Pharmaceuticals from Microbes The

Bioengineering Perspective Divya

Arora
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/pharmaceuticals-from-microbes-the-bioengineering-p
erspective-divya-arora/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Pharmaceuticals from Microbes Impact on Drug Discovery

Divya Arora

https://textbookfull.com/product/pharmaceuticals-from-microbes-
impact-on-drug-discovery-divya-arora/

From the Rat Race to Financial Freedom 2nd Edition

Manoj Arora

https://textbookfull.com/product/from-the-rat-race-to-financial-
freedom-2nd-edition-manoj-arora/

Igniting Innovation: The Tata Way Ravi Arora

https://textbookfull.com/product/igniting-innovation-the-tata-
way-ravi-arora/

Microbial Technology for the Welfare of Society Pankaj

Kumar Arora

https://textbookfull.com/product/microbial-technology-for-the-
welfare-of-society-pankaj-kumar-arora/
Introduction to Optimum Design, Fourth Edition Arora

https://textbookfull.com/product/introduction-to-optimum-design-
fourth-edition-arora/

Delhi Riots 2020 An Untold Story Monika Arora

https://textbookfull.com/product/delhi-riots-2020-an-untold-
story-monika-arora/

101 algorithms questions you must know Arora A

https://textbookfull.com/product/101-algorithms-questions-you-
must-know-arora-a/

Good Manufacturing Practices for Pharmaceuticals Graham

P. Bunn (Editor)

https://textbookfull.com/product/good-manufacturing-practices-
for-pharmaceuticals-graham-p-bunn-editor/

Bioengineering for surgery : the critical engineer-

surgeon interface 1st Edition Drake

https://textbookfull.com/product/bioengineering-for-surgery-the-
critical-engineer-surgeon-interface-1st-edition-drake/
Environmental Chemistry for a Sustainable World

Divya Arora
Chetan Sharma
Sundeep Jaglan
Eric Lichtfouse Editors

Pharmaceuticals
from Microbes
The Bioengineering Perspective
Environmental Chemistry for a Sustainable
World

Series Editors
Eric Lichtfouse, Aix Marseille Univ, CNRS, IRD, INRA, Coll France, CEREGE,
Aix en Provence, France
Jan Schwarzbauer, RWTH Aachen University, Aachen, Germany
Didier Robert, CNRS, European Laboratory for Catalysis and Surface Sciences,
Saint-Avold, France
 Other Publications by the Editors

Books
Environmental Chemistry
http://www.springer.com/978-3-540-22860-8

Organic Contaminants in Riverine and Groundwater Systems

http://www.springer.com/978-3-540-31169-0

Sustainable Agriculture
Volume 1: http://www.springer.com/978-90-481-2665-1
Volume 2: http://www.springer.com/978-94-007-0393-3

Book series
Environmental Chemistry for a Sustainable World
http://www.springer.com/series/11480

Sustainable Agriculture Reviews

http://www.springer.com/series/8380

Journals
Environmental Chemistry Letters
http://www.springer.com/10311

More information about this series at http://www.springer.com/series/11480

Divya Arora • Chetan Sharma • Sundeep Jaglan
Eric Lichtfouse
Editors

Pharmaceuticals from
Microbes
The Bioengineering Perspective
Editors
Divya Arora Chetan Sharma
Indian Institute of Integrative Medicine Guru Angad Dev Veterinary and Animal
CSIR Science University
Jammu, India Ludhiana, Punjab, India

Sundeep Jaglan Eric Lichtfouse

Indian Institute of Integrative Medicine Aix Marseille University
CSIR CNRS, IRD, INRA, Coll France
Jammu, India CEREGE, Aix en Provence, France

ISSN 2213-7114     ISSN 2213-7122 (electronic)

Environmental Chemistry for a Sustainable World
ISBN 978-3-030-01880-1    ISBN 978-3-030-01881-8 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-030-01881-8

Library of Congress Control Number: 2018963747

© Springer Nature Switzerland AG 2019

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of
the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation,
broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information
storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology
now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication
does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant
protective laws and regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book
are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the
editors give a warranty, express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors
or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims
in published maps and institutional affiliations.

This Springer imprint is published by the registered company Springer Nature Switzerland AG
The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland
Preface

The important thing in science is not so much to obtain new facts as to discover new ways
of thinking about them
Sir William Bragg, Nobel Prize in Physics

Microbiology has made a huge contribution to the pharmaceutical industry. Indeed,

microbes have been used to produce antibiotics, enzymes, polysaccharides, pro-
teins, vitamins and nucleotides. Further, with the advent of new approaches and
modern techniques, pharmaceutical industries are looking for innovative solutions,
such as bioengineering, to improve the quality of products and enhance productiv-
ity. Bioengineering is a discipline that applies engineering principles of design and
analysis to biological systems and biomedical technologies. Bioengineering con-
cepts can be applied to the pharmaceuticals as well as to microbes to generate better
quality products. This book presents recent advances in microbial technology with
emphasis on drug delivery strategies for healthcare products, vaccine delivery, bio-
transformation and processing of biopharmaceuticals.
The first chapter by Ageitos and Garcia-Fuentes reviews innovative drug delivery
strategies for microbial healthcare products (Fig. 1) with improved pharmacological
effects and characteristics, as compared to classical formulations. Kumar then
explores live-attenuated bacterial vector applications in the delivery of vaccine anti-
gens to the mucosal immune system, DNA vaccine and immunotherapy and the
mechanism of immune responses elicited by live-attenuated bacterial vector-based
vaccines in Chap. 2. In Chap. 3, Kumar et al. review the preparation methods of
polylactide/polylactide-co-glycolide delivery-based particles, their properties as
carriers of bioactive molecules and applications of delivery systems based on poly-
meric particles against microbes.
Giorgiana discusses drug delivery systems based on pullulan and derivatives and
structured function of therapeutic effects of drugs in Chap. 4. Parajuli et al. analyse
biotransformation approaches to produce engineered molecules using microbial
platforms, with focus on microbial modification of flavonoids, in Chap. 5. Mehta
reviews the upstream process and the three chronological steps – initial recovery,
purification and polishing – involved in downstream processing of biopharmaceuti-
cals, in Chap. 6. Finally, Shrestha et al. review the fermentation, engineering

v
vi Preface

Fig. 1 Nanocarriers for innovative drug delivery. Blue areas are hydrophilic; yellow areas are
hydrophobic. In Chap. 1 by Ageitos and Garcia-Fuentes

r­ egulatory genes at the molecular level, with focus on doxorubicin and daunorubi-
cin biosynthesis in Streptomyces peucetius, in Chap. 7.
It was our pleasure to interact with all the authors, and we wish to express our
gratitude to all the contributors for accepting our invitation. We greatly appreciate
their commitment and contribution in shaping the scattered information from
diverse fields into their chapters and incorporating the editorial suggestions to pro-
duce this venture.
We also extend our thanks to the Springer Nature team for their generous coop-
eration at every stage of the book production. We hope that the book will serve to
update the knowledge and will be helpful to the students, professors, scientists and
researchers who have focus on drug discovery. Lastly, we acknowledge God and our
family members, who keep motivating and provided all the channels to work in
cohesion and coordination right from the conception of the idea to the finalization
of the book.

Jammu, India Divya Arora

Ludhiana, Punjab, India Chetan Sharma
Jammu, India Sundeep Jaglan
Aix en Provence, CEREGE, France Eric Lichtfouse
Contents

1 Advances in Drug Delivery Strategies for Microbial

Healthcare Products ��������������������������������������������������������������������������������   1
Jose Manuel Ageitos and Marcos Garcia-Fuentes
2 Live-Attenuated Bacterial Vectors for Delivery of Mucosal
Vaccines, DNA Vaccines, and Cancer Immunotherapy ������������������������ 39
Sudeep Kumar
3 Poly-lactide/Poly-lactide-co-glycolide-Based Delivery
System for Bioactive Compounds Against Microbes ���������������������������� 75
Robin Kumar, Divya Jha, and Amulya K. Panda
4 Drug Delivery Systems Based on Pullulan Polysaccharides
and Their Derivatives ������������������������������������������������������������������������������ 99
Anca Giorgiana Grigoras
5 Microbial Modifications of Flavonols ������������������������������������������������������ 143
Prakash Parajuli, Biplav Shrestha, Jae Kyung Sohng,
and Ramesh Prasad Pandey
6 Downstream Processing for Biopharmaceuticals Recovery ������������������ 163
Anu Mehta
7 Engineering Streptomyces peucetius for Doxorubicin
and Daunorubicin Biosynthesis �������������������������������������������������������������� 191
Biplav Shrestha, Anaya Raj Pokhrel, Sumangala Darsandhari,
Prakash Parajuli, Jae Kyung Sohng, and Ramesh Prasad Pandey

Index�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 211

vii
Contributors

Jose Manuel Ageitos Centre for Research in Molecular Medicine and Chronic
Diseases (CiMUS) and Department of Pharmacology, Pharmacy and Pharmaceutical
Technology, University of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain
Sumangala Darsandhari Department of Life Science and Biochemical
Engineering, Sun Moon University, Chungnam, Republic of Korea
Marcos Garcia-Fuentes Centre for Research in Molecular Medicine and Chronic
Diseases (CiMUS) and Department of Pharmacology, Pharmacy and Pharmaceutical
Technology, University of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain
Anca Giorgiana Grigoras Laboratory of Natural Polymers, Bioactive and
Biocompatible Materials, “Petru Poni” Institute of Macromolecular Chemistry,
Iassy, Romania
Divya Jha Product Development Cell-II, National Institute of Immunology, New
Delhi, India
Robin Kumar Product Development Cell-II, National Institute of Immunology,
New Delhi, India
Sudeep Kumar Department of Immunology and Microbial Diseases, Albany
Medical Center, Albany, NY, USA
Anu Mehta Department of Biochemistry, Kurukshetra University, Kurukshetra,
Haryana, India
Amulya K. Panda Product Development Cell-II, National Institute of Immunology,
New Delhi, India
Ramesh Prasad Pandey Department of Life Science and Biochemical Engineering,
Sun Moon University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea
Department of Pharmaceutical Engineering and Biotechnology, Sun Moon
University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea

ix
x Contributors

Prakash Parajuli Department of Life Science and Biochemical Engineering, Sun

Moon University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea
Anaya Raj Pokhrel Department of Life Science and Biochemical Engineering,
Sun Moon University, Chungnam, Republic of Korea
Biplav Shrestha Department of Life Science and Biochemical Engineering, Sun
Moon University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea
Jae Kyung Sohng Department of Life Science and Biochemical Engineering, Sun
Moon University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea
Department of Pharmaceutical Engineering and Biotechnology, Sun Moon
University, Asan-si, Chungnam, Republic of Korea
About the Editors

Divya Arora is working in Microbial Biotechnology

Division at CSIR-Indian Institute of Integrative
Medicine, Jammu. She has obtained her Ph.D. from the
Academy of Scientific and Innovative Research
(AcSIR) at the CSIR-Indian Institute of Integrative
Medicine, Jammu. She has received several interna-
tional awards such as the Raman Charpak Fellowship
from the Indo-French Centre for the Promotion of
Advanced Research (IFCPAR), India; a travel award
for attending the 4th AIST International Imaging
Workshop at the National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology (AIST), Japan; and
the DST-DFG Award for participation in the 68th
Lindau Nobel Laureate Meeting, Lindau, Germany.
Her current research interests are isolation of secondary
metabolites from microbial co-­culture, natural product
chemistry and nanocarrier-mediated drug delivery.

Chetan Sharma is working as Research Associate at

the College of Dairy Science and Technology, Guru
Angad Dev Veterinary and Animal Science University,
Ludhiana, India. He has completed his M.Sc. and Ph.D.
in Microbiology from Kurukshetra University,
Kurukshetra. He has published several research papers
of international repute, serves as a reviewer for differ-
ent journals and has submitted many nucleotide
sequences in NCBI database. He has also edited and
published one book at Nova Science Publishers. His
present research interest covers the isolation of bioac-
tive compounds from natural sources, medical microbi-
ology, antimicrobial resistance (AMR) and probiotics.

xi
xii About the Editors

Sundeep Jaglan is working as Scientist in the

Microbial Biotechnology Division at the CSIR-Indian
Institute of Integrative Medicine, Jammu, India. Dr.
Jaglan graduated in Biotechnology and obtained his
Ph.D. from Guru Jambheshwar University of Science
and Technology, Hisar, India. He has joined CSIR-IIIM
Jammu in 2008 and has research experience of more
than 10 years. He has to his credit several international
publications and patents. Dr. Jaglan is member of vari-
ous professional bodies and reviewer for prestigious
journals. His research interests include the diversifica-
tion of secondary metabolites in microbes via elicita-
tion and co-culture-­based approaches. With the mandate
of drug discovery, his focus is to obtain microbial natu-
ral products of bioactive potential.
https://www.researchgate.net/profile/Sundeep_Jaglan
https://orcid.org/0000-0002-5691-7980

Eric Lichtfouse, 58, is a Biogeochemist at the

University of Aix-Marseille, France. He is the inventor
of carbon-13 dating and author of the book Scientific
Writing for Impact Factor Journals. He is Chief Editor
and founder of Environmental Chemistry Letters,
Sustainable Agriculture Reviews and Environmental
Chemistry for a Sustainable World (Springer Nature),
and Publier La Science (INRA). His actual research
interests include soil carbon sequestration and temporal
pools of individual substances in complex media.
https://cv.archives-ouvertes.fr/eric-lichtfouse
Chapter 1
Advances in Drug Delivery Strategies
for Microbial Healthcare Products

Jose Manuel Ageitos and Marcos Garcia-Fuentes

Contents
1.1 Introduction    2
1.2 Anti-inflammatory and Immunosuppressant Drugs    5
1.2.1 Cyclosporine A    5
1.2.2 Tacrolimus    7
1.3 Cardiovascular Protective Drugs    9
1.3.1 Lovastatin    9
1.3.2 Simvastatin 10
1.4 Antitumoral Drugs 11
1.4.1 Aclarubicin 11
1.4.2 Bleomycin 12
1.4.3 Doxorubicin 13
1.4.4 Mithramycin 14
1.4.5 Mitomycin C 16
1.4.6 Paclitaxel 17
1.4.7 Prodigiosin 19
1.5 Antibiotic Drugs 20
1.5.1 Amphotericin B 20
1.5.2 Gentamicin 21
1.5.3 Polymyxin B 23
1.5.4 Nisin 24
1.5.5 Vancomycin 25
1.6 Probiotic Microorganisms 27
1.7 Conclusion 28
References 29

Abstract Biomacromolecules produced by microorganisms have been employed

in healthcare ever since ancient times as part of fermented products or natural rem-
edies, but from the discovery of penicillin in 1928 by Alexander Fleming, it is

J. M. Ageitos (*) · M. Garcia-Fuentes

Centre for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CiMUS) and Department
of Pharmacology, Pharmacy and Pharmaceutical Technology, University of Santiago de
Compostela, Santiago de Compostela, Spain
e-mail: josemanuel.ageitos@usc.es

© Springer Nature Switzerland AG 2019 1

D. Arora et al. (eds.), Pharmaceuticals from Microbes,
Environmental Chemistry for a Sustainable World 26,
https://doi.org/10.1007/978-3-030-01881-8_1
2 J. M. Ageitos and M. Garcia-Fuentes

impossible to conceive medicine without microbial products. In addition to antibiot-

ics, microorganisms produce secondary metabolites currently employed as anti-­
inflammatory, immunosuppressant, and antitumoral drugs, among others. As with
any other well-established drugs, undesirable side effects may occur with these
compounds due to excessive systemic drug concentrations, and their pharmacologi-
cal activity can be lost by the development of resistance in the target cells. Besides,
many microbial drugs have intrinsic physicochemical properties that limit their
application in healthcare such as low aqueous solubility, low bioavailability, acute
toxicity, and fast systemic and pre-systemic degradation.
Here we review the critical aspects of innovative strategies for microbial prod-
ucts of high interest for academia and healthcare industry. In order to improve some
of the current drug limitations, researchers have explored multiple advanced formu-
lation approaches based on disruptive technologies. By means of new biomaterials
and nanotechnology, it is possible to maximize the possibilities for functionaliza-
tion and interfacing with the biological environment, a characteristic that leads to
unique properties as drug delivery carriers. These approaches have resulted in
improved pharmacological effects and pharmaceutical characteristics as compared
to classical formulations, representing the dawn of a new era in microbial healthcare
products.

Abbreviations

FDA Food and Drug Administration

GRAS generally recognized as safe
MRSA methicillin-resistant S. aureus
PEG poly(ethylene glycol)
PEGylated functionalized with PEG
PLGA poly(lactic-co-glycolic acid)
TAT peptide transactivator of transcription of human immunodeficiency virus
(HIV1)
VRE vancomycin-resistant enterococci
VRSA vancomycin-resistant S. aureus

1.1 Introduction

Microorganisms are a fundamental source of products for human purposes. On the

one hand, primary metabolites, such as alcohols, vitamins, amino acids, enzymes,
or organic acids, are employed as nutritional supplements and as raw material for
industrial biotransformation. On the other hand, secondary metabolites are employed
by pharmaceutical industry to produce active pharmaceutical ingredients widely
used in healthcare. Only related to healthcare industry, the estimated market of
1 Advances in Drug Delivery Strategies for Microbial Healthcare Products 3

microbes and microbial products is estimated as $187.8 billion by 2020 (Singh et al.
2017a). As part of these active pharmaceutical ingredients, it can be included anti-­
inflammatory, antitumoral, and antibiotic drugs, among others.
However, the applicability of these drugs can be hindered by their intrinsic phys-
icochemical properties, such as limited solubility in aqueous environment, reduced
intestinal absorption, enzymatic degradation, or interspecific metabolization, and
thus can easily conduct to a lack of efficiency or acute toxicity induced by the
increase of dose. The conventional approach consists of solubilization by means of
surfactants for producing suspensions of these compounds; however, biocompatible
surfactants are uneconomic and difficult to synthesize and often unable to eliminate
the toxicity or improve the absorption. Another concern for conventional formula-
tions, which makes well-established treatments into obsolete, is the emergence of
antibiotic resistance in microorganism (Kalhapure et al. 2015). Antibiotics have
been widely employed in medicine since the 1940s; however, due to their prolonged
use and abuse, we have conducted the selection of resistant strains of microorgan-
isms (de Miguel et al. 2016; Ageitos et al. 2017). Nowadays, infections with multi-
resistant microorganisms are becoming the main issue in nosocomial treatments
(Inweregbu et al. 2005; WHO 2014). Other than searching for new drugs, research-
ers are focusing attention in drugs that, while having high antibiotic activity, have
high toxicity. Those drugs have not been extensively employed and, therefore, less
prone to resistance selection. It is required the reformulation of these drugs to find
a therapeutic window where its toxicity is tolerable while maintaining their ­antibiotic
activity. This dichotomy is usually solved with a precise controlled release or using
specific carriers to bring the active pharmaceutical ingredients close to where they
are needed and, in an ideal case, both solutions (Wong and Choi 2015). The con-
trolled release of drugs was classically conducted by the design of drug delivery
systems which allow the sustainable liberation of compounds based on the proper-
ties and inner structure of the materials. With the advances in material science,
nowadays it is possible to design “smart” drug delivery systems with stimuli-­
responsive characteristics (Liu et al. 2016).
Nanotechnology is one of the best alternatives for the design of new formulations
to improve existing therapies. This emerging area of medicine is based on the use of
nanometric carries to significantly reduce the side effects of nonspecific treatments.
Drug delivery systems can be classified regarding their properties such as size, com-
position, structure, and physical properties. There is some controversy regarding the
size definition. Nanocarriers are defined materials in nanometric scale (10−9 m);
however, in biological sciences the concept is dynamic, referring to particles smaller
than 500 nm; in the case of microcarriers, the size spans between 0.1 and 100 μm.
Regarding composition, the classification is clearer; thereby, metallic devices can be
composed by pure metals (usually gold or silver) or metal oxides [iron(II, III)oxide
(Fe3O4), gadolinium(III) oxide (Gd2O3), or titanium dioxide (TiO2)]. Polymeric
devices are generally composed by a polydisperse synthetic polymer, such as
poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly(lactic acid), poly(ethylene glycol)
(PEG), methoxy poly(ethylene glycol), poly(vinyl alcohol), and poly(vinyl acetate),
among others. Dendrimers are a special case of polymeric devices where the poly-
mer have a low dispersion, being formed of repetitively branched molecules, such
4 J. M. Ageitos and M. Garcia-Fuentes

as poly(propylene imine). Natural polysaccharides, such as chitosan, alginate, hyal-

uronic acid, starch, or dextran, are employed in formulations, as much as core or
covering of polymeric devices. Both metallic and polymeric devices are generally
named particles and, depending on size, as nanoparticles or microparticles; while
amphipathic polymers produce micelles, lipid-based devices can be composed by a
mixture of lipids or oils with emulsifiers in order to produce different structures
such as nanoemulsions, lipospheres, solid lipid particles, micelles, liposomes, nano-
structured lipid carriers, and cubosomes, among others. The main difference
between those devices is the organization of the hydrophobic and hydrophilic
regions (Fig. 1.1).
Furthermore, nanocarriers can be functionalized with biomarkers which allow
the active delivery of the drugs by targeting ligands specific for a cell surface recep-
tor molecule (Wong and Choi 2015). This mechanism allows a tight adhesion of the
nanocarrier to the targeted cell surface, which may lead either to endocytosis or the
drug release induced by other factors, such as pH, temperature, redox-responsible,
or the presence of enzymes (Liu et al. 2016). The design of drug nanocarriers must
be done taking into account some critical parameters, such as size, shape, or surface
charge, the biological response they induce, and the employed administration route
(Ageitos et al. 2016).
Examples of succeeding drug nanocarriers are the liposomal formulations
approved by the US Food and Drug Administration (FDA). Doxil®/CaelyxTM, a
PEGylated (functionalized with polyethylene glycol) liposomal formulation of
doxorubicin developed by Janssen, initially approved by the FDA for Kaposi’s sar-
coma treatment in 1995, was later approved for ovarian cancer (2005) and multiple
myeloma (2008). This formulation improved site-directed delivery to disease and
decreased systemic toxicity of free doxorubicin. Also for Kaposi’s sarcoma treat-
ment, in 1996, was approved DaunoXome® (Galen), a liposomal formulation of

Fig. 1.1 Schematic representation of different nanocarriers described in this chapter. Blue areas
represent hydrophilicity and yellow hydrophobicity
1 Advances in Drug Delivery Strategies for Microbial Healthcare Products 5

daunorubicin, which showed an increased delivery to tumor site and lowered the
systemic toxicity arising from side effects of daunorubicin. The antifungal drug
amphotericin B was also approved in two liposome formulations, Abelcet® (Sigma-­
tau) and AmBisome® (Gilead Sciences), both showing a reduction in the toxicity in
comparison to free compound. Nowadays there are several microbial drugs based
on nanomedicine in clinical trials, and it is expected that those numbers increase
soon (Egusquiaguirre et al. 2012; Anselmo and Mitragotri 2016; Bobo et al. 2016;
Anselmo et al. 2017).
In the current chapter, we are going to present recent formulations of well-­
established microbial drugs that can serve as example of the different ongoing
approaches, highlighting the critical aspects as compared to classical formulations.
It must be considered that the main part of the discussed works are only proofs of
concept and will take time to reach the mark, considering that, as explained by Liu
and collaborators, “these nanoplatforms are lack of standardized manufacturing
method, toxicity assessment experience, and clear relevance between the pre-­
clinical and clinical studies, resulting in the huge difficulties to obtain regulatory
and ethics approval” (Liu et al. 2016). However, authors consider that the works
exposed here are an excellent point of reference and a valuable font of knowledge
for “advances in drug delivery strategies for microbial healthcare products.”

1.2 Anti-inflammatory and Immunosuppressant Drugs

1.2.1 Cyclosporine A

Cyclosporine A (Fig. 1.2) is a non-ribosomally synthesized cyclic peptide isolated

from Tolypocladium inflatum and is widely used for treating psoriasis and arthritis
due its immunosuppressant effect (Thell et al. 2014). Some of the limitations of
cyclosporine A are its low bioavailability (Bravo González et al. 2002) derived from
poor aqueous solubility and low intestinal permeability (Italia et al. 2007).
Cyclosporine A has a narrow therapeutic window where nephrotoxicity, hepatotox-
icity, and neurotoxicity have been reported (De Clercq and Holý 2005; Zhang et al.
2013). For these reasons, cyclosporine A is considered a model peptide in nano-
medicine, and multiple formulations have been proposed for cyclosporine A deliv-
ery through a variety of routes (Wang et al. 2014). Here we will cover the major
examples, and we direct the readers seeking further details to a recent review by
Guada et al. (Guada et al. 2016b).
PLGA nanoparticles and microspheres have been developed for increasing the
stability during the storage of cyclosporine A (Chacón et al. 1999). Orally adminis-
tered cyclosporine A-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles
showed a cyclosporine A controlled release for 5 days and lower nephrotoxicity than
current cyclosporine A formulations (Sandimmune Neoral®) (Italia et al. 2007).
Similar results were obtained by Guada and collaborators with cyclosporine A lipid
nanoparticles, where these nanoparticles had improved pharmacological response
1 Advances in Drug Delivery Strategies for Microbial Healthcare Products 17

Mitomycin C/10-hydroxycamptothecin-loaded folic acid micelles induced death of

tumor cells in vitro and produced the inhibition of growth of tumor tissue in vivo,
with low toxicity (Lin et al. 2015). Similar results were obtained with chemical
analogs of folic acid such as methotrexate (an inhibitor of dihydrofolate reductase).
PEGylated chitosan nanoparticles loaded with mitomycin C/methotrexate were
internalized by folic acid receptor-mediated endocytosis and were effective in vivo
and in vitro due to the synergic effect of these two drugs (Jia et al. 2014a).
In addition to systemic administration, mitomycin C can be delivered topically
using formulations such as the recently reported mitomycin C imprinted
poly(2-­
­ hydroxyethyl methacrylate-N-methacryloyl-L-glutamic acid) cryogel mem-
branes (Öncel et al. 2017). Cryogel membranes showed low cytotoxicity and released
mitomycin C following a non-Fickian diffusion with an initial burst release phase. For
intravesical topical treatment focused on bladder tumors, Sun and collaborators pro-
posed mitomycin C loaded onto an in-situ depot of chitosan, β-glycerophosphate, and
Fe3O4 magnetic nanoparticles (Sun et al. 2016). Fe3O4-mitomycin C-chitosan/β-­-
glycerophosphate allowed a sustainable release of mitomycin C in vitro and in vivo,
increasing its retention time in the bladder (up to 72 h). Fe3O4-mitomycin C-chitosan/β-
glycerophosphate increased the survival rate and inhibited the growth of bladder tumors
during the in vivo tests, where they observed an improvement in tumor cell apoptosis
as compared with conventional administration of mitomycin C (Sun et al. 2016).

1.4.6 Paclitaxel

Paclitaxel (Fig. 1.11) is an anticancer drug isolated in the late 1960s from the west-
ern yew, Taxus brevifolia; however, the natural abundance of paclitaxel in the bark
of yew is only 0.01%–0.05%. Thus, the search for alternative sources of paclitaxel
has been a main issue in the past decades. The isolation of several paclitaxel-­
producing endophytic fungi, such as Taxomyces andreanae or Pestalotiopsis guepi-
nii, has opened the door to a sustainable paclitaxel source (Zhou et al. 2010). In this
way, although the quest is still ongoing (Li et al. 2014; Ismaiel et al. 2017), nowa-
days paclitaxel can be considered as a drug with microbial origin. Paclitaxel has
been approved in many countries for the treatment of ovarian and breast cancers. Its
mechanism of action is based on arresting the cell cycle by disrupting the dynamic
equilibrium within the microtubule system, inhibiting cell replication. Even though
paclitaxel should be functional in most cancer cells, the drug has important solubil-
ity problems and side effects and might lack efficacy against some resistant cancers
(Steffes et al. 2017).
Traditional formulation of paclitaxel (Taxol®) produces several side effects such
as hypersensitivity, nephrotoxicity, neurotoxicity, vasodilatation, labored breathing,
lethargy, and hypotension. In order to improve these main issues, several new for-
mulations have been investigated (Nehate et al. 2014). For instance, Danhier and
collaborators proposed paclitaxel-loaded polyethylene glycol (PEG)-functionalized
Another random document with
no related content on Scribd:
—Zeker, mijnheer, antwoordde de man gedienstig. Gij kunt goede
auto’s huren in een garage op den hoek van den Boulevard
Gambetta en de Place Voltaire, op ongeveer twintig minuten loopen
hier vandaan, maar als gij nog een kwartier kunt wachten, dan kunt
gij u die kosten besparen, want gij zijt hier slechts tien minuten gaans
van de halte van Issy van den ceintuur-spoorweg, die u tot in het
hartje van Parijs brengt.

—Zooveel te beter! hernam Raffles, dan zullen wij met den trein
gaan.

Hij betaalde, en een oogenblik later wandelden de drie mannen langs

den Boulevard Rouget de Lille, die het vliegveld van het
manoeuvreterrein scheidt.

Na tien minuten te hebben geloopen traden zij het kleine haltestation

binnen en vijf minuten later kwam de trein aanrijden, die hen door de
Porte du Bas Meudon Parijs binnenvoerde.

Zij stapten aan het station van de Champ de Mars uit.

Het was toen kwart over negenen, en de grootste drukte van het
coiffeur- en het winkelpersoneel, dat zich naar zijn betrekking begaf,
was reeds gedaan.

—Nu zullen wij maar eerst eens omzien naar een goed hotel, stelde
Raffles voor.

—Ik weet een voortreffelijk hotel maar dat ligt in Londen aan de
Readsing-Street, zeide Charly droogjes, die zich nog volstrekt niet
kon vereenigen met het denkbeeld, dat hij zich in Parijs bevond om
aandeel te nemen in een hoogst gevaarlijk avontuur.

Raffles liet een kort lachje hooren en zeide:

—Naar het schijnt ben je met mijn plannetje niet zeer ingenomen,
mijn jongen.

—Je plannetje, herhaalde Charly verontwaardigd, waarom noem je

het niet liever een uitspanning, iemand die voornemens was, zijn
heele verdere leven in de gevangenis door te brengen zou
onmogelijk anders kunnen handelen.

—Kom, kom—je bent een zwartkijker, kwam Raffles kalm, je zoudt in

staat zijn mij mijn vermaak te [21]bederven. Ik zeg je, dat alles
gesmeerd zal loopen—als wij het geluk althans aan onze zijde
hebben.

—En als het geluk eens ditmaal niets van ons weten wil, drong
Charly aan.

—Wel, dan geven wij de partij eenvoudig verloren en verwijderen

ons.

—Je kunt er gemakkelijk over spreken, zeide Charly schamper; het is

maar de vraag of men ons daartoe de gelegenheid zal laten.

—O, wij zullen die gelegenheid wel scheppen! kwam Raffles,

eenigszins ongeduldig, en laat verdere opmerkingen nu maar
achterwege, want er zal geen rekening mee worden gehouden.

Charly pruttelde iets voor zich heen, dat onverstaanbaar was in het
straatgewoel, en schikte zich in het onvermijdelijke.

Raffles had het krankzinnige plan nu eenmaal opgevat—de treurige

gevolgen zouden voor zijn rekening zijn.

—Laat ons nu eens zien waar de koning logeert, begon Raffles

weder, alsof Charly in het geheel niets gezegd had. Men heeft hem
een onderkomen verschaft in het hotel Maurice aan de Champs
Elysées gelegen, reeds daaruit blijkt dat zijn reis niet officieel is,
anders zou hij natuurlijk aan het Elysée logeeren. Het zal zaak voor
ons zijn, zoo dicht mogelijk in zijn nabijheid te vertoeven, en daarom
stel ik voor, onzen intrek te nemen in het Hotel de l’Esplanade, niet
ver van de Place de l’Etoile, en aan denzelfden prachtigen
verkeersweg gelegen; draagt mijn keuze je goedkeuring weg of geef
je de voorkeur aan een ander hotel?

—Ik zou de voorkeur geven aan den eersten den besten trein, die mij
naar Calais bracht! antwoordde Charly.

Raffles schudde afkeurend het hoofd en hernam:

—Men kan het jou ook nooit naar den zin maken. Hoe is het mogelijk,
dat je het pittoreske van mijn onderneming niet inziet, jij zult nooit
leeren begrijpen, dat men een berooving zoodanig met romantiek kan
omkleeden, dat zij zelfs voor den beroofde bijna aantrekkelijk wordt.

—Een kwestie van opvatting, bromde Charly schouderophalend, en

als ik nu eenmaal toch hier moet blijven, dan is mij mijn woonplaats
onverschillig.

—Dan maar naar het hotel de l’Esplanade, zeide Raffles lachend.

Hij wendde zich daarop tot Henderson, en zeide:

—Je draagt immers je livrei onder je dikken pels?

—Om u te dienen, Mylord.

—Prachtig!

Wij zijn hier op den Quai d’Orsai, en daar weet ik een groote
verhuurinrichting van auto’s waar je een flinken, zeer snellen wagen
moet uitzoeken.
—All right, Mylord, antwoordde de chauffeur.

De drie mannen waren den Eiffeltoren reeds voorbijgeloopen en op

den hoek van de Avenue de la Bourdonnais traden zij een groote
garage binnen, waar Henderson spoedig een niet al te groote, maar
zeer fraaie en snelle auto had uitgezocht, geschikt voor vier
personen.

Nadat Raffles zich in het verhuurregister had laten inschrijven als

graaf Gresham en het vrij hooge staangeld vooruit had voldaan, en
nadat hij ook als verblijfplaats het Hotel de l’Esplanade had
opgegeven, stapten de beide vrienden in, terwijl Henderson achter
het stuurwiel plaats nam.

De brave kerel was met Raffles reeds herhaaldelijk in Parijs geweest

en kende er den weg, althans wat de hoofdstraten betreft, even goed
als zijn meester. Hij stuurde dus de auto zonder te aarzelen langs
den Quai d’Orsai tot aan de l’Alma, reed de Seinebrug over, stak de
Place de l’Alma dwars over en reed de Avenue Marcoi in, welke hij
volgde tot aan de wereldberoemde Place de l’Etoile, in welks midden
zich de Zegenboog, het door Napoleon I gestichte kunstwerk verhief,
opgericht ter eere van de vele overwinningen van het Fransche leger
ten tijde van het eerste keizerrijk, en waarop de namen van Marengo,
Yena, Austerlitz en zooveel andere in onvergankelijke glorie prijkten.

Hier liet hij de auto een wending maken en reed de Avenue des
Champs Elysées op. Op den hoek van de Rue Barsac stond de auto
stil voor het fraaie terras van het Hotel de l’Esplanade.

Een portier kwam ijlings toesnellen, die het portier van de auto
opende, nog voor een der reizigers dit had kunnen doen, ofschoon zij
vlug genoeg waren.
Raffles en Charly stapten uit, en Henderson reed [22]de auto naar de
garage, die zich achter het groote hotel bevond.

De twee vrienden begaven zich naar de loge van den portier, en

lieten hun namen inschrijven: „Graaf Gresham en secretaris”.

Zij kregen twee kamers op de tweede verdieping, en begaven zich

aanstonds daar heen, teneinde zich een weinig te verfrisschen.

Daar hun eetlust door de luchtreis en alles wat daarop gevolgd was,
niet weinig was geprikkeld, daalden zij naar de eetzaal af, waar zich
nog slechts een gering aantal reizigers bevonden, en lieten zich
chocolade en cakes brengen, daar het voor het eerste ontbijt nog
veel te vroeg was.

Terwijl zij zich de smakelijke koek goed lieten smaken, las Raffles
vluchtig de „Figaro” door, die wel het best zou zijn ingelicht omtrent
het doen en laten van Spanje’s koning in de Fransche hoofdstad.

Hij had spoedig gevonden wat hij zocht.

Zijne Majesteit had den dag te voren te Rambouillet gejaagd, en later

deputaties ontvangen van verminkten uit den grooten oorlog,
oorlogsweduwen of moeders van krijgsgevangenen, die hem dank
wilden zeggen voor zijn bemiddeling bij het overbrengen van
berichten omtrent het lot der hunnen tijdens de vreeselijke
wereldworsteling.

Den volgenden dag zou een rondrit door Parijs en omstreken plaats
hebben en des avonds zou er een gala-diner op het Elysée plaats
vinden, gevolgd door een cercle.

In het deftige Parijsche blad vond Raffles bovendien nog enkele

aanwijzingen, welke hem van groot nut zouden kunnen zijn bij zijn
gevaarvolle onderneming.
Zijne Majesteit was namelijk vergezeld door zijn aide de camp, den
brigade-generaal Del Rio, zijn adjudant, kapitein De Estella, en den
hofstalmeester, markies De Vianna.

Naar Raffles meende, moest het onder deze omstandigheden niet

onmogelijk zijn, toegang tot den koning te erlangen.

Hij vouwde het blad weder dicht, en zat geruimen tijd in gedachten
verzonken.

Maar als Charly hem een half uur later eens had gevraagd of hij
reeds een plan had gemaakt, dan zou hij ontkennend hebben moeten
antwoorden. [23]

[Inhoud]
HOOFDSTUK VI.
 De Chileensche Gezant.

Den volgenden dag reden Raffles en Charly des middags in de fraaie

auto door de straten van Parijs, en opnieuw genoten zij van de
ongestoorde harmonie, welke geen andere stad der wereld in zoo
hooge mate in het stadsbeeld oplevert als de Fransche hoofdstad.

Het was een verrukkelijke dag en de zon scheen nog zoo warm, dat
men zich in den nazomer kon wanen.

De kap van de auto was dan ook teruggeslagen en de beide mannen

hadden zich ermede vergenoegd zich in hun pelsjas te steken.

Henderson reed de Champs Elysées af, tot hij de Rond Point

bereikte, sloeg toen de Avenue d’Antin in en koos zijn weg naar het
noorden van de stad naar de wijk der Batignolles.

De auto was de Rue de Pronie genaderd, en had deze eenigen tijd

gevolgd, toen er een groote auto kwam aanrijden, die stilhield voor
een fraai huis, boven welks deur een groot schild was aangebracht.

In de auto leunde een man van omstreeks vijftigjarigen leeftijd achter

in de kussens, terwijl een jongere man hem nu en dan toesprak met
een blik van medelijden in de oogen.

Met behulp van den chauffeur en dezen jongen man stapte de oude
heer uit de auto, waarbij hij veel pijn scheen te lijden.

Zijn eene voet was geheel in een wit verband gewikkeld, en hij
leunde zwaar op de schouders van de beide mannen, die hem
ondersteunden.
Van uit de halve duisternis der koetspoort kwam een bediende
aansnellen, die de taak van den chauffeur overnam.

Deze keerde naar zijn wagen terug en reed ermee weg.

Raffles had Henderson verzocht, een weinig langzamer te rijden, en

keek Charly nu glimlachend aan.

—Je hebt immers den geheelen nacht volgehouden, mijn jongen, dat
het mij onmogelijk zou zijn, hedenavond toegang te krijgen tot het
Elysée.

—Zeker! En dat houd ik vol!

—Dat is heel onverstandig van je, want niet ik alleen, maar wij beiden
zullen er heen gaan!

Charly wierp Raffles een blik van ongeloof toe en zeide:

—Dat is je zeker geen ernst?

—Volkomen ernst!

—Wil je mij dan eens zeggen, waaraan die plotselinge zekerheid is

toe te schrijven? vroeg Charly.

—Heel eenvoudig! Heb je dien man herkend, die zooeven uit de auto
werd geholpen en die aan den voet gewond is?

Charly schudde het hoofd.

—Dan heb je zeker niet goed de geïllustreerde bladen bestudeerd.

Die man was de Chileensche gezant te Parijs, Sanfuentes, die nog
pas gisteren een interview heeft toegestaan aan een
vertegenwoordiger van het „Journal des Débats”.
—En die andere heer?

—Dat zal zijn eerste secretaris, Aldunata, wel geweest zijn.

—Hoe komt de gezant dan gewond? riep Charly uit.

—Dat is meer dan ik je zeggen kan, maar het zou mij niet
verwonderen als hij van zijn paard was gevallen en zijn enkel had
verstuikt! Zijn eene laars was [24]gespoord en zijn adjudant droeg een
rijpantalon en had een karwats in de hand.

—Dat heb ik niet opgelet!

Raffles dreigde den jongen man met den vinger en zeide bestraffend:

—Onoplettendheid is de grootste en de onvergeeflijkste fout in de

detectives en in hun tegenvoeters, Charly! Nu, ik heb dan beter
toegezien, en ik zou er wel wat onder durven verwedden, dat die
heeren zoo juist een wandeling hebben gemaakt, en dat de
Chileensche gezant daarbij van zijn paard geduikeld is!

—Je zou je weddenschap gewonnen hebben, Edward, want daar zie

ik een pikeur met twee paarden aankomen! zeide Charly, terwijl hij
wees naar een ruiter, die een tweede paard aan den teugel
meevoerde.

De man kwam naderbij en reed met beide paarden onder de hooge

koetspoort door, waarop hij uit het gezicht verdween.

Charly had hem nagekeken en wendde zich nu weder tot Raffles met
de vraag:

—Wij nemen dus aan, voorloopig tenminste, dat Sanfuentes een

wandelrit heeft gemaakt en een klein ongeluk heeft gehad, door zijn
voet te verstuiken, maar wat heeft dat in ’s hemels naam te maken
met je plannen?

—O, het verband is veel nauwer dan je wel denkt, mijn jongen!
antwoordde Raffles glimlachend. De Chileensche gezant zal zich
namelijk naar den cercle of naar het Elysée hebben begeven.

Charly maakte een gebaar van schrik, want zonder nadere toelichting
begreep hij reeds, wat Raffles van plan was.

Maar toch wilde hij nog trachten zijn vriend terug te houden van een
voornemen, hetwelk hij bij voorbaat tot mislukking gedoemd achtte,
en daarom zocht hij naar bezwaren.

Hij meende er al zeer spoedig een gevonden te hebben en riep uit:

—Ik geloof, dat ik weet wat je wil doen, Edward! Je wilt ongetwijfeld
de plaats innemen van Sanfuentes, wat jou met je ongelooflijke
grimeerkunst al zeer gemakkelijk zou vallen, want de Chileensche
gezant heeft jouw donkergrijze oogen, je grootte, en ook wel
eenigszins je figuur, al is hij een weinig gevulder, maar je vergeet één
ding—het is natuurlijk alom bekend, dat de gezant zich gewond heeft
en daarom zeker niet zal kunnen verschijnen.

Als Charly gedacht had, dat dit bezwaar doel zou treffen, dan had hij
zich vergist!

Raffles had de wenkbrauwen opgetrokken en vroeg nu glimlachend:

—Hoe laat denk je wel, dat de Parijsche avondbladen gedrukt

worden?

—Ik vermoed om een uur of zes.

—Je vergist je ruim een uur, Charly! hernam Raffles
hoofdschuddend. Van de meeste bladen wordt het redactioneele
gedeelte reeds om half vijf gesloten en zeker niet later dan hoogstens
vijf uur. Het is dus zoo goed als onmogelijk, dat het bericht van dit
tamelijk onbeteekenende ongelukje nog in de avondbladen zal
verschijnen; dat kunnen wij trouwens over een half uur al weten door
eenige bladen aan een kiosk te koopen.

—Laten wij dat dan eens aannemen, hernam Charly. Geloof je dan
soms, dat de gezant zich niet heeft laten excuseeren?

—Integendeel—dat zal hij wel gedaan hebben! antwoordde Raffles

kalm. Maar zulk een verstuiking kan binnen enkele uren zeer veel
beter worden—en de gezant kan er wel zoo bijzonder op gesteld zijn,
aan de feestelijke bijeenkomst in de officieele ontvangst van
President Poincaré deel te nemen, dat hij zijn pijn verbijt en zich toch
maar naar het Elysée laat brengen!

Charly liet zich achterover in de kussens vallen en vroeg zich

verbaasd af, of dit nu de redeneering was van een met reden
begaafd wezen of van een Don Quichot!

Hij slaakte een diepen zucht en zeide:

—Ik zie het wel—ik zal je niet kunnen weerhouden. Je wilt je zelf
blijkbaar moedwillig in het ongeluk storten!

—Als ik dat doe, Charly, dan zul je me toch zeker niet alleen mijn
ongeluk tegemoet zenden, nietwaar? vroeg Raffles, terwijl een
eigenaardige glimlach zijn lippen deed krullen.

—Wat wil je daarmee zeggen? stamelde Charly.

—Heel eenvoudig. De gezant komt natuurlijk niet alleen, maar laat

zich vergezellen door zijn secretaris!
—Dus—ik.…..? hakkelde Charly. [25]

—Ja, jij! antwoordde Raffles lachend. Je zult voortreffelijk geschikt

zijn om de rol van Aldunata te vervullen, weliswaar is zijn haar
gitzwart, maar met een van de paar honderd pruiken in ons huisje
aan de Rue Marcadet te Montmartre, zal je zoodanig veranderen, dat
men je in het geheel niet zal herkennen—en het geluk wil, dat die
jonge man donkerblauwe oogen heeft, een bijzonderheid in zijn land.
Ik hoop toch niet, dat je aarzelt?

Charly vestigde zijn heldere oogen op het gelaat van zijn vriend en
zeide eenvoudig:

—Ik vind, dat je een waanzinnige daad begaat, die je je vrijheid kan
kosten, en misschien nog wel meer—en daarom zal ik je natuurlijk
niet alleen laten gaan—ik geloof echter, dat dit onze laatste reis naar
Parijs is geweest, en dat wij hier wel geruimen tijd zullen blijven—
heel wat langer dan ons aangenaam zal zijn.…..

—Kom, kom! Niet zoo zwartgallig, mijn jongen, hernam Raffles

glimlachend, terwijl hij Charly op den schouder klopte. Ik verzeker je,
dat alles op rolletjes zal loopen! Je moet niet vergeten, dat wij te doen
krijgen met diplomaten, hoog geplaatste officieren, ministers en
andere personen, die specialist zijn op hun bijzonder gebied, maar
meestal niet uitblinken door buitengewone schranderheid in het
algemeen. De meest ongehoorde dingen worden natuurlijk het minst
verwacht.

—En een vervanging van een gezant, al is het dan ook maar een
Chileensche, is toch zeker wel ongehoord!

Het was nu langzamerhand duister geworden en de straatlantaarns

waren opgestoken.
De auto had haar weg vervolgd, maar Raffles had toch de ligging van
het Chileensche gezantschap nauwkeurig in het geheugen geprent.

Langs de helderverlichte boulevards reed de auto weder terug en

bracht de beide vrienden weder naar hun hotel.

Zij dineerden er met opzet zoo vroeg mogelijk, en Raffles moest de

kosten van het onderhoud dragen, want Charly was zeer weinig
spraakzaam.

Een ontijdige ontdekking zou de noodlottigste gevolgen na zich

sleepen, en hoe gemakkelijk kon een schijnbaar onbeteekenend
voorval, een onverwachte samenloop van omstandigheden die
ontdekking niet teweeg brengen?

Daar was, om te beginnen, de Spaansche taal.

Men zou toch wel kunnen verwachten, dat de Chileensche gezant en

zijn secretaris hun landstaal zouden spreken!

Raffles nu sprak de Spaansche taal bijna even vloeiend als Fransch,

maar met zijn eigen kennis van de taal van Cervantes was het poover
gesteld!

En dan—hoeveel vergissingen zou hij niet kunnen begaan, hoe vaak

zou hij geen dingen doen, die in strijd waren met het heilige protocol,
waardoor hij meer de aandacht op zich zou vestigen dan goed was
voor zijn veiligheid en die van Raffles!

Deze evenwel scheen in de beste stemming te zijn en praatte geestig

en onderhoudend over allerlei zaken—maar in het geheel niet over
de receptie op het Elysée!

Dat was een gewoonte van den Grooten Onbekende—daardoor bleef

de geest frisch, zoo beweerde hij, en het was altijd vroeg genoeg om
over de aangelegenheid na te denken, wanneer men er zich
middenin bevond.

Maar tegen het dessert meende Charly toch eensklaps een

tegenwerping te hebben gevonden, die onweerlegbaar was!

Zijn oogen schitterden van zegepraal, toen hij zich tot Raffles
overboog en fluisterend zeide:

—Een enkele opmerking, Edward!

—Toch niet over de zaak van vanavond? vroeg Raffles, terwijl hij
even de wenkbrauwen fronste.

—Ik vraag verschooning. Daar gaat het integendeel wel om!

—Maak het dan kort!

—Wil je mij eens zeggen, hoe je zoo zeker weet, dat Aldunata, de
secretaris van den gezant, niet alleen naar het Elysée zal gaan?

—Nu denk je me zeker met een enkelen treffer in den grond te

hebben geboord, mijn jongen, antwoordde Raffles glimlachend. Je
vergist je echter! Als de gezant niet gaat—dan gaat de secretaris ook
niet. Dat is zoo overal het gebruik over de geheele wereld—en men
wijkt er nimmer van af!

Charly zweeg. Ook dit laatste wapen was hem uit de handen
geslagen. [26]

Het diner werd tamelijk stilzwijgend geëindigd, en Charly rekende, in

zijn rol van secretaris van den Engelschen graaf, met den kellner af.

Henderson was reeds gewaarschuwd en stond reeds met de auto

vóór het terras van het hotel, toen de beide vrienden naar buiten
stapten.
Maar toen zij in de auto gezeten waren, liet Charly nogmaals zijn
zwaarste geschut losbranden.

—Luister eens, Edward—de personen, die voor hedenavond op het

Elysée genodigd zijn, zullen natuurlijk wel een uitnoodigingskaart
moeten vertoonen?

—Dat spreekt van zelf!

—Dan heb ik je dan toch eindelijk vóór den loop van mijn geweer!
riep Charly triomfantelijk uit, want wij hebben zulk een kaart niet!

—Ik heb er tenminste niet een in mijn zak! hernam Raffles volmaakt
kalm; maar daarentegen eenige dozijnen, oningevuld, wel te verstaan
—in het huis in de Rue Marcadet! Eenige maanden geleden, toen ik
hier eveneens vertoefde, heb ik zulk een invitatie-kaart in handen
gekregen, en ik heb er toen met mijn eigen kleine handpers een paar
dozijn van nagemaakt—zeker geen kunstwerken, in typografisch
opzicht, maar ruimschoots voldoende voor ons doel!

Charly liet een zacht gekreun hooren en mompelde toen:

—Ik geef het op—laat het noodlot zich dan maar aan ons voltrekken!

Raffles barstte in lachen uit en riep:

—Je doet als een hoofdpersoon in een drama van Eugène Sue! Ik
heb je nog nimmer in zulk een eigenaardige stemming gezien! Ik ken
je niet meer! Zou dit soms het gevolg zijn van de Parijsche lucht?

—Dat weet ik niet, antwoordde Charly op somberen toon, maar ik gaf

een lief ding als ik weer rustig de lucht van Londen inademde!

—Als alles goed gaat, kun je dat reeds morgen, wie weet, vannacht,
alweder doen!
—En als het niet goed gaat?

—Met die mogelijkheid houd ik geen rekening!

En hiermede eindigde het gesprek.

De auto had intusschen in snelle vaart haar weg vervolgd en was

langs den Boulevard de Courcelles en den Boulevard des Batignolles
naar den heuvel van Montmartre gereden. Zij stak de Place de Clichy
over, reed de Avenue van dien naam op, volgde eenigen tijd de
Avenue van St. Ouen en sloeg ten slotte de Rue Marcadet in.

De wagen stond stil voor een zeer oud huis, hetwelk Raffles reeds
jaren geleden gekocht had, en dat zoo goed als steeds ledig stond.

Het diende zoogenaamd tot opslagplaats van handelsgoederen,

maar iemand, die er zou zijn binnengetreden, zou daar weinig van
gevonden hebben.

Het was een der oudste huizen van deze oude straat en was gelegen
op den hoek van de Rue de Bergerac. Het had een ingang in de
beide straten, en bovendien kon men het binnengaan door de deur
van een kleinen tuin aan den kant van de Rue Francœur. Het was
dus als aangewezen voor het doel, hetwelk Raffles zich gesteld had.

Mochten de drie uitgangen eens worden afgezet, dan nog was de

gentleman-inbreker niet als een muis in de val opgesloten, want dan
kon hij nog ontsnappen door den kelder. Daar bevond zich in den
vloer een verborgen luik, waarvan hij en zijn beide metgezellen alleen
het geheim kenden en dat het begin van een onderaardsche gang
afsloot, die ruim een kilometer verder uitkwam midden op het kerkhof
van Montmartre, dicht bij een vervallen grafkelder, die sedert eeuwen
niet was gebruikt.
De beide vrienden waren snel binnengetreden, en Henderson, die
zijn instructies had, liet de auto dadelijk keeren—een half uur later
zou hij zijn meester bij een anderen uitgang weder opwachten.

Raffles en Charly volgden een smalle gang, waar het pikdonker was,
zoodat zij van een electrische zaklantaarn gebruik moesten maken.

Daarop beklommen zij, ongeveer in het midden van deze gang, een
oude, eikenhouten wenteltrap en traden op de eerste verdieping een
vrij ruim, eenvoudig gemeubeld slaapvertrek binnen.

Er hing een muffe lucht, zooals in alle huizen, die niet of slechts
zelden bewoond worden, maar het was thans te gevaarlijk om een
raam open te zetten, dat op de binnenplaats uitzag.

Integendeel, het gordijn ervoor werd zorgvuldig dichtgetrokken, en

daarop trad Raffles naar den schoorsteen toe en drukte op een kleine
verhevenheid, [27]die in de krullen van de lijst om een grooten spiegel
was aangebracht.

Dadelijk liet zich een zacht knarsend geluid hooren en de spiegel

draaide om een onzichtbare as—hij vormde een soort van deur, die
een smal vertrekje afsloot.

Men kon dit nu slechts bereiken door een stoel vóór den schoorsteen
te plaatsen en daarop te klimmen.

Het geheime vertrek, of liever de doodloopende gang was iets meer

dan een meter breed en bijna ongeveer drie meter lang.

Aan weerszijden met lakens bedekt, hing aan kapstokken een groot
aantal kleedingstukken: rokcostuums, livreien en uniformen van
allerlei aard.
Op planken daarboven stonden doozen, die pruiken, valsche baarden
en andere benoodigdheden bevatten.

Ten slotte lag er op een der planken een groot boek, van de dikte van
een Statenbijbel, vol platen en een zeer nauwkeurige beschrijving
van alle leger-uniformen, diplomaten-gewaden en ridderorden ter
wereld, van het grootste land, zooals Amerika en Rusland af tot
miniatuur-landjes als het vorstendom Monaco toe.

Raffles had aanstonds dit boek ter hand genomen en het hoofdstuk
„Chili” opgeslagen.

Na eenige oogenblikken mompelde hij:

—De Chileensche gezantenuniform heb ik niet. Mijn verzameling is

helaas lang niet compleet.

Charly meende reeds victorie te kunnen roepen, maar hij kwam

bedrogen uit, want Raffles vervolgde:

—Ik heb echter wel een Chileensch generaalsuniform, die met een
weinig handigheid veranderd kan worden! Jij kunt voortreffelijk
omgaan met naald en draad, Charly, toon dus je kunst eens.

Raffles was de gang binnengetreden en wierp Charly, die in de kamer

was blijven staan, na eenige oogenblikken een complete uniform toe.

—Hierbij hoort eigenlijk een kepi, zeide hij, en wij hebben een steek
noodig. Maar deze fraaie Engelsche admiraalssteek kan, als hij een
weinig veranderd wordt, uitstekend dienst doen. Toon eens, wat je
kunt, mijn jongen, en maak hiervan, aan de hand van de beschrijving
in mijn boek, een Chileenschen diplomatensteek.

Zuchtend zette Charly zich met naald en draad aan het werk, nadat
hij uit een verborgen lade, eveneens in de kleederenkast, galon,
gouddraad, en eenige passementen had gehaald.

Zijn vaardige vingers draaiden en keerden de stugge stof van de

uniform, en het duurde niet lang, of hij had haar zoodanig veranderd,
dat het zeer moeilijk zou vallen, tenzij misschien aan een echten, op
de hoogte zijnden Chileen, om het bedrog te ontdekken.

Raffles had intusschen een illustratie uit zijn zak gehaald, welke een
uitstekend gelijkend portret van den Chileenschen gezant bevatte, en
deze foto voor zich neder gezet, tegen den rand van een kaptafel,
voorzien van een Venetiaanschen spiegel.

Hij had zich van pelsjas en rokcostuum ontdaan en begon zich nu

met de grootste zorgvuldigheid te grimeeren, nu en dan het portret
voor zich bestudeerend.

Zijn weelderig haar verdween onder een pruik van grijs haar, zoo
voortreffelijk nagemaakt, als geen enkele beroepsacteur de zijne zou
kunnen noemen, en welke zoo zuiver om het hoofd paste, dat een
afscheiding ook bij scherp toezien niet te ontdekken viel.

Raffles veranderde de kleur van zijn gelaat door middel van een soort
kleurstof, die er als helder water uitzag, maar in de lucht lichtbruin
opdroogde, en in niets geleek op de schmink, welke de
tooneelspelers gebruiken, maar hij bracht dit pas aan, nadat hij den
vorm van zijn neus geheel gewijzigd had, want markies Sanfuentes
mocht zich verheugen in het bezit van een zeer grooten, eenigszins
terzijde gekromden neus, en het was dus noodzakelijk, dit
lichaamsdeel zoo goed mogelijk te imiteeren.

Met behulp van een soort stopverf, die na eenige minuten tot een
stijve massa opdroogde, maakte Raffles eerst den vorm van den
neus van zijn model na, en overtoog toen het geheel met een zeer
dun vleeschkleurig vlies, hetwelk de opperhuid moest nabootsen.