2/17/2020

Mục tiêu bài học

 Nắm được những khái niệm cơ bản về enzym,

Enzym và biomarker hoạt tính enzym, dấu chỉ snh học (biomarker)

TS. Vũ Thị Thơm  Phương pháp đo hoạt tính enzym và các dấu chỉ
Khoa Y Dược sinh học
ĐHQGHN
Nêu được một số liên hệ giữa enzym và tổng hợp
hóa dược

1 2

Khái niệm
PHẦN I: ENZYM
 Enzym, bản chất là protein, đóng vai trò là chất xúc
 Đại cương về enzym tác sinh học cho các phản ứng hóa học đặc hiệu

 Cấu trúc phân tử  Isoenzym: được tìm thấy ở tất cả các tế bào và mô;
là các dạng phân tử khác nhau của một loại
 Cơ chế tác dụng enzym, xúc tác cùng một phản ứng, nhưng có
tính chất vật lý – hóa học khác nhau
 Động học enzym
 Biomarker: là các phân tử sinh học mà nồng độ
 Yếu tố ảnh hưởng của nó ở trong máu thay đổi đặc trưng cho từng
 Điều hòa enzym bệnh/tổn thương cụ thể.

 Các phương pháp đo hoạt tính enzym

3 4

1
 2/17/2020

Tính chất Cách gọi tên

 Có tính chất của chất xúc tác
 Tên cơ chất + ase
 Không bị tiêu hao hay sinh ra thêm trong quá trình phản ứng

 Làm tăng tốc độ phản ứng

Ure -> urease
 Không làm thay đổi hằng số cân bằng của phản ứng được xúc tác  Tác dụng + ase

Oxy hóa -> oxidase

 Ưu việt hơn chất xúc tác vô cơ và hữu cơ
 Tên cơ chất, tác dụng + ase
 Hiệu suất xúc tác
Khử hydro của lactat -> lactat dehydrogenase
 Tính đặc hiệu

 Xúc tác các phản ứng ở điều kiện sinh lý cơ thể  Tên thường gọi
 Được điều hòa nghiêm ngặt Pepsin, trypsin

5 6

Phân loại
Phân loại
Hiệp hội enzym quốc tế (EC) phân loại enzym theo
phản ứng mà chúng xúc tác thành 6 loại  Enzym phân cắt (lyase): xúc tác chuyển nhóm hóa
học khỏi cơ chất (không có tham gia của nước)
 Enzym oxy hóa khử (oxydoreductase): xúc tác
phản ứng oxy hóa – khử AB  A + B
AH2 + B  A + BH2  Enzym đồng phân (isomerase): xúc tác đồng phân
hóa
 Enzym vận chuyển nhóm (transferase): xúc tác
phản ứng chuyển vị nhóm hóa học (không phải H) ABC  ACB
giữa hai cơ chất  Enzym tổng hợp (ligase): xúc tác gắn hai phân tử
AX + B  A + BX với nhau thành một phân tử lớn hơn, sử dụng năng
lượng cung cấp từ ATP hay các NTP khác
 Enzym thủy phân (hydrolase): xúc tác phản ứng
thủy phân ATP ADP + Pi
AB + H2O  AH + BOH A+B AB

7 8

2
 2/17/2020

Thành phần cấu tạo Cấu trúc phân tử

 Enzym thuần (enzym một thành phần): chỉ bao Cơ chất Sản phẩm

gồm acid amin  Trung tâm hoạt động: vùng

 Enzym tạp (enzym hai thành phần hay đặc biệt của enzym có tác dụng
holoenzym): ngoài thành phần protein còn có chất gắn với cơ chất để xúc tác
cộng tác phản ứng biến đổi cơ chất
thành sản phẩm Trung tâm
hoạt động
 TTHĐ gồm các nhóm hóa học
Holoenzym = Apoenzym + Cofactor
và liên kết tiếp xúc trực tiếp với cơ chất hoặc có
chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác
 Cofactor: ion kim loại hay phân tử hữu cơ nhỏ  TTHĐ thường gồm các acid amin có các nhóm hóa
(coenzym) hay phức hợp hữu cơ kim loại học phân cực hoặc ion hóa, có khả năng tạo liên kết
 Coenzym: thường là vitamin và dẫn xuất của H hay liên kết ion với cơ chất
vitamin

9 10

Chọn lọc cơ chất Chọn lọc cơ chất – Tính đặc hiệu

Ví dụ: Phenylalanine hydroxylase
 Enzym có thể biểu hiện mức độ đặc hiệu khác nhau
OH
với cơ chất khác nhau
H
H
-
OOC +
NH3 - +
 Enzym có thể nhận biết và xúc tác phản ứng với:
OOC NH3
 Chỉ một cơ chất nhất định (đặc hiệu tuyệt đối)

H
VD: urease chỉ xúc tác thủy phân ure
- Không liên kết
OOC
+
NH3  Một nhóm các cơ chất
OH VD: hexokinase xúc tác phosphoryl hóa hexose
HO OH
H  Một loại liên kết nhất định
H
Liên kết nhưng không phản ứng
H
NH VD: chimotrypsin xúc tác thủy phân liên kết peptid
CH3

11 12

3
 2/17/2020

Isoenzym
Cấu trúc phân tử
 Isoenzym (isozym): các dạng phân tử khác nhau
 Enzym dị lập thể (allosteric enzym): ngoài TTHĐ của một loại enzym
còn có vị trí dị lập thể  Xúc tác cùng một phản ứng, nhưng có tính chất vật
 Vị trí DLT: tiếp nhận yếu tố DLT để điều chỉnh hoạt lý – hóa học khác nhau
động xúc tác của enzym
 Yếu tố DLT có thể là dương hoặc âm

TTHĐ

Vị trí dị lập thể

13 14

Cơ chế tác dụng

 Đại cương về enzym
• Enzym làm giảm
năng lượng hoạt hóa
 Cấu trúc phân tử (activation energy)
của phản ứng
 Cơ chế tác dụng
• Cơ chất dễ đạt mức
 Động học enzym năng lượng đưa
phản ứng vào trạng
 Yếu tố ảnh hưởng thái chuyển tiếp
(transition state) 
phản ứng diễn ra
 Điều hòa enzym

15 16

4
 2/17/2020

Cơ chế tác dụng Mô hình “ổ khóa và chìa khóa”

 Enzym biến một phản ứng hóa Thuyết “ổ khóa và chìa khóa” (lock-and-key) của Emil
học đơn thuần thành một phản Fischer (1894):
ứng hóa học qua 2 bước:  TTHĐ có dạng cấu trúc không gian cố định, chỉ cơ chất
E + S  ES  E + P đặc hiệu mới có dạng phù hợp khớp với TTHĐ
 Hai phản ứng mới đều cần  Enzym nào chỉ xúc tác cho đúng cơ chất đó  đặc hiệu
năng lượng hoạt hóa thấp hơn tuyệt đối
rất nhiều so với phản ứng
không có xúc tác của enzym
 Enzym giúp đưa các nhóm
chức lại gần nhau và ổn định
trạng thái chuyển tiếp

17 18

Mô hình “cảm ứng không gian” Các bước phản ứng enzym
Thuyết “cảm ứng không gian” (induced fit) của Daniel  Cơ chất (S) khớp với TTHĐ, tạo thành phức hợp
Edward Koshland (1958): enzym-cơ chất (ES):
 TTHĐ có dạng cấu trúc không gian tương đối linh hoạt
E + S  ES
 Phản ứng xảy ra trong TTHĐ của phức hợp ES, biến
 Trong quá trình tương tác, cấu hình không gian của
đổi cơ chất thành sản phẩm (P):
enzym, TTHĐ và cơ chất có thể biến đổi sao cho phù hợp
ES  E + P
 Cho phép tương tác với nhiều loại cơ chất hơn  Sản phẩm được giải phóng, cho phép một phân tử cơ
chất khác lại có thể gắn với enzym
 Chu trình này có thể được lặp lại hàng triệu lần (hoặc
hơn) mỗi phút
 Phương trình chung của cả phản ứng có thể viết:
E + S  ES  E + P

19 20

5
 2/17/2020

Một số định nghĩa

 Đại cương về enzym
 Tốc độ phản ứng (v) của một enzym là lượng cơ chất
 Cấu trúc phân tử bị biến đổi dưới tác động của enzym đó trong 1 phút ở
25oC dưới các điều kiện được chuẩn hóa
 Cơ chế tác dụng  Đơn vị đo hoạt độ: đơn vị quốc tế (IU, hay U). Đây là
lượng enzym làm biến đổi 1 μmol cơ chất thành sản
 Động học enzym phẩm trong 1 phút ở 25oC dưới các điều kiện được
chuẩn hóa
 Yếu tố ảnh hưởng  Tốc độ ban đầu (V0): tốc độ phản ứng của enzym ở
những phút đầu tiên của phản ứng (~ 5 phút)
 Điều hòa enzym

21 22

Nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng Phương trình Michaelis - Menten

 Khi duy trì nồng độ enzym, tốc độ phản ứng tăng khi  Tốc độ phản ứng E + S  ES  E + P theo phương trình
nồng độ cơ chất tăng Michaelis - Menten:
 Tốc độ phản ứng tối đa (Vmax) đạt được khi enzym bị
bão hòa (tất cả TTHĐ của enzym được gắn với cơ chất) Vmax [ S ]
v
Km  S

 Vmax: Tốc độ tối đa

 [S]: Nồng độ cơ chất

 Km: hằng số Michaelis của

enzym với cơ chất

23 24

6
 2/17/2020

Đồ thị Lineweaver - Burk Ý nghĩa của các giá trị

 Km (mol/L): hằng số đặc trưng của mỗi enzym đối với
một cơ chất, phần nào thể hiện ái lực của enzym với cơ
 Biến đồ thị hyperbol
chất
thành đồ thị tuyến tính
 kcat (s-1): số vòng quay (turnover number) của một
 Giản đơn hóa việc tìm
enzym, là số phân tử cơ chất được biến đổi thành sản
Vmax và Km phẩm trong một đơn vị thời gian, khi enzym này được
 Công cụ để nghiên cứu bão hòa cơ chất
enzym kcat = Vmax/[Et]

 Vmax: Tốc độ tối đa

 [Et]: Nồng độ TTHĐ của enzym

25 26

Nồng độ enzym và tốc độ phản ứng

 Tốc độ phản ứng tăng khi nồng độ enzym tăng (khi duy
 Đại cương về enzym
trì nồng độ cơ chất)
 Cấu trúc phân tử  Tốc độ phản ứng quan hệ tuyến tính với nồng độ enzym
 Km không phụ thuộc vào nồng độ enzym
 Cơ chế tác dụng
 Động học enzym
 Yếu tố ảnh hưởng
 Điều hòa enzym

27 28

7
 2/17/2020

Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH

Optimum pH values
 Enzym hoạt động tốt  Enzym hoạt động tốt
nhất ở nhiệt độ cực Denaturation
nhất ở pH cực thuận
Q10
thuận (thường là 37oC ở Enzyme
activity  Mất hoạt tính khi bị biến Enzyme
người) tính ở pH quá cao hay
activity
Trypsin

 Hoạt động yếu ở nhiệt quá thấp

độ thấp
Pepsin

 Mất hoạt tính khi bị biến 0 10 20 30 40 50

1 3 5 7 9 11

tính ở nhiệt độ cao Temperature / °C

pH

© 2007 Paul Billiet ODWS © 2007 Paul Billiet ODWS

29 30

Các chất ức chế Ức chế thuận nghịch

 Làm giảm hoạt động của enzym
 Thường đặc hiệu, có tác dụng ngay cả ở nồng độ thấp  Có thể gắn với enzym tự do (E) hay phức hợp ES

 Ức chế nhưng không phá hủy enzym  Có 3 loại:

 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
 Hai nhóm chính
 Ức chế phi cạnh tranh (uncompetitive inhibition)
 Ức chế thuận nghịch: thường tương tác không cộng hóa trị
với enzym  Ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)
E + I  EI
 Ức chế không thuận nghịch: thường tương tác cộng hóa trị
với enzym
E + I  EI

31 32

8
 2/17/2020

Ức chế cạnh tranh Ức chế phi cạnh tranh

 Vmax không thay đổi  Vmax và Km giảm

 Km tăng

33 34

Ức chế hỗn hợp Ức chế không cạnh tranh

 Ảnh hưởng Vmax và  Nếu KI = K’I: ức chế không cạnh tranh (noncompetitive
Km inhibition)
 Km không đổi, Vmax giảm

35 36

9
 2/17/2020

Ức chế không thuận nghịch Các chất hoạt hóa

 Là các chất giúp hoạt hóa enzym

 Thường gắn với TTHĐ của enzym  Có thể làm tăng tốc độ phản ứng của enzym

 Làm bất hoạt enzym

Active
 Thường là chất độc mạnh Site
Activator

X
Binding Substrate
Site

Life Sciences-HHMI Outreach. Copyright 2009 President and Fellows of Harvard College

37 38

Điều hòa enzym

 Đại cương về enzym
 Cấu trúc phân tử  Điều hòa dị lập thể
 Các yếu tố dị lập thể tương tác với enzym, làm thay đổi khả
 Cơ chế tác dụng năng tạo phức với cơ chất và khả năng xúc tác
 Tạo ra điều hòa ngược điều tiết các con đường trao đổi chất
 Động học enzym  Điều hòa homotropic và heterotropic

 Yếu tố ảnh hưởng  Biến đổi cộng hóa trị: thuận nghịch
 Phân giải protein, chuyển hóa tiền chất enzym
 Điều hòa enzym (zymogen) thành dạng hoạt hóa

39 40

10
 2/17/2020

Điều hòa hoạt động enzym

Ức chế Proteolysis
or proteolysis
o I I x x o
I
Xét nghiệm enzym
S I S

inhibitor

Điều hòa ngược Phosphorylation

o R x x P o TS. Vũ Thị Thơm

S R S P
(+) Khoa Y Dược
regulator
effector phosphorylation ĐHQGHN
Truyền tin
Juang RH (2004) BCbasics
A or A
o
+
x Regulatory cAMP or
S calmodulin
(-) subunit

41 42

Đo hoạt tính enzym

Các phương pháp đo hoạt tính E
Fixed time Continuous Monitoring/Kinetic
 Phương pháp hóa học = quang phổ so màu
 Đo lượng cơ chất sử  Nhiều phép đo được
 Đo động học thời gian cố định/ đo động học dụng trong 1 khoảng thực hiện liên tục
thời gian xác định hoặc
điểm cuối (kinetic fixed time) lượng huyết thanh xác  Ưu điểm
định.  Có thể quan sát được
 Đo động học liên tục (tốc độ phản ứng) sự phân hủy cơ chất
 Khó khăn
(Kinetic continuous monitor)  Thời gian ủ lâu  Độ chính xác cao
 Dễ biến tính enzym
 Phương pháp miễn dịch
 Thường ở pha lag
 Phương pháp điện di  Có thể bị phân hủy cơ
chất

43 44

11
 2/17/2020

Các xét nghiệm enzym cơ bản Chức năng gan

Enzym Cơ chất Sản phẩm Mô/cơ quan
Chức năng gan Chức năng cơ/ Chức năng Alkaline P-nitrophenol P-nitrophenol Ung thư gan/viêm gan
 Transaminases cơ tim tiêu hóa phosphatase phosphate (vàng) hepatitis
(AP/ALP) (không màu) Xương/gan/thận/ruột/nhau
 AST  CK  Amylase Acid phosphatase Phosphate Phosphate vô Tuyến tiền liệt/tinh dịch/
 ALT  LDH/LD  Lipase (ACP) monoester cơ + Alcohol lách/hồng cầu/tiểu cầu
(pH 9-10)
 Phosphatases Aspatate L-Aspatate + L-glutamate + Tim/gan/cơ (chủ yếu)
 ALP aminotransferase oxoglutarate Oxaloacetate Hồng cầu/thận/tụy/phổi (ít
(AST/GOT) (không màu) (màu đỏ tươi) gặp)
Alanine Alanine + L-glutamate + Gan (chủ yếu)/thận, tim, cơ
transaminase oxoglutarate Pyruvate
(ALT/GPT)
Gamma- γ-glutamyl p- P-nitroanilide + Gan (Chủ yếu)/thận, tụy, mật,
Glutamyltransferase nitroanilide + γ-glutamyl lách, tim, não
(GGT) glycylglycin glycylglycin

45 46

Ý nghĩa của xét nghiệm: AST & ALT Gamma-Glutamyltransferase (GGT)

• Các bệnh về Gan
– Viêm gan
– Xơ gan
– Ung thư gan
• Nhồi máu cơ tim
– Chủ yếu AST tăng
– ALT bình thường/tăng nhẹ,
trừ khi có tổn thương gan
đi kèm
• Các bệnh khác
– Nghẽn phổi  Ý nghĩa chẩn đoán
– Tổn thương cơ  Chất chỉ thị cho tổn thương gan
– Hoại tử  Tăng khi bệnh nhân uống thuốc warfarin,
– Tan máu phenobarbital và phenytoin
– Nhược cơ diễn tiến  Chất chỉ thị nghiện rượu (tăng khi uống nhiều rượu)
 Tăng trong viêm tụy cấp, tiểu đường
 Dải bình thường
 Nam: 10-34 U/L
 Nữ: 9-22 U/L

47 48

12
 2/17/2020

Ý nghĩa: Alkaline Phosphatase (ALP)

 Bình thường: 30-90 U/L Acid Phosphatase (ACP)
 Ghi chú: Bình thường tăng khi mang thai, còn giai đoạn  Dải bình thường: 0-4.5 ng/mL
thanh thiếu niên
 Giá trị chẩn đoán:
 Ý nghĩa chẩn đoán:  Giúp phát hiện ung thư tuyến tiền liệt
 Tăng khi  Các bệnh khác liên quan tới tuyến tiền liệt
 Hoạt động của xương
 Tăng trong bệnh về xương
 Bệnh Paget’s
 Bệnh gan, đặc biệt khi tắc mạch ngoài gan
 Phụ nữ mang thai tuần 16-20
 Giảm cũng xảy ra nhưng không được dùng để chẩn
đoán

49 50

Chức năng cơ/cơ tim Chức năng cơ/cơ tim

Enzym Cơ chất/SP Mô/cơ quan Bệnh liên quan Enzym Cơ Mô/cơ quan Bệnh liên quan
chất/SP
Creatinin Creatinin Cơ vân/ Nhồi máu cơ tim, Rối loạn cơ (như nhược Lactate L-Lactate + Cơ vân/ cơ
kinase +ATP/ tim/ não cơ), tai biến mạch máu não, suy nhược dehydrog NAD+/ tim/ thận/
(CK) Creatinin thần kinh, co giật enase Pyruvate + hồng cầu/ khắp
CK-MM phosphate Tim/ cơ vân Nhồi máu cơ tim, rối loạn cơ, nhược cơ, (LDH/LD) NADH + H+ cơ thể
+ ADP viêm đa cơ, nhược giáp, LDH-1 Tim/ hồng cầu Nhồi máu cơ tim, tan máu
(4H)
CK-MB Tim/ cơ vân Nhồi máu cơ tim, tổn thương cơ tim,
trụy tim, phẫu thuật tim, viêm đa cơ tim, LDH-2 Tim/ hồng cầu Thiếu máu hồng cầu lớn, tổn thương thận
chứng đau thắt ngực, ngộ độc CO (3H-1M) cấp, tan máu

CK-BB Não/phổi/ Sốc hệ thống thần kinh trung ương, bệnh LDH-3 Phổi, bạch cầu, Co thắt phổi, viêm phổi, lymphocytosis,
tuyến tiền liệt/ ngộ độc thần kinh thiếu oxy, trấn thương (2H-2M) tụy, lách viêm tụy cấp, ung thư
buồng trứng/ sọ não, co giật, ung thư, hội chứng Reye’s,
ruột kết/dạ ngộ độc CO, suy thận cấp và mạn, LDH-4 Gan Tổn thương/viêm gan
dày/ tuyến giáp (1H-3M)
LDH-5 Cơ vân Tổn thương cơ vân
(4M)

51 52

13
 2/17/2020

Cấu trúc CK Xét nghiệm CK XN Phân loại Creatine Kinase

• Phân tử gồm 2 đơn vị  Tác động bởi:
• Hai đơn vị này tái cấu trúc  Tuổi
tạo thành 3 isoenzym  Hoạt động vật lý  XN Isoenzyme
• CK-BB: (CK-1) Dạng não  Vận động viên  Phân đoạn CK
• Khi điện di CK-1 di chuyển  Ức chế miễn dịch
nhanh  Nghỉ ngơi (nghỉ ngơi cả
• Lượng nhỏ tìm thấy ở (phổi,  Khối phổ
đêm có thể giảm CK)
bọng đái, ruột)  Điện di
• CK-MB: (CK-2) Dạng lai  CK tổng
• Tim, cơ vân  Nam: 46-180 U/L
• CK-MM: (CK-3) Dạng cơ  Nữ: 15-171 U/L
• Hầu hết ở người khỏe mạnh
• Trong cơ và trong huyết
thanh

53 54

Lactate Dehydrogenase (LDH/LD) Chức năng tiêu hóa

Enzym Cơ chất/SP Mô/cơ quan Ý nghĩa chẩn đoán
Amylase Tinh bột, Tuyến tụy, Viêm tụy cấp (2-12h, bình
 Cấu trúc: 4 đơn phân  Các yếu tố ảnh hưởng XN glycogen/ tuyến nước bọt thường sau vài ngày), tổn
gồm 2 loại protein H và  Vỡ hồng cầu hydratcarbon thương /viêm tuyến nước bọt
(quai bị)
M  LDH trong hồng cầu cao gấp 100-
150 lần trong huyết thanh Lipase Triglycerit/ Tuyến tụy Viêm tụy cấp (đặc hiệu hơn
 Ý nghĩa chẩn đoán Alcohol + amylase)
 Độ ổn định acid béo
 Không đặc hiệu
 Chạy ở nhiệt độ phòng
 Tăng
 Tế bào và huyết thanh tiếp xúc
 Các bệnh máu và ung thư
máu
nhau trong thời gian dài
 Bệnh về gan  Dải bình thường
 Các vấn đề về tim  140- 280 U/L

55 56

14
 2/17/2020

Amylase Lipase
 Yếu tố ảnh hưởng  Yếu tố ảnh hưởng
 Các chất gây mê  Tan hồng cầu
Thắc mắc?
 Dải bình thường  Dải bình thường
 Huyết thanh: 30-100 U/L  Huyết thanh: 13-60 U/L
 Nước tiểu: 1-17 U/h

57 58

15