KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA

I.TỔNG QUAN

-PP giải trình tự DNA lần đầu được công bố vào 1970 và được phát triểu bởi Fred Sanger

-Là KT giải trình tự sử dụng deideoxyribonuclotide (ddNTP) có gắn đồng vị phóng xạ trong quá trình sinh
tổng hợp DNA
Sau đó những mảnh DNA có tín hiệu được trực quan trên gel acrylamide bằng PP điện di

-Giải trình tự DNA: là Xác định thứ tự của nucleotide (ATGC) trên DNA khuôn

-Giải trình tự thế hệ mới/tiếp theo – Next Generation Sequencing (NGS)

• Hiện đại • Quy mô lớn

• Tốc độ cao • Giá thành giảm

1.Nguyên tắc chung

Dùng một sợi DNA làm khuôn tổng hợp DNA bổ sung, sợi bổ sung đánh dấu bằng ĐV phóng xạ và dùng
những ddNTP thay cho dNTP

2.Vai trò của dideoxyribonucleotide (ddNTP)

-ddNTP có cấu trúc tương tự dNTP nhưng gốc OH ở đầu 3’ bị thay bằng H
 không hình thành liên kết phosphodiester với nu tiếp theo

-Trong quá trình tổng hợp DNA bổ sung, ddNTP cũng bổ sung cho DNA khuôn nhưng khi phân tử ddNTP
gắn vào DNA bổ sung thì tổng hợp bị ngưng lại (do không tạo được liên kết phosphodiester)

 DNA tạo ra là hỗn hợp nhiều đoạn DNA dài ngắn khác nhau nhưng cùng kết thúc tại vị trí ddNTP

3.Điều kiện để thực hiện giải trình tự DNA

-DNA mẫu phải ở dạng sợi đơn

-Sử dụng xen kẽ dNTP và ddNTP

-Chỉ một loại ddNTP được đánh dấu bằng ĐV phóng xạ

II.GIẢI TRÌNH TỰ DNA THEO PHƯƠNG PHÁp SANGER

1.Các bước

a.Chuẩn bị ddNTP

-Trong 4 loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP thì chỉ đánh dấu 1 loại bằng ĐV phóng xạ

-Chất ĐVPX thường dùng: 32P, 33P, 35S. Dùng nhiều nhất là [α35S]dATP vì ít nguy hiểm và T1/2 dài (15 ngày)
b.Giải trình tự

-Tổng hợp DNA trong 4 ống nghiệm chứa thành phần giống nhau, trong cùng 1 lúc:

 DNA đích (DNA khuôn)

 dNTP không đánh dấu
 primer
 DNA polymerase
 4 ống chứa lần lượt các ddNTP khác nhau (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
 tỉ lệ ddNTP/ dNTP cùng loại (ví dụ: ddATP/dATP) là 1/10

-Quá trình: giả sử

1. xét ở ống A chứa ddATP,…(các thành phần như ở trên)

Tổng hợp mạch bổ sung nhờ các dNTP như thường  khi ddATP gắn vào mạch bổ sung thì phản ứng tổng hợp ngưng lại

2.Xét ống nghiệm C

-1/10 là ddATP, khi ddATP gắn vào mạch bổ sung  phản ứng  ngưng tổng hợp
9/10 còn lại tạo phản ứng với dATP  pư tiếp tục đến khi gặp ddATP tiếp theo thì ngừng

Kết quả tạo ra những đoạn DNA nhỏ dài ngắn khác nhau nhưng đều kết thúc bằng ddATP

c.Điện di trên gel

-DNA polymerase sử dụng trong phản ứng định chuỗi có thể tổng hợp trên 1000 base

-Người đọc được dễ dàng 400-500 bp, hoặc có thể lên tới 800bp

Phụ thuộc nhiều vào gel và PP điện di cải tiến

-Muốn giải trình tự, thường người ta phải thực hiện trên 1 sợi DNA và sợi bổ sung
-Hệ thống gel sử dụng nguồn điện có hiệu điện thế cao (1500-3000V)  phải đảm bảo an toàn

-Gel thường dùng là polyacrylamide:

 được kẹp giữa 2 tấm thủy tinh đúng tiêu chuẩn (dài 40-50cm)
 gel dày 0,4 mm và rộng 30-40cm

-Dùng lược coa rang nhọn (lược rang cá)  đọc được dễ dàng hơn

-Nhiệt độ tối ưu: 40-50ͦC

Đoạn DNA nhỏ nhất chạy xa nhất trên gel

 khi đọc đọc theo chiều 5’-3’

2.Ưu, nhược điểm

Ưu điểm Nhược điểm

• Không độc hại bằng M&G
• Có thể tự động hóa
• Đọc được chừng 700 bp?
• Dễ sử dụng
• 15-40 bp đầu dễ bị sai?  sai số
• Mất thời gian do cần gel phân tách trình tự đoạn tín hiệu phóng xạ
• PP chuẩn bị mẫu khó tự động hóa
• Đọc được ít bp (300-1000bp)
• Giá thành cao

III.PHƯƠNG PHÁP THẾ HỆ MỚI

1.Nguyên tắc

DNA polymerase xúc tác sự kết hợp của dNTP và ddNTP đánh dấu huỳnh quang  mạch mới

Thay vì sắp xếp 1 đoạn DNA theo Sanger, PP này mở rộng quá trình ra cho hàng triệu mảnh
 Năng suất cao
2.Các bước

-Chuẩn bị mẫu: DNA mẫu được cắt thành đoạn nhỏ 200-500 bp, gắn adapter ở cả 2 đầu

-Nhân bản bằng PCR trong môi trường dung dịch emulsion PCR

 DNA polymerase xúc tác sự bắt cặp bổ sung giữa các nu đánh dấu huỳnh quang với nu mạch khuôn

 Mỗi lần bắt cặp thành công, sẽ phát tín hiệu huỳnh quang với tần số đặc trưng của từng loạn ATGC

-Đọc trình tự DNA tương ứng

3.Một số kĩ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới (NGS)

a.Công nghệ giải trình tự bằng PP tổng hợp

sử dụng 4 ddNTP đánh dấu HQ để giải trình tự hành chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow cell

Trình tự được đọc từng base với độ chính xác cao, cho phép giải trình tự toàn bộ genome

b.Công nghệ SOLid

-Được thiết kế dựa trên nguyên lý ghép nối

-Toàn bộ genome được cắt thành đoạn DNA ngắn sau đó được gắn từng đoạn với các adapter rồi cố
định vào các hạt từ

-Quá trình được thực hiện nhờ oligonu đánh dấu HQ

c.Công nghê Nanoball sequencing

dựa trên quá trình sao chép của VK : DNA được khuếch đại rồi cuộn thành nanoball

d.Công nghệ SMRT

-Nguyên lý: quan sát quá trình tổng hợp chuỗi DNA tự nhiên bằng các DNA polymerase riêng lẻ

 các tín hiệu nu được đánh dấu sẽ được phát hiện theo thời gian thực  XĐ loại nu nào đang được
gắn vào mạch

Khi kết thúc sao chép, sẽ biết được toàn bộ trình tự

-Tiên tiến nhất

NGOÀI RA CÒN CÓ PP