Блот-гібридизація,

нозерн-блотинг,
саузерн блотинг та
вестерн блотинг.
Презентацію виконала студентка
Медичного факультету №2 11217 групи
Ткаченко Віолетта
 Різні методи блотингу використовуються для виявлення унікальних білків і
послідовностей нуклеїнових кислот. Нозерн, саузерн протоколи блоту схожі
і починаються з електрофоретичного розділення фрагментів білка та
нуклеїнових кислот на гель, які потім переносяться на мембрану
(мембрана нітроцелюлози, мембрана полівінілідендифториду (PVDF)
тощо), де вони іммобілізовані.
 Це дозволяє радіоміченим або
ферментативно міченим
антитілам або зондам ДНК
зв'язувати іммобілізовану
мішень, і молекули, що
представляють інтерес, можуть
бути візуалізовані різними
методами. Методи блотингу
вибираються на основі
молекули-мішені: ДНК, РНК
або білка.
Southern Blot
 Саузерн блоти використовуються для визначення ідентичності, розміру і
кількості конкретних послідовностей ДНК. Протокол саузерн блоту
починається з вилучення ДНК з клітин або тканин, яка потім
ферментативно перетравлюється для отримання фрагментів ДНК.
Фрагменти розділяються за розміром на агарному або поліакриламідному
гелі за допомогою електрофорезу. Менші фрагменти будуть мігрувати
далі на гелі, ніж більші. Після електрофорезу ДНК на гелі переноситься на
нейлонову мембрану.
Southern Blot
 Мембрана інкубується зондом
нуклеїнової кислоти, який має
послідовність, гомологічну цільовій
послідовності, і позначений
радіоактивністю, флуоресцентним
барвником або ферментом, здатним
генерувати хемілюмінесцентний
сигнал. Гібридизація комплементарних
послідовностей відбувається під час
інкубації, а негібридизований зонд
видаляється промиванням буфером.
Southern Blot
 Повністю гібридизовані мічені молекули зонда залишаться пов'язаними з
плямою. Методи виявлення відрізняються залежно від мітки зонда.
Радіомічені зонди візуалізуються рентгенівською плівкою, а
ферментативно мічені зонди візуалізуються хемілюмінесцентною
підкладкою.
Протокол Southern Blot

1. Виділення ДНК.
2. Обмеження травлення: переварити
ДНК рестрикційним ферментом, а
при необхідності сконцентрувати
перетравлену ДНК.
3. Гель-електрофорез: підготуйте
агарний гель і буфер (вибір буфера
буде залежати від розміру
фрагментів ДНК). Завантажте зразки
і включіть маркер молекулярної маси
ДНК. Запустіть гель.
 Протокол Southern
Blot
4. Передачі:
1. Помістіть гель в ємність з
денатуруючим розчином, і двічі
мийте протягом 15 хвилин на
шейкері.
2. Промити водою, потім обмити
розчином нейтралізації.
3. Під час попереднього етапу
починайте готувати ватман і
капронову мембрану до
перенесення.
4. Зберіть апарат, який буде
передаватися з мембраною,
ватманом і гелем і перенесіть в
буфер SSC або SSPE.
5. Коли перенесення буде завершено,
зшийте ДНК в зшивачі, потім
промийте мембрану.
 Протокол Southern Blot

5. Прегібридизація (блокування):
1. Блокування зменшує неспецифічне зв'язування з
мембраною. Підготуйте розчин для попередньої
гібридизації та додайте зразок ДНК. Видаліть
пляму з зшивача, додайте розчин попередньої
гібридизації та проведіть інкубацію.
6. Гібридизації:
1. Готують зондову суміш (комплементарну нитку
ДНК) і буфер.
2. Вийміть розчин попередньої гібридизації та
інкубуйте пляму зондом (час інкубації буде
відрізнятися в залежності від застосування).
3. Після інкубації виконайте прання з низькою
жорсткістю для уточнення ДНК.
Протокол Southern
Blot
7. Виявлення зонда:
 Мембрану промити, перекласти в
ємність з блокуючим розчином і
витримати.
 Викиньте блокуючий розчин,
замініть розчином антитіл і
інкубуйте.
 Викиньте розчин антитіл,
промийте мембрану.
8. Дотримуйтесь інструкцій виробника для
виявлення хемілюмінесцентної системи.
Northern Blot
 Нозерн блоти використовуються для визначення ідентичності, розміру і
кількості конкретних послідовностей РНК. Протоколи нозерн блоту
починаються з виділення РНК, а методи розділення варіюються в
залежності від розміру РНК. Великі РНК відокремлюються
електрофорезом на формальдегідному агарному гелі або
гліоксальагарному гелі, який перешкоджає нормальному з’єднанню основ і
підтримує РНК в денатурованому стані.
  Дрібні РНК відокремлюються на
денатуруючому (сечовині) поліакриламідному
гелі. Потім РНК переноситься з гелю на
нейлонову мембрану, яка потім інкубується
радіоактивно або неізотопно міченою РНК,
Northern Blot ДНК або олігодоксинуклеотидним зондом.
Негібридизований зонд видаляється
промиванням буфером. Радіомічені зонди
візуалізуються рентгенівською плівкою, а
ферментативно мічені зонди візуалізуються з
хемілюмінесценцією.
Протокол Northern Blot
1. Виділення РНК.
2. Електрофорез:
1. Для формальдегідного агарного гелю: підготуйте гель і вставте лоток для
гелю в апарат. Заповніть буфером MOPS, завантажте зразки та включіть
маркер молекулярної маси. Запустіть гель, потім обріжте гель перед
промоканням.
2. Для гліоксаль-агарного гелю: підготуйте гель і вставте лоток для гелю в
апарат. Заповнити буфером MOPS, підготувати проби і завантажити разом
з РНК.
3. Для денатуруючого поліакриламідного гелю: відлийте гель і встановіть його
в блок електрофорезу. Підготуйте зразки, завантажте в гель і запустіть з
працюючим буфером TBE.
 Протокол Northern Blot
3. Передачі:
1. Для формальдегідного агарного гелю або
гліоксаль-агарозного гелю: промийте гель
в SSC, потім зберіть передавальний блок
з гелем, фільтрувальним папером і
нейлоновою мембраною. Коли
перенесення буде завершено, помістіть
мембрану в УФ-зшивач.
2. Для денатуруючого поліакриламідного
гелю: зберіть трансферний блок, що
включає гель, фільтрувальний папір та
нейлонову мембрану, переконавшись, що
вони залиті TBE. Коли перенесення буде
завершено, помістіть мембрану в УФ-
зшивач, щоб закріпити РНК на мембрані.
4. Прегібридизація (блокування):
1. Попередньо гібридизують мембрану в
розчині гібридизації.
Протокол Northern
Blot
5. Гібридизації:
 Додайте зонд до розчину
гібридизації та інкубуйте.
 Промивають мембрану з
низькою жорсткістю для
видалення розчину гібридизації
та негібридизованого зонда, а
також у промивках високої
жорсткості для видалення
частково гібридизованих
молекул.
 Дотримуйтесь інструкцій
виробника для виявлення
хемілюмінесцентної системи.
Western Blot

 Вестерн-блоти використовуються для визначення ідентичності, розміру та

кількості специфічних білків у зразку. Протокол вестерн-блоту починається з
отримання зразка лізату з культури тканин або клітин і розділення на
поліакриламідному гелі за допомогою електрофорезу. Розділені білки потім
переносяться на мембрану нітроцелюлози або полівінілідендифториду (PVDF).
Мембрану інкубують блокатором для запобігання неспецифічного зв'язування з
подальшою інкубацією з первинним антитілом для зв'язування білка.
 Western Blot
 Існує два методи виявлення, прямий і непрямий. Прямий метод виявлення
спирається на мічені первинні антитіла, тоді як для непрямого виявлення потрібне
первинне антитіло, спрямоване проти білка-мішені, і вторинне антитіло, спрямоване
проти класу імуноглобіну або підкласу первинних видів антитіл. Методи візуалізації
включають колориметричні аналізи, в яких утворюється кольоровий осад,
хемілюмінесценцію і флуоресценцію.
Протокол Western Blot
1. Готують лізат з культури клітин або тканин.
2. Підготовка зразка:
1. Визначте концентрацію білка кожного зразка за допомогою аналізу кількісного
визначення білка (Бредфордський аналіз).
2. Додайте рівний об'єм 2-кратного буфера до кожного зразка.
3. Деякі проби можуть потребувати денатурації, це досягається уварюванням
зразків в буфері.
Протокол
Western Blot
3. Електрофорез:
1. Підготуйте гель SDS-PAGE, завантажте
зразки разом з маркером молекулярної
маси.
2. Запустіть гель в запущеному буфері.
4. Передачі:
1. Після електрофорезу зберіть
трансферний пристрій, включаючи гель,
мембрану PVDF або нітроцелюлозу та
фільтрувальний папір.
2. Переносять білки на мембрану з
переносним буфером.
 Протокол Western
Blot
5. Фарбування антитіл (непряме виявлення):
 Підготуйте блокуючий буфер і інкубуйте
мембрану для зменшення
неспецифічного зв'язування.
 Інкубують мембрану первинними
антитілами, розведеними в блокуючому
буфері.
 Промивають мембрану при TBST і
інкубують кон'югованими вторинними
антитілами, розведеними в блокуючому
буфері.
 Промийте мембрану в TBST.
 Дотримуйтесь інструкцій виробника для
виявлення хемілюмінесцентної системи.
Висновок
 Методи блоттингу є одними з найбільш поширених підходів молекулярної
біології для іммобілізації білків або розділення нуклеїнових кислот (ДНК /
РНК) за допомогою мембрани. Зразки можуть бути виявлені специфічними
лігандами, антитілами або зондами нуклеїнових кислот, які зв'язуються з
окремими послідовностями нуклеїнових кислот або білками. Ці методи
залежать від роздільної здатності окремих макромолекул. Найбільш
відомим застосуванням блотингу є Southern Blot і Western Blot, в яких
нуклеїнові кислоти/білки іммобілізовані на мембранах PVDF або
нітроцелюлози. Технологія блоттингу була використана протягом останніх
30 років для з'ясування багатьох фундаментальних біологічних процесів і
обіцяє чудові відкриття в молекулярній біології.