Mikrobiologie

 -­‐  Praktická  
 
2010  

1. otázka  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Základní  principy  odběru  
Správně  provedený  odběr,  vhodný  klinický  materiál,  rychlý  transport.  
1) Odebrat   právě   ten   materiál,   v  němž   se   infekční   agens   nalézá   a   lze   ho   nejsnáze   prokázat.  
Volba  materiálu  souvisí  s  průběhem  infekčního  procesu  a  lokalizací.  
2) Technika   (musí   být   lege   artis   a   asepticky)   odběru   vhodnými   nástroji   a   do   vhodných  
odběrových  nádob.  
3) Sterilní  odběr  bez  kontaminace  vzorku.  
4) Odběr  před  podáním  ATB,  pokud  již  byla  léčba  zahájena  upozornit.  
5) Opakovaný  odběr  v  případě,  že  jednorázové  vyšetření  není  zárukou  záchytu  mikrobů.  
Odběrové   a   transportní   soupravy   musí   umožňovat   odběr   vzorku,   zajistit   přežívání  
mikroorganismů   v  původní   kvantitě   než   dojde   ke   zpracování,   ochránit   vzorek   před   kontaminací   a  
ochránit  okolí  před  kontaminací  vzorkem.    
Nutností  je  rovněž  identifikace  vzorku!!!  
Důležitá  je  volba  doby  odběru  –  u  pacientů  s  intermitentní  bakteriémií  (teplotou)  je  odběr  krve  
vhodný  na  začátku  nebo  hodinu  před  očekávaným  vzestupem  teploty  (vyplavení  mikroorganismů  do  
těla),  v  případě  kontinuální  bakteriemie  se  odebíraní  4  hemokultury  v  průběh  2  hodin,  při  ATB  léčbě  
je  vhodné  odebrat  bezprostředně  před  podáním  ATB.  Vztah  bakteriemie  a  klinických  příznaků:  

 
 
Technika  odběru  jednotlivých  druhů  infekčního  materiálu  
Stolice  
Pro  bakteriální  vyšetření  rektální  výtěr  –  do  konečníku  se  zavede  zvlhčený  tampon  a  pootočí  se  
jím,  vloží  se  do  transportní  půdy  (Amiesova).  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového   kontejneru.   Průkaz   roupů   –   stěr   z  análních   řas   Schüffnerovou   tyčinkou   nebo   otisk   lepicí  
páskou  
Moč  
Před   odběrem   nutné   omytí   genitálu,   odebírá   se   střední   proud   moči   (u   uretritidy   počáteční   u  
postižení  ledvin  konečný!).  Případně  katetrizace  nebo  suprapubická  punkce.  Do  sterilních  plastových  
kontejnerů  s  pevným  uzávěrem  
Krev  
Na   kultivační   vyšetření   minimálně   třikrát   během   jednoho   dne,   dezinfekce   kůže   v  místě   vpichu,  
venepunkcí   odběr   10-­‐20ml   krve,   vstříknutí   do   speciálních   kultivačních   nádobek   (obsah   bujónu   a  
protisrážlivého  prostředku).  Provede  se  kontrolní  stěr  z  kůže  –  vyloučení  kožní  kontaminace.    
Na   sérologické   vyšetření   (srážlivá   krev)   stejná   technika,   transport   ve   zkumavce   s  pevným  
uzávěrem.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Mozkomíšní  mok  
Lumbální  punkce,  přísně  asepticky  do  stříkačky,  poté  do  sterilní  zkumavky  s  pevným  uzávěrem.      
Hnis,  punktát  
Sterilní   stříkačkou,   po   vytěsnění   vzduchu,   výměně   sterilní   jehly   a   zapíchnutí   do   gumové   zátky  
transport.    
Výtěry  
Sterilní  vatové  tampony  s  vhodnou  transportní  půdou,  před  užitím  vhodné  zvlhčit  fyziologickým  
roztokem.  Transportní  půdy  by  měly  být  předehřáté  na  pokojovou  teplotu,  chránit  před  vysycháním.    
Výtěr   z  krku   –   šroubovitým   pohybem   otřeme   povrch   obou   mandlí,   nutno   vyhnout   se   jazyku  
(stafylokok,  streptokok).  
Výtěr   z  ucha   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   zvukovod   (stafylokok,   pneumokok,  
pseudomonády).  
Výtěr   z  dutiny   nosní   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   sliznice   obou   dolních   nosních   průduchů  
(stafylococcus  aureus,  diplococcus  pneumoniae).  
Výtěr   ze   spojivkového   vaku   –   po   odchlípení   víčka   nabíráme   na   tampon   sekret   ze   spojivkového  
vaku,  stěr  z  vřídků  na  okraji  víček,  spojivce  a  rohovce  (Stafylokok).  
Výtěr   z  ran   a   kožních   lézí   –   stíráme   spodinu   při   periferii   rány,   případně   se   po   desinfekci  
alkoholem   seškrábnou   sterilním   skalpelem   kožní   šupiny,   vzorky   nehtů   nebo   podnehtového   detritu,  
úlomky  postižených  vlasů.    
Výtěr   z  pochvy   –   za   kontroly   poševního   zrcadla,   z  děložního   čípku   a   klenby   poševní  
(Lactobacillus,  stafylococcus,  Trichomonas)    
Výtěr  z  uretry  (kožní  flóra,  diplokoky)  
Sputum  
Vykašlávání,   nejlépe   ranní,   do   širokých   plastových   kontejnerů   s  pevným   uzávěrem.   Je   možný  
laryngální   výtěr   tamponem   a   ohebné   hliníkové   tyčince   (podržen   nad   epiglottis)   po   zakašlání,  
v  indikovaných  případech  bronchoalveolární  laváž  nebo  aspirace  z  bronchů  
Bioptické  vzorky,  žaludeční  a  duodenální  šťávy,  zvratky  a  zbytky  potravin  
Sterilní  zkumavky  nebo  plastové  kontejnery  s  pevným  uzávěrem  
Pitevní  materiál  
Sekční   vzorek,   nutné   rychlé   provedení   (čím   později   tím   větší   změny   poměrů   v  přirozené  
mikroflóře)  
Materiál  pro  izolaci  viru  
Použití  speciální  půdy  při  4°C  
Materiál  pro  molekulárně  genetické  vyšetření  
Tekutý  materiál  nebo  stěr  suchým  vatovým  tamponem.  Nutno  pamatovat,  že  enzymy  používané  
u  těchto  metod  mohou  být  inhibovány  různými  chemickými  a  biologickými  látkami  
 
Transport  materiálu  
Co   nejrychlejší,   nejlépe   v  tekutém   materiálu   nebo   hemokulturách.   Tuhé   materiály   mohou  
zaschnout   -­‐>transport   ve   fyziologickém   roztoku   nebo   bujónu.   Nevhodné   využití   jen   vatového  
tamponu  bez  transportního  média.    
Většina   mikrobů   snáší   teplotu   4-­‐8°C,   snížená   teplota   =   snížená   metabolických   procesů   -­‐>lépe  
vydrží   nepříznivé   podmínky.   Některé   specifické   patogeny   (Neisseria   gonorrhoeae)   nevydrží   nižší  
teplotu!  Vyšší  teplota  může  naopak  vést  k  přemnožení  přirozené  mikroflóry  a  potlačení  patogenního  
původce  (25-­‐30°C,  prostředí  s  dostatkem  živin).

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

2. otázka  –  Nativní  preparát,  pozorování  v  zástinu.  Odběr  a  transport  

materiálu  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Nativní  preparát  
 Využívá   odlišné   světlolomnosti   korpuskulárních   částic   v  pozorovaném   objektu.   Připravuje   se  
jako   suspenze   kolonií   z  pevných   půd   ve   fyziologickém   roztoku   na   podložním   sklíčku.  Využívá   se   pro  
pozorování  živých  mikroorganismů,  zejména  pro  posouzení  pohyblivosti  
 
Druhy  pohybů  
Brownův  pohyb  –  vliv  elektrostatických  nábojů  a  molekulárních  sil.  Molekuly  H2O  tvoří  dipóly  a  
působí  na  částice  -­‐>  kmitavý  pohyb  na  místě  (chvění;  neživé  částice,  nepohybliví  mikrobi).  
 
 
Aktivní  pohyb  –  organely  pohybu  (bičíky),  neuspořádaný  rychlý  pohyb  všemi  směry,  mikrob  mizí  
ze  zorného  pole.  
 
 
Pasivní  pohyb  –  pohyb  jedním  směrem,  proudění  tekutiny  v  preparátu  unáší  živé  i  neživé  částice  
 
 
Prohlížíme  suchým  systémem  při  100-­‐400  násobném  zvětšení.  Nejčastěji  se  využívá  při  sledování  
typického   pohybu   některých   bakterií,   při   přímé   diagnostice   syfilis   (treponema),   v  parazitologii   při  
průkazu   střevních   parazitů   ve   stolici   (hledání   vajíček)   a   v  mykologii   pro   sledování   růstu   a   množení  
kvasinek  a  plísní.    
 
Pozorování  v  zástinu  
Pro   lepší   sledování   pohybu,   filtr   mikroskopu   je   nahrazen   clonou,   propouští   pouze   okrajové  
paprsky   procházející   mimo   čelní   čočku.   Mikrobi   a   částice   osvětleny   ze   strany,   ohýbají   světlo   do  
objektivu   a   jeví   se   jako   „svítící“   body   na   temném   pozadí.   Využívá   se   v  diagnostice   pro   průkaz  
spirochet  (Teponema,  borelie)  
 
Provedení  
1) opálíme  sklíčko,  uděláme  si  na  něm  kolečko  
2) naneseme   kapku   tekutého   materiálu,   překryjeme   krycím   sklíčkem   (pro   ochranu   proti  
vyschnutí  vytvoříme  parafinový  rámeček)  
3) Prohlížíme   suchým   systémem   bez   clony   a   s  clonou,   sledujeme   přítomnost   různých   struktur  
(erytrocyty,  leukocyty,  hyalinní  válce,  granulární  válce,  tukové  válce,  krystaly  solí,  epitelie…)  
a  mikrobů  se  zaměřením  na  jejich  pohyb.    
 
 
Odběr  a  transport  materiálů  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření  
Výtěry,   sterilní   vatové   tampony   s  vhodnou   transportní   půdou,   před   užitím   vhodné   zvlhčit  
fyziologickým   roztokem.   Transportní   půdy   by   měly   být   předehřátém   a   pokojovou   teplotu,   chránit  
před  vysycháním.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Výtěr   z  krku   –   šroubovitým   pohybem   otřeme   povrch   obou   mandlí,   nutno   vyhnout   se   jazyku  
(stafylokok,  streptokok).  
Výtěr   z  ucha   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   zvukovod   (stafylokok,   pneumokok,  
pseudomonády).  
Výtěr   z  dutiny   nosní   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   sliznice   obou   dolních   nosních   průduchů  
(stafylococcus  aureus,  diplococcus  pneumoniae).  
Výtěr   ze   spojivkového   vaku   –   po   odchlípení   víčka   nabíráme   na   tampon   sekret   ze   spojivkového  
vaku,  stěr  z  vřídků  na  okraji  víček,  spojivce  a  rohovce  (Stafylokok).  
Výtěr   z  ran   a   kožních   lézí   –   stíráme   spodinu   při   periferii   rány,   případně   se   po   desinfekci  
alkoholem   seškrábnou   sterilním   skalpelem   kožní   šupiny,   vzorky   nehtů   nebo   podnehtového   detritu,  
úlomky  postižených  vlasů.    
Výtěr   z  pochvy   –   za   kontroly   poševního   zrcadla,   z  děložního   čípku   a   klenby   poševní  
(Lactobacillus,  stafylococcus,  Trichomonas)    
Výtěr  z  uretry  (kožní  flóra,  diplokoky)  
Tampon   bez   transportního   média   neumožňuje   skladování,   doba   transportu   by   neměla  
přesáhnout   2hod,   teplota   4°C.   Tampon   s  transportním   médiem   umožňuje   přežívání   bakterií,  
zachovává   její   původní   kvantitativní   poměry.   Doba   skladování   by   neměla   přesáhnout   24   hodin   a  
teplota  4°C.

3. otázka  –  Barvení  dle  Grama.  Odběr  a  transport  materiálu  z  dolních  cest  

dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Barvení  podle  Grama  
Umožňuje   dělení   bakterií   na   Grampozitivní   G+   a   Gram   negativní   G-­‐   lišící   se   tocxicitou   a  
antigenicitou  (působí  na  ně  odlišná  ATB  -­‐>  ATB  proti  BS).  Mohou  se  vyskytovat  některé  Gramlabilní  
mikrobi,  u  kterých  není  zbarvení  jasné,  nebo  bakterie,  které  se  podle  Grama  nebarví  (Mycobacterium,  
spory)  nebo  se  barví  obtížně  (Treponema  pallidum).  Barvitelnost  je  dána  vlastnostmi  BS:  
G+   bakterie   mají   jednodušší   a   silnější   stěnu,   která   obsahuje   převážně   polysacharidy  
(peptidoglykan,   teichoové   kyseliny,   AMK   a   proteiny).   G-­‐   bakterie   má   BS   tvořenou   nejen  
polysacharidy,  ale  také  lipidy  (rozpustné  v  alkoholu)  a  bílkovinami.    
Princip   barvení   podle   Grama   vychází   ze   skutečnosti,   že   při   použití   krystalové   violeti   a   následném  
moření  Lugolovým  roztokem  vzniká  v  buňce  komplex  krystalové  violeti  a  jódu,  který  se  u  G+  bakterií  
špatně   vyplavuje   alkoholem   (zachovávají   si   proto   modrofialové   zbarvení),   zatímco   u   G-­‐   bakterií   je  
odbarvení  snadné.    
!Při   delším   působení   alkoholu   nebo   acetonu   se   může   odbarvit   i   G+   bakterie,   při   prodlouženém  
moření  Lugolem  se  i  G-­‐  může  jevit  jako  gramlabilní!  
 
Postup  
1) opálíme  sklíčko,  naneseme  materiál,  fixujeme  teplem,  necháme  zaschnout.    

2) Převrstvíme  krystalovou  violetí  a  necháme  20s  působit.  Poté  slijeme   V  

3) Po  dobu  20s  překapáváme  Lugolovým  roztokem  (dokud  se  tvoří  nazlátlé  sraženiny)   L  
4) Po  dobu  20s  sléváme  acetonalkoholem   A  
5) Opláchneme  vodou  a  dobarvíme  safraninem  (nebo  karbolfuchsinem)  po  dobu  1min.   S  (K)  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

6) Opláchneme  vodou  
Hodnotí   se   barvitelnost   podle   Grama,   velikost,   tvar   a   uspořádání.   Využívá   se   jako   diagnostické  
barvení  pro  taxonomii  a  klasifikaci  bakterií,  jako  základ  okamžité  a  racionální  ATB  terapie.    
 
Odběr  a  transport  materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření  
Sputum  
Vykašlávání,   nejlépe   ranní,   do   širokých   plastových   kontejnerů   s  pevným   uzávěrem.   Je   možný  
laryngální   výtěr   tamponem   a   ohebné   hliníkové   tyčince   (podržen   nad   epiglottis)   po   zakašlání,  
v  indikovaných  případech  bronchoalveolární  laváž  nebo  aspirace  z  bronchů.  
Nutný   rychlý   transport,   uchovávání   při   4°C   by   mohlo   mít   za   následek   uhynutí   náročnějších  
bakterií,   při   vyšších   teplotách   hrozí   pomnožení   kontaminující   ústní   mikroflóry   a   zkreslení  
kvantitativních  poměrů.  
Zpracování   nutné   do   2   hodin   po   odběru,   provádí   se   homogenizací   (naředění   broncholysinem  
1:1,   protřepání),   mikroskopicky   (Gram   –   ověření,   že   se   jedná   o   sputum,   musí   tam   být   epitelie   a  
leukocyty,   Ziehl-­‐Neelsen   na   TBC)   nebo   kvantitativně   (KA,   END,   GPA;   signifikantní   je   záchyt   >108  
v  1ml),   průkaz   antigenu   (neobvyklé,   použití   pro   dg   pneumonií),   molekulárně   genetické   metody   (hl.  
mycobacteria  tuberculosis)  
 
 
 
4. otázka  –  Barvení  acidorezistentních  mikrobů  dle  Ziehl-­‐Neelsena.  Odběr  
a  transport  krve  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Barvení  acidorezistentních  mikrobů  dle  Ziehl-­‐Neelsena  
Jedná   se   o   obtížně   barvitelné   mikroby,   jejichž   nebarvitelnost   je   podmíněna   vysokým   obsahem  
lipidů   v  BS   (c-­‐mykolové   kyseliny   u   mycobacteria).   Týká   se   hlavně   rodu   Mycobacterium,   v  neúplné  
míře  acidoresistenci  vykazují  i  korynebakterie,  nokardie  nebo  aktinomycety.    
Barviva   nesnadno   pronikají   do   jejich   těla,   barvení   je   proto   možné   pouze   za   použití  
koncentrovaných   barviv,   s  použitím   mořidel   a   za   tepla.   Po   obarvení   je   již   nelze   odbarvit!   a   to   ani  
použitím  kyseliny,  louhu  nebo  alkoholu  -­‐>  acido-­‐alkali-­‐alkoholresistentní  mikroby.    
 
Postup  
1) ožehneme  sklíčko,  naneseme  materiál,  fixujeme  teplem,  necháme  zaschnout.  
2) položíme  na  barvící  misku  a  přelijeme  koncentrovaným  kalbolfuchsinem  a  necháme  5  minut  
působit  (jinak  se  dělá  za  zahřívání  nad  kahanem  do  výstupu  par  3-­‐5  minut)  
3) Odbarvíme  kyselým  alkoholem  v  šikmé  poloze  (dokud  odtéká  narůžovělá  tekutina)  
4) Opláchneme  vodou  a  dobarvíme  roztokem  malachitové  zeleně  (nebo  metylénové  modři)    po  
dobu  1min.    
5) Opláchneme  vodou  a  necháme  oschnout  
Červené   acidorezistentní   mikroby   na   zeleném   (modrém)   pozadí   (nespecifické   elementy   –  
epitelie,   leukocyty…),   rovné   nebo   mírně   prohnuté,   granulované   nebo   homogenně   probarvené.  
Hodnocení   pod   mikroskopem   za   použití   imerze,   50   zorných   polí,   meandrovitě   určujeme   četnost  
v  preparátu:  
ART  neg.  –  nenalezeny  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

ART  ojediněle  –  do  9/  50  zorných  polí  

ART  +  -­‐  10-­‐20/50  zorných  polí  
ART++  -­‐  21-­‐100/50  zorných  polí  
ART+++  -­‐  100  a  více  v  50  zorných  polích  
Provádí   se   nejčastěji   ze   sputa   -­‐>není   diagnostickým   závěrem,   může   se   jednat   o   nepatogenní  
druhy,  velmi  závažný  je  průkaz  v  likvoru  -­‐>  indikace  k  zahájení  okamžití  antituberkulózní  léčby.  
 
Odběr  a  transport  krve  na  bakteriologické  vyšetření  
Krev  
Na   kultivační   vyšetření   minimálně   třikrát   během   jednoho   dne   nejlépe   při   vzestup   teploty   –  
uvolnění  mikrobů  do  oběhu  -­‐>  reakcí  je  pyróza,  dezinfekce  kůže  v  místě  vpichu,  venepunkcí  odběr  10-­‐
20ml   krve,   vstříknutí   do   speciálních   kultivačních   nádobek   (hemokultury,   obsah   bujónu   a  
protisrážlivého   prostředku   s  indikátorem,   anaerobní   i   aerobní   kultivace).   Provede   se   kontrolní   stěr  
z  kůže   –   vyloučení   kožní   kontaminace.   Při   pozitivním   výsledku   se   provádí   mikroskopie   (Gram),  
kultivace  (KA,  END,  GPA,  citlivost).  
Na   sérologické   vyšetření   (srážlivá   krev)   stejná   technika,   transport   ve   zkumavce   s  pevným  
uzávěrem.  
Zpracovává   se   mikroskopií   (kultivace   po   inkubaci,   Gram),   průkaz   antigenů,   detekce   nukleových  
kyselin   a   kultivačně   nejlépe   v  hemokultivačních   nádobkách   pro   anaerobní   a   aerobní   kultivaci.  
Očkování   na   pevné   půdy   se   provádí   až   při   známkách   růstu   mikrobů   (detekce   na   základě   produkce  
CO2)  na  END,  KA  a  GPA.  

5. otázka  –  Barvení  podle  Giemsy,  diagnostika  protozoárních  infekcí.  

Odběr  a  transport  materiálu  na  mykologické  vyšetření.  
 
Barvení  podle  Giemsy  
Barvení   podle   Giemsy   –   Romanowského,   vhodné   zejména   k  diferenciaci   buněčných   struktur,  
znázornění   prvoků,   červů   (helmintologie),   a   při   hodnocení   jemných   mikroorganismů   špatně   se  
barvících  podle  Grama  (Spirochety,  mykoplazmy,  chlamydie  –  nemají  klasickou  BS,  a  rickettsie).    
Giemsův   roztok   obsahuje   azur   (zásaditý)   a   eosin   (kyselý)   ve   směsi   glycerinu   a   metanolu.   Před  
barvením   se   musí   ředit   destilovanou   vodou   (1:2-­‐1:20,   většinou   1:10,   nestálý   roztok,   připravuje   se  
vždy  čerstvý).    
 
Postup    
1) ožehneme  sklíčko,  naneseme  materiál,  fixujeme  metanolem  (ne  etanol!)  po  dobu  3min.  
2) Slijeme  alkohol,  osušíme  filtračním  papírem.  
3) Naředíme  Giemsův  roztok  (1:10).  
4) Barvíme  v  Petriho  misce  nátěrem  dolů  30  minut.  ¨  
5) Vyjmeme,  opláchneme  a  osušíme.    
Červenofialová  jádra,  bleděmodré  epitelie  a  cytoplazma  prvoků.  Leukocyty  světle  fialové,  jádra  
modrofialová,  erytrocyty  růžovočervené,  bakterie  modrofialové.  Využívá  se  pro  hodnocení  MOP,  při  
podezření   na   lambliózu,   barvení   abscesů   (skolexy   při   echinokokóze),   průkaz   původců   malárie   a  
mikrofilarií  u  filarióz  z  periferní  krve.    
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

 
Odběr  a  transport  materiálu  na  mykologické  vyšetření  
Odebírají   se   seškraby   kůže   (kožní   šupiny,   hyperkeratózy)   a   nehtů,   vlasy,   chlupy   po   desinfekci  
70%   alkoholem   a   výtěry   ze   sliznic   (povrchové   mykózy),   sputum,   moč,   stolice   (odpovídá   odběru   na  
parazitické  vyšetření),  krev  (hluboké  mykózy).    
Nutnost  okamžitého  transportu  do  laboratoře.  Uchovávání  při  teplotě  4°C  
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Louhový   preparát   –   20%   louh,   Parkerův   inkoust   –   má   afinitu  
k  chitinu   –   probarvení   mykotic.   Elementů,   Gram   na   kvasinky   –   modrofialové,   Giemsa,   Burri   –  
Cryptococcus,   Fluoresčenční   –   vazba   na   chitin),   rychlým   průkazem   mykotických   agens   (detekci  
antigenu,   nukleových   kyselin),   kultivačně   (Sabouardův   agar   –   obsah   ATB   chloramfenikolu   potlačí  
bakterie,   minimálně   48   hodin;   Chromogenní   půdy   –   zpracovávání   substrátů   -­‐>   barevné   změny;  
vláknité  houby  2-­‐7  týdnu!)  nebo  nepřímým  důkazem  mykotických  agens  (ELISA,  aglutinace,  KFR).  
 
 
 
 
 
6. otázka  –  Mikroskopická  diagnostika  vaginálních  infekcí.  Odběr  a  
transport  hnisu,  punktátů  a  likvoru  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Mikroskopická  diagnostika  vaginálních  infekcí  
Odebírá  se  sekret  z  urogenitální  oblasti,  stěr  z  klenby  poševní,  uretry  a  děložního  hrdla,  nejlépe  
2x  za  sebou.  Podléhá  kultivaci  (END,  GPA,  KA  s  ATB)  a  mikroskopii  –  pozorování  nativního  preparátu  
(v   zástinu),   Gram,   Giemsa   -­‐>   stanovení   MOPů.   Hodnotí   se   kvantitativní   poměr   epitelií,   leukocytů   a  
mikroorganismů.    
 
MOP  
Mikrobiální  obraz  poševní,  6  obrazů:  
I. Fyziologický   obraz   zdravé   ženy   –   dlaždicovité   epitelie,   G+   hrubší   tyčinky   (Lactobacillus,   štěpí  
glykogen  -­‐>  kyselé  pH),  ojediněle  leukocyty  a  jiní  mikrobi.  
II. Nehnisavý  bakteriální  zánět  –  epitelie>  leukocyty,  smíšená  mikroflóra  (koky,  tyčinky,  G+  i  G-­‐,  
adorují   na   povrch   epitelií   –   znak   bakteriálních   vaginóz),   Lactobacillus   ubývá.   Hl.   G+   kok  
Enterococcus,  Streptococcus,  G-­‐  tyčinka  E.  Coli.  
III. Hnisaný   bakteriální   zánět   –   roste   množství   leukocytů   (>epitelie),   pestrá   bakteriální   flóra,  
méně   epitelií,   potlačení   Lactobacillů.   Hl.   G+   kok   Enterococcus,   Streptococcus,   G-­‐   tyčinka   E.  
Coli,  Gardnerella  vaginalis.  
IV. Kapavčitý   výtok   –   varianta   MOP   III,   G-­‐   diplokoky   (Neisseria   gonorrhoeae),   často   mohou   být  
fagocytované   v  leukocytech.   Při   akutní   fázi   –   zvýšené   množství   polynukleárů   a   diplokoků,   při  
chronické  fázi  -­‐    méně  diplokoků  i  polynukleárů,  pestrá  flóra.  
V. Trichomonádový   výtok   –  Trichomonas   vaginalis  (Giemsa,  hruškovitý  tvar,  světle  modrá  CYT  a  
červené  jádro  a  axostyl  –  podpůrná  „kostřička“),  vyrovnaný  počet  epitelií  a  leukocytů.  
VI. Vaginální   mykóza   –   velké   G+   specifické   elementy   –   kvasinky   (Candida),   vyrovnaný   počet  
epitelií  a  leukocytů.  Kvasinky  se  mohou  vláknit  –  invazivní  mykóza!  
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Odběr  a  transport  hnisu,  punktátů  a  likvoru  na  bakteriologické  vyšetření  

Mozkomíšní  mok  
Lumbální   punkce   sterilní   kautelou,   přísně   asepticky   do   stříkačky,   poté   do   sterilní   zkumavky  
s  pevným  uzávěrem.  
Transport   nutný   co   nejrychleji,   nutné   okamžité   zpracování.   Případně   inokulace   do   lahviček   na  
hemokultury  a  ponechání  při  pokojové  teplotě  pro  odložení.    
Zpracování   centrifugací   (bakterie   a   lymfocyty   při   zánětu   by   vytvořily   sediment),   mikroskopicky  
(Gram,  Ziehl-­‐Neelsen,  Cryptococcus  tuší,  amoeby  nativní  preparát),  Latex-­‐aglutinační  průkaz  antigenu  
(hlavně  u  meningitidu  vyvolávajících  kmenů)  a  kultivací  (KA,  END,  GPA,  pomnožovací  tekutá  půda).  
Hnis,  punktát  
Sterilní   stříkačkou,   po   vytěsnění   vzduchu,   výměně   sterilní   jehly   a   zapíchnutí   do   gumové   zátky  
transport.    
Transport  při  4°C,  při  vyšší  teplotě  může  dojít  ke  kvasným  procesům  tvorbou  plynu  a  porušení  
obalu.    
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Gram,   jen   u   materiálu   odebraných   do   stříkačky   nebo   zkumavky,  
stěry   –   málo   materiálu,   neumožňují   mikroskopii),   kultivačně   (END,   GPA,   aerobně   se   zvýšenou   tenzí  
CO2,  pomnožení  na  bujónu,  KA  pro  anaeroby)

7. otázka  –  Aerobní  kultivace  (základní  podmínky,  půdy).  Odběr  a  

transport  moče  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Aerobní  kultivace  
Cílem   je   získat   mikroba   z  klinického   materiálu   v  čisté   kultuře   -­‐>   izolace   pro   určení,   provedení  
antigenní   analýzy   a   určení   citlivost   na   ATB.   Kultivační   průkaz   se   provádí   na   neživém   prostřední  
kultivačních  půd  různého  složení  podle  náročnosti  mikroba.    
Někteří   mikrobi   (viry,   rickettsie,   chlamydie)   rostou   jen   v  živých   buňkách   kuřecího   embrya   nebo  
tkáňové  kultury.    
Lze   použít   takové   postupy   a   půdy,   které   poskytují   optimální   podmínky   pro   růst   a   množení  
mikrobů:    1)  Dostatečná  vlhkost  prostředí  (nutná  pro  metabolismus)  
2)   Optimální   teplota   (většina   bakterií   37°C   –   lidské   tělo;   mezofilní   bakterie   20-­‐40°C,  
psychrofilní  0-­‐20°C,  termofilní  >40°C)  
3)  Optimální  pH  (7,2  –  7,4  ;  kyselejší  půdy  pro  laktobacily,  alkalické  pro  Vibria)  
4)  Vhodná  izotonie  média  (0,1-­‐1%  NaCl)  
5)  Dostatek  živin  (autotrofy  –  pouze  anorg.  látky,  heterotrofy  –  organické    
6)   Vhodné   plynné   prostředí   (striktně   aerobní,   fakultativně   anaerobní,   striktně   anaerobní,  
anaerobní  aerotolerantní,  mikroaerofilní,  kapnofilní)  
7)  Přiměřená  délka  kultivace  –  16-­‐24  hodin,  aktinomycety  až  10  dní,  mykobakterie  3-­‐9  týdnů!  
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Druhy  kultivačních  půd  

Podle  složení  
Přirozené  půdy  (komplexní)  –  živný  bujón,  není  chemicky  definován  
Syntetické  půdy  (definované)  –  sestaveny  z  chemicky  popsaných  sloučenin  
Podle  konzistence  
Tekuté   půdy   –   umožňují   pomnožení   bakterií,   ale   ne   rozlišení   čisté   kultury   a   směsi   bakterií.  
Mikrobi  rostou  ve  formě  blanky  na  hladině  nebo  ve  formě  difusního  zákalu  nebo  sedimentu.    
Polotuhé  půdy  –  odvozeny  od  tekutých  přidáním  menšího  procenta  agaru.  Sledování  pohybu  (při  
pohybu  -­‐>  zákal  v  celé  zkumavce,  bez  jen  na  povrchu),  očkujeme  vpichem  ve  zkumavce.    
Tuhé   půdy   (pevné)   –   určené   k  diagnostice   bakterií,   přidání   1-­‐2%   agarové   řasy,   mikrobi   rostou  
v  koloniích.    
Podle  funkce  
Základní  půdy  –  umožňují  růst  většiny  bakterií  
Diagnostické   –   obsah   látek,   které   se   mění   vlivem   metabolismu   mikroba   -­‐>   projev   změnou  
morfologie,  barvy  kolonie  (půdy).  Příkladem  je  krevní  agar,  na  kterém  můžeme  rozlišovat  různé  typy  
hemolýzy:    •  alfa  hemolýza  –  viridace,  změna  hemoglobinu  ve  verdoglobin  zelenohnědé  barvy  
(Streptococcus  pneumoniae,  Streptococcus  mutans)  
•   beta   hemolýza   úplná   –   rozpad   ERY,   rozložení   krevního   barviva   –   projasnění   kolem  
kolonie  (Streptococcus  pyogenes,  Staphylococcus  aureus  prod.  alfa-­‐lyzin)  
•  beta  hemolýza  neúplná  –  červená  barva  krevního  agaru  se  ztrácí,  půda  zůstává  
zakalená  –  ERY  jen  částečně  narušeny  (Staphylococcus  aureus  prod.  beta-­‐lyzin)  
•  gama  hemolýza  –  anhemolytické  bakterie,  nic  se  nestane.  
Selektivní   půdy   –   výběrový   růst   patogenů,   souč.   látky   potlačující   růst   nežádoucích   mikrobů  
(Sabouardův  agar  -­‐  kvasinky,  Selenitový  bujón  –  salmonely)  
Selektivně  diagnostické  půdy  –  obsahují  inhibitor  růstu  nežádoucích  mikrobů  a  vhodný  substrát  
a   indikátor   změn.   Endova   půda   (Enterobakterie),   Deoxycholát-­‐citrátový   agar   (Enterobakterie),  
Wilsonova  půda  (Salmonella  Typhi),  Claubergova  půda  (Corynebacterium  diphteriae),  žluč-­‐eskulinový  
agar  (enterokoky)  
Transportní  půdy  –  umožňují  přežití  mikrobů  ve  stejném  počtu  v  době  mezi  odběrem  klinického  
materiálu  a  jeho  zpracováním  v  laboratoři.  Stuartova,  Amiesova  půda.    
Pomnožovací   půdy   –   tekuté,   slouží   k  pomnožení   bakterií   ve   vzorku,   kde   předpokládáme   malý  
počet  mikrobů.    
 
Nejčastěji  využívané  půdy  
Masopeptonový   agar   –   MA,   bezbarvé   nic,   bez   zápachu,   masová   voda   obohacená   o   1-­‐2%  
peptonu,  0,5%  NaCl  a  přídavek  2%  agarové  řasy.    
Krevní   agar   –   KA,   červená,   selektivně-­‐diagnostická   půda,   přídavek   7-­‐10%   ochlazené   ovčí   krve  
k  živnému  agaru.    
Čokoládová  agar  –  ČA,  hnědý,  přídavek  krve  za  vyšší  teploty  –  hemolýza,  uvolnění  živných  látek  
do  půdy  –  růst  náročnějších  bakterií  (Hemophilus).    
Levinthalův  agar  –  LEV,  hemolyzovaná  krav  je  přefiltrována,  nažloutlé  médium.    
Endova   půda   –   END,   selektivně   diagnostická   pro   G-­‐   tyčinky.   Růžová,   inhibitor   G+   je   fuchsin,  
diagnostika   –   laktóza   +   indikátor   fermentace   –   Schiffovo   reagens.   Bakterie   štěpící   laktózu   (+)   červené  
kolonie,  bakterie  neštěpící  laktózu  (-­‐)  bledé,  růžovoučké  kolonie.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Deoxycholát-­‐citrátový  agar  –  DCA,  selektivně  diagnostický  pro  G-­‐  tyčinky,  oranžovo-­‐žlutý.  Obsah  
thiosíranu   (inhibice   G+),   stejný   efekt   jako   END   +   tvorba   H2S   (citrát   železitý)   –   (+)   černě   zbarvený   střed  
kolonie,  (-­‐)  bledé  kolonie.    
Sabouardův   agar   –   GPA,   bezbarvý   až   nažloutlý,   značí   se   X,   nakysle   voní.   Kultivace   kvasinek   a  
plísní,  obsah  glukózy  a  peptonové  vody,  chloramfenikol  –  ATB  inhibice  mikrobů.    
Základní  trojice  půd  vždy  očkovaných:  KA,  END,  GPA  
 
Popis  kolonií  na  pevných  půdách  
Kolonie   –   populace   miliónů   bakterií   vzniklá   postupným   dělením   jedné   buňky.   Popisujeme  
velikost,   tvar,   profil   (plochý,   vypouklý),   okraj,   povrch   (hladký,   lesklý,   matný…),   barva,   konzistence,  
změna  půdy  v  okolí  kolonie,  vůně  (květinový  –  pseudomonáda  –  jasmín,  kvasný,  plísňový).  
Některé  bakterie  –  ne  kolonie  ale  povlak  -­‐>  typ.  Rod  Proteus  (Raussův  fenomén).    
  V  
Odlišujeme  různé  růstové  fáze:     P   I  
O   R  
• M-­‐fáze  –  mukózní,  hlenovité,  vypouklé,  lesklá,  způsobená  přítomností  pouzdra   K   U  
L   L  
• S-­‐fáze  –  hladké,  lesklé,  mazlavé   E   E  
S   N  
• R-­‐fáze  –  drsná  (rough),  kráterky,  sušší,  matném  nerovné  okraje,  rozbrázděný  povrch.       C  
E  
 
Očkování  půd  
Tekuté   půdy   –   tužší   materiál   přenášen   kličkou   na   vnitřní   obnaženou   stěnu   šikmo   nakloněné  
zkumavky.    
Pevná   půda   –   odběrovým   tamponem   nebo   kličkou   -­‐>   inokulum,   sterilní   kličkou   vytahujeme   tři  
čáry,  kolmo  na  ně  tři  čáry  a  pak  zakončíme  vlnovkou.  
Můžeme  vkládat  ATB  disky  –  provádíme  jehlou!  
 
Odběr  a  transport  moče  na  bakteriologické  vyšetření  
Moč  
Před   odběrem   nutné   omytí   genitálu,   odebírá   se   střední   proud   moči   (u   uretritidy   počáteční   u  
postižení  ledvin  konečný!).  Případně  katetrizace  nebo  suprapubická  punkce.  Do  sterilních  plastových  
kontejnerů  s  pevným  uzávěrem.  
Neskladuje   se  –   snadná   dostupnost,   výjimečně   až   18   hodin   při   4°C.   Transport   při   nízké   teplotě   –  
při  vyšší  teplotě  by  došlo  k  přemnožení  bakterií  bez  klinického  významu.    
Zpracovává   se   kultivačně   (do   2   hodin   po   odběru,   KA,   END,   počet   kolonií   >105   signifikantní),  
průkazem  antigenu  (neobvyklé,  hl.  diagnostika  pneumonií).    
Speciální  zpracování  –  Urikult,  komerční  souprava,  sterilní  nádobka  +  nosič  s  agarovými  půdami  
(ponoří   se   do   nádobky   s  močí   –   inokulace).   Po   inkubaci   vyrostou   na   půdách   kolonie   mikrobů  
v  závislosti  na  jejich  kvantitě.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

8. otázka  –  Aerobní  kultivace  (zpracování  výtěru  z  krku).  Odběr  a  

transport  stolice  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Zpracování  výtěru  z  krku  
Provádí   se   sterilním   vatovým   tamponem   zvlhčeným   fyziologickým   roztokem.   Šroubovitým  
pohybem  otřeme  povrch  obou  mandlí,  nutno  vyhnout  se  jazyku.  Nejčastějším  nálezem  je  stafylokok  a  
streptokok.  
Očkujeme   na   KA,   END   a   GPA.   Vytvoříme   inokulum   odběrovým   tamponem.   Sterilní  
bakteriologickou   kličkou   roztahujeme   inokulum   čtyřmi   čarami,   vypálíme   kličku,   uděláme   kolmo   na  
konce  těchto  čar  další  čtyři  čáry,  opět  vypálíme  kličku  a  dokončíme  roztažení  vlnovkou.    
Výsledkem   je   naředění   bakteriální   kultury   tak,   abychom   oddělili   jednotlivé   čisté   kultury   -­‐>  
izolace.    
Do   inokula   se   vkládá   ATB   disk   Vankomycin-­‐colistin   -­‐>   potlačuje   G+,   umožňuje   záchyt  
meningokoda  a  neisserie  (jsou  resistentní),  v  místě  křížení  čar  se  nanese  stafylokoková  čára  (kolonie  
Stafylococcus   aureus)   a   na   ni   se   vkládá   bacitracinový   ATB   disk   -­‐>   záchyt   Hemofilů   (mikroflóra  
potlačena,  aureus  mu  uvolní  živiny  pro  růst).    
 
 
 
Bacitracinový  disk  
Vankomycin  –  colistinový  disk  
Stafylokoková  čára  
Inokulum  
 
 
 
 
 
 
 
 
Odběr  a  transport  stolice  na  bakteriologické  vyšetření  
Stolice  
Pro  bakteriální  vyšetření  rektální  výtěr  –  do  konečníku  se  zavede  zvlhčený  tampon  a  pootočí  se  
jím,  vloží  se  do  transportní  půdy  (Amiesova).  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového   kontejneru.   Průkaz   roupů   –   stěr   z  análních   řas   Schüffnerovou   tyčinkou   nebo   otisk   lepicí  
páskou  
Transport  při  teplotě  4°C,  uchovávání  také  -­‐>  při  vyšších  teplotách  hrozí  kvasné  reakce.  
Zpracování   kultivačně   na   KA,   END,   DCA,   Selenitový   bujón   (pomnožení   Salmonella),   půda   pro  
záchyt   Yersenií,   půda   pro   záchyt   Campylobacterů   (mikroaerofilní   atmosféra   +   CO2),   průkaz   cholery  
(alkalická   peptonová   voda),   průkaz   antigenů   při   podezření   na   virovou   etiologii,   mikroskopie   při  
parazitologickém  a  mykologickém  vyšetření.  
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

9. otázka  –  Anaerobní  kultivace.  Zpracování  hnisu  Fortnerovou  metodou.  

Odběr  a  transport  materiálu  na  parazitologické  vyšetření.  
 
Anaerobní  kultivace  
Bakterie   nesnášenlivé   ke   kyslíku,   E   získávají   fermentací   nebo   anaerobní   respirací   (akceptorem   e-­‐  
není   O2).   Mikroby   anaerobní   aerotolerantní   nevyužívají   O2   pro   zisk   E,   ale   jsou   schopny   snášet   běžnou  
atmosféru.    
Toxicita   kyslíku   je   dána   enzymatickým   vybavením   –   nemají   enzymy   k  rozložení   jedovatých  
peroxidů,   superoxidů   a   hydroxylových   radikálů.   Odolnější   druhy   –   některé   méně   účinné   enzymy,  
metabolismus  se  vznikem  menšího  množství  peroxidů.  Citlivost  ke  kyslíku  závisí  taky  na  růstové  fázi  
bakteriální  kultury,  druhu  kultivační  půdy,  rychlosti  průniku  kyslíku  k  buňce  a  na  procesech  brzdících  
tento  průnik.    
Ochrana   anaerobů   –   přidání   redukujících   látek   do   kultivačního   média   (příjemci   O2),   sníží   se  
oxidoredukční   potenciál   (Eh)   prostředí   vznikající   jako   důsledek   rovnováhy   redukovaných   a  
oxidovaných  sloučenin.  Iniciální  Eh  –  mikrobi  se  začínají  množit,  finální  Eh  po  jejich  pomnožení.  Pro  
množení  anaerobů  –  záporné  hodnoty  Eh  (<-­‐100mV).  
 
Možnosti  dosažení  optimálních  podmínek  pro  anaerobní  kultivaci  
Fyzikální  
1) Regenerace   tekutých   a   polotuhých   půd   –   povaření,   ztrácí   se   rozpuštěný   kyslík.   10-­‐20minut,  
převrstvíme  olejem  nebo  vazelínou  (zamezení  přístupu  O2)  
2) Anaerostat  –  nádoba,  z  níž  je  možno  vývěvou  odsát  vzduch  a  vytvořit  umělou  atmosféru  bez  
kyslíku  pro  inkubaci.  Obsah  jiných  plynů  (CO2,  N2,  H2).1  
Chemické  
1) Přidání  redukujících  látek  –  snížení  Eh,  většinou  cystein  nebo  glukóza,  thioglykolát…)  
2) Anaerostat  –  vhodné  prostřední  vytvoříme  chemickou  reakcí,  která  spotřebuje  O2  v  nádobě,  
uvolňuje  se  H2  a  CO2.  (křemelina,  železný  prášek,  kys.  citrónová,  Na2CO3).1  
Biologické  
1) Fortnerova   metoda   –   využití   symbiózy   anaerobů   a   aerobů.   Fakultativní   anaerob   spotřebuje  
kyslík,   sníží   tak   Eh   a   umožní   množení   a   růst   anaeroba.   Nevýhoda   –   pomalý   postup  
anaerobiózy,   nedostatečná   hloubla   –   velmi   náročné   anaeroby   nevyrostou.   Může   dojít   ke  
kontaminaci  materiálu  použitím  fakult.  anaer.  kmenem.    
 
Provedení  Fortnerovy  metody  
1) Na  jednu  polovinu  půdy  v  petriho  misce  rozočkujeme  vyšetřovaný  materiál.  
2) Druhou  polovinu  v  silné  vrstvě  naočkujeme  kmene  Serratia  marcescens  (fak.  anaer.)  
3) Uzavřeme,   okraje   misky   s  půdou   musí   zapadnout   do   drážky   na   zevní   straně   víčka,   zajistí   se  
v  okolí  lepící  páskou.  
4) Inkubace  nejméně  2  dny  při  teplotě  37°C.  
 
Půdy  pro  anaerobní  kultivaci  
Tekuté  
                                                                                                                       
1
  Lze   doplnit   metodou   katalytickou   –   pomocí   paladiového   katalyzátoru   dochází   k  reakci   mezi   kyslíkem   a  
vodíkem  -­‐>  vzniká  voda  zvlhčující  kultivační  prostředí  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

1) VL  bujón  –  masopeptonový  bujón  s  NaCl,  kvasnicovým  extraktem  a  cysteinem,  po  obohacení  

cukry  nebo  dusičnanem  a  příslušnými  indikátory  může  sloužit  jako  diagnostická  půda.  Není  
vhodný  pro  průkaz  toxinů.  
2) VF  bujón  –  masopeptonový  bujón  s  obsahem  masa  natráveného  pepsinem.    
Polotuhé  
1) Veillonův   hloubkový   agar   –   VL   bujón   obohacený   o   0,8%   agaru.   Je   možno   sledovat   rozvrstvení  
bakterií   podle   jejich   vztahu   ke   kyslíku   -­‐     Obligátní   aerobi   rostou   na   povrchu,   fakultativní  
v  difusně  všude,  anaerobi  v  hloubce.    
Pevné  
1) VL  krevní  agar  –  s  plnou  ovčí  krví,  růst  se  projeví  zákalem  
2) Schaedlerův  agar  
Nutné  rychlé  použití,  uchování  v  chladničce  –  difuse  O2  do  média  
3) Wilkins  –  Chalgrenův  agar  
 
Zvláštnosti  odběru  a  transportu  
Nejlepším   transportním   médiem   je   vlastní   infekční   materiál,   doba   transportu   musí   být  
minimální,   zajištění   inertní   atmosféry   s  dostatečnou   vlhkostí,   tekuté   vzorky   do   stříkačky,   vytěsnit  
vzduch,   nasadit   novou   jehlu   a   zapíchnout   do   gumové   zátky,   zajistit   píst   proti   posunutí.   Materiál   na  
tampónu  ve  zkumavce  s  CO2,  ponořený  do  transportní  půdy.    
Nutno  získat  co  největší  množství  materiálu  a  zabránit  vysychání.    
Výskyt  –  kůže,  sliznice,  adnexa,  HCD  (tonzily,  gingiva,  ÚD),  GIT  (hl.  tlusté  střevo  (není  tam  tolik  
vzduchu  jako  v  žaludku  a  tenk.  střevě  –  spolykaný  vzduch),  UGT  (uretra,  vagina)  
 
Odběr  a  transport  materiálu  na  parazitologické  vyšetření  
Nález  parazita  nebo  jeho  části  u  pacienta  se  neprodleně  posílá  v  uzavřeném  kontejneru  (možno  
ve  fyziologickém  roztoku)  do  laboratoře.  Odebírá  se:  
Stolice  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového  kontejneru.  Opakovaně,  nejméně  třikrát  obden.  
Stěr  z  análních  řas  (Perianální  stěr)    
Zvlhčenou  Schüffnerovou  tyčinkou,  kruhovým  pohybem  opláchneme  v  kapce  vody  na  podložním  
skle  a  necháme  zaschnout.  
Perianální  výtěr  
Zvlhčená  Schüffnerova  tyčinka  se  vsune  až  na  okraj  konečníku.  
Perianální  olep  
Průsvitná   lepicí   páska   se   přilepí   přes   anální   otvor   a   sevřením   hýždí   se   přitlačí   do   intergluteální  
rýhy,  nalepí  se  na  podložní  sklo  a  odešle  do  laboratoře.  
Kapilární  krev  
Krev  z  bříška  prstu  –  tenký  nátěr  a  tlustá  kapka  na  dvou  podložních  sklech.    
Duodenální  obsah    
Endoskopicky,  transport  v  uzavřené  zkumavce.  
Moč  
Poslední  porce  ranní  moči,  50-­‐100ml  v  uzavřené  nádobě.    
Uchovávání  výjimečně  při  4°C,  transport  neprodleně.    
Zpracovává   se   mikroskopickými   metodami   (nativní   preparát,   Giemsa,   Ziehl-­‐Neelsen,   Kato…),  
molekulárně  genetickými  metodami  a  Sérologickými  metodami.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

10. otázka  –  Difuzní  agarová    metoda,  stanovení  účinku  kombinace  

antibiotik.  Odběr  a  transport  krve  na  sérologii.  
 
Určování  citlivosti  mikrobů  na  ATB  
Výsledkem   má   být   cílená   a   účelná   léčba,   vyhodnocení   antimikrobiálních   účinků   nových   látek,  
epidemiologické  studie.    
Nejvhodnější   antimikrobiální   léčba   je   podmíněna:   vlastnostmi   makroorganismu   a   charakterem  
infekce,   vlastnostmi   etiologického   agens   včetně   jeho   citlivosti   nebo   resistence   k  antimikrobiálním  
přípravkům.    
 
Difuzní  agarová  metoda  
Orientační,   zdrojem   ATB   jsou   disky   z  filtračního   papíru   impregnované   stanoveným   množstvím  
ATB   a   následně   vysušené.   Při   položení   na   půdu   -­‐>   difuse   ATB   do   okolí   za   vzniku   koncentračního  
gradientu   (kolem   disku   nejvíce   ATB).   U   citlivých   bakterií   –   inhibiční   zóna   v  okolí   disku,   resistentní  
narostou   až   k  disku.   Velikost   z´´ony   je   ovlivněna   stupněm   citlivosti   testovaného   kmene   a   difusibilitou  
ATB,   pH   půdy,   výškou   a   bobtnavostí   půdy,   koncentrací   agaru,   živnými   látkami,   velikostí   inokula   a  
rychlostí  bakteriálního  množení.    
Dovoluje   pouze   kvalitativní   hodnocení,   množství   ATB   v  disku   je   stanoveno   tak,   aby   koncentrační  
gradient  dopovídal  hodnotám  dosažitelným  v  makroorganismu.    
 
Provedení  
1) Připravíme  inokulum  –  3-­‐5  kolonií  bakt.  kultury  přeneseme  kličkou  do  2ml  bujónu,  upravíme  
na  koncentraci  cca  1,5-­‐3  x  108  bakt./1ml  fyziologickým  roztokem.    
2) Inokulum   rozočkujeme   roztěrem   nebo   přelitím   na   pevnou   půdu   (musí   být   suchá!.   Na   vlhkých  
se   nevytváří   hodnotitelné   zóny   inhibice).   Při   očkování   přelitím   nutno   ředit   fyziologickým  
roztokem  1:10!    
3) PO  zaschnutí  umístíme  na  půdu  ATB  disky  2cm  od  okraje  a  2,5  cm  od  sebe  v  kruhu  (většinou  
6  disků).  Po  kontaktu  disku  s  agarem  nepřemisťovat!  –  už  je  zahájena  difuse.    
4) Inkubace  1-­‐18  hodin.    
Hodnocení   dle   velikosti   inhibičních   zón   -­‐>   porovnány   s  definovanými   kritérii   (hranice  
citlivosti/resistence)   pro   konkrétní   ATB   a   bakterii.   Citlivost   je   definována   průměrem   inhibiční   zóny  
větším  nebo  rovným  stanovené  hranici.    
Výsledkem  stanovené  citlivosti  je  antibiogram  –  umožní  výběr  nejvhodnějšího  ATB.    
 
Stanovení  účinku  kombinace  ATB  
Indikace   pro   kombinaci   ATB:   infekce   nejasné   etiologie,   závažné   život   ohrožující   infekce,  
polymikrobiální   infekce,   oddálení   vzniku   resistence,   blokáda   negativního   vlivy   beta-­‐laktamáz   či   jiných  
bakt.   enzymů.   Nevýhody:   alergie,   možnost   kolonizace   multiresistentními   bakteriemi,   kvasinkami   a  
plísněmi,  vyšší  náklady.    
Interakce  ATB  je  buď  synergická  (vyšší  účinek  než  samost.),  indiferentní  (bez  změny  účinku)  nebo  
antagonistická  (snížený  účinek).    
Provádí  se  kvalitativním  difusním  nebo  dilučním  testem:  
Difuzní  disková  metoda  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Stejný   postup   jako   u   difuzní   agarové   metody,   na   povrch   se   kladou   disky   s  ATB,   jejichž  
kombinovaná   účinnost   je   posuzována.   Vzdálenost   dvou   disků   asi   12mm,   inkubace,   určení   tvaru  
inhibičních  zón  po  kultivaci.    
 
Difuzní  proužková  metoda  
Stejný  postup  jako  u  difusní  agarové  metody,  proužky  se  kladou  na  povrch  půd  v  pravém  úhlu,  
konce  se  dotýkají,  hodnotí  se  tvar  inhibičních  zón.    
 
Diluční  metoda  
Řada   kvantitativně   odstupňovaných   kombinací   dvou   ATB   v  různých   poměrech.   PO   inkubaci  
stanovujeme  MIC  nebo  MBC  kombinace  v  porovnání  s  jednotlivými  ATB.    
 
Odběr  a  transport  krve  na  sérologii  
Dezinfekce   kůže   v  místě   vpichu,   venepunkcí   odběr   10-­‐20ml   krve,   srážlivá   krev,   transport   ve  
zkumavce  s  pevným  uzávěrem.  
Krev  se  centrifuguje,  sérum  se  odsaje  a  rozplní  do  několika  malých  zkumavek,  uchovávají  se  při  -­‐
20°C  a  rozmrazí  se  bezprostředně  před  provedením  reakce.    
Sérum   nesmí   být   chylózní   (odběr   na   lačno),   kontaminované   (venepunkce   lege   artis)   ani  
hemolytické  (rychlý  transport  bez  mechanických  inzultů  a  zahřátí).    
 
11. otázka  –  Stanovení  MIC  a  MBC.  Odběr  a  transport  materiálu  ze  sliznic  a  
kůže  na  bakteriologické  vyšetření.  
Stanovení  MIC  a  MBC  
MIC   =   Minimální   inhibiční   koncentrace   ATB,   tedy   nejnižší   koncentrace,   která   inhibuje   růst  
bakterie.    
MBC   =   Minimální   baktericidní   koncentrace,   tedy   koncentrace,   která   nedovolí   přežití   ani   jediné  
bakteriální  buňky.    
Provádí  se:  
E-­‐test  
Vychází   z  difuzního   agarového   testu,   zdrojem   ATB   je   plastikový   proužek   s  obsahem  
exponenciálně   rostoucí   koncentrace   ATB.   Proužky   jsou   kladeny   na   inokulovanou   půdu,   po   16-­‐18  
hodinách  hodnotíme  zóny  inhibice.  Kde  zóna  inhibice  protíná  proužek,  tam  se  nachází  hodnota  MIC.    
 
 
 
 
Diluční  testy  
Používají   se   odstupňované   koncentrace   ATB   v  tekutých   nebo   tuhých   půdách,   půdy   jsou  
inokulovány   standardním   množstvím   čisté   kultury   testovaného   kmene.   Zjišťujeme,   při   kterém  
nejmenší   množství   ATB   došlo   k  zástavě   viditelného   růstu   bakteriální   populace.   Tato   hodnota  
odpovídá   MIC.   Kontrola   kvality   ATB   přípravku   se   provádí   pomocí   referenčních   kmenů   se   známým  
výsledkem  MIC  (kontrola  růstu,  v  jamce  vpravo  nahoře).  
Lze  stanovit  i  MBC  přeočkováním  ze  všech  koncentrací  bez  viditelného  růstu  na  půdy  bez  ATB.  
Nejnižší  koncentrace,  při  které  nedojde  k  růstu,  odpovídá  MBC.  MBC  ne  nemusí  rovnat  MIC!!  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Diluční   mikrometoda   –   v  jamkách   mikrotitrační   destičky   přesně   definované   koncentrace   ATB   v  

100µl  bujónu,  po  naočkování  vyšetřovaným  kmenem  a  inkubaci  se  odečítá  MIC.  Obvykle  12  ATB  v  8  
koncentracích   na   jeden   kmen.   Porovnává   se   růst   testované   bakterie   v  kontrolní   jamce   bez   ATB  
s  růstem   v  jamkách   s  ATB.   Odečte   se   MIC.   Kmeny   s  MIC   shodnou   nebo   nižší   než   je   hraniční  
koncentrace  se  označí  jako  citlivé  k  ATB  (breakpoint2).    
Agarová   diluční   metoda   –   použití   agarových   půd   obsahujících   vzestupné   koncentrace   jednoho  
ATB.   12-­‐15   koncentrací,   ředěných   dvojnásobně   geometrickou   řadou.   Ne   půdy   se   očkuje   inokulum  
v  objemu   1-­‐2µl.   Většinou   více   kmenů   na   jednu   koncentraci   (jedna   petriho   miska   až   20   kmenů).   PO  
inkubaci  hodnotíme  formu  růstu  testovaného  kmene  na  půdě  bez  ATB,  podle  toho  odečítáme  MIC.    
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Odběr  a  transport  materiálů  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření  
Výtěry,   sterilní   vatové   tampony   s  vhodnou   transportní   půdou,   před   užitím   vhodné   zvlhčit  
fyziologickým   roztokem.   Transportní   půdy   by   měly   být   předehřáté   na   pokojovou   teplotu,   chránit  
před  vysycháním.    
Výtěr   z  krku   –   šroubovitým   pohybem   otřeme   povrch   obou   mandlí,   nutno   vyhnout   se   jazyku  
(stafylokok,  streptokok).  
Výtěr   z  ucha   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   zvukovod   (stafylokok,   pneumokok,  
pseudomonády).  
Výtěr   z  dutiny   nosní   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   sliznice   obou   dolních   nosních   průduchů  
(stafylococcus  aureus,  diplococcus  pneumoniae).  
Výtěr   ze   spojivkového   vaku   –   po   odchlípení   víčka   nabíráme   na   tampon   sekret   ze   spojivkového  
vaku,  stěr  z  vřídků  na  okraji  víček,  spojivce  a  rohovce  (Stafylokok).  
Výtěr   z  ran   a   kožních   lézí   –   stíráme   spodinu   při   periferii   rány,   případně   se   po   desinfekci  
alkoholem   seškrábnou   sterilním   skalpelem   kožní   šupiny,   vzorky   nehtů   nebo   podnehtového   detritu,  
úlomky  postižených  vlasů.    
Výtěr   z  pochvy   –   za   kontroly   poševního   zrcadla,   z  děložního   čípku   a   klenby   poševní  
(Lactobacillus,  stafylococcus,  Trichomonas)    
Výtěr  z  uretry  (kožní  flóra,  diplokoky)  
Tampon   bez   transportního   média   neumožňuje   skladování,   doba   transportu   by   neměla  
přesáhnout   2hod,   teplota   4°C.   Tampon   s  transportním   médiem   umožňuje   přežívání   bakterií,  
zachovává   její   původní   kvantitativní   poměry.   Doba   skladování   by   neměla   přesáhnout   24   hodin   a  
teplota  4°C.  
 

                                                                                                                       
2
  Vyšší   hodnoty   než   breakpoint   nelze   v  organismu   dosáhnout   –   proto   ATB   s  MIC   vyšší   než   breakpoint   nejsou  
k  užitku.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

12. otázka  –  Aglutinace,  sérotypizace  Escherichia  coli.  Odběr  a  transport  

materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Sérologické  reakce  
Složkami  jsou    
Antigeny   –   cizorodé   látky   vyvolávající   imunitní   reakci   organismu.   Korpuskulární   (bakterie,   viry,  
mikromycety…)  a  nekorpuskulární  (enzymy,  toxiny…),  jsou  koloidního  charakteru.  Inaktivace  antigenů  
–  teplem  nebo  chemicky.    
Protilátky  –  nacházejí  se  v  séru  a  jiných  tělních  tekutinách.    
Vehikulum   –   prostředí   reakce,   fyziologický   roztok,   kterým   se   sérum   ředí.   Vytvoří   se   tak   roztok  
elektrolytů   nutný   pro   uskutečnění   sérologických   reakcí.   Ve   spec.   případech   se   používají   pufry  
s  vápenatými  a  hořečnatými  kationty.    
Reakce   se   provádí   v  kvalitativní   variantě   (zda   je   nebo   není   přítomna   protilátka)   nebo   ve   variantě  
kvantitativní   (stanovuje   se   množství   protilátek,   sérum   se   ředí   a   určuje   se   titr   =   obrácen   hodnota  
nejvyššího   ředění   séra   dávajícího   ještě   pozitivní   reakci   –   1:160   =   160,   podle   něj   zjistíme,   v  jakém  
stadiu  infekce  jsme  –  velký  titr  –  vrchol  infekce,  malý  titr  -­‐  počátek)  
Pro  uvažované  etiologické  agens  hovoří  průkaz  signifikantního  vzestupu  titru  protilátek,  Používá  
se  k  přímému  důkazu  původce  infekce  –  známou  složkou  je  protilátka  určujeme  antigen.    
Výskyt  IG:  IgA  –  aktivní  infekce,  IgM  –  prvoinfekce,  IgG  –  opakovaná  infekce,  po  očkování,  IgE  –  
alergická  reakce,  parazitární  infekce.    
 
Aglutinace  
Reakce   korpuskulárního   antigenu   (aglutinogenu)   se   specifickou   protilátkou   (aglutininem)   za  
vzniku  komplexu  (aglutinátu)  ve  formě  vloček  nebo  sraženin.  Probíhá  ve  dvou  fázích:    
1) Specifická   –   rychlá   vazba   mezi   antigenem   a   protilátkou,   antigen   je   senzibilizován   a   mění   se  
některé  jeho  vlastnosti  (hl.,  snížení  povrchového  napětí)  
2) Nespecifická   –   pouze   v  prostředí   elektrolytů,   vypadává   senzibilizovaný   antigen   obaleny  
protilátkou  ze  suspenze  v  podobě  vloček  nebo  sraženiny.    
V  reakci  převládá  antigen  nad  protilátkou.    
 
Typy  aglutinačních  reakcí  
1) Přímá   aglutinace   –   známou   složkou   je   antigen,   prokazovány   jsou   protilátky,   používá   se   ke  
stanovené  titru  protilátek.    
a. Widalova   reakce   –   průkaz   Salmonelózy.   Řady   po   osmi   zkumavkách   podle   počtu  
antigenů   (antigeny   somatické   O,   termostabilní   a   bičíkové   H,   termolabilní),  
hodnotíme  vznik  aglutinátu  proti  světlu  –  O  aglutinace  –  zrnité  sraženiny  a  vyčeření  
tekutiny,   neroztřepatelný,   H   aglutinace   –   lehké   kypré   chomáčky   či   vločky   na   dvě  
s  vyčeřením   tekutiny,   roztřepatelný,   Vi   aglutinace   –   krajkovitý   charakterem  
roztřepatelný,  K  aglutinace  –  korpuskulární.    
2) Nepřímá   aglutinace   –   antigen   koloidního   charakteru   je   navázán   na   korpuskulární   nosič  
(Erytrocyt,   latex),   prokazovány   protilátky   ve   vyšetřovaném   vzorku.   Na   povrch   nosiče   lze  
precipitogen   navázat   specifickou   adsorpcí   nebo   chemickou   reakcí.   Prokazujeme   protilátky  
v  séru.  Lze  navázat  i  protilátku  -­‐>  prokazován  antigen.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

3) Aglutinace   zpětná   (sklíčková)   –   průkaz   antigenu   pomocí   hyperimunního   séra   z   imunizace  

zvířat).  Využití  v  sérotypizaci  bakterií.  Na  masopeptonovém  agaru  je  naočkován  kmen  E.  Coli,  
nutné   posoudit   enteropatogenitu   -­‐>   „mléčná“   suspenze   ve   fyziologickém   roztoku   na  
podložním   skle,   na   druhé   podložní   sklo   přeneseme   kličkou   několik   kapek   (dle   počtu  
diagnostických  sér),  sterilními  kličkami  umístíme  naproti  kapek  suspenze  kapky  jednotlivých  
sér,  příslušné  dvojice  se  promíchají,  v  pozitivním  případě  se  tvoří  viditelná  aglutinace.    
 
 
 
 
 
4) Průkaz   inkompletních   protilátek   –   blokujících,   univalentních   protilátek.   Specifická   reakce  
s  antigenem,   nejsou   však   schopny   viditelné   aglutinace   (příslušné   antigenní   determinanty  
jsou  lokalizovány  na  nepřístupných  místech  nebo  je  vazebná  avidita  protilátek  nízká.    
a. Coombsův   test   -­‐>   centrifugace,   supernatant   se   slije,   ke   zbylé   suspenzi   se   přidá  
antiglobulinové   Coombsovo   sérum,   inkubace   1   hod   při   45°C,   v  pozitivním   případě  
dochází  k  aglutinaci  (jsou  to  γ-­‐globuliny  které  jsou  antigenem  pro  antiglobuliny).  
 
Odběr  a  transport  materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření  
Sputum  
Vykašlávání,   nejlépe   ranní,   do   širokých   plastových   kontejnerů   s  pevným   uzávěrem.   Je   možný  
laryngální   výtěr   tamponem   a   ohebné   hliníkové   tyčince   (podržen   nad   epiglottis)   po   zakašlání,  
v  indikovaných  případech  bronchoalveolární  laváž  nebo  aspirace  z  bronchů.  
Nutný   rychlý   transport,   uchovávání   při   4°C   by   mohlo   mít   za   následek   uhynutí   náročnějších  
bakterií,   při   vyšších   teplotách   hrozí   pomnožení   kontaminující   ústní   mikroflóry   a   zkreslení  
kvantitativních  poměrů.  
Zpracování   nutné   do   2   hodin   po   odběru,   provádí   se   homogenizací   (naředění   broncholysinem  
1:1,   protřepání),   mikroskopicky   (Gram   –   ověření,   že   se   jedná   o   sputum,   musí   tam   být   epitelie   a  
leukocyty,   Ziehl-­‐Neelsen   na   TBC)   nebo   kvantitativně   (KA,   END,   GPA;   signifikantní   je   záchyt   >108  
v  1ml),   průkaz   antigenu   (neobvyklé,   použití   pro   dg   pneumonií),   molekulárně   genetické   metody   (hl.  
mycobacteria  tuberculosis)  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

13. otázka  –  Precipitace.  Odběr  a  transport  krve  na  bakteriologické  

vyšetření.  
 
Precipitace  
Nekorpuskulární   antigen   (precipitogen)   reaguje   se   specifickou   protilátkou   (precipitinem)   za  
vzniku  komplexu  (precipitátu).  Reakce  má  2  fáze:  
3) Specifická  –  rychlá  vazba  mezi  antigenem  a  protilátkou  (spojí  se  to),  antigen  je  senzibilizován  
a  mění  se  některé  jeho  vlastnosti  (hl.,  snížení  povrchového  napětí)  
4) Nespecifická   –   pouze   v  prostředí   elektrolytů,   vypadává   senzibilizovaný   antigen   obaleny  
protilátkou  ze  suspenze  v  podobě  vloček  nebo  sraženiny.    
Převládá  protilátka  -­‐>  vhodné  pro  průkaz  antigenu.  Vazbou  precipitogenu  na  korpuskulární  nosič  
se  převádí  na  aglutinaci.    
 
Typy  precipitačních  reakcí  
1) Prstencová   precipitace   v  tekutém   prostředí   –   ve   zkumavkách   nebo   kapilárách,   podvrstvení  
séra   pod   roztok   antigenu.   Na   rozhraní   vrstev   –   bílý   proužek   precipitátu.   Promísením   -­‐>  
suspenze  sraženiny  v  celém  objemu,  usazují  se  na  dně.    
a. Provedení   jako   Ascoliho   termoprecipitační   reakce   –   tkáň   se   rozetře   v  misce   se  
sterilním   mořským   pískem,   přidá   se   10ml   fyziologického   roztoku,   promíchá   se,  
přelije   se   do   větší   zkumavky,   povaří   se   nad   plamenem   kahanu   do   vytvoření  
sraženiny  a  vyčeření  tekutiny,  zfiltruje  se,  filtrát  se  podvrství  hyperimunním  sérem,  
na  rozhraní  vzniká  prstenec.    
2) Precipitační   reakce   v  agaru   –   zkumavkové   a   plotnové   provedení.   Rozlišují   se   jednoduché  
(difunduje  jedna  složka  reakce)  a  dvojité  (difundují  obě  složky  reakce).    
a. Dvojitá   plotnová   imunodifuze   podle   Ouchterlonyho   –   do   vrstvy   agaru   se   vyhloubí   šest  
jamek  po  obvodu  a  jedna  jamka  centrální.  Do  středové  jamky  precipituje  sérum  do  
periferních   antigeny.   Do   agaru   difundují   jak   protilátka,   tak   antigeny.   V  pozitivním  
případě  se  vytváří  precipitační  linie.  Při  křížení  linií  –  odlišné  antigeny,  při  splynutí  –  
totožné  antigeny,  částečné  splynutí  –  příbuzné  antigeny.    
 
Odběr  a  transport  krve  na  bakteriologické  vyšetření  
Krev  
Na   kultivační   vyšetření   minimálně   třikrát   během   jednoho   dne   nejlépe   při   vzestup   teploty   –  
uvolnění  mikrobů  do  oběhu  -­‐>  reakcí  je  pyróza,  dezinfekce  kůže  v  místě  vpichu,  venepunkcí  odběr  10-­‐
20ml   krve,   vstříknutí   do   speciálních   kultivačních   nádobek   (hemokultury,   obsah   bujónu   a  
protisrážlivého   prostředku   s  indikátorem,   anaerobní   i   aerobní   kultivace).   Provede   se   kontrolní   stěr  
z  kůže   –   vyloučení   kožní   kontaminace.   Při   pozitivním   výsledku   se   provádí   mikroskopie   (Gram),  
kultivace  (KA,  END,  GPA,  citlivost).  
Na   sérologické   vyšetření   (srážlivá   krev)   stejná   technika,   transport   ve   zkumavce   s  pevným  
uzávěrem.  
Zpracovává   se   mikroskopií   (kultivace   po   inkubaci,   Gram),   průkaz   antigenů,   detekce   nukleových  
kyselin   a   kultivačně   nejlépe   v  hemokultivačních   nádobkách   pro   anaerobní   a   aerobní   kultivaci.  
Očkování   na   pevné   půdy   se   provádí   až   při   známkách   růstu   mikrobů   (detekce   na   základě   produkce  
CO2)  na  END,  KA  a  GPA.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

 
 
14. otázka  –  Komplement-­‐fixační  reakce,  titrace  komplementu.  Odběr  a  
transport  materiálu  na  mykologické  vyšetření.  
 
Komplement  fixační  reakce  (KFR)  
Probíhá  ve  dvou  fázích:  
1) Specifická  –  váže  se  komplement  na  přítomnou  protilátku  opsonizující  antigen  (až  po  reakci  
antigen   –   protilátka,   zpřístupní   struktury   pro   komplement   na   Fc   fragmentu   protilátky),  
nedochází  k  viditelné  změně.    
2) Indikátorová   fáze   –   přidání   opich   erytrocytů   senzibilizovaných   králičími   protilátkami   neboli  
hemolytický   systém.   Pokud   proběhla   specifická   fáze,   pak   nedojde   ke   změně   na  
hemolytickém   systému   (nedojde   k  hemolýze,   komplement   už   byl   využit,   takže   nenapadá  
antigeny  ovčích  erytrocytů).  Pokud  nespecifická  fáze  neproběhla  a  komplement  je  přítomen,  
dochází  k  hemolýze.  
!!!!!!!Zábrana  hemolýzy  je  (+)  reakce,  hemolýza  je  (-­‐)!!!!!!!!  
 
Složky  KFR:  
1) Vyšetřované   sérum   –   nesmí   působit   antikomplementárně   –   nesmí   obsahovat   konzervační  
látky,   korek   (používána   guma).   Nutno   inaktivovat   přirozený   komplement   (zahřátím   na   30  
minut  ve  vodní  lázni  56°C)  
2) Antigen  –  nutno  zajistit  ředění  boxovou  titrací  
3) Komplement   –   složitý   bílkovinný   systém   přítomný   v  každém   séru.   Mnoho   složek,   některé  
jsou   termolabilní.   Zdrojem   je   sérum   morčat,   přidává   se   v  množství   2   jednotek   (jedna  
jednotka   je   nejmenší   množství   komplementu,   které   umožní   kompletní   hemolýzu  
hemolytického   systému.   Nadbytek   nebo   nedostatek   -­‐>   falešná   pozitivita   nebo   negativita.  
Určuje  se  titrací.    
4) Ovčí  erytrocyty  –  proprané  krvinky  z  defibrilonované  krve.  
5) Králičí  protilátka  proti  ovčím  krvinkám  –  z  imunizace  králíku,  do  reakce  se  přidává  v  předně  
určeném  množství  podle  výsledku  titrace  
6) Ředicí   roztok   –   podmínkou   vazy   komplementu   na   komplex   protilátky   s  antigenem   je  
přítomnost  Ca+2  iontů  a  Mg  +2  iontů  ve  vehikulu.    
 
Provádí  se  v  mikrotitračních  destičkách  kvantitativním  způsobem.    
 
Titrace  komplementu  
1) Morčecí  sérum  se  zředí  fyziologickým  roztokem  1:15  nebo  1:30.  
2) Antigen  se  naředí  stejným  způsobem  jako  pro  vlastní  reakci  (boxovou  titrací).  
3) Připraví  se  řada  osmi  zkumavek,  pipetují  se  složky:    
 
Ředěný  komplement   0,05   0,1   0,15   0,2   0,25   0,3   0,35   -­‐  

Veronalový  izotonický  roztok   0,65   0,6   0,55   0,5   0,45   0,4   0,35   0,7  

antigen   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5  

 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

4) Inkubace  ve  vodní  lázni  při  37°C  30  minut.  Do  zkumavek  nepipetujeme  0,5ml  suspenze  ovčích  
erytrocytů   senzibilizovaných   králičí   protilátkou,   inkubace   37°C   30   minut.   Zkumavka  
s  nejmenším   množstvím   komplementu,   ve   které   došli   k  úplné   hemolýze,   obsahuje   jednu  
jednotku  komplementu.    
 
Odběr  a  transport  materiálu  na  mykologické  vyšetření  
Odebírají   se   seškraby   kůže   (kožní   šupiny,   hyperkeratózy)   a   nehtů,   vlasy,   chlupy   po   desinfekci  
70%   alkoholem   a   výtěry   ze   sliznic   (povrchové   mykózy),   sputum,   moč,   stolice   (odpovídá   odběru   na  
parazitické  vyšetření),  krev  (hluboké  mykózy).    
Nutnost  okamžitého  transportu  do  laboratoře.  Uchovávání  při  teplotě  4°C  
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Louhový   preparát   –   20%   louh,   Parkerův   inkoust   –   má   afinitu  
k  chitinu   –   probarvení   mykotic.   Elementů,   Gram   na   kvasinky   –   modrofialové,   Giemsa,   Burri   –  
Cryptococcus,   Fluoresčenční   –   vazba   na   chitin),   rychlým   průkazem   mykotických   agens   (detekci  
antigenu,   nukleových   kyselin),   kultivačně   (Sabouardův   agar   –   obsah   ATB   chloramfenikolu   potlačí  
bakterie,   minimálně   48   hodin;   Chromogenní   půdy   –   zpracovávání   substrátů   -­‐>   barevné   změny;  
vláknité  houby  2-­‐7  týdnu!)  nebo  nepřímým  důkazem  mykotických  agens  (ELISA,  aglutinace,  KFR).  
 

15. otázka  –  ELISA,  imunofluorescence.  Odběr  a  transport  hnisu,  punktátů  a  

likvoru  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Imunofluorescence  
Pracnost   nezbytné   vybavení   fluorescenčním   mikroskopem.   Jedna   ze   složek   sérologické   reakce   je  
označena   fluorochromem   nebo   enzymem.   Umožňuje   stanovení   jednotlivých   tříd   protilátek   nebo  
detekci  antigenu.    
1) Přímý   test   –   protilátka   proti   antigenu   je   označena   fluorochromem,   na   sklíčko   s  fixovaným  
nátěrem   vyšetřovaného   materiálu   je   aplikována   značená   protilátka,   inkubace,   preparát  
promyt   (nenavázaná   protilátka   se   odstraní.   Místa   s  navázanou   protilátkou   se   v  mikroskopu  
jeví  jako  svítící.    
2) Nepřímý  test  –  Dvě  fáze,  v  první  fázi  reaguje  antigen  s  neznačenou  protilátkou,  ve  druhé  fázi  
reaguje  značení  druhově  specifický  antiglobulin  proti  protilátce  z  první  fáze.  Je  citlivější.    
 
ELISA  
Enzyme-­‐linked   ImmunoSorbent   Assay.   Jedna   ze   složek   reakce   je   značena   enzymem   (křenová  
peroxidáza   nebo   alkalická   fosfatáza,   později   štěpí   substrát   za   změny   zbarvení.   Jedna   složka   je  
fixovaná  na  pevno  fázi  (na  dno  jamky  mikrotitrační  destičky  nebo  proužku).  
1) Průkaz  antigenu  –  na  dno  jamky  se  adsorbuje  specifická  protilátka,  po  promytí,  kdy  se  odplaví  
nenavázaná   protilátka   se   nepipetuje   suspenze   cyšetřovaného   materiálu,   inkubuje   se,  
rpomyje   se,   přidává   se   další   protilátka   proti   detekovanému   antigenu   konjugovaná  
s  enzymem.   Další   inkubace,   další   promytí,   poté   se   přidává   substrát,   za   přit.   Enzymu   je  
rozkádán   -­‐>   barevná   změna.   Vkápnutím   zastavovacího   roztoku   –   ukončení   reakce,   změna  
zbarvení  se  hodnotí  okem  nebo  spektrofotometrem.  Čím  sytější,  tím  více  antigenu.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

2) Průkaz   protilátky   –   na   dno   jamky   se   adsorbuje   antigen,   promytí   přidá   se   vyšetřovaný  

materiál,   inkubace,   promytí,   pipetuje   se   protilátka   proti   lidským   IgA,   IgM,   IgE   a   IgG  
(antiglobulin)   značená   enzymy,   substrát,   barevná   změna.   Stanovujeme   jednotlivé   třídy  
protilátek.    
Obecně  –  žlutá  (+)  bez  barvy  (-­‐).  
 
 
Odběr  a  transport  hnisu,  punktátů  a  likvoru  na  bakteriologické  vyšetření  
Mozkomíšní  mok  
Lumbální   punkce   sterilní   kautelou,   přísně   asepticky   do   stříkačky,   poté   do   sterilní   zkumavky  
s  pevným  uzávěrem.  
Transport   nutný   co   nejrychleji,   nutné   okamžité   zpracování.   Případně   inokulace   do   lahviček   na  
hemokultury  a  ponechání  při  pokojové  teplotě  pro  odložení.    
Zpracování   centrifugací   (bakterie   a   lymfocyty   při   zánětu   by   vytvořily   sediment),   mikroskopicky  
(Gram,  Ziehl-­‐Neelsen,  Cryptococcus  tuší,  amoeby  nativní  preparát),  Latex-­‐aglutinační  průkaz  antigenu  
(hlavně  u  meningitidu  vyvolávajících  kmenů)  a  kultivací  (KA,  END,  GPA,  pomnožovací  tekutá  půda).  
Hnis,  punktát  
Sterilní   stříkačkou,   po   vytěsnění   vzduchu,   výměně   sterilní   jehly   a   zapíchnutí   do   gumové   zátky  
transport.    
Transport  při  4°C,  při  vyšší  teplotě  může  dojít  ke  kvasným  procesům  tvorbou  plynu  a  porušení  
obalu.    
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Gram,   jen   u   materiálu   odebraných   do   stříkačky   nebo   zkumavky,  
stěry   –   málo   materiálu,   neumožňují   mikroskopii),   kultivačně   (END,   GPA,   aerobně   se   zvýšenou   tenzí  
CO2,  pomnožení  na  bujónu,  KA  pro  anaeroby

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

16. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  stafylokoků.  Odběr  materiálu  na  

parazitologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  Stafylokoků  
Důležité   bakteriální   patogeny   u   nozokomiálních   infekcí   krevného   řečiště.   Významné   koagulasa  
negativní  stafylokoky  (S.  epidermidis,  haemolyticus,hominid,  capitis,  carpae,  lentus,  přirozená  součást  
mikroflóry)   -­‐>   nutno   odlišit   kontaminaci   od   kolonizace.   Koagulasa   pozitivní   stafylokoky   -­‐  
Staphylococcus  aureus,  intermedius.  
G+   koky,   tvoří   hloučky,   nemají   pouzdro,   nesportují,   respirační   i   fermentační   typ   metabolismu,  
rezistentní,   rostou   za   vyšší   koncentrace   NaCl   produkce   toxinů   (enterotoxiny,   syndrom   toxického  
šoku)  a  faktorů  virulence  (peptidoglykan,  protein  A…).    
1) Kultivace  –  nenáročné,  KA  (hemolýza,  produkce  α  a  β  hemolyzinu),  barva  kolonií  (Staf.  Aureus  
–  žluté  kolonie)  
2) Podle  biochemických  vlastností:  
Využívá   se   komerčních   diagnostických   souprav   v  mikrodestičkách   (20   biochemických   reakcí   na  
základě  barevných  změn),  po  inkubaci  numerické  zpracování  -­‐>  kód,  určení  mikroba.    
Základní  určení  –  podle  změn  při:  
a) Produkci  volné  plasmakoagulasy  –  vzniká  sraženina  fibrinu  (+)  
b) Štěpení  manitolu  –  (+)  žluté  zbarvení  
c) KNO3  –  redukce  na  dusitany,  změna  barvy  na  červenou  po  přidání  indikátoru  
d) Štěpení  argininu  –  změna  barvy  na  fialovou  (+)  
e) Citlivost  k  novobiocinu  –  difusní  test,  citlivý  kmen  –  zóna  zábrany  růstu  o  d>20mm  
Staphaurex  Plus  –  latexová  aglutinace  k  průkazu  vázané  plasmakoagulasy  
Molekulárně-­‐genetické  metody  –  tvorba  enterotoxinů,  toxin  syndromu  toxického  šoku…  (PCR)  
 
Odběr  a  transport  materiálu  na  parazitologické  vyšetření  
Nález  parazita  nebo  jeho  části  u  pacienta  se  neprodleně  posílá  v  uzavřeném  kontejneru  (možno  
ve  fyziologickém  roztoku)  do  laboratoře.  Odebírá  se:  
Stolice  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového  kontejneru.  Opakovaně,  nejméně  třikrát  obden.  
Stěr  z  análních  řas  (Perianální  stěr)    
Zvlhčenou  Schüffnerovou  tyčinkou,  kruhovým  pohybem  opláchneme  v  kapce  vody  na  podložním  
skle  a  necháme  zaschnout.  
Perianální  výtěr  
Zvlhčená  Schüffnerova  tyčinka  se  vsune  až  na  okraj  konečníku.  
Perianální  olep  
Průsvitná   lepicí   páska   se   přilepí   přes   anální   otvor   a   sevřením   hýždí   se   přitlačí   do   intergluteální  
rýhy,  nalepí  se  na  podložní  sklo  a  odešle  do  laboratoře.  
Kapilární  krev  
Krev  z  bříška  prstu  –  tenký  nátěr  a  tlustá  kapka  na  dvou  podložních  sklech.    
Duodenální  obsah    
Endoskopicky,  transport  v  uzavřené  zkumavce.  
Moč  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Poslední  porce  ranní  moči,  50-­‐100ml  v  uzavřené  nádobě.    

Uchovávání  výjimečně  při  4°C,  transport  neprodleně.    
Zpracovává   se   mikroskopickými   metodami   (nativní   preparát,   Giemsa,   Ziehl-­‐Neelsen,   Kato…),  
molekulárně  genetickými  metodami  a  Sérologickými  metodami.  

17. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  streptokoků  a  enterokoků.  Odběr  a  

transport  materiálu  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  Streptokoků  
Součást   přirozené   mikroflóry,   zvláště   HCD,   GIT   a   na   kůži.   Streptococcus   pyogenes   –   infekce   HCD,  
kožní   onemocnění,   Str.   agalactiae   –   onemocnění   novorozenců   (meningitida,   sepse),   orální  
streptokoky  (zubní  kaz)…  
G+   koky,   dvojice   nebo   řetízky   (jedna   rovina   dělení,   řadí   se   za   sebou,   nejlépe   vidit.   v  tek,   půdách),  
hemolýza  na  KA  (α  i  β).  Nepohyblivé,  nesportující,  Kataláza  negativní.    
1) Kultivace  –  KA  drobné  kolonie,  neg.  na  MA,  END,  GPA.  Popis  hemolýzy  –  druhová  identit.    
2) Sérologie  –  Skupinově  specifický  antigen  substance  C,  precipitací,  latexová  aglutinace  
a. Nepřímá   diagnostika   S.   pyogenes   –   zvýš.   hladina   antistreptolyzinu   a  
antideoxyribonukleázy.  Vždy  zároveň!  
b. Průkaz  antigenů  S.  pyogenes  –  z  výtěru  z  krku,  latexová  aglutinace  
c. Průkaz   antigenů   S.   pyogenes   v  tělních   tekutinách   –   komerční   soupravy,   latexová  
aglutinace.    
3) Biochemické  vlastnosti    
a. komerční  diagnostické  soupravy  (STREPTOtest)  
b. CAMP  test  -­‐  produkce  CAMP  faktoru  vážícího  se  na  membránu  erytrocytů  narušenou  
Stafylokokem   (sfingomyelinasa   C,   beta-­‐hemolysin)   -­‐>   rozpad   erytrocytů   (úplné  
projasnění  tvaru  motýlích  křídel.  
4) Podle  schopnosti  růstu  v  prostředí  s  6,5%  NaCl  –  odlišení  od  Enterokoků  
5) ATB  testy    
a. Bacitracinový  test  –  difusní  agarová  metoda  
b. Optochinový  test  –  difusní  agarová  metoda  
 
Druh   hemolýza   bacitracin   optochin   CAMP   Růst  v  6,5%  NaCl  
S.  pyogene   Β  (úplná)   +   -­‐   -­‐   -­‐  
S  agalactiae   Β  (neúplná),  α,  γ   -­‐   -­‐   +   -­‐  
S  pneumoniae   α   -­‐   +   -­‐   -­‐  
Orální  S.   α,  γ   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐  
Viridující  S.   α,  β,  γ   -­‐   -­‐   -­‐   +  
Enterococcus  sp.   α   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐  
 
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Diferenciální  diagnostika  enterokoků  

Součást   přirozené   mikroflóry   tlustého   střeva,   přítomny   v  genitálním   traktu,   v  HCD.   Podmíněné  
patogeny,  nozokomiální  nákazy.  Častá  multiresistenci  na  ATB.  Enterococcus  faecalis,  E.  faecium.  
G+   ovoidní   koky,   dvojice   (protáhlejší),   vysoká   odolnost   (až   6,5%   NaCl),   neprodukují   katalázu   (-­‐,  
nebublá  v  H2O2  testu),  produkce  pyrrolidonylarylamidasy  (+  PYRA  test).  
1) Kultivace  –  KA,  MA,  (ne  GPA  a  END),  drobné  šedé  kolonie,  α  hemolýza  
2) Biochemický  vlastnosti  –  štěpení  sacharidů,  určení  stěnového  antigenu  D,  PYRA  test  
Využívají  se  komerční  testy  (ENTERO-­‐COCCUStest).  
 
Odběr  a  transport  materiálů  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření  
Výtěry,   sterilní   vatové   tampony   s  vhodnou   transportní   půdou,   před   užitím   vhodné   zvlhčit  
fyziologickým   roztokem.   Transportní   půdy   by   měly   být   předehřáté   na   pokojovou   teplotu,   chránit  
před  vysycháním.    
Výtěr   z  krku   –   šroubovitým   pohybem   otřeme   povrch   obou   mandlí,   nutno   vyhnout   se   jazyku  
(stafylokok,  streptokok).  
Výtěr   z  ucha   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   zvukovod   (stafylokok,   pneumokok,  
pseudomonády).  
Výtěr   z  dutiny   nosní   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   sliznice   obou   dolních   nosních   průduchů  
(stafylococcus  aureus,  diplococcus  pneumoniae).  
Výtěr   ze   spojivkového   vaku   –   po   odchlípení   víčka   nabíráme   na   tampon   sekret   ze   spojivkového  
vaku,  stěr  z  vřídků  na  okraji  víček,  spojivce  a  rohovce  (Stafylokok).  
Výtěr   z  ran   a   kožních   lézí   –   stíráme   spodinu   při   periferii   rány,   případně   se   po   desinfekci  
alkoholem   seškrábnou   sterilním   skalpelem   kožní   šupiny,   vzorky   nehtů   nebo   podnehtového   detritu,  
úlomky  postižených  vlasů.    
Výtěr   z  pochvy   –   za   kontroly   poševního   zrcadla,   z  děložního   čípku   a   klenby   poševní  
(Lactobacillus,  stafylococcus,  Trichomonas)    
Výtěr  z  uretry  (kožní  flóra,  diplokoky)  
Tampon   bez   transportního   média   neumožňuje   skladování,   doba   transportu   by   neměla  
přesáhnout   2hod,   teplota   4°C.   Tampon   s  transportním   médiem   umožňuje   přežívání   bakterií,  
zachovává   její   původní   kvantitativní   poměry.   Doba   skladování   by   neměla   přesáhnout   24   hodin   a  
teplota  4°C.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

18. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  korynebakterií.  Odběr  a  transport  

materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  korynebakterií  
Nepohyblivé,   kyjovité   tyčinky,   součást   přirozené   kožní   mikroflóry,   příčina   endogenních   infekcí.  
Na  ATB  výrazně  resistentní  druh.    
G+  tyčinky,  palisádovité  uspořádání,  čínské  písmo,  katalasa  (+).    
1) Kultivace   –   KA,   bez   hemolýzy,   selektivně   diagnosticky   na   Claubergově   půdě   (obsah  
teluričitanu   draselného   –   inhibice   G-­‐   bakterií)   –   tmavé   zbarvené   kolonií   (C.   diphteriae,  
redukce   teluričitanu   na   telur,   ukládá   se   v  buňce),   popisovány   4   biotypy   (mitis,   gravis,  
minimus  a  intermedius).  Ostatní  C.  drobné  šedavé  nebo  bělavé  kolonie.  
2) Na  základě  biochemických  vlastností  –  málo  aktivní,  určujeme  
a. Štěpení  glukosy  –  (+)  žlutá,  (-­‐)  fialová  
b. Sacharosy  –  (+)  žlutá,  (-­‐)  fialová  
c. Produkce  Ureasy  –  (-­‐)  čirá,  (+)  červená  
d. Inversní  CAMP  –  jedná  se  o  interakci  korynebakterie  a  Staphylococcus  aureus,  jehož  
vliv  na  krvinky  redukuje  (inhibice  beta  hemolýzy).  
 
 
 
 
e. Produkce  difterického  toxinu  –  PCR  nebo  precipitace  v  gelu.    
 
Druh   Glukosa   Sacharosa   Ureasa   Inversní  CAMP  
C.  Diphteriae   +   -­‐   -­‐   -­‐  
C.  Ulcerans   +   -­‐   +   +  
C.  pseudodiphteriticum   -­‐   -­‐   +   -­‐  
Arcanobacterium  haemolyticum   +   +/-­‐   -­‐   +  
 
 
Odběr  a  transport  materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření  
Sputum  
Vykašlávání,   nejlépe   ranní,   do   širokých   plastových   kontejnerů   s  pevným   uzávěrem.   Je   možný  
laryngální   výtěr   tamponem   a   ohebné   hliníkové   tyčince   (podržen   nad   epiglottis)   po   zakašlání,  
v  indikovaných  případech  bronchoalveolární  laváž  nebo  aspirace  z  bronchů.  
Nutný   rychlý   transport,   uchovávání   při   4°C   by   mohlo   mít   za   následek   uhynutí   náročnějších  
bakterií,   při   vyšších   teplotách   hrozí   pomnožení   kontaminující   ústní   mikroflóry   a   zkreslení  
kvantitativních  poměrů.  
Zpracování   nutné   do   2   hodin   po   odběru,   provádí   se   homogenizací   (naředění   broncholysinem  
1:1,   protřepání),   mikroskopicky   (Gram   –   ověření,   že   se   jedná   o   sputum,   musí   tam   být   epitelie   a  
leukocyty,   Ziehl-­‐Neelsen   na   TBC)   nebo   kvantitativně   (KA,   END,   GPA;   signifikantní   je   záchyt   >108  
v  1ml),   průkaz   antigenu   (neobvyklé,   použití   pro   dg   pneumonií),   molekulárně   genetické   metody   (hl.  
mycobacteria  tuberculosis)  
 
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

19. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  neisserií.  Odběr  a  transport  krve  na  

bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  neisserií  
G-­‐  diplokoky  tvaru  kávového  zrna  (zploštělá  strana  nasedání),  polymorfní,  často  fagocytované  ale  
nelyzované  uvnitř  leukocytů,  aerobní,  nesportující,  kat  (+),  oxidása  (+).    
Patogenní   druhy   jsou   náročnější,   Neisseria   meningitis   (sepse,   hnisavé   meningitidy),   N.  
gonorrhoeae  (kapavka),  nenáročné  nepatogenní  –  ústní  mikroflóra  (N.  subflava,  N.  sicca).    
1) Kultivace   –   ČA,   LEV,   KA   s  ATB   (Vankomycin-­‐colistin),   častá   produkce   nažloutlého   pigmentu,  
hemolýza.  Drobné  průhledné  nebo  našedlé  kolonie.  NIKDY  na  END.  
2) Biochemické  vlastnosti  –  štěpení  cukrů  (Komerční  soupravy  –  NEISSERIAtest)  
3) Antigenní   analýza   –   podle   přítomnost   kapsulárních   polysacharidových   antigenů   (10   sérolog.  
skupin),  latexová  aglutinace.    
4) Průkaz  nukleových  kyselin  –  PCA  
 
Druh   Glukosa   Maltosa   Sacharosa   Laktosa   ONPG   Pigment  
N.  gonorrhoeae   +   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐  
N.  meningitis   +   +   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐  
N.  lactamica   +   +   -­‐   +   +   +/-­‐  
Moraxella  catarrhalis   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐   -­‐   +/-­‐  
 
 
Odběr  a  transport  krve  na  bakteriologické  vyšetření  
Krev  
Na   kultivační   vyšetření   minimálně   třikrát   během   jednoho   dne   nejlépe   při   vzestup   teploty   –  
uvolnění  mikrobů  do  oběhu  -­‐>  reakcí  je  pyróza,  dezinfekce  kůže  v  místě  vpichu,  venepunkcí  odběr  10-­‐
20ml   krve,   vstříknutí   do   speciálních   kultivačních   nádobek   (hemokultury,   obsah   bujónu   a  
protisrážlivého   prostředku   s  indikátorem,   anaerobní   i   aerobní   kultivace).   Provede   se   kontrolní   stěr  
z  kůže   –   vyloučení   kožní   kontaminace.   Při   pozitivním   výsledku   se   provádí   mikroskopie   (Gram),  
kultivace  (KA,  END,  GPA,  citlivost).  
Na   sérologické   vyšetření   (srážlivá   krev)   stejná   technika,   transport   ve   zkumavce   s  pevným  
uzávěrem.  
Zpracovává   se   mikroskopií   (kultivace   po   inkubaci,   Gram),   průkaz   antigenů,   detekce   nukleových  
kyselin   a   kultivačně   nejlépe   v  hemokultivačních   nádobkách   pro   anaerobní   a   aerobní   kultivaci.  
Očkování   na   pevné   půdy   se   provádí   až   při   známkách   růstu   mikrobů   (detekce   na   základě   produkce  
CO2)  na  END,  KA  a  GPA.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

20. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  hemofilů.  Odběr  a  transport  stolice  

na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  hemofilů  
Kolonizují   dutinu   ústní,   HCD.   Haemophilus   influenzae   –   respirační   infekce,   sinusitidy,   otitidy,   u  
dětí  hnisavé  meningitidy,  epiglottidy…  Neopouzdřené  kmeny  nižší  patogenita,  H.  ducreyi  –  původce  
měkkého  vředu.    
G-­‐   tyčinky,   drobné,   pleomorfní   (vícetvaré),   někdy   polysacharidové   pouzdro   (vyšší   virulence),   fak.  
anaerobní,   kapnofilní,   náročné   (růstové   faktory   X   –   hemin   a   V   –   NAD   a   NADP,   příjem   a   přenos   e-­‐  
v  reakcích,  kofaktorů  enzymů).    
1) Kultivace   –   ne   na   MA,   KA,   (+)   na   ČA,   LEV,   KA   s  disky   růst.   faktorů.   Nebo   v  přítomnost  
Stafylococcus   aureus   (uvolňuje   růst.   faktory   z  erytrocytů).   Drobné   transparentní   lesklé  
kolonie.    
a. Určení  nároků  hemofilů  na  růstové  faktory  –  na  MA,  naočkování  kmenem,  položí  se  
disky  nasycené  faktory  –  jeden  X,  druhý  V  a  třetí  VX.  PO  inkubaci  hodnotíme  nárůst  a  
závislost  na  faktorech.  
b. Resistence  k  bacitracinu  –  využívá  se  pro  kultivace,  v  okolí  Stafylokokové  čáry,  vyhuí  
se  to  ostatní,  abychom  je  zahlédli.    
2) Antigenní   analýza   –   sérotypizaci   sklíčkovou   aglutinací,   biotypizace   (8   biotypů   I-­‐VIII)   podle  
produkce   indolu,   ureas   a   dekarboxylasy   ornitinu,   detekce   pouzderného   antigenu   pomocí  
latexové  aglutinace.    
3) Molekulárně-­‐genetické  metody  –  PCR,  detekce  nukl.  kyselin.    
 
Druh   X  faktor   V  faktor   Hemolýza  
H.  influenzae   +   +   -­‐  
H.  parainfluenzae   -­‐   +   -­‐  
H.  haemolyticus   +   +   +  
H.  parahaemolyticus   -­‐   +   +  
H.  aphrophilus   +   -­‐   -­‐  
 
 
 
Odběr  a  transport  stolice  na  bakteriologické  vyšetření  
Stolice  
Pro  bakteriální  vyšetření  rektální  výtěr  –  do  konečníku  se  zavede  zvlhčený  tampon  a  pootočí  se  
jím,  vloží  se  do  transportní  půdy  (Amiesova).  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového   kontejneru.   Průkaz   roupů   –   stěr   z  análních   řas   Schüffnerovou   tyčinkou   nebo   otisk   lepicí  
páskou  
Transport  při  teplotě  4°C,  uchovávání  také  -­‐>  při  vyšších  teplotách  hrozí  kvasné  reakce.  
Zpracování   kultivačně   na   KA,   END,   DCA,   Selenitový   bujón   (pomnožení   Salmonella),   půda   pro  
záchyt   Yersenií,   půda   pro   záchyt   Campylobacterů   (mikroaerofilní   atmosféra   +   CO2),   průkaz   cholery  
(alkalická   peptonová   voda),   průkaz   antigenů   při   podezření   na   virovou   etiologii,   mikroskopie   při  
parazitologickém  a  mykologickém  vyšetření.  
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
 Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

21. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  enterobakterií.  Odběr  a  transport  

materiálu  na  mykologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  enterobakterií  
Fakultativně   anaerobní   tyčinky,   přirozená   mikroflóra   (hl.   tlusté   střevo),   obligátně   patogenní  
Salmonella,  Shigella  a  Yersinia,  potenciálně  patogenní  Escherichia,  Klebsiella.    
G-­‐  tyčinky  se  zaoblenými  konci,  některé  opouzdřené,  značně  odolné,  nenáročné,  často  bičíkaté  –  
pohyb,  katalasa  (+),  antigeny  O  (somatické),  H  (bičíky),  K  (pouzdro).    
1) Kultivace   –   KA,   END   (laktóza   +/-­‐),   DCA   (prod.   H2S),   šedé   uniformní   kolonie,   hladké,   ploché  
nebo   lehce   vypouklé.   Opouzdřené   kolonie   -­‐>   M   fáze,   někdy   hemolýza   (β,   úplná).   Rod  
Proteus  –  specifický  růst  –  Raussův  fenomén  (plazivý  růst).    
2) Biochemické  vlastnosti  –    
a. fermentace  glukózy  –  uvolňování  plynu  (CO2  s  H2)  (+),  žluté  zbarvení.  
b. redukce   dusičnanů   na   dusitany   –   inokulace   tekuté   půdy,   po   přidání   indikátoru   (α-­‐
naftol   a   kyselina   sulfanilová   -­‐>   (+)   červené   zbarvení,   při   negativitě   přidáme   práškový  
zinek   -­‐>   pokud   tehdy   zčervená,   potvrzuje   se   negativita.   Pokud   zůstane   po   přidání  
zinku  bezbarvá  -­‐  výsledek  je  pozitivní!  (Nitrát  už  tam  není,  aby  se  redukoval  na  nitrit)  
c. negativní  oxidázová  reakce  –  papírkový  test,  modrá  (+)  bílá  (-­‐)  
3) Antigenní  analýza  –  sklíčková  aglutinace,  u  rodů  Shigella  a  Salmonella  
4) Schopnost  produkce  enterotoxinu  -­‐>  PCR  nebo  latexová  aglutinace.    
5) Nepřímá  diagnostika  –  ELISA,  přímá  aglutinace,  u  systémových  infekcí  (salmonelózy).  
6) Pohyb  –  v  polotuhém  médiu  (zákal  difusní)  nebo  v  nativním  preparátu.    
 
Odběr  a  transport  materiálu  na  mykologické  vyšetření  
Odebírají   se   seškraby   kůže   (kožní   šupiny,   hyperkeratózy)   a   nehtů,   vlasy,   chlupy   po   desinfekci  
70%   alkoholem   a   výtěry   ze   sliznic   (povrchové   mykózy),   sputum,   moč,   stolice   (odpovídá   odběru   na  
parazitické  vyšetření),  krev  (hluboké  mykózy).    
Nutnost  okamžitého  transportu  do  laboratoře.  Uchovávání  při  teplotě  4°C  
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Louhový   preparát   –   20%   louh,   Parkerův   inkoust   –   má   afinitu  
k  chitinu   –   probarvení   mykotic.   Elementů,   Gram   na   kvasinky   –   modrofialové,   Giemsa,   Burri   –  
Cryptococcus,   Fluoresčenční   –   vazba   na   chitin),   rychlým   průkazem   mykotických   agens   (detekci  
antigenu,   nukleových   kyselin),   kultivačně   (Sabouardův   agar   –   obsah   ATB   chloramfenikolu   potlačí  
bakterie,   minimálně   48   hodin;   Chromogenní   půdy   –   zpracovávání   substrátů   -­‐>   barevné   změny;  
vláknité  houby  2-­‐7  týdnu!)  nebo  nepřímým  důkazem  mykotických  agens  (ELISA,  aglutinace,  KFR).  
 
 
  Glukóza   laktóza   Manóza   Indol   Urea   Si   H2S   Poh   Phe   KNO3   ONPG  
poz   žlutá   žlutá   žlutá   červená   červená   Modrá   Černá   Zákal   zelená   červená   Žlutá  

neg   fialová   fialová   fialová   bezbarvá   bezbarvá   zelená   žlutá   čirá   bezbarvá   bezbarvá   bílá  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

22. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  nefermentujících  gramnegativních  

bakterií.  Odběr  a  transport  hnisu,  punktátů  a  likvoru.  
 
Diferenciální  diagnostika  nefermentujících  gramnegativních  bakterií  
Nejsou  schopny  fermentovat  glukózu,  mohou  ji  však  štěpit  aerobně  respiračním  mechanismem.  
Součást   vnějšího   prostředí   (voda,   rostliny,   živočichové),   původci   nozokomiálních   infekcí   DCD,   ran,  
močového  traktu  a  sepsí.  Acinetobacter,  Cryseobacterium,  Pseudomonas,  Kingella…  
Štíhlé   tyčinky,   někdy   kokobacily,   rovné   nebo   lehce   zahnuté,   pohyblivé   (i   více   bičíků),   často  
opouzdřené,  aerobní  nebo  mikroaerofilní,  katalasa  (+),  cytochromoxidasa  (+).    
1) Kultivace  –  nenáročné,  MA,  END,  KA,  necharakteristické  kolonie,  hladké,  lesklé,  ploché  nebo  
mírně   vypouklé,   mohou   hemolyzovat   krvinky,   někdy   produkce   pigmentů   (žluté,   oranžové,  
hnědé,  zelené).  Pseudomonas  –  nazelenalé  kolonie  vonící  po  jasmínu.    
2) Biochemické  vlastnosti  
a. Glukosa  –  neschopnost  fermentovat,  ale  oxidují  ji,  očkování  do  dvou  zkumavek,  jedna  
bez   přístupu   kyslíku,   druhá   za   aerobních   podmínek.   V  případě   štěpení   Glu   dochází  
k  zežloutnutí   média   (+).   Fermentující   –   (+)   v  obou   zkumavkách,   nefermentující   (+)  
jen  v  aerobní  zkumavce.    
b. Cytochromoxidasa  –  papírkový  test  
c. Produkce  ureasy,  indolu,  redukce  dusičnanů  
Využívají  se  komerční  soupravy  –  NEFERMtest.  
3) Pohyblivost  –  nativní  preparát  nebo  polotuhé  půdy.  
4) Antigenní  analýza  –  sérotypizaci  a  fagotypizace,  molekulárně  genetické  metody.    
 
Odběr  a  transport  hnisu,  punktátů  a  likvoru  na  bakteriologické  vyšetření  
Mozkomíšní  mok  
Lumbální   punkce   sterilní   kautelou,   přísně   asepticky   do   stříkačky,   poté   do   sterilní   zkumavky  
s  pevným  uzávěrem.  
Transport   nutný   co   nejrychleji,   nutné   okamžité   zpracování.   Případně   inokulace   do   lahviček   na  
hemokultury  a  ponechání  při  pokojové  teplotě  pro  odložení.    
Zpracování   centrifugací   (bakterie   a   lymfocyty   při   zánětu   by   vytvořily   sediment),   mikroskopicky  
(Gram,  Ziehl-­‐Neelsen,  Cryptococcus  tuší,  amoeby  nativní  preparát),  Latex-­‐aglutinační  průkaz  antigenu  
(hlavně  u  meningitidu  vyvolávajících  kmenů)  a  kultivací  (KA,  END,  GPA,  pomnožovací  tekutá  půda).  
Hnis,  punktát  
Sterilní   stříkačkou,   po   vytěsnění   vzduchu,   výměně   sterilní   jehly   a   zapíchnutí   do   gumové   zátky  
transport.    
Transport  při  4°C,  při  vyšší  teplotě  může  dojít  ke  kvasným  procesům  tvorbou  plynu  a  porušení  
obalu.    
Zpracovává   se   mikroskopicky   (Gram,   jen   u   materiálu   odebraných   do   stříkačky   nebo   zkumavky,  
stěry   –   málo   materiálu,   neumožňují   mikroskopii),   kultivačně   (END,   GPA,   aerobně   se   zvýšenou   tenzí  
CO2,  pomnožení  na  bujónu,  KA  pro  anaeroby

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

23. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  anaerobních  bakterií.  Odběr  a  

transport  materiálu  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  anaerobních  bakterií  
Součást   přirozené   mikroflóry   (kůře,   adnexa,   hl.   G+,   GIT.   UGT,   HCD),   původci   exogenních  
(Clostridium)  i  endogenních  infekcí.  Anaerobní  respirace,  anaerobní  kvašení  (e-­‐  jsou  přijímány  něčím  
jiným,  než  O2),  Eh  půdy  pod  -­‐100mV  aby  se  začaly  množit  (převládají  redukované  formy).  
1) Mikroskopie  –  Gram,  přítomnost  polymorfonukleárů,  G+   i  G-­‐  bakterie,  různé  tvary  a  velikosti  
(koky,   tyčinky,   různé   uspořádání).   Hodnotí   se   schopnost   sporulace   (Barvení   podle   Wirtze-­‐
konklina).    
2) Kultivace  –  anaerobní  i  aerobní  metoda  současně  (vyloučení  fakultativně  anaerobních),  půdy  
pro  anaer  kultivaci  (ot.  9).  Kolonie  narostlé  v  anaer.  prostředí  -­‐>  mikroskopická  diagnostika,  
naočkování   na   KA   (určení   striktních   anaerobů,   (+)   růst   –   fakultativní   anaerob)   a   anaerobní  
pevnou  půdu  (hodnotí  se  za  48  hodin)  
3) Komerční  testy  –  ANAEROtest  23  
4) Průkaz   toxinu   –   na   pokusném   zvířeti   nebo   latexovou   aglutinací,   ELISA,   Clostridium   difficile  
(Toxin  A  a  B)  
 
Odběr  a  transport  materiálů  ze  sliznic  a  kůže  na  bakteriologické  vyšetření  
Výtěry,   sterilní   vatové   tampony   s  vhodnou   transportní   půdou,   před   užitím   vhodné   zvlhčit  
fyziologickým   roztokem.   Transportní   půdy   by   měly   být   předehřáté   na   pokojovou   teplotu,   chránit  
před  vysycháním.    
Výtěr   z  krku   –   šroubovitým   pohybem   otřeme   povrch   obou   mandlí,   nutno   vyhnout   se   jazyku  
(stafylokok,  streptokok).  
Výtěr   z  ucha   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   zvukovod   (stafylokok,   pneumokok,  
pseudomonády).  
Výtěr   z  dutiny   nosní   –   šroubovitým   pohybem   setřeme   sliznice   obou   dolních   nosních   průduchů  
(stafylococcus  aureus,  diplococcus  pneumoniae).  
Výtěr   ze   spojivkového   vaku   –   po   odchlípení   víčka   nabíráme   na   tampon   sekret   ze   spojivkového  
vaku,  stěr  z  vřídků  na  okraji  víček,  spojivce  a  rohovce  (Stafylokok).  
Výtěr   z  ran   a   kožních   lézí   –   stíráme   spodinu   při   periferii   rány,   případně   se   po   desinfekci  
alkoholem   seškrábnou   sterilním   skalpelem   kožní   šupiny,   vzorky   nehtů   nebo   podnehtového   detritu,  
úlomky  postižených  vlasů.    
Výtěr   z  pochvy   –   za   kontroly   poševního   zrcadla,   z  děložního   čípku   a   klenby   poševní  
(Lactobacillus,  stafylococcus,  Trichomonas)    
Výtěr  z  uretry  (kožní  flóra,  diplokoky)  
Tampon   bez   transportního   média   neumožňuje   skladování,   doba   transportu   by   neměla  
přesáhnout   2hod,   teplota   4°C.   Tampon   s  transportním   médiem   umožňuje   přežívání   bakterií,  
zachovává   její   původní   kvantitativní   poměry.   Doba   skladování   by   neměla   přesáhnout   24   hodin   a  
teplota  4°C.

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

24. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  mykobakterií.  Odběr  a  transport  

materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Diferenciální  diagnostika  mykobakterií  
Při  podezření  na  TBC,  nejčastěji  materiál  z  DCD,  punktát,  moč.  
1) Mikroskopie   –   nelze   barvit   podle   grama,   barví   se   podle   Ziehl-­‐Neelsena   (acido-­‐alkali-­‐alkohol  
resistentní),   lze   vidět   specifické   elementy   –   dlouhé   červené   acidorezistentní   tyčinky   a  
nespecifické   elementy   modré   nebo   zelené   (leukocyty,   epitelie,   ostatní   mikroflóra).  
Hodnocení  dle  četnosti  v  nálezu  na  křížky.    
2) Kultivace      
a. dekontaminace   –   potlačení   přirozené   mikroflóry   (rostla   by   rychleji   než  
mykobakterie),  založeno  na  resistenci  k  NaOH  s  následnou  neutralizací  HCl  
b. homogenizace   –   mechanicky,   třepáním   na   třepačce,   rozdistribuje   se   to   po   celém  
médiu,  nejsou  tam  chuchvalce  
c. koncentrace  –  centrifugací,  sediment  je  inokulován  na  půdy  
d. inokulace   –   pevné   půdy   (Ogawova,   Loewenstein-­‐Jensenova),   pomnožovací   půdy  
(Šulova),  inkubace  po  6  (první  výsledky)  -­‐9  (uzavření  inkubace)  týdnů  při  37°C.    
Na  pevných  půdách  roste  Mycobacterium  tuberculosis  nažloutlých  koloniích  typu  R,  ostatní  
rozmanité  kolonie,  lesklé  i  mazlavé.  Hodnotí  se  četnost  kolonií  –  do  9  kolonií  přesný  počet,  
10-­‐20  +,  21-­‐100  ++  nad  100  +++.    
3) Citlivost   na   antituberkulotika   –   Streptomycin,   Etambutol,   pyrazinamid,   izoniazid.   Princip   –  
porovnání   růstu   testovaného   kmene   v  půdě   bez   antituberkulotika   s  růstem   v  půdě  
s  kritickou  koncentrací  léků.  
4) Rychlé  metody  průkazu  
a. Urychlená   kultivace   –   stanovení   metabolických   produktů   při   růstu   v  kultivačních  
půdách.   Vložením   do   automatického   přístroje,   inkubace   při   37°C,   průběžný  
monitoring.   Sleduje   pozitivitu   změnou   pH,   spotřebou   kyslíku,   změnou   barvy  
indikátoru…    
b. Průkaz  nukleové  kyseliny  v  klinickém  vzorku  –  PCR,  M.  tuberculosis  
c. Biologický   pokus   –   na   morčeti,   zvětšené   kaseifikované   inguinální   uzliny,   šedé   uzlíky  
na  plicích.  
d. Sérodiagnostika  –  ELISA,  specifické  protilátky  
 
Odběr  a  transport  materiálu  z  dolních  cest  dýchacích  na  bakteriologické  vyšetření  
Sputum  
Vykašlávání,   nejlépe   ranní,   do   širokých   plastových   kontejnerů   s  pevným   uzávěrem.   Je   možný  
laryngální   výtěr   tamponem   a   ohebné   hliníkové   tyčince   (podržen   nad   epiglottis)   po   zakašlání,  
v  indikovaných  případech  bronchoalveolární  laváž  nebo  aspirace  z  bronchů.  
Nutný   rychlý   transport,   uchovávání   při   4°C   by   mohlo   mít   za   následek   uhynutí   náročnějších  
bakterií,   při   vyšších   teplotách   hrozí   pomnožení   kontaminující   ústní   mikroflóry   a   zkreslení  
kvantitativních  poměrů.  
Zpracování   nutné   do   2   hodin   po   odběru,   provádí   se   homogenizací   (naředění   broncholysinem  
1:1,   protřepání),   mikroskopicky   (Gram   –   ověření,   že   se   jedná   o   sputum,   musí   tam   být   epitelie   a  
leukocyty,   Ziehl-­‐Neelsen   na   TBC)   nebo   kvantitativně   (KA,   END,   GPA;   signifikantní   je   záchyt   >108  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

v  1ml),   průkaz   antigenu   (neobvyklé,   použití   pro   dg   pneumonií),   molekulárně   genetické   metody   (hl.  
mycobacteria  tuberculosis)  
 
25. otázka  –  Sérodiagnostika  lues.  Odběr  a  transport  moče  na  
bakteriologické  vyšetření.  
 
Sérodiagnostika  Lues  
Původcem  je  Treponema  pallidum,  3  stadia:  Primární  (místní  pomnožení,  výskyt  tvrdého  vředu  
na   genitáliích,   v  ústní   dutině   nebo   konečníku),   Sekundární   (generalizace   infekce,   průnik   do   trep.   do  
krve   a   tělních   tekutin,   kožní   a   slizniční   léze),   Terciární   (vymizení   trep.   z  oběhu,   lokalizace   v  růz.  
orgánech  –  CNS,  kůže,  kosti,  srdce).    
Vrozená  Silfilis  –  chybí  primární  stádium   –  jdou  rovnou  do  krve  od  matky,   může  vést  k  poškození  
plodu,  potratu  nebo  malformacím.    
1) Mikroskopie   –   v  prim.   Stadiu   z  tvrdého   vředu,   v  sek.   Z  vyrážky,   sledování   v  zástinu,   spirální  
mikroorganismy   s  4-­‐14   závity,   patří   mezi   spirochety.   Velmi   citlivá   na   kyslík   –   brzo   uhyne   a  
přestane  se  hýbat.    
2) Kultivace  –  na  umělých  půdách  NELZE,  jen  na  zvířecích  subjektech  
3) Sérologie  (nepřímý  důkaz)  
a. Netrepomenové   testy   –   nespecifický   antigen,   nejčastěji   fosfolipid   kardiolipin   -­‐>   při  
infekci   dochází   k  poškození   buněk   a   uvolní   se   do   oběhu,   proti   němu   se   vytváří  
antikardiolipin   -­‐>   detekce   antikardiolopinu   fosfolipidem   kardiolipinem.   Aglutinace,  
KFR,  precipitace  
i. Sypha  card  –  uhlíková  zrnka  potažená  kardiolipinem  -­‐>  kapka  séra  -­‐>  přitom.  
Protilátek  -­‐>  aglutinace  
Fungují  jen  velmi  brzy  po  infekci,  falešná  pozitivita  u  ostatních  onemocnění  (infekce  
viry,  EBV,  nádory).  
b. Treponemové   testy   –   dělají   se   při   pozitivním   netreponemovém   testu,   prokazují   se  
antigeny  na  povrchu  treponemat,  reakce  protilátek  s  treponemou.    
i. TPHA   –   treponema   pallidum   hemaglutinační   test,   erytrocyty   potažené  
antigeny  treponem,  hemaglutinace  po  celém  dnu  jamky  (+)  nebo  malá  tečka  
(sediment)  uprostřed  jamky  (-­‐)  
ii. TPPA  –nosič  antigenu  je  červená  želatina  
iii. FTA-­‐ABS  –  nepřímá  fluorescence  
iv. ELISA,  WESTERN  BLOT  
v. TPIT   –   treponema   pallidum   imobilizační   test   –   znehybnění   a   následná   lýza  
živých  treponemat  v  přítomnosti  specifických  protilátek  a  komplementu.    
4) PCR  –  z  krve  jen  v  sekundární  fázi.    
 
Odběr  a  transport  moče  na  bakteriologické  vyšetření  
Moč  
Před   odběrem   nutné   omytí   genitálu,   odebírá   se   střední   proud   moči   (u   uretritidy   počáteční   u  
postižení  ledvin  konečný!).  Případně  katetrizace  nebo  suprapubická  punkce.  Do  sterilních  plastových  
kontejnerů  s  pevným  uzávěrem.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

Neskladuje   se  –   snadná   dostupnost,   výjimečně   až   18   hodin   při   4°C.   Transport   při   nízké   teplotě   –  
při  vyšší  teplotě  by  došlo  k  přemnožení  bakterií  bez  klinického  významu.    
Zpracovává   se   kultivačně   (do   2   hodin   po   odběru,   KA,   END,   počet   kolonií   >105   signifikantní),  
průkazem  antigenu  (neobvyklé,  hl.  diagnostika  pneumonií).    
Speciální  zpracování  –  Urikult,  komerční  souprava,  sterilní  nádobka  +  nosič  s  agarovými  půdami  
(ponoří   se   do   nádobky   s  močí   –   inokulace).   Po   inkubaci   vyrostou   na   půdách   kolonie   mikrobů  
v  závislosti  na  jejich  kvantitě.  

26. otázka  –  Přímá  diagnostika  virových  nákaz.  Odběr  a  transport  

materiálu  na  parazitologické  vyšetření.  
Přímá  diagnostika  virových  nákaz  
1) Mikroskopie  –    
a. Elektronová   mikroskopie,   hodnotí   se   morfologie   a   symetrie   kapsidy,   počítají   se  
kapsomery,   měří   se   velikost   virionu,   v  imunoelektronovém   provedení   se   pozoruje  
reakce  protilátek  s  viry.    
b. Světelný   mikroskop   –   barvení   podle   Giemsy,   pouze   větší   viry   lze   vidět   jako  
elementární   tělíska,   prokazují   se   eozinofilní   inkluze   v  napadených   buňkách  
(intracytoplasmatické,  intranukleární).    
c. Fluorescenční  mikroskopie  –  značená  protilátka  na  virový  antigen    
2) Kultivace  (izolace)  –  pomnožení  v  živých  buňkách  
a. Kuřecí   embryo   –   sérum   pacienta   se   vstříkne   do   alantoidní   nebo   amniové   dutiny   nebo  
na   chorioalantoidní,   viry   se   pomnoží.   Pozitivní   výsledek   –   úhyn   embrya,   tvorba   poků  
na   chorioalantoidní   membráně   (bělavá   ložiska),   v  tekutinách   z  amniové   dutiny   a  
alantoidní  dutiny  se  objevují  virové  antigeny.  Hirsův  test  –  průkaz  hemaglutinujících  
antigenů   –   plodová   tekutina   se   smíchá   s  erytrocyty   morčete   -­‐>   aglutinace   (+)  
přítomnost  viru.  
b. Tkáňová  kultura  –  Připravuje  se  z  tkáně,  rozstříhání  na  malé  kousky,  vystaveno  účinku  
trypsinu   -­‐>   enzymatické   rozvolnění   mezibuněčných   spojů   -­‐>   vznik   suspenze   buněk,  
smíchání  s  živným  médiem  (glukosa,  aminokyseliny,  sérum,  vitaminy…),  rozplnění  do  
zkumavek,   inkubace,   vzniká   monolayer   (souvislá   vrstva   proliferujících   buněk   na  
stěně  nádoby.  Poté  se  očkuje  vyšetřovaným  materiálem,  při  inkubaci  projev  virové  
infekce   -­‐>   cytopatický   efekt   –   buňky   odpadávající   od   podkladu,   tvorba  
mnohojaderným  buněk  (mikroskopické  hodnocení).    
i. Primární   kultura   buněk   –   po   několika   přeočkováních   (pasážích)   hynou,  
diploidní  počet  chromosomů.  
ii. Semikontinuální  kultury  –  40-­‐60  pasážování,  konzervace  zmražením,  diploidní  
počet  chromozomů.  Pro  přípravu  vakcín.  
iii. Trvalé   buněčné   linie   –   z  nádorových   nebo   normálních   buněk,   po   několika  
pasážích  se  změní,  nepravidelnosti  v  počtu  chromosomů  (aneuploidie).    
c. Pokusné  zvíře  –  bílá  myš.  Sledují  se  příznaky  onemocněné  a  doba  úmrtí.    
3) Průkaz   antigenu   v  klinickém   vzorku   –   diagnostické   soupravy,   založené   na   reakci   protilátek  
s  antigenem.  Imunoenzymatické  a  imunofluorescenční  metody  
4) Průkaz  nukleové  kyseliny  v  klinickém  vzorku  –  PCR,  komplementární  sondy.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

 
Odběr  a  transport  materiálu  na  parazitologické  vyšetření  
Nález   parazita   nebo   jeho   části   u   pacienta   se   neprodleně   posílá   v  uzavřeném   kontejneru   (možno   ve   fyziologickém  
roztoku)  do  laboratoře.  Odebírá  se:  
Stolice  
Pro   parazitologické   vyšetření   se   odebírá   kousek   stolice   umělohmotnou   lopatičkou   do   speciálního   plastového  
kontejneru.  Opakovaně,  nejméně  třikrát  obden.  
Stěr  z  análních  řas  (Perianální  stěr)    
Zvlhčenou   Schüffnerovou   tyčinkou,   kruhovým   pohybem   opláchneme   v  kapce   vody   na   podložním   skle   a   necháme  
zaschnout.  
Perianální  výtěr  
Zvlhčená  Schüffnerova  tyčinka  se  vsune  až  na  okraj  konečníku.  
Perianální  olep  
Průsvitná   lepicí   páska   se   přilepí   přes   anální   otvor   a   sevřením   hýždí   se   přitlačí   do   intergluteální   rýhy,   nalepí   se   na  
podložní  sklo  a  odešle  do  laboratoře.  
Kapilární  krev  
Krev  z  bříška  prstu  –  tenký  nátěr  a  tlustá  kapka  na  dvou  podložních  sklech.    
Duodenální  obsah    
Endoskopicky,  transport  v  uzavřené  zkumavce.  
Moč  
Poslední  porce  ranní  moči,  50-­‐100ml  v  uzavřené  nádobě.    
Uchovávání  výjimečně  při  4°C,  transport  neprodleně.    
Zpracovává  se  mikroskopickými  metodami  (nativní  preparát,  Giemsa,  Ziehl-­‐Neelsen,  Kato…),  molekulárně  genetickými  
metodami  a  Sérologickými  metodami.  

27. otázka  –  Sérodiagnostika  chřipky.  Odběr  a  transport  stolice  na  

bakteriologické  vyšetření.  
 
Sérologická  diagnostika  chřipky  
Viry   čeledi   Orthomyxoviridae,   hl.   virus   chřipky   A   –   velká   antigenní   proměnlivost   (změna   –   drift  
nebo  úplná  výměna  -­‐  shift  podtypových  antigenů).  Virus  chřipky  B  –  antigenně  stálejší,  virus  chřipky  C  
–  mírné  infekce  respiračního  traktu.    
Používají   se   sérologické   postupy   průkazu   antigenu   v  klinickém   vzorku   pomocí   specifické  
protilátky   imunofluorescenční   metodou   nebo   imunoenzymatickou   metodou.   Izolace   na   kuřecím  
embryu  jenom  tkáňové  kultuře.    
1) Sérodiagnostika   –   zjištění   alespoň   4   násobného   vzestupu   titru   specifických   protilátek  
v  párových  sérech.  Nejčastější  metody  
a. KFR  –  typově  specifický  nukleoproteinový  antigen,  odlišení  chřipky  A  a  B  
b. HIT   –   test   inhibice   hemaglutinace,   protilátky   obalují   virovou   částici   –   nedojde  
k  hemolýze.  Využívá  povrchových  antigenů  –  hemaglutinin,  neuraminidáza,  význam  
pro   přípravu   očkovacích   látek,   protilátky   podtypově   specifické   (proti   povrchovým  
antigenům),  protekční,  objevují  se  dříve  než  typově  specifické  protilátky.  
c. ELISA  –  přítomnost  protilátek  IgA  a  IgM.    
i. Výskyt   protilátek   –   v  akutní   fázi   IgA   na   počátku,   posléze   roste   IgM   do  
vrcholné   fáze   v  konečné   vymizí   IgA,   zůstává   IgM,   v  přechodu   do  
rekonvalescence  vznikají  IgG,  IgM  ubývá.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

 
Odběr  a  transport  stolice  na  bakteriologické  vyšetření  
Stolice  
Pro  bakteriální  vyšetření  rektální  výtěr  –  do  konečníku  se  zavede  zvlhčený  tampon  a  pootočí  se  
jím,  vloží  se  do  transportní  půdy  (Amiesova).  
Pro  parazitologické  vyšetření  se  odebírá  kousek  stolice  umělohmotnou  lopatičkou  do  speciálního  
plastového   kontejneru.   Průkaz   roupů   –   stěr   z  análních   řas   Schüffnerovou   tyčinkou   nebo   otisk   lepicí  
páskou  
Transport  při  teplotě  4°C,  uchovávání  také  -­‐>  při  vyšších  teplotách  hrozí  kvasné  reakce.  
Zpracování   kultivačně   na   KA,   END,   DCA,   Selenitový   bujón   (pomnožení   Salmonella),   půda   pro  
záchyt   Yersenií,   půda   pro   záchyt   Campylobacterů   (mikroaerofilní   atmosféra   +   CO2),   průkaz   cholery  
(alkalická   peptonová   voda),   průkaz   antigenů   při   podezření   na   virovou   etiologii,   mikroskopie   při  
parazitologickém  a  mykologickém  vyšetření.

 
28. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  kvasinek.  Odběr  a  transport  krve  na  
bakteriologické  vyšetření.  
Diferenciální  diagnostika  kvasinek  
Heterogenní   skupina   hub,   některé   jen   nepohlavní,   jiné   i   pohlavní   rozmnožování,   nejvýš.   Skupina  
-­‐  rod  Candida.  Oportunní  patogeny  –  adherence  na  povrch  buňky,  germinace  a  tvorba  hyf  –  invaze,  
mechanické  poškození  tkáně,  produkce  proteinázy  (napomáhá  rozpadu  tkáně).  
1) Mikroskopie   –   G+   výrazně   větší   ovoidní   útvary   (blastospory),   viditelné   pučící   buňky,   mateřská  
buňka   zůstává   často   ve   spojení   s  dceřinými   buňkami-­‐>   vznik   řetízků   připomínající   vláknité  
houby  -­‐>  pseudomycelia,  v  místě  sept  jsou  zaškrcené.  
2) Kultivace   –   růst   na   diagnostických   půdách,   využívají   schopnost   hydrolyzovat   chromogenní  
substráty   pomocí   druhově   specifických   enzymů-­‐>   zbarvení   kolonií.   GPA   -­‐>   příměs   ATB   pro  
potlačení  ost.  mikrobů,  krémové  kolonie  s  kvasnicovým  zápachem,  lesklé  nebo  matné.    
3) Morfologické  testy    
a. Tvorba  askospor  –  u  druhů  pohlavně  se  množících,  barvení  podle  Wirtze-­‐Conklina,  po  
inkubaci   na   specializovaných   půdách   omezujících   růst   a   podporujících   tvorbu  
askospor.    
b. Tvorba   pouzder   –   Cryptococcus   neoformans,   mukózní   vzhled   kolonií,   mikroskopicky  
barvení  podle  Burriho  nebo  indickým  inkoustem.    
4) Testy  na  specifický  průkaz  Candida  albicans    
a. Tvorba   chlamydospor   –   nepohlavní   výtrusy   na   rýžovém   agaru,   silnostěnné   kulaté  
útvary,  očkuje  se  otiskem  kolonie  kličkou  na  rýžový  agar  dvěma  paralelními  čárami,  
vypálí   se   klička,   ředění   několika   čarami   protínajícími   původní   linie,   inkubace  
minimálně   48   hodin,   poté   mikroskopické   hodnocení   kulovitých   chlamydospor   na  
konci  hyf.    
b. Tvorba   klíčících   vláken   –   v  tekutém   prostředí   dochází   k  tvorbě   hyf,   do   zkumavky   se  
sérem   se   přenese   kolonie   kvasinky,   inkubace   1-­‐2   hodiny,   vyrobíme   nativní   preparát,  
lze  vidět  klíčky  vylézající  z  ovoidních  útvarů.    

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

5) Biochemické  testy  –    
a. Auxanogramy   –   asimilace   sacharidů   za   přítomnosti   O2.,   suspenze   kvasinek   v  YNB  
médiu   (obsah   N   pro   tvorbu   těla   kvasinek),   nalije   se   do   teplého   agaru,   nechá   se  
zatuhnout,   dodáme   disky   s  cukry,   inkubace   1-­‐3   dny   -­‐>   difuse   cukru   do   okolí   -­‐>  
umožní  růst  a  množení  kvasinek  -­‐>  vzniká  zákal  kolem  disků.    
b. Zymogramy  –  přeměna  cukrů  bez  přístupu  O2.  Vzniká  CO2  a  alkohol.  Ve  zkumavkách  
s  plynovkou,   obsah   indikátoru   pH   (fermentací   dochází   k  okyselení).   Hodnotí   se  
změna   barvy   a   tvorba   bublinek   –   chytají   se   v  plynovce   -­‐>   odlišíme   asimilaci   od  
fermentace  (co  se  fermentuje,  tvoří  plyn).    
 
 
 
 
Odběr  a  transport  krve  na  bakteriologické  vyšetření  
Krev  
Na   kultivační   vyšetření   minimálně   třikrát   během   jednoho   dne   nejlépe   při   vzestup   teploty   –  
uvolnění  mikrobů  do  oběhu  -­‐>  reakcí  je  pyróza,  dezinfekce  kůže  v  místě  vpichu,  venepunkcí  odběr  10-­‐
20ml   krve,   vstříknutí   do   speciálních   kultivačních   nádobek   (hemokultury,   obsah   bujónu   a  
protisrážlivého   prostředku   s  indikátorem,   anaerobní   i   aerobní   kultivace).   Provede   se   kontrolní   stěr  
z  kůže   –   vyloučení   kožní   kontaminace.   Při   pozitivním   výsledku   se   provádí   mikroskopie   (Gram),  
kultivace  (KA,  END,  GPA,  citlivost).  
Na   sérologické   vyšetření   (srážlivá   krev)   stejná   technika,   transport   ve   zkumavce   s  pevným  
uzávěrem.  
Zpracovává   se   mikroskopií   (kultivace   po   inkubaci,   Gram),   průkaz   antigenů,   detekce   nukleových  
kyselin   a   kultivačně   nejlépe   v  hemokultivačních   nádobkách   pro   anaerobní   a   aerobní   kultivaci.  
Očkování   na   pevné   půdy   se   provádí   až   při   známkách   růstu   mikrobů   (detekce   na   základě   produkce  
CO2)  na  END,  KA  a  GPA.  

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

29. otázka  –  Diferenciální  diagnostika  vláknitých  hub.  Odběr  a  transport  

krve  na  sérologii.  
 
Diferenciální  diagnostika  vláknitých  hub  
Hlavně   podle   morfologie   (popis   kolonií   a   mikroskopické   znaky).   Kolonie   sestává   z  vláken   (hyf),  
lineárním   prodlužováním   a   tvorbou   příčných   přehrádek   (sept)   rostou.   Větvením   a   splétáním   tvoří  
mycelia   (podhoubí),   dělí   se   na   vzdušné   (roste   nad   živnou   půdu,   zajišťuje   rozmnožování   –  
reproduktivní)  a  bazální  (vegetativní,  zajišťuje  výživu  kolonie,  vrůstá  do  živné  půdy).    
Rozmnožování  –    
a)  Pohlavní  spory  –  výsledek  sexuální  reprodukce.  Askospory  (uvnitř  vakovitého  útvaru  –  
ascus   –   vřecko),   bazidiospory   (na   povrchu   bazidií   –   plodných   buněk),   zygospory  
(okrouhlé  silnostěnné  útvary  vytvářené  v  místě  kontaktu  dvou  hyf).    
b) Nepohlavní   spory   –   vyrůstaní   na   vzdušném   myceliu,   konidie   (různá   velikost,   malé,  
okrouhlé   jednobuněčné   mikrokonidie,   velké   eliptické   vícebuněčné   makrokonidie),  
sporangiofory  (uvnitř  sporangia  –  váček,  na  specializovaných  hyfách.    
1) Kultivace   –   GPA,   nutno   kultivovat   alespoň   2-­‐7dní,   chromogenní   půdy   –   různé   zpracování  
substrátů,   změna   zbarvení,   důležitý   znak   charakter   povrchu   kolonie   –   rýhy,   exudáty,  
difusibilní  pigmenty,  rychlost  růstu.    
2) Mikroskopie  –    
a. Sklíčková  kultura  –  z  GPA  se  vykrojí  bločky  o  průměru  1cm,  přenesou  se  na  podložní  
sklo,  inokulační  jedlou  se  odebere  malé  množství  kultury,  naočkují  se  jím  protilehlá  
místa   bločku,   překryjí   se   krycím   sklem,   umístí   se   do   vlhké   komůrky,   inkubuje   se  
několik   dní   v  temnu   při   30°C,   prohlíží   se   ve   světle   suchým   systémem.   Hodnotíme  
vzhled  mycelia,  optování  zakončení  hyf.    
b. Louhový   preparát   –   20%   louh,   nanesení   šupin   z  kůže,   roztlačení   krycím   sklíčkem,  
organismy   s  chitinem   v  BS   přežijí   louh,   ostatní   nikoli,   dobarvení   Parkerovým  
inkoustem  –  afinita  k  chitinu  
c. Fluorescenční  mikroskopie  –  vazba  barviv  na  chytin  
 
Odběr  a  transport  krve  na  sérologii  
Dezinfekce   kůže   v  místě   vpichu,   venepunkcí   odběr   10-­‐20ml   krve,   srážlivá   krev,   transport   ve  
zkumavce  s  pevným  uzávěrem.  
Krev  se  centrifuguje,  sérum  se  odsaje  a  rozplní  do  několika  malých  zkumavek,  uchovávají  se  při   -­‐
20°C  a  rozmrazí  se  bezprostředně  před  provedením  reakce.    
Sérum   nesmí   být   chylózní   (odběr   na   lačno),   kontaminované   (venepunkce   lege   artis)   ani  
hemolytické  (rychlý  transport  bez  mechanických  inzultů  a  zahřátí).    
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.  

 
Mikrobiologie  -­‐  Praktická  
 
2010  

30. otázka  –  Laboratorní  průkaz  vajíček  střevních  parazitů.  Odběr  a  

transport  moče  na  bakteriologické  vyšetření.  
 
Laboratorní  průkaz  vajíček  střevních  parazitů  
Jednobuněčné  eukaryotní  nebo  mnohobuněčné  organismy,  cizopasníci  na  nebo  uvnitř  lidského  
těla.   Mají   složité   vývojové   cykly,   člověk   může   být   jak   terminálním   hostitelem,   tak   mezihostitelem,  
jsou  to  zoonózy  (přenos  člověk-­‐zvíře,  zvíře-­‐člověk).    
1) Mikroskopie  –    
a. barvení   podle   Kato   –   vzorek   stolice   na   podložním   skle   se   překryje   proužkem   celofánu  
a   impregnuje   se   roztokem   malachitové   zeleně,   po   hodině   odbarvení   a   projasnění,  
prohlížíme  suchým  systémem,  vajíčka  helmitů  
b. koncentrační   metoda   podle   Fausta   –   využívá   různé   hustoty   parazitárních   útvarů   ve  
flotačním  roztoku,  detekce  cyst  prvoků,  vajíček  tasemnic  a  hlístic,  stolice  se  smíchá  
s  flotační  m  roztokem,  centrifuguje  se,  zkumavka  se  doplní  po  okraj,  přiloží  se  krycí  
sklo,  aby  se  dotýkalo  hladiny,  vajíčka  helmitů  vyflotují  k  povrchu  roztoku  a  zachytí  se  
na  krycím  skle,  zhotovíme  nativní  preparát  a  prohlížíme.    
c. Sedimentační   metoda   podle   Telemanna   –   centrifugace,   vajíčka   si   sednou   na   dno  
zkumavky.  Vzorek  se  rozmíchá  ve  vodě,  centrifuguje  se,  přidá  se  koncentrovaná  HCl  
a   dietyleter,   znovu   se   centrifuguje,   dojde   k  rozvrstvení   kapalin   podle   hustoty,  
pozorujeme  v  mikroskopu.  
d. Barvení   podle   Miláčka   –   kryptosporidia,   na   hnědooranžovém   pozadí   jsou  
pozorovatelné  kulaté,  fialově  zbarvené  oocysty  s  charakteristickou  vnitřní  strukturou  
e. Metoda   tlustého   nátěru   –   vzorek   stolice   se   smíchá   s  kapkou   vody   a   rozetře   se   na  
podložním   skle   d   plochy   2x4   cm   po   zaschnutí   se   převrství   parafinovým   olejem,  
hodnotí  se  v  mikroskopu.      
f. Grahamova   metoda   –   přes   anální   otvor   nalepena   speciální     průhledná   lepící   páska,  
poté  odlepena  a  nalepena  na  podložní  sklo,  prohlíží  se  pod  mikroskopem.  Hl.  průkaz  
roupů.    
 
Odběr  a  transport  moče  na  bakteriologické  vyšetření  
Moč  
Před   odběrem   nutné   omytí   genitálu,   odebírá   se   střední   proud   moči   (u   uretritidy   počáteční   u  
postižení  ledvin  konečný!).  Případně  katetrizace  nebo  suprapubická  punkce.  Do  sterilních  plastových  
kontejnerů  s  pevným  uzávěrem.  
Neskladuje   se  –   snadná   dostupnost,   výjimečně   až   18   hodin   při   4°C.   Transport   při   nízké   teplotě   –  
při  vyšší  teplotě  by  došlo  k  přemnožení  bakterií  bez  klinického  významu.    
Zpracovává   se   kultivačně   (do   2   hodin   po   odběru,   KA,   END,   počet   kolonií   >105   signifikantní),  
průkazem  antigenu  (neobvyklé,  hl.  diagnostika  pneumonií).    
Speciální  zpracování  –  Urikult,  komerční  souprava,  sterilní  nádobka  +  nosič  s  agarovými  půdami  
(ponoří   se   do   nádobky   s  močí   –   inokulace).   Po   inkubaci   vyrostou   na   půdách   kolonie   mikrobů  
v  závislosti  na  jejich  kvantitě.    
 
 

Ot.  č.  1  –  Odběr  a  transport  materiálu  k  mikrobiologickému  vyšetření.