ćwiczenie 6. Wykorzystanie testu IMViC do identyfikacji rodzajowej szczepów z rodziny
Enterobacterales.
I – wytwarzanie indolu – woda peptonowa z tryptofanem – badanie zdolności bakterii do
rozkładu tryptofanu do indolu. Zawarty w podłożu tryptofan za pośrednictwem tryptofanazy
przekształcany jest w indol, skatol, amoniak i kwas pirogronowy. Przed odczytem na
powierzchnię podłoża nawarstwić 1-2 krople odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa. Powstanie
ciemnoczerwonego pierścienia świadczy o rozkładzie tryptofanu.
M – próba MR (methyl red) – za pomocą tej próby określa się typ fermentacji glukozy.
Badane szczepy posiewa się na podłoże Clarka i inkubuje w temperaturze 37°C przez
48-72 godziny. Po tym czasie do hodowli dodaje się kilka kropli czerwieni metylowej.
Hodowle, w których bakterie zakwaszają podłoże do pH poniżej 4,5 przyjmują barwę czerwoną
– wynik (+). Jeżeli hodowla ma pH wyższe niż 4,5 podłoże ma kolor żółty – wynik (-).
V – próba VP (Vogesa-Proskauera) – określanie typu fermentacji glukozy. Kwas
pirogronowy powstający w komórkach bakterii w wyniku rozkładu glukozy może być
przekształcony m.in. w acetoinę. Ta pod wpływem ługu, przy dostępie tlenu utlenia się do
di-acetylu, a związek ten w obecności α-naftolu daje karminowe zabarwienie. Badane szczepy
posiewa się na podłoże Clarka i inkubuje w temperaturze 37°C przez 48-72 godziny. Po tym
czasie do hodowli dodaje się 0,5 ml 40% KOH i 0,2 ml 6% alkoholowego roztworu α-naftolu
i odstawia na 15 minut. Powstanie karminowego zabarwienia świadczy o obecności acetoiny.
C – wykorzystywanie cytrynianu – określa się zdolność bakterii do wykorzystywania węgla Ćwiczenie 7. Oznaczanie mechanizmu oporności ESBL.
z cytrynianu. Cechę tę bada się na podłożu Simmonsa. Zawarty w pożywce błękit
bromotymolowy w środowisku obojętnym ma zielone zabarwienie. Pałeczki, które mają Opis wykonania oznaczenia przy temacie VI.
zdolność wykorzystania tego substratu alkalizują podłoże i zmieniają zabarwienie podłoża na
niebieskie.
……………………………………………..……………………………
I M V C
……………………………………………….…………………………
…………………………………………………………………………
Eschericha
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………...........................................
………………………………………………………………………………………………

Klebsiella
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………

Proteus Ćwiczenie 8. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości.

………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
Wykonanie odczytu: Na podłożach przeźroczystych, odczytać średnicę zahamowania wzrostu
wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z
………………………………………………………………………………………………
boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu.
………………………………………………………………………………………………
Na podłożach nieprzeźroczystych – oświetlić płytkę światłem padającym z boku pod kątem 45°
i odczytać strefę zahamowania wzrostu (nie odczytywać strefy hemolizy).
Enterobacter
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………

Serratia
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
Wynik badania lekowrażliwości dla szczepu …………………………………………...

Strefa zahamowania
Antybiotyk Interpretacja wyniku
wzrostu w mm

Wnioski:

……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………