Phage Display 2nd Edition Michael Hust

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Methods in
Molecular Biology 2702

Michael Hust
Theam Soon Lim Editors

Phage Display
Methods and Protocols
Second Edition
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
 Phage Display

Methods and Protocols

Second Edition

Edited by

Michael Hust
Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Technische Universit€at Braunschweig,
Braunschweig, Germany

Theam Soon Lim

Institute for Research in Molecular Medicine (INFORMM), Universiti Sains Malaysia, Penang, Malaysia
Editors
Michael Hust Theam Soon Lim
Institut für Biochemie, Biotechnologie Institute for Research in Molecular Medicine
und Bioinformatik (INFORMM)
Technische Universit€at Braunschweig Universiti Sains Malaysia
Braunschweig, Germany Penang, Malaysia

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3380-9 ISBN 978-1-0716-3381-6 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3381-6
© The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part
of Springer Nature 2023
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part
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broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and
retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter
developed.
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even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
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The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Preface

Paul Ehrlich first coined the term magic bullet to describe antibodies which were initially
described by his colleague Emil von Behring as “Antitoxine” (anti-toxins) about 125 years
ago. The Emil von Behring got the first Nobel Prize for the anti-diphtheria treatment using
polyclonal antisera. This concept of polyclonal antibodies was used for several applications
as, e.g., anti-snake venom serum preparations, anti-botulinum sera, or as passive therapy
against infectious diseases. Since the initial use of antibodies for therapy, the progress of
antibodies as a means for therapy was slower compared to the influence antibodies played in
the field of diagnostics. It was 15 years after the introduction of hybridoma technology that
phage display technology was first reported, and not long after other new technologies were
also introduced coinciding with the growing interest of adapting antibodies for therapy. The
advancement in recombinant DNA technology and phage display allowed for the selection
of fully human antibodies from antibody phage display libraries. The first fully human
antibody Adalimumab was developed by guided selection using a human antibody phage
display library. There has since been a significant number of different types of phage display
antibody libraries been developed. The advent of machine learning and artificial intelligence
has also impacted the field of antibody phage display in the number of clones it is able to
sieve and allow more in silico-based methods to complement traditional affinity maturation
strategies. The wide array of applications of phage display highlights the robustness and
durability of the method for antibody generation and other biomolecules.
This book is the second edition culminating from the success of the first edition. We
were able to collate a collection of various examples of protocols leading to the generation of
different forms of antibody libraries including libraries from different hosts as well as
different antibody selection (“panning”) strategies. We are grateful as many renowned
research groups internationally were willing to share their expertise and experience in this
book making it an ideal companion for avid researchers in the field of antibody technology. A
comprehensive list of different antibody libraries as well as novel approaches for antibody
discovery is covered in this book. The chapters in this book are divided into four sections:
the first focuses on the construction of antibody libraries, followed by selection strategies for
antibodies, complementary approaches for antibody selection, and finally other phage
display-related applications such as epitope mapping and biomarker identification. Although
a comprehensive list of topics has been covered in this book, there are still many more
chapters that can still be written considering so much activity in all the antibody laboratories
in the world. We also included a chapter on yeast display to highlight the synonymous nature
of other display technologies to phage display.
The diverse author list showcases the ability for science to transcend borders allowing
keen researchers from different parts of the world to carry out antibody development
projects. The process to put this book together has helped strengthen our friendship and
exchange between our laboratories not just on a research level but also more importantly on
a personal level. Many new friendships and ideas have been developed over the course of this
book that bolds well for cross-border collaborative initiatives. It is our hope that this book
can provide technical assistance to new groups and researchers that are venturing into the
field of antibody phage display. We also hope this book will help spur interest and ideas in the
field while expanding our growing family of enthusiastic antibody researchers.

v
vi Preface

We would like to thank all the authors whose contributions to this volume have allowed
it to be a comprehensive guide to the processes involved in antibody phage display. We
would also like to thank Prof. John M. Walker for his guidance and assistance throughout
the editorial process. We would also like to express our gratitude to our great mentors
Erhard Rhiel, Thomas Reinard, and Stefan Dübel and Zoltán Konthur and Jörn Glökler who
are great influences in our scientific careers. On a personal note, we would like to thank our
families Poi Hong, Hayley, and Hayden and Dagmar, Noah Joris, and Lenja Marie for their
patience and understanding while preparing this book and with our other commitments.

Braunschweig, Germany Michael Hust

Penang, Malaysia Theam Soon Lim
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

PART I INTRODUCTION

1 Antibody Phage Display . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Alia Nur, Maren Schubert, Jing Yi Lai, Michael Hust,
Yee Siew Choong, Wan Yus Haniff Wan Isa,
and Theam Soon Lim

PART II CONSTRUCTION OF ANTIBODY PHAGE DISPLAY LIBRARIES

2 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries . . . . . 15

Maximilian Ruschig, Philip Alexander Heine, Viola Fühner,
Kilian Johannes Karl Zilkens, Stephan Steinke, Maren Schubert,
Federico Bertoglio, and Michael Hust
3 Construction of Naı̈ve and Immune Human Fab Phage Display Library . . . . . . . 39
Jing Yi Lai and Theam Soon Lim
4 Construction of Synthetic Antibody Phage Display Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Kim Anh Giang, Sachdev S. Sidhu, and Johan Nilvebrant
5 Construction of Chicken and Ostrich Antibody Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Jeanni Fehrsen, Susan Wemmer, and Wouter van Wyngaardt
6 Construction of Rabbit Immune Antibody Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Thi Thu Ha Nguyen, Jong Seo Lee, and Hyunbo Shim
7 Isolation and Characterization of Single-Domain Antibodies
from Immune Phage Display Libraries. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Martin A. Rossotti, Frederic Trempe, Henk van Faassen,
Greg Hussack, and Mehdi Arbabi-Ghahroudi
8 Phagekines: Directed Evolution and Characterization of Functional
Cytokines Displayed on Phages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
Gertrudis Rojas, Tania Carmenate, Gisela Garcı́a-Pérez,
and Dayana Pérez-Martı́nez
9 Efficient Cloning of Inserts for Phage Display by Golden Gate Assembly . . . . . . 191
Ashley K. Grahn, Grace L. Allen, and Brian K. Kay
10 Construction of an Ultra-Large Phage Display Library by Kunkel
Mutagenesis and Rolling Circle Amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Renhua R. Huang, Michael Kierny, Veronica Volgina,
Makio Iwashima, Christina Miller, and Brian K. Kay

vii
viii Contents

11 Construction of Semisynthetic Shark vNAR Yeast Surface Display

Antibody Libraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
Harald Kolmar, Julius Grzeschik, Doreen Könning,
Simon Krah, and Stefan Zielonka

PART III SELECTION STRATEGIES FOR ANTIBODIES

12 Antibody Selection via Phage Display in Microtiter Plates. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

Stephan Steinke, Kristian Daniel Ralph Roth, Maximilian Ruschig,
Nora Langreder, Saskia Polten, Kai-Thomas Schneider,
Rico Ballmann, Giulio Russo, Kilian Johannes Karl Zilkens,
Maren Schubert, Federico Bertoglio, and Michael Hust
13 Antibody Selection in Solution Using Magnetic Beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
Philip Alexander Heine, Maximilian Ruschig, Nora Langreder,
Esther Veronika Wenzel, Maren Schubert, Federico Bertoglio,
and Michael Hust
14 Streptavidin-Coated Solid-Phase Extraction (SPE) Tips for Antibody
Phage Display Biopanning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
Theam Soon Lim, Angela Chiew Wen Ch’ng,
Brenda Pei Chui Song, and Jing Yi Lai
15 Magnetic Nanoparticle-Based Semi-automated Panning
for High-Throughput Antibody Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Angela Chiew Wen Ch’ng, Zoltán Konthur,
and Theam Soon Lim
16 Antibody Selection on Cells Targeting Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
Viktor Glaser, U€ mran Karsli-U € nal, Maike Hagedorn,
and Tom Pieper
17 Targeting Intracellular Antigens with pMHC-Binding Antibodies:
A Phage Display Approach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
Zhiyuan Yang, Zhihao Wu, Brian H. Santich, Jingbao Liu,
Cheng Liu, and Nai-Kong V. Cheung
18 Antibody Isolation from Human Synthetic Libraries of Single-Chain
Antibodies and Analysis Using NGS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347
Adi Amir, David Taussig, Almog Bitton, Limor Nahary,
Anna Vaisman-Mentesh, Itai Benhar, and Yariv Wine
19 Selection of Affibody Affinity Proteins from Phagemid Libraries . . . . . . . . . . . . . . 373
Kim Anh Giang, Per-Åke Nygren, and Johan Nilvebrant

PART IV COMPLEMENTARY APPROACHES FOR ANTIBODY PHAGE

DISPLAY SELECTIONS

20 Antibody Affinity and Stability Maturation by Error-Prone PCR. . . . . . . . . . . . . . 395

Nora Langreder, Dorina Sch€ a ckermann, Tobias Unkauf,
Maren Schubert, André Frenzel, Federico Bertoglio,
and Michael Hust
21 Antibody Batch Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
Rico Ballmann, Kai-Thomas Schneider,
Kristian Daniel Ralph Roth, and Stefan Dübel
 Contents ix

22 Deep Mining of Complex Antibody Phage Pools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419

Tulika Tulika and Anne Ljungars
23 High-Throughput IgG Reformatting and Expression Using Hybrid
Secretion Signals and InTag Positive Selection Technology . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
Georgina Sansome, Veronika Rayzman, Irene Kiess,
Michael J. Wilson, Con Panousis, and Chao-Guang Chen
24 Validation and the Determination of Antibody Bioactivity
Using MILKSHAKE and Sundae Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
Mary R. Ferguson, Qiana M. Mendez, Felicity E. Acca,
Cassandra D. Chapados, Holland A. Driscoll, Kezzia S. Jones,
Gregory Mirando, Michael P. Weiner, and Xiaofeng Li
25 Mapping Polyclonal Antibody Responses to Infection Using
Next-Generation Phage Display . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467
Maria T. Tsoumpeli, Anitha Varghese, Jonathan P. Owen,
Ben C. Maddison, Janet M. Daly, and Kevin C. Gough
26 Applications of High-Throughput DNA Sequencing to Single-Domain
Antibody Discovery and Engineering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489
Michael J. Lowden, Eric K. Lei, Greg Hussack,
and Kevin A. Henry

PART V EPITOPE MAPPING AND BIOMARKER DISCOVERY BY PHAGE DISPLAY

27 Biomarker Discovery by ORFeome Phage Display . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543

Philip Alexander Heine, Rico Ballmann, Praveen Thevarajah,
Giulio Russo, Gustavo Marçal Schmidt Garcia Moreira,
and Michael Hust
28 Mapping Epitopes by Phage Display . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563
Stephan Steinke, Kristian Daniel Ralph Roth, Ruben Englick,
Nora Langreder, Rico Ballmann, Viola Fühner,
Kilian Johannes Karl Zilkens, Gustavo Marçal Schmidt Garcia Moreira,
Allan Koch, Filippo Azzali, Giulio Russo, Maren Schubert,
Federico Bertoglio, Philip Alexander Heine, and Michael Hust
29 Epivolve: A Protocol for Site-Directed Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 587
Xiaofeng Li, Kezzia S. Jones, Felicity E. Acca,
Cassandra D. Chapados, Holland A. Driscoll, Emily P. Fuller,
Qiana M. Mendez, Gregory Mirando, Michael P. Weiner,
and Mary R. Ferguson

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603
Contributors

FELICITY E. ACCA • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA

GRACE L. ALLEN • Tango Biosciences, Chicago, IL, USA
ADI AMIR • The Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research, The George S. Wise
Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
MEHDI ARBABI-GHAHROUDI • Human Health Therapeutics Research Centre, National
Research Council Canada, Ottawa, ON, Canada; Department of Biochemistry,
Microbiology and Immunology, University of Ottawa, Ottawa, ON, Canada; Department
of Biology, Carleton University, Ottawa, ON, Canada
FILIPPO AZZALI • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Technische
Universit€at Braunschweig, Braunschweig, Germany
RICO BALLMANN • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Abteilung
Biotechnologie und Medizinische Biotechnologie, Technische Universit€
at Braunschweig,
Braunschweig, Germany
ITAI BENHAR • The Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research, The George S. Wise
Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
FEDERICO BERTOGLIO • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Technische
Universit€at Braunschweig, Braunschweig, Germany; Choose Life Biotech SA, Bellinzona,
Switzerland
ALMOG BITTON • Ukko LTD, Rehovot, Israel
TANIA CARMENATE • Center of Molecular Immunology, La Habana, Cuba
ANGELA CHIEW WEN CH’NG • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains
Malaysia, Penang, Malaysia
CASSANDRA D. CHAPADOS • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
CHAO-GUANG CHEN • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
NAI-KONG V. CHEUNG • Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer
Center, New York, NY, USA; Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical
Sciences, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
YEE SIEW CHOONG • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains
Malaysia, Penang, Malaysia
JANET M. DALY • School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham,
Sutton Bonington, Leicestershire, UK
HOLLAND A. DRISCOLL • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
STEFAN DÜBEL • Institute of Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, Technische
Universit€at Braunschweig, Braunschweig, Germany
RUBEN ENGLICK • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Technische
Universit€at Braunschweig, Braunschweig, Germany
HENK VAN FAASSEN • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research
Council Canada, Ottawa, ON, Canada
JEANNI FEHRSEN • ARC-Onderstepoort Veterinary Research, Pretoria, South Africa
MARY R. FERGUSON • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
ANDRÉ FRENZEL • YUMAB GmbH, Science Campus Braunschweig-Süd, Braunschweig,
Germany

xi
xii Contributors

VIOLA FÜHNER • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Abteilung

Biotechnologie und Medizinische Biotechnologie, Technische Universit€ at Braunschweig,
Braunschweig, Germany
EMILY P. FULLER • Institute for Systems Genomics, University of Connecticut, Storrs, CT,
USA; Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, Storrs, CT,
USA
GISELA GARCÍA-PÉREZ • Center of Molecular Immunology, La Habana, Cuba
KIM ANH GIANG • Division of Protein Engineering, School of Chemistry, Biotechnology and
Health, Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden
VIKTOR GLASER • Department of Gastroenterology, Hepatology, Infectious Diseases and
Endocrinology, Hannover Medical School, Hannover, Germany; Berlin Center for
Advanced Therapies (BeCAT), Charité – Universit€ a tsmedizin Berlin, corporate member of
Freie Universit€
a t Berlin, Humboldt-Universit€ at zu Berlin, and Berlin Institute of Health
(BIH), Berlin, Germany
KEVIN C. GOUGH • School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham,
Sutton Bonington, Leicestershire, UK
ASHLEY K. GRAHN • Tango Biosciences, Chicago, IL, USA
JULIUS GRZESCHIK • Institute for Organic Chemistry and Biochemistry, Technische
Universit€
at Darmstadt, Darmstadt, Germany
MAIKE HAGEDORN • Department of Gastroenterology, Hepatology, Infectious Diseases and
Endocrinology, Hannover Medical School, Hannover, Germany
PHILIP ALEXANDER HEINE • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik,
Abteilung Biotechnologie und Medizinische Biotechnologie, Technische Universit€ at
Braunschweig, Braunschweig, Germany
KEVIN A. HENRY • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research
Council Canada, Ottawa, ON, Canada; Department of Biochemistry, Microbiology and
Immunology, University of Ottawa, Ottawa, ON, Canada
RENHUA R. HUANG • MacroGenics, Rockville, MD, USA
GREG HUSSACK • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council
Canada, Ottawa, ON, Canada
MICHAEL HUST • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments
Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
WAN YUS HANIFF WAN ISA • School of Medical Sciences, Department of Medicine, Universiti
Sains Malaysia, Kubang Kerian, Kelantan, Malaysia
MAKIO IWASHIMA • Department of Microbiology and Immunology, Loyola University
Chicago, Maywood, IL, USA
KEZZIA S. JONES • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
€ MRAN KARSLI-U
U € NAL • Department of Gastroenterology, Hepatology, Infectious Diseases and
Endocrinology, Hannover Medical School, Hannover, Germany
BRIAN K. KAY • Tango Biosciences, Chicago, IL, USA
MICHAEL KIERNY • AstraZeneca, Gaithersburg, MD, USA
IRENE KIESS • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
ALLAN KOCH • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Technische
Universit€
at Braunschweig, Braunschweig, Germany; Innovationszentrum Niedersachsen
GmbH, startup.niedersachsen, Hannover, Germany
HARALD KOLMAR • Institute for Organic Chemistry and Biochemistry, Technische Universit€ at
Darmstadt, Darmstadt, Germany
 Contributors xiii

DOREEN KÖNNING • Antibody-Drug Conjugates and Targeted NBE Therapeutics, Merck

KGaA, Darmstadt, Germany
ZOLTÁN KONTHUR • Department of Analytical Chemistry, Reference Materials,
Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM), Berlin, Germany
SIMON KRAH • Antibody Discovery & Protein Engineering, Merck KGaA, Darmstadt,
Germany
JING YI LAI • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains Malaysia,
Penang, Malaysia
NORA LANGREDER • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments
Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
JONG SEO LEE • AbClon Inc., Seoul, Korea
ERIC K. LEI • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council
Canada, Ottawa, ON, Canada
XIAOFENG LI • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
THEAM SOON LIM • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains Malaysia,
Penang, Malaysia; Analytical Biochemistry Research Center, Universiti Sains Malaysia,
Penang, Malaysia
CHENG LIU • Eureka Therapeutics, Emeryville, CA, USA
JINGBAO LIU • Eureka Therapeutics, Emeryville, CA, USA
ANNE LJUNGARS • Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of
Denmark, Kongens Lyngby, Denmark
MICHAEL J. LOWDEN • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research
Council Canada, Ottawa, ON, Canada
BEN C. MADDISON • RSK-ADAS Ltd, Beeston, Nottinghamshire, UK
QIANA M. MENDEZ • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
CHRISTINA MILLER • Tango Biosciences, Chicago, IL, USA
GREGORY MIRANDO • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
GUSTAVO MARÇAL SCHMIDT GARCIA MOREIRA • Institut für Biochemie, Biotechnologie und
Bioinformatik, Abteilung Biotechnologie und Medizinische Biotechnologie, Technische
Universit€
at Braunschweig, Braunschweig, Germany; Tacalyx GmbH, Sector for Antibody
and Protein Biochemistry, Berlin, Germany
LIMOR NAHARY • The Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research, The George
S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
THI THU HA NGUYEN • Imvastech Inc., Seoul, Korea
JOHAN NILVEBRANT • Division of Protein Engineering, School of Chemistry, Biotechnology
and Health, Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden
ALIA NUR • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains Malaysia,
Penang, Malaysia
PER-ÅKE NYGREN • Division of Protein Engineering, School of Chemistry, Biotechnology and
Health, Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden; Science for Life Laboratory,
Solna, Sweden
JONATHAN P. OWEN • RSK-ADAS Ltd, Beeston, Nottinghamshire, UK
CON PANOUSIS • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
DAYANA PÉREZ-MARTÍNEZ • Center of Molecular Immunology, La Habana, Cuba
TOM PIEPER • Department of Gastroenterology, Hepatology, Infectious Diseases and
Endocrinology, Hannover Medical School, Hannover, Germany
xiv Contributors

SASKIA POLTEN • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments

Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
VERONIKA RAYZMAN • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
GERTRUDIS ROJAS • Center of Molecular Immunology, La Habana, Cuba
MARTIN A. ROSSOTTI • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research
Council Canada, Ottawa, ON, Canada
KRISTIAN DANIEL RALPH ROTH • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik,
Departments Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ at
Braunschweig, Braunschweig, Germany
MAXIMILIAN RUSCHIG • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik,
Departments Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ at
Braunschweig, Braunschweig, Germany
GIULIO RUSSO • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments
Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
GEORGINA SANSOME • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
BRIAN H. SANTICH • Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences,
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
DORINA SCHA€ CKERMANN • Technische Universit€ a t Braunschweig, Institut für Biochemie,
Biotechnologie und Bioinformatik, Braunschweig, Germany; Wirtschaftsgenossenschaft
deutscher Tier€
a rzte eG (WDT), Garbsen, Germany
KAI-THOMAS SCHNEIDER • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik,
Departments Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ at
Braunschweig, Braunschweig, Germany
MAREN SCHUBERT • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments
Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
HYUNBO SHIM • Department of Life Sciences, Ewha Womans Univesity, Seoul, Korea
SACHDEV S. SIDHU • School of Pharmacy, University of Waterloo, Kitchener, ON, Canada
BRENDA PEI CHUI SONG • Institute for Research in Molecular Medicine, Universiti Sains
Malaysia, Penang, Malaysia
STEPHAN STEINKE • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Departments
Biotechnology and Medical Biotechnology, Technische Universit€ a t Braunschweig,
Braunschweig, Germany
DAVID TAUSSIG • The Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research, The George
S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
PRAVEEN THEVARAJAH • Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, Abteilung
Biotechnologie und Medizinische Biotechnologie, Technische Universit€ at Braunschweig,
Braunschweig, Germany
FREDERIC TREMPE • Human Health Therapeutics Research Centre, National Research
Council Canada, Ottawa, ON, Canada
MARIA T. TSOUMPELI • School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham,
Sutton Bonington, Leicestershire, UK
TULIKA TULIKA • Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of
Denmark, Kongens Lyngby, Denmark
 Contributors xv

TOBIAS UNKAUF • Technische Universit€ a t Braunschweig, Institut für Biochemie,

Biotechnologie und Bioinformatik, Braunschweig, Germany; Bayer Consumer Care AG,
Basel, Switzerland
ANNA VAISMAN-MENTESH • 1E Therapeutics LTD, Rehovot, Israel
ANITHA VARGHESE • School of Veterinary Medicine and Science, University of Nottingham,
Sutton Bonington, Leicestershire, UK
VERONICA VOLGINA • Department of Microbiology and Immunology, Loyola University
Chicago, Maywood, IL, USA
MICHAEL P. WEINER • Abbratech, Inc., Branford, CT, USA
SUSAN WEMMER • ARC-Onderstepoort Veterinary Research, Pretoria, South Africa
ESTHER VERONIKA WENZEL • Abcalis GmbH, Braunschweig, Germany
MICHAEL J. WILSON • Research and Development, CSL Limited, Parkville, Australia
YARIV WINE • The Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research, The George S. Wise
Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
ZHIHAO WU • Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center,
New York, NY, USA
WOUTER VAN WYNGAARDT • ARC-Onderstepoort Veterinary Research, Pretoria, South Africa
ZHIYUAN YANG • Eureka Therapeutics, Emeryville, CA, USA
STEFAN ZIELONKA • Institute for Organic Chemistry and Biochemistry, Technische
Universit€at Darmstadt, Darmstadt, Germany; Antibody Discovery & Protein
Engineering, Merck KGaA, Darmstadt, Germany
KILIAN JOHANNES KARL ZILKENS • Abcalis GmbH, Braunschweig, Germany
 Part I

Introduction
 Chapter 1

Antibody Phage Display

Alia Nur, Maren Schubert, Jing Yi Lai, Michael Hust, Yee Siew Choong,
Wan Yus Haniff Wan Isa, and Theam Soon Lim

Abstract
The application of antibodies has transcended across many areas of work but mainly as a research tool, for
diagnostic and for therapeutic applications. Antibodies are immunoproteins from vertebrates that have the
unique property of specifically binding foreign molecules and distinguish target antigens. This property
allows antibodies to effectively protect the host from infections. Apart from the hybridoma technology
using transgenic animals, antibody phage display is commonly considered the gold standard technique for
the isolation of human monoclonal antibodies. The concept of antibody phage display surrounds the ability
to display antibody fragments on the surface of M13 bacteriophage particles with the corresponding gene
packaged within the particle. A repetitive in vitro affinity based selection process permits the enrichment of
target specific binders. This process of recombinant human monoclonal antibody generation also enables
additional engineering for various applications. This makes phage display an indispensable technique for
antibody development and engineering activities.

Key words Antibody libraries, Biopanning, M13 bacteriophage, Monoclonal antibodies, Phage
display

1 Introduction

Antibodies are one of the prominent products of the human

immune system. They are produced by B cells as a response to
encounters with any foreign antigen. B cells will proliferate and
secrete soluble antibodies into circulation via the blood and lym-
phatic system when triggered by these foreign antigens [1]. The
inherent ability of antibodies to confer protection to the human
body against a plethora of pathogens is governed by the diverse
repertoire of antibodies produced by the B cells through muta-
tional processes. Germline level diversification of antibody genes
functions to generate a diverse population of antibodies with dif-
ferent binding specificities. The binding specificities are refined
through clonal selection to produce an affinity-rich population of

Michael Hust and Theam Soon Lim (eds.), Phage Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2702,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3381-6_1,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2023

3
4 Alia Nur et al.

antibodies to bind specific target antigens from any pathogen

[2, 3].
The increase in demand for antibodies especially monoclonal
antibodies after the advent of hybridoma technology [4] has
exposed some of the challenges associated with the method. This
brought about innovations to produce monoclonal antibodies
using different approaches to achieve fully human antibodies as
well for other species at a faster rate. This was possible with the
introduction of phage display as the first major display technique
for antibody discovery [5–7] based on the work of G.P. Smith
[8]. It changed the way monoclonal antibodies can be gener-
ated allowing the generation of fully human antibodies. The idea-
tion of phage display is based on the possibility to clone antibody
sequences as a fusion to the minor coat protein of the phage
particle. Therefore, when phage proteins are produced, the anti-
body fused to the minor coat protein would also be expressed
simultaneously by the host cell. During virion packaging in the
periplasm, phage particles would be produced presenting the par-
ticular antibody fragment on its surface. The presented antibody
molecule on the surface of the phage particle is attached to the
minor coat protein of the mature phage particles with the genetic
information being encapsulated in the phage particle allowing
for easy clone identification [9–11]. A directed evolution selection
process is carried out by selecting clones with the highest specificity
and affinity by selective elimination through several enrichment
cycles. This entire select and concentrate cycle makes for the basis
of phage display panning for monoclonal antibody selection
[12, 13].

2 Antibody Structure and Function

The general architecture of an antibody resembles a typical

Y-shaped structure that is typically made up of two identical pairs
of heavy chain (HC) and light chain (LC) [14]. The bivalency of
these four polypeptide chains is formed via disulfide bonds between
the two halves of the Y-shape structure [15]. The human antibody
LC is unique where it can be classified as either kappa (κ) or lambda
(λ) families [16, 17]. Each antibody chain is further divided into the
constant (C) region and a highly varied variable (V) region. The
sequence variability stems from three regions of hypervariability
that are separated by four framework regions (FR). These hyper-
variable sites are commonly referred to as complementarity-
determining regions (CDRs). The 6 CDRs found throughout the
HC and LC (each chain having 3 CDRs) accounts for the antibody
variability and specificity in antigen binding. The heavy chain (VH)
and light chain (VL) variable domains will fold to form the fragment
variable region (Fv), which plays the pivotal role of target binding.
 Antibody Phage Display 5

Fig. 1 Structure of an antibody and various recombinant antibody formats (a) Typical structure of IgG
comprises two identical heavy chains (HC) and two identical light chains (LC) interconnected through disulfide
bonds to form a flexible Y-shaped molecule. VH and VL form the fragment variable region (Fv); Fv together with
CH1 and CL form the fragment antigen-binding region (Fab); CH2 and CH3 form the fragment crystallizable
region (Fc). (b) Some of the commonly used recombinant antibody formats includes the single-chain fragment
variable (scFv), single-domain antibody (sdAb), Fab, single-chain Fab (scFab), scFv-CH3, and scFv-Fc

However, the VH and VL when fused to their respective constant

domains (light chain constant region, CL and first heavy chain
constant domain, CH1) will form the fragment antigen-binding
region (Fab) giving rise to two identical arms of the “Y”-shaped
structure [3, 18, 19]. The Fab structure makes up the upper half of
the antibody Y shape structure. However, recombinant DNA tech-
nology has brought about various antibody domain configurations
to yield a selection of different antibody formats in Fig. 1.
The upper half of the antibody is then linked to the bottom half
by a flexible linker. The bottom half of the antibody consist of the
fragment crystallizable (Fc) region. The Fc domain is made up of
the heavy chain constant domains 2 and 3 (CH2 and CH3). The Fc
region is able to elicit an immune response by interacting with the
Fc receptors (FcR) or C1q complement components to eliminate
invading antigens either by antibody-dependent cellular cytotoxic
(ADCC) or complement-dependent cytotoxic (CDC) mechanism
[3, 20]. The sequence makeup of the C region is relatively constant
with only slight variations occurring at specific sites responsible for
the effector cell binding [3].

2.1 Recombinant The main characteristic of antibodies is its ability to specifically bind
Formats and distinguish target antigens. As the variable region of the anti-
body molecules is responsible for antigen binding, a diverse
6 Alia Nur et al.

collection of antibody fragments or formats focusing on variable

domains have been engineered for display.
Truncated antibody fragments can be produced either by enzy-
matic fragmentation or genetic modification. This can be achieved
either by disulfide bond reduction or by protease digestion using
papain and pepsin to yield Fab, F(ab)’2, and Fc formats from a
single antibody molecule [21, 22]. However, genetic-based
approaches allows for greater freedom to generate unique antibody
formats. Of the many potential recombinant formats, the format
that is most widely utilized is the single-chain variable fragment
(scFv). The scFv construct consists of both the VH and a VL domain
that is connected through a short flexible peptide linker [23]. The
scFv format is a monomeric protein in general, but further genetic
modification has also developed multimeric scFvs that consist of
multiple scFv fragments that are joined together through a shorter
peptide linker to form multivalent diabodies, triabodies, or tetra-
bodies. These multimeric scFv formats would also generate a mol-
ecule with a higher avidity [24, 25]. Additionally, fusing multiple
scFv molecules with different target binding pockets can also help
to achieve antibody fragments with multispecificities. Likewise, the
freedom of genetic-based approaches brought about various com-
binations utilizing the VH, VL, CH1, CL, CH2, and CH3 domains.
Some of the alternative formats achievable by genetic modification
includes the Fab, scFab, scFv-CH3, and scFv-Fc [26–28] (Fig. 1).
The smallest antibody fragment available is the single-domain
antibody (sdAb) that consist of a single variable domain. sdAb, also
termed as nanobody, is derived from heavy chain antibody (hcAb)
such as VHH of camelids and VNAR of sharks [29–31]. Alterna-
tively, sdAb can also be engineered using either the VH or VL of
human or mouse IgG [32]. A major advantage of sdAb over con-
ventional antibodies or other recombinant antibody formats is
the rapid penetration to buried sites or cryptic epitopes due to its
smaller size which are not accessible to larger antibodies
[33, 34]. At the same time, its size is also a disadvantage as clearance
from the body is faster and therefore resulting in a reduced half-
life compared to an IgG.

3 Antibody Phage Display Libraries

The primary application of antibody phage display libraries is based

on the fundamental ability of phage display to allow the recovery of
the genotype (DNA sequence) based on the phenotypic (protein)
characteristic [6, 7]. In order to achieve this coupling of phenotype
and genotype, the antibody is fused to the pIII protein of M13 as a
fusion. This way, the phenotype is now displayed on the phage
particles encapsulating the genotype corresponding to the specific
antibody being displayed. When constructing antibody phage
 Antibody Phage Display 7

display libraries, the genes encoding different antibody clones are

cloned into a phagemid with the antibody sequence located
upstream of pIII gene. The phagemid lacking other accessory
proteins required would depend on helper phages that con-
tains the remaining sequences required to regulate the packaging
of phage particles. When phage particles are packaged, the antibody
fragment is translated with the coat protein as a fusion protein
permitting it to be anchored and displayed on the surface of the
phage particle [6, 9, 10, 35].
A large collection of unique phage particles each encoding a
unique antibody gene forms the basis for antibody phage display
libraries. Antibody libraries are generally designed based on the
choice of antibody format preferred with various antibody formats
such as scFv [23], Fab, or sdAb [36] that are normally used for
phage display. Another factor to be considered is the source of
antibody genes which can be derived from humans or other species
which includes rodents, camelids, non-cartilaginous fishes and non-
human primates [37]. Even so, antibody phage display libraries can
be categorized into three main categories based on the source of
the V gene repertoire. They are commonly referred to as either
immune libraries, naı̈ve libraries, or synthetic antibody
libraries [38].

3.1 Immune Immune antibody libraries are constructed using B cells or plasma
Antibody Library cells from either immunized animals or disease infected individuals.
Immune libraries take advantage of the in vivo affinity maturation
and V gene hypermutation process that shapes the antibody
response upon exposure to an infection [39–41]. These processes
help shape a skewed repertoire against the infection, therefore
allowing the isolation of antibodies with higher affinities in the
nanomolar range. Like naı̈ve antibody libraries, the antibody
genes could also be isolated from PBMC, bone marrow, lymph
nodes, or spleen [42]. The library quality can be improved by
isolating donor plasma cells for library construction [43].
The antibody isotype that is typically used for the development
of immune antibody libraries is IgG, while IgA and IgE repertoires
are sometimes considered especially for mucosal-, parasitic-, and
allergy-based libraries [39]. As the nature of immune libraries is
somewhat focused in its response, the required repertoire size for
immune antibody libraries is relatively smaller compared to naı̈ve
antibody libraries. Even so, immune libraries should not be dis-
counted from the presence of an extended repertoire due to the
complexity generated by combinatorial cloning [44]. The general
application of immune antibody libraries is mainly for the genera-
tion of antibodies against a specific set of antigens that are related to
a specific infection given the nature of the skewed repertoire. Even
so, it is also possible to isolate binders against closely related anti-
gens using immune libraries [45, 46]. However, such a practice
8 Alia Nur et al.

with immune libraries is not common as the general perception of a

skewed repertoire would mean a focused application of immune
libraries. Thus in general, new libraries would have to be con-
structed for each new antibody development campaign against a
new target or disease which may not be cost effective and tedious.

3.2 Naı¨ve Antibody A naı̈ve antibody library as the name depicts is naı̈ve in terms of its
Library repertoire preference. Such a library is generated using B cells
from either healthy donors or individuals with no known infection
at the point of collection. The antibody genes can be retrieved by
mRNA extraction of various source materials ranging from either
peripheral blood mononuclear cells (PBMC), bone marrow, lymph
nodes, or spleen. The mRNA is then reverse transcribed into cDNA
using either oligo(dt) primers or random primers in order to pre-
serve the large and diverse repertoire of the antibody population.
After the first-strand cDNA synthesis, the specific V genes are
amplified using a set of primers designed to provide a maximum
coverage all known V gene families [42, 47, 48]. The gene cover-
age of the designed primer set is a critical aspect in antibody library
construction to ensure good gene coverage during amplification for
a diverse library repertoire [49]. Although the general repertoire of
the antibody genes is very diverse, the inclusion of a combinatorial
mixing step of the antibody genes during cloning can further
expand the diversity of the library. During cloning, the VH genes
are paired randomly with the VL gene repertoire giving rise to
multiple combinations where some may not even exist naturally
[42, 47].
Naı̈ve libraries would usually utilize the IgM repertoire for
construction of the library repertoire as it targets the repertoire
from naı̈ve B cells. The repertoire of naı̈ve antibody libraries must
be large, generally in the vicinity of between 109 and 1011 indepen-
dent clones. The diversification of the six CDRs would mathemati-
cally yield an infinite number of combinations that is sufficient to
generate a diverse repertoire. However, the ability to replicate the
possible repertoire in vitro is not possible in actual practice with the
repertoire of a phage display library usually being limited to 1010–
1011 due to the limits of transformation efficiency of E. coli
[24, 50]. Even so, the large repertoire of such libraries is sufficient
to allow isolation of antibodies against more or less infinite number
of targets. Naı̈ve antibody libraries can be used for selection of
antibodies against a wide host of targets ranging from infectious
diseases, autoimmune disease, cancer, self-antigens, and toxins
[3, 42]. The acceptance is that antibodies derived from naı̈ve anti-
body libraries could have a lower affinity, but this is not always the
case. The lower affinity clones derived from naive libraries is not a
major hindrance as these clones could be improved through down-
stream refinement such as in vitro affinity maturation [51].
 Antibody Phage Display 9

3.3 Synthetic and The third and fourth classes of antibody libraries are semisynthetic
Semisynthetic and synthetic antibody libraries. Semisynthetic libraries are com-
Antibody Library posed of one antibody framework and randomization of at least
the CDR-H3 [52]. This allows a for a hybrid of natural framework
sequences with the synthetic randomization of the CDRs to gener-
ate a library of unique clones.
Synthetic libraries utilize predesigned repertoires where the
genetic makeup of the library is chemically synthesized and assem-
bled in vitro with a level of control [53]. The approach allows the
CDR and framework designs to be optimized and predefined using
bioinformatic analysis. This allows the scaffolds used for synthetic
antibody libraries to be pre-defined to promote various traits such
as good expression levels in E. coli and proper folding for good
solubility and antigen binding. The repertoire of synthetic libraries
is thus defined by predetermined CDRs that are synthetically ran-
domized to mimic either germline or rearranged V genes [54–57].
There are several different approaches that are applied for
synthetic CDR randomization. One of the most common methods
to generate randomization is through mutagenesis using degener-
ate codons such as NNN, NNS, and NNK, where N represents all
four nucleotide bases, S represents guanine (G) and cytosine (C),
and K represents G or thymine (T) [58]. Although the application
of degenerate codons is capable of providing a high diversity, the
process introduces a risk factor to the library quality. As the diversi-
fication is uncontrolled, it could yield codons that encode unnatu-
ral amino acids or stop codons that will disrupt the folding or
translation of the antibody fragments as well as solubility. An
improvement to the randomization process was introduced in the
form of trinucleotide mutagenesis (TRIM) technology. TRIM is
able to generate similar diversities devoid of the risk involved using
standard degenerate primers. TRIM applies a series of trimers
encoding for 20 amino acids instead of random combination of
nucleotides to generate the diversity in the CDRs, thus providing a
more precise and controlled manipulation process. This approach
alleviates stop codons or unfavorable amino acid distribution or
combination during diversity generation that could impede the
library quality [11, 24]. The nature of the repertoire of synthetic
antibody libraries makes it synonymous to naı̈ve libraries where a
highly diverse repertoire and library size are required. This in turn
permits the application of synthetic libraries for use in unbiased
selection against a wide range of targets [54].
A close derivative of synthetic antibody libraries can be found in
the form of semisynthetic libraries. Semisynthetic libraries are
designed to exhibit characteristics that are a combination from
both naı̈ve and synthetic library designs. In semisynthetic libraries,
the framework sequence of the library is naturally obtained from
naı̈ve B cells or a known antibody sequence [52]. The diversity of
semisynthetic libraries is dependent on the prospect of at least one
10 Alia Nur et al.

of the CDRs being randomized at positions responsible for antigen

binding. In many cases, the HCDR3 is the most frequently used
CDR for randomization given its major role in antigen binding
[52, 56].

4 Conclusion

Phage display is a powerful technology for the development of

monoclonal antibodies used in therapy or as diagnostic tools.
Monoclonal human antibodies against more or less any target
protein, peptide, or other target structure can be generated in a
short amount of time. Immediate sequence information of the
individual antibodies allows direct transfer into the desired format
starting from the natural IgG format to multimeric and/or multi-
specific scFv formats. The different kinds of phage libraries (naı̈ve,
immune, synthetic, and semisynthetic) offer different advantages
for specific target proteins and applications. Up to 2022, antibody
phage display yielded 14 approved antibodies against different dis-
eases and several more in clinical trials highlighting the capabilities
and importance of the method in the field of immunotherapy [9].

Acknowledgments

This work was supported by a Universiti Sains Malaysia, Special

(Matching) Short-Term Grant with Project No: 304/CIPPM/
6315708.

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 Part II

Construction of Antibody Phage Display Libraries

 Chapter 2

Construction of Human Immune and Naive scFv Phage

Display Libraries
Maximilian Ruschig, Philip Alexander Heine, Viola Fühner,
Kilian Johannes Karl Zilkens, Stephan Steinke, Maren Schubert,
Federico Bertoglio, and Michael Hust

Abstract
Antibody phage display is a widely used in vitro selection technology for the generation of human
recombinant antibodies and has yielded thousands of useful antibodies for research, diagnostics, and
therapy. In order to successfully generate antibodies using phage display, the basis is the construction of
high-quality antibody gene libraries. Here, we describe detailed methods for the construction of such high-
quality immune and naive scFv gene libraries of human origin. These protocols were used to develop human
naive (e.g., HAL9/10) and immune libraries, which resulted in thousands of specific antibodies for all kinds
of applications.

Key words Antibody phage display, Single-chain fragment variable (scFv), Antibody gene library,
Naive antibody library, Immune antibody library, Library generation

1 Introduction

Antibody phage display is a widely used technology for the gener-

ation of fully human recombinant antibodies for applications in the
research field, for diagnostic purposes, and most importantly for
therapeutic applications. As of January 2023, more than 110 anti-
bodies and antibody-based therapeutics, including antibody-drug
conjugates, are approved by the US Food and Drug Administration
(FDA) or European Medicines Agency (EMEA, since 2009 EMA)
with 19 additional candidates pending approval [1]. The market is
rapidly growing with 115.2 billion US$ business volume in 2018
and is estimated to reach 300 billion US$ by 2025 [2], with an
estimated annual growth rate of 13.2% from 2022 to 2028 [3].
Most prominent applications of therapeutic antibodies are can-
cer and autoimmune diseases [4] with 45% and 27% of all approved
antibodies, respectively [5]. The first therapeutic antibody,

Michael Hust and Theam Soon Lim (eds.), Phage Display: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2702,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3381-6_2,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2023

15
16 Maximilian Ruschig et al.

muronomab-CD3 (Orthoclone OKT3®), was approved in 1986

and is of murine origin applied for immunosuppression after organ
transplantation [6] . Chimeric antibodies formed the next genera-
tion of therapeutic antibodies like the anti-tumor necrosis factor
(TNF) antibody infliximab (Remicade®) for the treatment of rheu-
matic arthritis but also Crohn’s disease [7] or the anti-epidermal
growth factor receptor (EGFR) antibody cetuximab (Erbitux®) for
cancer therapy [8] . Subsequently, humanized antibodies were used
for therapy, e.g., trastuzumab (Herceptin®) [9] . Finally adalimu-
mab (Humira®), the first fully human antibody generated by phage
display, was commercially available in 2002 [10]. Despite their
lower risk of immunogenicity, human antibodies can have adverse
effects in some cases [11, 12]. Currently, 14 FDA/EMA-approved
antibodies were generated by phage display and more are still in
clinical development [13].
The basis for the phage display technology are the studies of
George P. Smith on the filamentous bacteriophage M13, which was
awarded with a Noble Prize in 2018 [14]. Key to the technology is
linking genotype and phenotype of displayed oligopeptides, by
fusing the corresponding gene fragments encoded on the phage-
mid to the minor coat protein III gene of the phage. Thereby, the
peptide::pIII fusion protein is expressed and displayed on the sur-
face of the phage allowing the affinity selection of the peptide and
its encoding gene. Likewise, antibody fragments fused to pIII can
be presented on the surface of M13 phage particles. This technol-
ogy was invented independently in parallel in Cambridge, Heidel-
berg, and La Jolla in 1990/1991 [15–20]. Because of limitations of
the E. coli protein machinery, phage display is routinely only done
with antibody fragments like scFv (single-chain fragment variable),
Fab (fragment antigen binding), VHH (camel heavy chain variable
domain), or dAbs (human heavy chain variable domain) [21–
23]. Due to the parallel invention, two different genetic systems
have been established for the expression of the antibody::pIII
fusion proteins. On one hand, the antibody genes can be directly
integrated into the phage genome fused to the wild-type pIII gene
[15]. Alternatively, antibody expression is uncoupled from phage
amplification by providing the genes encoding the antibody::pIII
fusion proteins on a phagemid. This system leads to more efficient
antibody expression. The genes encoding the remaining structural
proteins and the proteins needed for phage assembly are located on
the phage genome. In addition to the antibody::gIII fusion, the
phagemid carries a morphogenetic signal for encapsulation of the
vector into the assembled phage particles [19]. Even though there
are alternative in vitro display techniques like ribosomal display
[24, 25], puromycin display [26], yeast surface display [27–29],
or mammalian cell display [30–32], antibody phage display is the
most commonly used selection technique for human antibodies.
Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 17

The choice between different types of antibody gene libraries

depends on the scientific or medical applications. Immune libraries
are constructed from antibody V genes isolated from IgG-secreting
plasma cells of immunized donors [18, 33–36]. As immune
libraries are usually enriched in in vivo affinity maturated antibody
genes against certain antigens, they are usually used in medical
applications, e.g., to obtain antibodies against a particular cell
surface antigen of a pathogen or a tumor marker. In contrast to
that, naı̈ve, semisynthetic, and synthetic libraries are designed to
have a high diversity to select antibody fragments directed against
nearly every possible antigen. Naive libraries are constructed from
rearranged V genes from B cells (IgM) of non-immunized donors.
Detailed description of antibody gene libraries and vectors needed
for construction are shown in several reviews [21, 37, 38].
Various methods have been established to clone the genetic
diversity of human antibody repertoires in vitro. After isolation of
mRNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMC), isolated
B lymphocytes, or isolated plasma cells, the corresponding cDNA is
synthesized. Immune libraries are usually constructed by a consec-
utive two-step cloning or by assembly PCR (see below). The heavy
chain contributes more to antibody diversity, as a consequence of its
highly variable CDRH3 [39]. Therefore, the amplified repertoire
of light chain genes is cloned into the phage display vector first in
the “two-step cloning strategy.” Subsequently, the repertoire of
amplified heavy chain genes is cloned into the vectors containing
the light chain gene repertoire [40–43]. Another commonly used
method for the cloning of naive [44, 45] or immune [18] scFv
phage display libraries is assembly PCR. Here the amplified VH and
VL genes are fused directly by assembly PCR instead of consecu-
tively cloning VH and VL genes into the vector. This approach can
be combined with a randomization of the CDR3 regions and
thereby introducing sequence variety, leading to semisynthetic
libraries [39]. Oligonucleotide primers encoding various CDR3
and J gene segments can be used for the amplification of the V
gene segments of human germlines [46]. Hoogenboom and Win-
ter [47] as well as Nissim et al. [48] demonstrated a different
approach by using degenerated CDRH3 oligonucleotide primers
to create a semisynthetic heavy chain repertoire with human V gene
germline origin. Subsequently, the semisynthetic heavy chain rep-
ertoire was combined with a known anti-BSA light chain. Similarly,
the framework of a single well-known/robust antibody can be used
as a backbone for the introduction of randomly created CDRH3
and CDRL3 [49, 50]. Amplification of all CDR regions derived
from B cells and shuffling them into a robust antibody framework
by assembly PCR was demonstrated by Jirholt et al. [46] and
Söderlind et al. [51]. A more recent approach for library construc-
tions is Golden Gate cloning allowing a one-step construction of
the library plasmid [52]. Full synthetic libraries were first described
18 Maximilian Ruschig et al.

by Knappik et al. [53] by using 49 framework regions, while the

randomized CDR3s of the heavy and light chains were generated
by trinucleotide synthesis. Rothe et al. used seven different VH and
VL germline master frameworks to construct an entirely synthetic
library and combined those with all six synthetically created CDR
cassettes [54]. To ensure favorable antibody developability of
selected antibodies, Tiller et al. [55] used 36 fixed VH and VL
pairs that were selected for suitable biophysical properties as a basis
to generate a fully synthetic human library. Bottleneck in construc-
tion of large naive and synthetic libraries is achieving genetic diver-
sity due to the limited transformation efficiency of E. coli, e.g.,
287 transformations were performed for the generation of the
Hust/human antibody libraries (HAL) 9/10 to reach a combined
size of 1.5 × 1010 independent clones [56].
The protocols described here demonstrate the generation of
human naive or immune scFv antibody gene libraries by a two-step
cloning strategy, which was already successfully applied previously
for naive [43, 56] and immune libraries [33, 34, 36].

2 Materials

2.1 Isolation of 1. Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4: 8.0 g NaCl, 0.2 g

Lymphocytes KCl, 1.44 g Na2HPO4*2H2O, 0.24 g KH2PO4 in 1 L.
2. Lymphoprep™ (Serumwerk Bernburg AG).
3. mRNA Isolation Kit or TRIzol for total RNA.

2.2 Sorting of B 1. FACS buffer: PBS + 2% FCS/5% BSA + 1 mM EDTA.

Lymphocytes/Plasma 2. Fluorescence-automated cell sorter.
Cells (Optional)
3. Anti-human CD19 antibody, APC conjugated (MHCD1905),
Thermo Fisher Scientific.
4. Anti-human CD138 antibody, FITC conjugated (352304),
BioLegend.
5. mRNA Isolation Kit or TRIzol for total RNA.

2.3 cDNA Synthesis 1. Superscript IV Reverse Transcriptase + 5× RT

buffer + 0.1 m DTT.
2. RNAseOut Recombinant Ribonuclease Inhibitor.
3. Random hexamer oligonucleotide primer (dN6) or Oligo d
(T)20 primer.
4. dNTP mix: 10 mM each.

2.4 First and Second 1. GoTaq2 Polymerase + 5× buffer.

Antibody Gene PCR 2. dNTP mix: 10 mM each,
3. Oligonucleotide primer: see Table 1.
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 19

Table 1
Primers used for first and second PCR of antibody genes for antibody gene library construction using
phagemids like pHAL14, pHAL30, pHAL35, pHAL51, or pHAL52. Restriction sites are underlined

Primer 5′ to 3′ sequence
First antibody gene PCR VH
MHVH1_f cag gtb cag ctg gtg cag tct gg
MHVH1/7_f car rts cag ctg gtr car tct gg
MHVH2_f cag rtc acc ttg aag gag tct gg
JokVH3_f1 sag gtg cag ctg gtg gag tct gg
JokVH3_f2 gar gtg cag ctg ktg gag tct gg
MHVH4_f1 cag gtg car ctg cag gag tcg gg
JokVH4_f2 cag gtg cag cta car cag tgg gg
JokVH4_f3 cag ctg cag ctg cag gag tcs gg
MHVH5_f gar gtg cag ctg gtg cag tct gg
MHVH6_f cag gta cag ctg cag cag tca gg
MHIgMCH1_r aag ggt tgg ggc gga tgc act
MHIgGCH1_r2 cgt tga cca ggc agc cca ggg
MHIgECH1_r tgg gct ctg tgt gga gg
First antibody gene PCR kappa
MHVK1_f1 gac atc cag atg acc cag tct cc
MHVK1_f2 gmc atc crg wtg acc cag tct cc
MHVK2_f gat rtt gtg atg acy cag wct cc
MHVK3_f gaa atw gtg wtg acr cag tct cc
MHVK4_f gac atc gtg atg acc cag tct cc
MHVK5_f gaa acg aca ctc acg cag tct cc
MHVK6_f gaw rtt gtg mtg acw cag tct cc
MHkappaCL_r aca ctc tcc cct gtt gaa gct ctt
First antibody gene PCR lambda
MHVL1_f1 cag tct gtg ctg act cag cca cc
MHVL1_f2 cag tct gtg ytg acg cag ccg cc
MHVL2_f cag tct gcc ctg act cag cct
MHVL3_f1 tcc tat gwg ctg acw cag cca cc
MHVL3_f2 tct tct gag ctg act cag gac cc
MHVL4_f1 ctg cct gtg ctg act cag ccc
MHVL4_f2 cag cyt gtg ctg act caa tcr yc

(continued)
20 Maximilian Ruschig et al.

Table 1
(continued)

Primer 5′ to 3′ sequence
MHVL5_f cag sct gtg ctg act cag cc
MHVL6_f aat ttt atg ctg act cag ccc ca
MHVL7/8_f cag rct gtg gtg acy cag gag cc
MHVL9/10_f cag scw gkg ctg act cag cca cc
MHlambdaCL_r tga aca ttc tgt agg ggc cac tg
MHlambdaCL_r2 tga aca ttc cgt agg ggc aac tg
Second antibody gene PCR VH
MHVH1-NcoI_f gtcctcgca cc atg gcc cag gtb cag ctg gtg cag tct gg
MHVH1/7-NcoI_f gtcctcgca cc atg gcc car rts cag ctg gtr car tct gg
MHVH2-NcoI_f gtcctcgca cc atg gcc cag rtc acc ttg aag gag tct gg
JokVH3-NcoI_f1 gtcctcgca cc atg gcc sag gtg cag ctg gtg gag tct gg
JokVH3-NcoI_f2 gtcctcgca cc atg gcc gar gtg cag ctg ktg gag tct gg
MHVH4-NcoI_f1 gtcctcgca cc atg gcc cag gtg car ctg cag gag tcg gg
JokVH4-NcoI_f2 gtcctcgca cc atg gcc cag gtg cag cta car cag tgg gg
JokVH4-NcoI_f3 gtcctcgca cc atg gcc cag ctg cag ctg cag gag tcs gg
MHVH5-NcoI_f gtcctcgca cc atg gcc gar gtg cag ctg gtg cag tct gg
MHVH6-NcoI_f gtcctcgca cc atg gcc cag gta cag ctg cag cag tca gg
MHIgMCH1scFv-HindIII_r gtcctcgca aag ctt tgg ggc gga tgc act
MHIgGCH1scFv-HindIII_r gtcctcgca aag ctt gac cga tgg gcc ctt ggt gga
MHIgECH1scFv-HindIII_r gtcctcgca aag ctt tgg gct ctg tgt gga gg
Second antibody gene PCR kappa
MHVK1-MluI_f1 accgcctcc a cgc gta gac atc cag atg acc cag tct cc
MHVK1-MluI_f2 accgcctcc a cgc gta gmc atc crg wtg acc cag tct cc
MHVK2-MluI_f accgcctcc a cgc gta gat rtt gtg atg acy cag wct cc
MHVK3-MluI_f accgcctcc a cgc gta gaa atw gtg wtg acr cag tct cc
MHVK4-MluI_f accgcctcc a cgc gta gac atc gtg atg acc cag tct cc
MHVK5-MluI_f accgcctcc a cgc gta gaa acg aca ctc acg cag tct cc
MHVK6-MluI_f accgcctcc a cgc gta gaw rtt gtg mtg acw cag tct cc
MHkappaCLscFv-NotI_r accgcctcc gc ggc cgc gaa gac aga tgg tgc agc cac agt
Second antibody gene PCR lambda
MHVL1-MluI_f1 accgcctcc a cgc gta cag tct gtg ctg act cag cca cc

(continued)
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 21

Table 1
(continued)

Primer 5′ to 3′ sequence
MHVL1-MluI_f2 accgcctcc a cgc gta cag tct gtg ytg acg cag ccg cc
MHVL2-MluI_f accgcctcc a cgc gta cag tct gcc ctg act cag cct
MHVL3-MluI_f1 accgcctcc a cgc gta tcc tat gwg ctg acw cag cca cc
MHVL3-MluI_f2 accgcctcc a cgc gta tct tct gag ctg act cag gac cc
MHVL4-MluI_f1 accgcctcc a cgc gta ctg cct gtg ctg act cag ccc
MHVL4-MluI_f2 accgcctcc a cgc gta cag cyt gtg ctg act caa tcr yc
MHVL5-MluI_f accgcctcc a cgc gta cag sct gtg ctg act cag cc
MHVL6-MluI_f accgcctcc a cgc gta aat ttt atg ctg act cag ccc ca
MHVL7/8-MluI_f accgcctcc a cgc gta cag rct gtg gtg acy cag gag cc
MHVL9/10-MluI_f accgcctcc a cgc gta cag scw gkg ctg act cag cca cc
MHLambdaCLscFv-NotI_r accgcctcc gc ggc cgc aga gga sgg ygg gaa cag agt gac
Primer for colony PCR and sequencing
MHLacZ-Pro_f ggctcgtatgttgtgtgg
MHgIII_r c taa agt ttt gtc gtc ttt cc

4. Agarose.
5. TAE-buffer 50×: 2 M TrisHCl, 1 M acetic acid, 0.05 M EDTA
pH 8.
6. NucleoSpin Gel and PCR Clean-up.

2.5 First Cloning 1. MluI-HF restriction enzyme (NEB).

Step – VL 2. NotI-HF restriction enzyme (NEB).
3. Cut Smart Buffer.
4. Calf intestine phosphatase (CIP).
5. T4 ligase (Promega).
6. Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 K) (Millipore, Schwal-
bach, Germany).
7. E. coli XL1-Blue MRF‘(Agilent), genotype: Δ(mcrA)183
Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1
gyrA96 relA1 lac [F′ proAB lac IqZΔM15 Tn10 (Tetr)].
8. Electroporator MicroPulser, 0.1 cm cuvettes.
9. 2 M glucose, sterile filtered
10. 2 M magnesium solution (autoclaved): 1 M MgCl2, 1 M
MgSO4.
22 Maximilian Ruschig et al.

11. SOC medium pH 7.0: 2% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) yeast

extract, 0.05% (w/v) NaCl, 20 mM Mg solution, 20 mM
glucose, sterilize magnesium and glucose separately, add solu-
tions after autoclavation.
12. 2xYT-medium pH 7,0: 1,6% (w/v) tryptone, 1% (w/v) yeast
extract, 0,5% (w/v) NaCl)
13. Ampicillin: 100 mg/mL stock.
14. 2xYT-GA: 2xYT + 100 mM glucose + 100 μg/mL ampicil-
lin + 20 μg/mL tetracycline
15. Tetracycline: 10 mg/mL stock.
16. 9 cm Petri dishes
17. 25 cm square Petri dishes (“pizza plates”)
18. 2xYT-GA agar plates: 2xYT-GA, 1.5% (w/v) agar-agar
19. Nucleobond Extra Midi Kit.

2.6 Second Cloning 1. NcoI-HF restriction enzyme (NEB).

Step – VH 2. HindIII-HF restriction enzyme (NEB).
3. AscI restriction enzyme (NEB).
4. Cut Smart Buffer.
5. E. coli ER2738 (Lucigen), genotype: [F′ proA + B+ lacIq
Δ(lacZ)M15 zzf::Tn10 (tetr)] fhuA2 glnVΔ(lac-proAB)
thi-1Δ(hsdS-mcrB)5.
6. Glycerol of 99.5%.

2.7 Colony PCR 1. Oligonucleotide primer: see Table 1.

2.8 Library 1. 2xYT media pH 7.0: 1.6% (w/v) tryptone, 1% (w/v) yeast
Packaging and scFv extract, 0.5% (w/v) NaCl
Phage Production 2. 2xYT-GA: 2xYT, 100 mM glucose, 100 μg/mL ampicillin
3. M13K07 helper phage for monovalent display (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, USA).
4. Hyperphage for oligovalent display (Progen, Heidelberg,
Germany).
5. 2xYT-AK: 2xYT + 100 μg/mL ampicillin +50 μg/mL
kanamycin
6. Sorval Centrifuge RC5B Plus, rotor GS3 and SS34.
7. Polyethylenglycol (PEG) solution: 20% (w/v) PEG 6000,
2.5 M NaCl.
8. Phage dilution buffer: 10 mM TrisHCl pH 7.5, 20 mM NaCl,
2 mM EDTA.
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 23

9. Mouse α-pIII monoclonal antibody PSKAN3 (Mobitec, Göt-

tingen, Germany).
10. Goat α-mouse IgG alkaline phosphatase (AP) conjugate.

2.9 Phage Titration 1. 2xYT-GA agar plates: 2xYT-GA + 1.5% (w/v) agar-agar.

3 Methods

3.1 Isolation of 1. Mix 20 mL fresh blood or EDTA/citric acid treated blood

Lymphocytes (~2 × 107 cells) of each donor with 20 mL PBS (see Note 1).
(Peripheral Blood 2. Fill 10 mL Lymphoprep™ in a 50 mL polypropylene tube.
Mononuclear Cells Carefully cover Lymphoprep™ with 40 mL of the diluted
(PBMC)) blood using a plastic pipette.
3. Centrifuge the blood with 500× g for 30 min at RT (without
brake and with low acceleration!).
4. The lymphocytes form a distinct layer between the Lympho-
prep™ and the medium, whereas the erythrocytes and granu-
locytes will be pelleted. Carefully aspirate the lymphocytes
using a plastic pipette and transfer to a new 50 mL
polypropylene tube.
5. Fill up with 50 mL PBS and pellet the lymphocytes with 280× g
for 7 min at RT. Discard the supernatant (be careful, the
lymphocyte pellet is not solid).
6. Repeat this washing step to remove most of the thrombocytes.
7. Resuspend the lymphocyte pellet in the supplied extraction
buffer of the mRNA Isolation Kit according to the manufac-
turer’s instructions or use 0.5–1 mL TRIzol for total RNA
isolation (see Note 2). After resuspension using the mRNA
extraction buffer or TRIzol, the RNA can be stored at -80 °C.

3.2 Fluorescence- 1. Isolate PBMC as described above.

Automated Sorting of 2. Prepare 10 mL FACS buffer in 15 mL centrifugation tube and
B Lymphocytes/ add PBMC fraction.
Plasma Cells
3. Centrifuge at 280× g for 7 min at RT. Discard the supernatant
(be careful, the lymphocyte pellet is not solid).
4. Add 9 mL ddH2O and incubate 30 s at RT (lysis of remaining
erythrocytes).
5. Add 1 mL 10× PBS and pellet cells with 280× g for 5 min at RT.
6. Repeat lysis of erythrocytes.
7. Resuspend cells in 1 mL FACS buffer.
8. Stain cells for CD19 and CD138 (1 h at 4 °C, in the dark!).
9. Wash cells with 10 mL FACS buffer twice, resuspend in
0.5–1 mL FACS buffer, and proceed with sorting.
24 Maximilian Ruschig et al.

3.3 cDNA Synthesis 1. Set up mixture for the first-strand cDNA synthesis:

Solution or component Volume Final concentration

mRNA or total RNA Up to 50–250 ng (mRNA) or
11 μL 2–20 μg (total RNA)
Random hexamer oligonucleotide 1 μL 2.5 μM
primer (dN6) or oligo d(T)20
primer (50 μM)
dNTP-mix (10 mM each) 1 μL 500 μM
DEPC-treated or nuclease-free water To 13 μL

2. Denature the RNA for 5 min at 65 °C. Afterward chill on ice

for at least 1 min.
3. Add the following components:

Solution or component Volume Final concentration

SSIV buffer (5×) 4 μL 1×
0.1 M DTT 1 μL 10 mM
Superscript IV reverse transcriptase 1 μL 200 U
(200 U/μL)
RNAseOut (200 U/μL) 1 μL –

4. If using random hexamer, incubate the 20 μL mixture for

10 min at 23 °C for primer annealing. Afterward incubate
10 min at 50–55 °C for first strand synthesis
If using Oligo d(T)20 primer directly, incubate 10 min at
50–55 °C for first-strand synthesis.
5. Inactivate the reaction by incubating for 10 min at 80 °C. Store
at -20 °C or use directly for first antibody gene PCR.

3.4 First Antibody 1. The cDNA derived from 50–250 ng mRNA or 2–20 μg total
Gene PCR RNA will be used as template to amplify VH and the light
chain. Set up the PCR reactions as follows (30× master mix
for 28 PCR reactions):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 1130 μL –
Buffer with MgCL2 300 μL 1×
(5×)
dNTPs (10 mM each) 30 μL 200 μM each

(continued)
Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 25

Solution or component Volume Final concentration

cDNA 20 μL Complete first-strand synthesis
reaction
GoTaq2 5 U/μL 7.5 μL 1.25 U

2. Divide the master mix in 500 μL for VH, 350 μL for kappa, and
550 μL for lambda.
3. Add to each of the three reactions the corresponding reverse
primers (see also Table 1) as follows (use the IgM primer for
naive antibody gene libraries or the IgG primer for immune
antibody gene libraries. Also, IgE libraries are possible with the
IgE primer set):

Antibody Final
gene Primer Volume concentration
VH MHIgMCH1_r or 20 μL 0.4 μM
MHIgGCH1_r2 or
MHIgECH1_r (10 μM)
Kappa MHkappaCL_r (10 μM) 14 μL 0.4 μM
Lambda MHlambdaCL_r1/ _r2 mix ( 9:1 ) 22 μL 0.4 μM
(10 μM)

4. Divide the mixture to 10 (VH), 7 (kappa) and 11 (lambda)

PCR reactions each with 48 μL and add 2 μL (10 μM, 0.4 μM
final concentration) of the subfamily specific forward primer
(see also Table 1)
VH: (1) MHVH1_f, (2) MHVH1/7_f, (3) MHVH2_f, (4)
JokVH3_f1 (5) JokVH3_f2, (6) MHVH4_f1, (7)
JokVH4_f2, (8) JokVH4_f3,
(9) MHVH5_f, (10) MHVH6_f
Vkappa: (11) MHVK1_f1, (12) MHVK1_f2, (13) MHVK2_f,
(14) MHVK3_f, (15) MHVK4_f, (16) MHVK5_f,
(17) MHVK6_f
Vlambda: (18) MHVL1_f1, (19) MHVL1_f2, (20) MHVL2_f,
(21) MHVL3_f1, (22) MHVL3_f2, (23) MHVL4_f1,
(24) MHVL4_f2, (25) MHVL5_f, (26) MHVL6_f, (27)
MHVL7/8_f, (28) MHVL9/10_f

5. Carry out the PCR using the following program:

95 °C 120 s
95 °C 45 s 30×
55 °C 45 s
72 °C 90 s
72 °C 10 min
26 Maximilian Ruschig et al.

6. Separate PCR products by 1.5% TAE agarose gel electrophore-

sis, cut out the amplified antibody genes (VH: ~380 bp, kappa/
lambda: ~650 bp) (see Notes 3 and 4), and purify the PCR
products using a gel extraction kit according to the manufac-
turer’s instructions. Pool all VH, kappa, and lambda subfami-
lies separately. Determine the DNA concentration. Store the
three purified first PCR pools at -20 °C.

3.5 Second Antibody 1. In the second PCR, the restriction sites for library cloning will
Gene PCR be added. Set up the PCR reactions as follows (30× master mix
for 28 PCR reactions) (see Note 5):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 2200 μL –
Buffer with MgCL2 (5×) 600 μL 1×
dNTPs (10 mM each) 60 μL 200 μM each
GoTaq 5 U/μL 15 μL 2.5 U

2. Divide the master mix in 1000 μL for VH, 700 μL for kappa,
and 1100 μL for lambda.
3. Add to each of the three reactions the corresponding reverse
primers (see also Table 1) as follows:

Antibody Final
gene Primer Volume concentration
VH MHIgMCH1scFv-HindIII_r or 20 μL 0.2 μM
MHIgGCH1scFv-HindIII_r
(10 μM)
Kappa MHKappaCLscFv-NotI_r2 (10 μM) 14 μL 0.2 μM
Lambda MHLambdaCLscFv-NotI_r (10 μM) 22 μL 0.2 μM

4. Add the corresponding PCR products of the first PCR as

follows:

VH 1000 ng
Kappa 700 ng
Lambda 1100 ng

5. Divide the solutions to 10 (VH), 7 (Kappa) and 11 (Lambda)

PCR reactions, each with 98 μL and add 2 μL (10 μM, 0.2 μM
final concentration) the subfamily specific forward primer (see
also Table 1)
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 27

VH: (1) MHVH1-NcoI_f, (2) MHVH2-NcoI_f, (3)

MHVH1/7-NcoI_f, (4) JokVH3-NcoI_f1, (5)
JokVH3-NcoI_f2, (6) MHVH4-NcoI_f1, (7) JokVH4-
NcoI_f2, (8) JokVH4-NcoI_f3, (9) MHVH5-NcoI_f,
(10) MHVH6-NcoI_f
Vkappa: (11) MHVK1-MluI_f1, (12) MHVK1-MluI_f2, (13)
MHVK2-MluI_f, (14) MHVK3-MluI_f, (15) MHVK4-
MluI_f, (16) MHVK5-MluI_f, (17) MHVK6-MluI_f
Vlambda: (18) MHVL1-MluI_f1, (19) MHVL1-MluI_f2, (20)
MHVL2-MluI_f, (21) MHVL3-MluI_f1, (22)
MHVL3-MluI_f2, (23) MHVL4-MluI_f1, (24)
MHVL4-MluI_f2, (25) MHVL5-MluI_f, (26)
MHVL6-MluI_f, (27) MHVL7/8-MluI_f, (28)
MHVL9/10-MluI_f

6. Carry out the PCR using the following program:

95 °C 60 s
95 °C 45 s 20×
57 °C 45 s
72 °C 60 s
72 °C 10 min

7. Separate the PCR products by 1.5% TAE agarose gel electro-

phoresis, cut out the amplified antibody genes (VH: ~450 bp,
kappa/lambda: ~450 bp), and purify the PCR products using a
gel extraction kit according to the manufacturer’s instructions.
Pool all VH, kappa, and lambda subfamilies separately. Deter-
mine the DNA concentration. Store the three purified second
PCR pools at -20 °C.

3.6 First Cloning 1. Prepare a plasmid preparation of pHAL52 vector for library
Step – VL cloning (see Note 6).
2. Digest the vector and the VL PCR products. Always perform
additional single-enzyme digestions of the vector in parallel to
check whether the digestion is complete (see also Note 7):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 87-x μL –
pHAL52 or VL x μL 5 μg or 2 μg
NEB cut smart buffer (10×) 10 μL 1×
NEB MluI-HF (20 U/μL) 1.5 μL 30 U
NEB NotI-HF (20 U/μL) 1.5 μL 30 U
28 Maximilian Ruschig et al.

3. Incubate at 37 °C for 2 h. Control the digestion of the vector

by using a 5 μL aliquot on 1.5% TAE agarose gel electrophore-
sis. If the vector is not fully digested, extend the
incubation time.
4. Inactivate the enzymes at 65 °C for 10 min.
5. Add 0.5 μL CIP (1 U/μL) to the vector digest and incubate at
37 °C for 30 min. Repeat this step once.
6. Purify the vector and the PCR product using a PCR Purifica-
tion Kit according to the manufacturer’s instructions and elute
with 50 μL elution buffer or water. The short stuffer fragment
containing multiple stop codons between MluI and NotI in
pHAL52 will be removed. Determine the DNA concentration.
7. Ligate the vector pHAL52 (4258 bp) and VL (~380 bp) as
follows (see Note 4):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 89-x-y μL –
pHAL52 x μL 1000 ng
VL (kappa or lambda) y μL 270 ng
T4 ligase buffer (10×) 10 μL 1×
T4 ligase (3 U/μL) 1 μL 3U

8. Incubate at 16 °C overnight.
9. Inactivate the ligation at 70 °C for 10 min.
10. Purify the ligation using an Amicon Ultra column. Add the
ligation to the column and add water to 500 μL. Centrifuge at
10 min at 14,000× g. Discard the flow through and repeat the
washing with 470 μL (about 30 μL will remain in the column)
step three times.
11. For elution invert the column and elute the remaining DNA
solution in a new cap for 3 min at 1000× g.
12. Add water to 35 μL.
13. Thaw 25 μL electrocompetent E. coli XL1-Blue MRF’ on ice
and mix with the ligation reaction.
14. Transfer the 60 μL mix to a prechilled 0.1 cm cuvette. Dry the
electrode of the cuvette with a tissue paper.
15. Perform a 1.7 kV pulse using an electroporator (see Note 8).
Immediately, add 1 mL 37 °C prewarmed SOC medium care-
fully, transfer the suspension to a 2 mL cap, and shake for 1 h at
600 rpm and 37 °C.
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 29

16. To determine the amount of transformants, use 10 μL (=10-

2
dilution) of the transformation and perform a dilution series
down to 10-6 dilution. Plate out a 10-6 dilution on 2xYT-GA
agar plates and incubate overnight at 37 °C.
17. Plate out the remaining 990 μL on 2xYT-GA agar “pizza plate”
and incubate overnight at 37 °C.
18. Calculate the amount of transformants which should be
around 1 × 106–2 × 108 cfu/mL. Control colonies for full
size insert by colony PCR (see Subheading 3.8).
19. Scrape off the colonies on the “pizza plate” with 40 mL 2xYT
medium using a Drigalski spatula. Pellet bacterial suspension,
discard the medium, and use the whole pellet for midi plasmid
preparation according to the manufacturer’s instructions.
Determine the DNA concentration.

3.7 Second Cloning 1. Digest the pHAL52-VL repertoire and the VH PCR products.
Step – VH Always perform additional single-enzyme digestions of the
vector in parallel (see also Note 7):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 82-x μL –
pHAL52-VL or VH x μL 5 μg or 2 μg
NEB cut smart buffer (10×) 10 μL 1×
NEB NcoI-HF (20 U/μL) 1.5 μL 30 U
NEB HindIII-HF (20 U/μL) 1.5 μL 30 U

2. Incubate at 37 °C for 2 h (see Note 9). Control the digest of the

vector by using a 5 μL aliquot on 1.5% agarose gel
electrophoresis.
3. Inactivate the digestion at 80 °C for 20 min.
4. Add 0.5 μL CIP (1 U/μL) to the vector digest and incubate at
37 °C for 30 min. Repeat this step once.
5. Purify the vector and the PCR product using a PCR Purifica-
tion Kit according to the manufacturer’s instructions and elute
with 50 μL elution buffer or water. The short stuffer fragment
between NcoI and HindIII in pHAL52 will be removed.
Determine the DNA concentration. (See also Note 10).
6. Ligate the vector pHAL52-VL (~4640 bp) and VH (~380 bp)
as follows (see Note 4):
30 Maximilian Ruschig et al.

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 89-x-y μL –
pHAL30 x μL 1000 ng
VH y μL 250 ng
T4 ligase buffer (10×) 10 μL 1×
T4 ligase (3 U/μL) 1 μL 3U

7. Incubate at 16 °C overnight.
8. Inactivate the ligation at 65 °C for 10 min.
9. Purify the ligation using an Amicon Ultra column. Add the
ligation to the column and add water to 500 μL. Centrifuge at
10 min at 14,000× g. Discard the flow through and repeat the
washing with 470 μL (about 30 μL will remain in the column)
step three times.
10. For elution invert the column and elute the remaining DNA
solution in a new cap for 3 min at 1000× g.
11. Add water to 35 μL.
12. Thaw 25 μL electrocompetent E. coli ER2738 on ice and mix
with the ligation reaction (see Note 11).
13. Transfer the 60 μL mix to a prechilled 0.1 cm cuvette. Dry
the electrode of the cuvette with a tissue paper.
14. Perform a 1.8 kV pulse using an electroporator (see Note 8).
Immediately, add 1 mL 37 °C prewarmed SOC medium
(Lucigen) carefully, transfer to a 2 mL cap, and incubate for
1 h at 37 °C with 600 rpm.
15. To determine the amount of transformants, use 10 μL (=10-
2
dilution) of the transformation and perform a dilution series
down to 10-6 dilution. Plate out a 10-6 dilution on 2xYT-
GA agar plates and incubate overnight at 37 °C.
16. Plate out the remaining 990 μL on 2xYT-GA agar “pizza plate”
and incubate overnight at 37 °C.
17. Calculate the amount of transformants (1 × 107–2 × 108
should be reached to be included into the final library). Con-
trol colonies for full size insert by colony PCR (see Subheading
3.8.).
18. Scrape off the colonies on the “pizza plate” with 25 mL 2xYT
medium using a Drigalski spatula (~OD 20–25 = ~2 × 1010
cells/mL). Use 800 μL bacteria solution (~1 × 1010 bacteria)
and 200 μL glycerol for glycerol stocks. Make 5–20 glycerol
stocks per sublibrary, freeze in liquid nitrogen, and store at -
80 °C.
 Construction of Human Immune and Naive scFv Phage Display Libraries 31

19. When all transformations are done, thaw one aliquot of each
sublibrary on ice, mix all sublibraries, and make new aliquots
for storage at -80 °C (see also Note 12).

3.8 Colony PCR 1. Choose 10–20 single colonies per transformation. Set up the
10 μL PCR reaction per colony as follows (see Table 1 for
primer sequences):

Solution or component Volume Final concentration

ddH2O 7.5 μL
GoTaq buffer (5×) 2 μL 1×
dNTPs (10 mM each) 0,2 μL 200 μM each
MHLacZPro_f 10 μM 0,1 μL 0,1 μM
MHgIII_r 10 μM 0,1 μL 0,1 μM
GoTag2 (5 U/ μL) 0,1 μL 0.5 U
Template Picked colonies from dilution plate

2. Control the PCR by 1.5% TAE agarose gel electrophoresis.

3. The PCR products should be ~1100 bp when including VH
and VL, ~750 bp when including only VL or VH, and 375 bp if
the vector contains no insert. Each used sublibrary should have
more than 80% full size inserts to be included into the final
library.

3.9 Library 1. To package the library, inoculate 400 mL 2xYT-GA in a 1 L

Packaging and scFv Erlenmeyer flask with 1 mL antibody gene library stock. Grow
Phage Production at 250 rpm at 37 °C up to an O.D.600 nm ~ 0.5.
2. Infect 25 mL bacteria culture (~1.25*1010 cells) with 2.5*1011
colony-forming units (cfu) of the helper phage M13K07 or
hyperphage according to a multiplicity of infection (moi) = 1:
20 (see Note 13). Incubate 30 min without shaking and the
following 30 min with 250 rpm at 37 °C.
3. To remove the glucose that represses the lac promoter of
pHAL52 and therefore the scFv::pIII fusion protein expres-
sion, harvest the cells by centrifugation for 10 min at 3200 xg
in 50 mL polypropylene tubes.
4. Resuspend the pellet in 400 mL 2xYT-AK in a 1 L Erlenmeyer
flask. Produce scFv-phage overnight at 250 rpm and 30 °C.
5. Pellet the bacteria by centrifugation for 10 min at 10,000× g in
two GS3 centrifuge tubes. If the supernatant is not clear,
centrifuge again to remove remaining bacteria.
32 Maximilian Ruschig et al.

6. Precipitate the phage from the supernatant by adding 1/5

volume PEG solution in two GS3 tubes. Incubate for 1 h at
4 °C with gentle shaking, followed by centrifugation for 1 h at
10,000× g.
7. Discard the supernatant, resolve each pellet in 10 mL phage
dilution buffer in SS34 centrifuge tubes, and add 1/5 volume
PEG solution.
8. Incubate on ice for 20 min and pellet the phage by centrifuga-
tion for 30 min at 10,000× g.
9. Discard the supernatant and put the open tubes upside down
on tissue paper. Let the viscous PEG solution move out
completely. Resuspend the phage pellet in 1 mL phage dilution
buffer. Titrate the phage preparation (see Subheading 3.9).
Store the packaged antibody phage library at 4 °C.
10. The library packaging should be controlled by 10%
SDS-PAGE, Western blot, and anti-pIII immunostain (mouse
anti-pIII 1:2000 , goat anti-mouse IgG AP conjugate 1:
10000 ). Wild-type pIII has a calculated molecular mass of
42.5 kDa, but it runs at an apparent molecular mass of
65 kDa in SDS-PAGE. Accordingly, the scFv::pIII fusion pro-
tein runs at about 95 kDa.

3.10 Phage Titration 1. Inoculate 5 mL 2xYT-T in a 100 mL Erlenmeyer flask with

E. coli XL1-Blue MRF’ and grow overnight at 37 °C and
250 rpm.
2. Inoculate 50 mL 2xYT-T with 500 μL overnight culture and
grow at 250 rpm at 37 °C up to O.D.600 ~ 0.5 (see Note 14).
3. Make serial dilutions of the phage suspension in PBS. The
package library phage preparation should have a titer of about
1011–1013 phage/mL.
4. Infect 50 μL bacteria with 10 μL phage dilution and incubate
30 min at 37 °C.
5. You can perform titrations in two different ways:
(a) Plate the 60 μL infected bacteria on 2xYT-GA agar plates
(9 cm Petri dishes).
(b) Pipette 10 μL (in triplicate) on 2xYT-GA agar plates.
Here, about 20 titrating spots can be placed on 1 9 cm
Petri dish. Dry drops on workbench.
6. Incubate the plates overnight at 37 °C.
7. Count the colonies and calculate the cfu or cfu/mL titer
according to the dilution.
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 Le 10. — Oh ! le beau rayon de lune qui vient de tomber sur
l’évangile que je lisais !

Le 11. — Aujourd’hui, à cinq heures du matin, il y a eu cinquante-

sept ans que notre père vint au monde. Nous sommes allés, lui,
Mimi et moi, à l’église en nous levant, célébrer cet anniversaire et
entendre la messe. Prier Dieu, c’est la seule façon de célébrer toute
chose en ce monde. Aussi ai-je beaucoup prié en ce jour où vint au
monde le plus tendre, le plus aimant, le meilleur des pères. Que
Dieu nous le conserve et ajoute à ses années tant d’années que je
ne les voie pas finir ! Mon Dieu, non, je ne voudrais pas mourir la
dernière ; aller au ciel avant tous serait mon bonheur. Pourquoi
parler de mort un jour de naissance ? C’est que la vie et la mort sont
sœurs et naissent ensemble comme deux jumelles.
Demain je ne serai pas ici. Je t’aurai quittée, ma chère
chambrette, papa m’emmène à Caylus. Ce voyage m’amuse peu ; je
n’aime pas de m’en aller, de changer de lieu ni de ciel, ni de vie, et
tout cela change en voyage. Adieu, mon confident, tu vas m’attendre
dans mon bureau. Qui sait quand nous nous reverrons ? Je dis dans
huit jours, mais qui compte au sûr en ce monde ? Il y a neuf ans que
je demeurai un mois à Caylus. Ce n’est pas sans quelque plaisir que
je reverrai cet endroit, ma cousine, sa fille, et le bon chevalier qui
m’aimait tant ! On prétend qu’il m’aime encore. Je vais le savoir.
C’est possible qu’il soit le même ; lui me trouvera bien changée
depuis dix ans. Dix ans, c’est un siècle pour une femme. Alors nous
aurons même âge, car le brave homme a ses quatre-vingts ans
passés.

Le 12. — C’était pour moi une véritable peine de m’en aller ;

papa l’a su et m’a laissée. Il me dit hier au soir : « Fais comme tu
voudras. » Je voulais demeurer et me sentais toute triste en pensant
que ce soir je serais loin d’ici, loin de Mimi, loin de mon feu, loin de
ma chambrette, loin de mes livres, loin de Trilby, loin de mon
oiseau : tout, jusqu’aux moindres choses, se présente quand on s’en
va, et vous entoure si bien qu’on n’en peut sortir. Voilà ce qui
m’arrive chaque fois qu’il est question de voyage : j’appelle voyage
une sortie de huit jours. Comme la colombe, j’aime chaque soir de
revenir à mon nid. Nul endroit ne me fait envie.

Je n’aime que les fleurs que nos ruisseaux arrosent,

Que les prés dont mes pas ont foulé le gazon ;
Je n’aime que les bois où nos oiseaux se posent,
Mon ciel de tous les jours et son même horizon.

Neuf heures. — C’est l’heure que l’âme pieuse écoute avec le

plus de recueillement, à cause des pieux souvenirs qu’elle réveille. A
la neuvième heure, nous dit l’Évangile, les ténèbres couvrirent la
terre pendant que Jésus était en croix. Ce fut aussi à la neuvième
heure que le Saint-Esprit descendit sur les apôtres. Aussi cette
heure est-elle bénie et consacrée par l’Église à la prière. C’est alors
que les chanoines commencent leur office.

Le 14. — C’est un de mes beaux jours, de ces jours qui

commencent doux et finissent doux comme une coupe de lait. Dieu
soit béni de ce jour passé sans tristesse ! Ils sont si rares dans la
vie ! et mon âme plus qu’une autre s’afflige de la moindre chose. Un
mot, un souvenir, un son de voix, un visage triste, un rien, je ne sais
quoi, souvent troublent la sérénité de mon âme, petit ciel que les
plus légers nuages ternissent. Ce matin, j’ai reçu une lettre de
Gabrielle, de cette cousine que j’aime à cause de sa douceur et de
sa belle âme. J’étais en peine sur sa santé si frêle, ne sachant rien
d’elle depuis plus d’un mois. Sa lettre aussi m’a fait tant de plaisir
que je l’ai lue avant la prière, tant j’étais pressée de la lire. Voir une
lettre, et ne pas l’ouvrir, chose impossible ! Je l’ai lue. Entre autres
choses, j’ai vu que Gabrielle n’approuve pas mes goûts de retraite et
de renoncement au monde. C’est qu’elle ne me connaît pas, qu’elle
est plus jeune et qu’elle ne sait pas qu’il est un âge où le cœur se
déprend de tout ce qui ne le fait pas vivre. Le monde l’enchante,
l’enivre, mais ce n’est pas la vie. On ne la trouve qu’en Dieu et en
soi. Être seul avec Dieu seul, ô bonheur suprême !
On m’a remis à Cahuzac encore une lettre. Celle-ci est de Lili,
autre douce amie, mais tout à fait à l’écart du monde ; âme pure,
âme de neige par sa candeur, si blanche que j’en suis éblouie quand
je la regarde, âme faite pour les yeux de Dieu. Elle me dit de l’aller
voir, mais je ne veux pas sortir avant Pâques. Après j’irai à Rayssac,
et au retour je demeurerai tant que je pourrai avec Lili. Je m’en allais
de Cahuzac toute contente avec ma lettre, lorsque j’ai vu près de la
fontaine un petit garçon qui se désolait à fendre l’âme. C’est qu’il
avait cassé son cruchon, et le pauvre enfant avait peur d’être battu
par son père. Ce n’est pas lui qui me l’a dit, tant il pleurait, mais des
femmes qui avaient vu tomber la cruche. Ce pauvre petit, j’ai vu
qu’avec dix sous je le consolerais ; et le prenant par la main, je l’ai
mené chez un terrassier où il a retrouvé sa cruche. Charles X ne
serait pas plus heureux s’il reprenait sa couronne. N’est-ce pas que
c’est un beau jour ?

Le 15. — Boue, pluie, ciel d’hiver, temps incommode pour un

dimanche ; mais ça m’est égal, tout comme si je voyais le soleil. Non
par indifférence, j’aime mieux le beau temps ; mais tous les temps
sont bons : quand le dedans est serein, que fait le reste ? J’étais à
Lentin, où j’ai entendu bien mal prêcher, ce me semble. Cette parole
de Dieu, si belle, comme elle se défigure en passant par certaines
bouches ! On a besoin de savoir qu’elle vient du ciel. Je vais à
vêpres, malgré le temps. J’ai rapporté d’Andillac une fleur, la
première que j’aie vue cette année. Les pareilles étaient sur l’autel
de la Vierge, dont elles embaumaient les pieds. C’est la coutume de
nos paysannes de lui offrir les premières fleurs de leur jardin ;
coutume pieuse et charmante : rien ne pare mieux un autel de
campagne. Je laisse ici ma fleur comme un souvenir du dimanche le
plus voisin du printemps.
 Le 16. — Encore une lettre de G…, une lettre pour m’annoncer
son mariage. Que j’étais loin d’y penser ! Elle est si jeune, si
délicate, si frêle. On ne voit qu’un peu de vie dans ce petit corps
d’enfant. Mon Dieu, que je la souhaite heureuse ! mais je ne sais
pas… je ne vois rien de riant dans son mariage. Il faut pourtant que
je lui fasse mes félicitations, c’est l’usage. J’ai passé tout le jour à
penser à elle, à me figurer son avenir et à penser à ces mots de sa
lettre : Je n’ai de calme qu’à genoux.

Le 17. — C’est un cœur tout neuf que celui de G… Voilà

pourquoi elle pourra être heureuse, si son mari est aimable, parce
qu’elle l’aimera avec tout le charme d’une première affection.
J’écoute le berger qui siffle dans le vallon. C’est l’expression la
plus gaie qui puisse passer sur les lèvres de l’homme. Ce sifflement
marque un sans-souci, un bien-être, un je suis content qui fait plaisir.
Ces pauvres gens, il leur faut bien quelque chose, ils ont la gaieté.
Deux petits enfants font aussi en chantant leur fagot de branches
parmi les moutons. Ils s’interrompent de temps en temps pour rire ou
pour jouer, car tout cela leur échappe. J’aimerais de les voir faire et
d’écouter le merle qui chante dans la haie du ruisseau ; mais je veux
lire. C’est Massillon que je lis depuis que nous sommes en carême.
J’admire son discours de vendredi sur la Prière, qui est vraiment un
cantique.

Le 18. — Le berger m’a annoncé ce matin l’arrivée des

bergeronnettes. Une a suivi le troupeau toute la journée : c’est de
bon augure, nous aurons bientôt des fleurs. On croit aussi que ces
oiseaux portent bonheur aux troupeaux. Les bergers les vénèrent
comme une sorte de génies et se gardent d’en tuer aucune. Si ce
malheur arrivait, le plus beau mouton du troupeau périrait. Je
voudrais que cette naïve crédulité préservât de même tant d’autres
petits oiseaux que nos paysans font périr inhumainement, et qui
m’ont donné bien du chagrin autrefois. Le malheur des nids était un
de mes chagrins d’enfance. Je pensais aux mères, aux petits, et
cela me désolait de ne pouvoir les protéger, ces innocentes
créatures ! Je les recommandais à Dieu.

Je disais : O mon Dieu, ne les faites pas naître

Ou préservez-les de malheur ;
Préservez ces petits, vous êtes bien le maître,
Des griffes du vautour, des mains de l’oiseleur.

J’en ai vu qu’on prenait de leur nid sous le lierre,

D’autres sur le grand chêne ou cachés sous la terre,
Et, tristes comme moi quand je n’ai pas ma cour,
Tous mouraient dans un jour.

Et tous auraient chanté, et tous, mettant des ailes,

Se seraient envolés dans les bois, sur les mers ;
Et quand naîtront les fleurs, ces pauvres hirondelles
Renaîtraient dans les airs.

Vous les verriez, enfants, passer sous les nuages,

Et puis chaque matin gazouiller tout l’été.
Oh ! que c’est bien plus doux que de les voir en cages
Sans chants ni liberté !

Le 19. — Je ne sais jusqu’où ces oiseaux m’auraient menée, tant

ils me donnent de souvenirs et tant je leur portais de tendresse. Me
voici dans une joyeuse attente ; papa revient ce soir. Il me tarde :
huit jours d’absence sont longs quand on a l’habitude de ne jamais
se quitter. C’est de plus Saint-Joseph aujourd’hui, la fête de papa.
Ce ne peut être qu’un beau jour. J’ai entendu la messe pour le fêter,
voilà mon bouquet : les prières sont des fleurs divines.

Le 20. — Papa est arrivé frais, bien portant et charmé de l’accueil

qu’on lui a fait chez ma cousine de La Gardelle. La soirée s’est
passée à parler de cette bonne famille qui nous aime, des voisins
qu’ils ont, de leur curé. La vie des curés de campagne est
intéressante, et j’aime à me la faire dire. Enfin, des uns ou des
autres, nous avons eu de quoi causer jusqu’après dix heures où
chacun de nous va dormir pour l’ordinaire, sans avoir tout appris.
Je n’ai aucune envie d’écrire aujourd’hui, j’aime mieux coudre.
L’aiguille me sied mieux que la plume, je la reprends. Nous avons eu
au lever ce matin une lettre de Marie et un cahier de la Propagation
de la foi, voilà pour le cœur et pour l’âme. Marie nous mande des
amitiés ; les missionnaires, des conversions. Que ces hommes sont
admirables, et que de grand cœur je leur donne mon sou par
semaine ! Je voudrais te voir de cette association.

Le 21. — Je crois que c’est aujourd’hui le premier jour du

printemps. Je ne m’en doutais pas ; au froid qu’il fait, à la bise qui
siffle, on se croirait en janvier. Encore un peu de temps et la froidure
s’en ira : patience, pauvre impatiente que je suis de voir des fleurs,
un beau ciel, de respirer l’air tout embaumé du printemps ! Quand
j’en serai là, j’aurai quelques jours de plus, quelques soucis peut-
être, et voilà comme les jouissances arrivent. J’ai fait pourtant un
beau réveil. Comme j’ouvrais l’œil, une lune charmante passait sur
ma fenêtre et rayonnait dans mon lit, et rayonnait si bien que tout à
coup j’ai cru que c’était une lampe suspendue à mon contrevent.
C’était joli à voir et bien doux, cette blanche lumière. Aussi l’ai-je
contemplée, admirée, regardée jusqu’à ce qu’elle se fût cachée
derrière le contrevent, pour reparaître ensuite et se cacher comme
un enfant qui joue à clignette.
J’ai été me confesser ; j’ai longtemps réfléchi sur la douce et
belle morale de M. Bories, puis j’ai écrit à Louise, ici à présent : que
de douces choses j’ai faites ! J’écrirais tout à présent que j’écrirais
trop ; je ne pourrais pas dormir, et il faut que je dorme, et que je
puisse penser à Dieu et le prier demain qui est dimanche. Ce frêle
corps qui tient l’âme, il le faut ménager. C’est ennuyeux, mais qu’y
faire ? Les anges n’ont pas ce souci : heureux anges !
 Le 24. — Je vois un beau soleil qui du dehors vient resplendir
dans ma chambrette. Cette clarté l’embellit et m’y retient, quoique
j’aie envie de descendre. J’aime tant ce qui vient du ciel ! J’admire
d’ailleurs ma muraille toute tapissée de rayons, et une chaise sur
laquelle ils retombent comme des draperies. Jamais je n’eus plus
belle chambre. C’est plaisir de s’y trouver et d’en jouir comme de
chose à soi. O le beau temps ! il me tarde d’en jouir, de respirer à
plein gosier l’air de dehors si suave aujourd’hui ; ce sera pour
l’après-midi : ce matin, il faut que j’écrive. Hier il nous arriva trois
personnes et des livres, toutes visites d’amis. L’après-dîner se passa
à causer, à écouter mille choses que Mme Roquiers sait raconter
comme nouvelles intéressantes, ou amuser sa petite fille, enfant de
quatre ans, fraîche comme une première rose. C’était plaisir de
baiser ses joues rondelettes et de lui voir croquer des gimblettes.
Nous sommes invitées Mimi et moi à aller assister demain chez M.
Roquiers à la bénédiction d’une cloche. Cette course ne me déplaît
pas.

Le 26. — C’est une jolie chose qu’une cloche entourée de

cierges, habillée de blanc comme un enfant qu’on va baptiser. On lui
fait des onctions, on chante, on l’interroge, et elle répond par un petit
tintement qu’elle est chrétienne et veut sonner pour Dieu. Pour qui
encore ? car elle répond deux fois. Pour toutes les choses saintes de
la terre, pour la naissance, pour la mort, pour la prière, pour le
sacrifice, pour les justes, pour les pécheurs. Le matin, j’annoncerai
l’aurore ; le soir, le déclin du jour. Céleste horloge, je sonnerai
l’Angelus et les heures saintes où Dieu veut être loué. A mes
tintements, les âmes pieuses prononceront le nom de Jésus, de
Marie ou de quelque saint bien-aimé ; leurs regards monteront au
ciel, ou, dans une église, leur cœur se distillera en amour.
Je pensais cela et d’autres choses devant cette petite cloche
d’Itzac, que je voyais bénir au milieu d’une foule qui regardait sans
penser à rien, ce me semblait, et qui regardait également nous et la
cloche. Deux demoiselles étaient en effet choses curieuses et toutes
nouvelles pour les Itzagois. Les pauvres gens !

Le 27. — A deux heures papa est parti pour Alby où Lili le

réclame pour ses affaires. Nous voilà encore seules pour je ne sais
combien de jours, car il est possible que papa aille à Rayssac. A son
retour j’aurai des nouvelles de Louise. Il me tarde. Voilà longtemps
que je ne sais rien de cette chère amie. Ce n’est pas qu’elle
m’oublie, je ne puis le croire. Si je le croyais… Non, non, Louise
m’aime et sera toujours mon amie. C’est dit, c’est fait, nous n’en
sommes plus aux commencements pour avoir des doutes sur notre
amitié. C’est qu’elle ne peut m’écrire ou que les charbonniers
perdent les lettres. Les ennuyeux, s’ils savaient ce qu’ils perdent !

Le 28. — J’ai failli avoir un chagrin : mon petit linot était sous la
griffe de la chatte, comme j’entrai dans ma chambre. Je l’ai sauvé en
donnant un grand coup de poing à la chatte, qui a lâché prise.
L’oiseau n’a eu que peur, puis il s’est trouvé si content qu’il s’est mis
à chanter de toutes ses forces comme pour me remercier et
m’assurer que la frayeur ne lui avait pas ôté la voix. Un bouvier qui
passe au chemin de Cordes chante aussi menant sa charrette, mais
un air si insouciant, si mou, que j’aime mieux le gazouillement du
linot. Quand je suis seule ici, je me plais à écouter ce qui remue au
dehors, j’ouvre l’oreille à tout bruit : un chant de poule, les branches
tombant, un bourdonnement de mouche, quoi que ce soit
m’intéresse et me donne à penser. Que de fois je me prends à
considérer, à suivre des yeux de tout petits insectes que j’aperçois
dans les feuillets d’un livre ou sur les briques ou sur la table ! Je ne
sais pas leur nom, mais nous sommes en connaissances comme
des passants qui se considèrent le long du chemin. Nous nous
perdons de vue, puis nous nous rencontrons par hasard, et la
rencontre me fait plaisir ; mais les petites bêtes me fuient, car elles
ont peur de moi, quoique je ne leur aie jamais fait mal. C’est
qu’apparemment je suis bien effrayante pour elles. En serait-il de
même au paradis ? Il n’est pas dit qu’Ève y fit jamais peur à rien. Ce
n’est qu’après le péché que la frayeur s’est mise entre les créatures.
Il faut que j’écrive à Philibert.

Le 29. — J’ai commencé hier au soir ma lettre d’outre-mer que

j’écris avec un inexprimable intérêt par les souvenirs qu’elle fait
naître, par les dangers qu’elle va courir. Est-il possible qu’une feuille
de papier lancée sur l’Océan arrive à son adresse, tombe juste sous
les yeux de mon cousin dans son île ? Ce n’est pas croyable, à
moins que quelque ange navigateur ne prenne ce papier sous son
aile. Cette île de France est en effet au bout du monde. Pauvre
Philibert, comme il est loin d’ici et qu’il est à plaindre, lui qui aime
tant son pays, ses parents, son beau ciel d’Europe ! Je me souviens
du dernier soir que nous avons passé ensemble, et comme il
contemplait avec extase ces étoiles de son pays qui bientôt
disparaîtraient pour lui ! Il regrettait surtout l’étoile polaire qu’on
cesse de voir sous la ligne. Alors paraît la croix du Sud. La croix du
Sud est bien belle, mais jamais, me disait-il, je ne l’ai tant regardée,
ni toutes nos constellations d’Afrique, que cette petite étoile du Nord.

Étoiles du beau ciel de France,

Du beau pays de ma naissance,
Vous ne luirez plus à mes yeux
Par delà l’Océan immense,
Où je vais vivre malheureux,
Et, sans vous voir, voir d’autres cieux,
Étoiles du beau ciel de France !

Ce pauvre cousin me disait cela, ce me semble, et j’en avais le

cœur gros. Que les exilés sont à plaindre ! Rien ne leur plaît dans
cet éloignement du pays. Avec sa femme et ses enfants, Philibert est
triste en Afrique ; en France, il serait heureux.
 Le 30. — Deux lettres nous sont venues : l’une de joie, pour
annoncer le mariage de Sophie Decazes, l’autre de deuil, pour nous
parler de mort. C’est ce pauvre M. de La Morvonnais qui m’écrit tout
pleurant, tout plein de sa chère Marie. Comme il l’aimait et comme il
l’aime encore ! C’étaient deux âmes qui ne pouvaient se quitter :
aussi demeureront-elles unies malgré la mort, et à part le corps où
n’est pas la vie. C’est là l’union chrétienne, union spirituelle,
immortelle, nœud divin formant l’amour, la charité qui jamais ne
meurt. Dans son veuvage, Hippolyte n’est pas seul : il voit Marie,
partout Marie, toujours Marie. « Parlez-moi d’elle, toujours d’elle »,
me dit-il. Puis : « Écrivez-moi souvent, vous avez des tours de
langage qui me la rappellent au vif. » Je ne m’en doutais pas ; c’est
Dieu qui le fait et m’a mis dans l’âme quelques traits de
ressemblance avec cette âme. Voilà pourquoi elle m’aimait et je
l’aimais : la sympathie naît des rapports de l’âme. Je trouvais de plus
en Marie quelque chose d’infiniment doux que j’aime tant, qui
n’émane que d’une âme pure. « La vraie marque de l’innocence,
c’est la douceur », dit Bossuet. Que de charmes, que de bien j’aurais
goûté dans cette amitié céleste ! Dieu en a jugé autrement et me l’a
ôtée après un an que j’en ai joui. Pourquoi si tôt ? Point de plaintes,
Dieu n’en veut pas pour ce qu’il nous ôte et pour quelques jours de
séparation. Ceux qui meurent ne vont pas si loin, car le ciel est tout
près de nous. Nous n’avons qu’à lever les yeux et nous voyons leur
demeure. Consolons-nous par cette douce vue en nous résignant
sur la terre, qui n’est qu’une marche à la porte du paradis.

1er avril. — Voilà donc un mois de passé, moitié triste, moitié

beau, comme à peu près toute la vie. Ce mois de mars a quelques
lueurs de printemps qui sont bien douces ; c’est le premier qui voit
des fleurs, quelques pimprenelles qui s’ouvrent un peu au soleil, des
violettes dans les bois sous les feuilles mortes, qui les préservent de
la gelée blanche. Les petits enfants s’en amusent et les appellent
fleurs de mars. Ce nom est très-bien donné. On en fait sécher pour
faire de la tisane. Cette fleur est douce et bonne pour les rhumes, et,
comme la vertu cachée, son parfum la décèle. On a vu aujourd’hui
des hirondelles, joyeuse annonce du printemps.

Le 2. — Mon âme s’en va tout aujourd’hui du ciel sur une tombe,

car il y a seize ans que ma mère mourut à minuit. Ce triste
anniversaire est consacré au deuil et à la prière. Je l’ai passé devant
Dieu en regrets et en espérances ; tout en pleurant, je lève les yeux
et vois le ciel où ma mère est heureuse sans doute, car elle a tant
souffert ! Sa maladie fut longue et son âme patiente. Je ne me
souviens pas qu’il lui soit échappé une plainte, qu’elle ait crié tant
soit peu sous la douleur qui la déchirait : nulle chrétienne n’a mieux
souffert. On voyait qu’elle l’avait appris devant la croix. Il lui serait
venu de sourire sur son lit de mort comme un martyr sur son
chevalet. Son visage ne perdit jamais sa sérénité, et jusque dans
son agonie elle semblait penser à une fête. Cela m’étonnait, moi qui
la voyais tant souffrir, moi qui pleurais au moindre mal, et qui ne
savais pas ce que c’est que la résignation dans les peines. Aussi,
quand on me disait qu’elle s’en allait mourir, je la regardais, et son
air content me faisait croire qu’elle ne mourrait pas. Elle mourut
cependant le 2 avril à minuit, à l’heure où je m’étais endormie au
pied de son lit. Sa douce mort ne m’éveilla pas, jamais âme ne sortit
plus tranquillement de ce monde. Ce fut mon père… Mon Dieu !
j’entends le prêtre, je vois des cierges allumés, une figure pâle, en
pleurs : je fus emmenée dans une autre chambre.

Le 3. — A neuf heures du matin ma mère fut mise au tombeau.

Le 4. — Je vais à Cahuzac avec le soleil sur la tête. Si cela

m’ennuie, je penserai au saint du jour, saint Macaire cheminant sous
une corbeille de sable dans le désert pour se défaire d’une tentation.
Il tourmentait le corps pour sauver l’âme.
 Le 8. — Je ne sais pourquoi je n’ai rien mis ici depuis quatre
jours ; j’y reviens à présent que je me trouve seule dans ma
chambre. La solitude fait écrire parce qu’elle fait penser. On prend
son âme avec qui l’on entre en conversation. Je demande à la
mienne ce qu’elle a vu aujourd’hui, ce qu’elle a appris, ce qu’elle a
aimé, car chaque jour elle aime quelque chose. Ce matin j’ai vu un
beau ciel, le marronnier verdoyant, et entendu chanter les petits
oiseaux. Je les écoutais sous le grand chêne, près du Téoulé dont
on nettoyait le bassin. Ces jolis chants et ce lavage de fontaine me
donnaient à penser diversement : les oiseaux me faisaient plaisir, et,
en voyant s’en aller toute bourbeuse cette eau si pure auparavant, je
regrettais qu’on l’eût troublée, et me figurais notre âme quand
quelque chose la remue ; la plus belle même se décharme quand on
en touche le fond, car au fond de toute âme humaine il y a un peu de
limon. Voilà bien la peine de prendre de l’encre pour écrire de ces
inutilités ! Mieux vaut parler du pauvre Tamisier, qui me racontait,
assis près du portail, quelque aventure de ses courses. Je l’en ai
remercié par un coup de vin, qui lui donnera d’autres paroles et des
jambes pour aller au gîte ce soir. J’ai lu un sermon ; ne pouvant pas
aller en entendre, je me fais de ma chambrette une église où je
trouve Dieu, ce me semble, et sans distractions. Quand j’ai prié, je
réfléchis ; quand j’ai médité, je lis, puis quelquefois j’écris, et tout
cela se fait devant une petite croix sur la table, comme un autel ;
dessous est le tiroir où sont mes lettres, mes reliques.

Le 9. — J’ai médité ce matin sur les larmes de Madeleine. Les

douces larmes et la belle histoire que celle de cette femme qui a tant
aimé ! Voici papa, je quitte tout.

Le 13. — Depuis le retour de papa j’ai laissé mon Journal, mes

livres et bien des choses. Il y a de ces jours de défaillance où l’âme
se retire de toutes ses affections et se replie sur elle-même comme
bien fatiguée. Cette fatigue sans travail, qu’est-ce autre chose que
faiblesse ? Il la faut surmonter comme tant d’autres qui vous
prennent cette pauvre âme. Si on ne les tuait une à une, toutes ces
misères finiraient par vous dévorer comme ces étoffes rongées par
les vers. Je passe trop subitement de la tristesse à la joie ; quand je
dis joie, je veux dire ces bonheurs de l’âme calmes et doux, et qui
n’éclatent au dehors que par la sérénité. Une lettre, un souvenir de
Dieu ou de ceux que j’aime, me feront cet effet, et d’autres fois tout
le contraire. C’est quand je prends les choses mal qu’elles
m’attristent. Dieu sait les craintes et les ravissements qu’il me
donne ; mes amis, vous ne savez pas combien vous m’êtes doux et
amers ! Te souviens-tu, Maurice, de cette petite courte lettre qui m’a
tourmentée quinze jours ? que tu me semblais froid, indifférent, peu
aimable !
Je viens de suspendre à mon bénitier le rameau bénit. C’était
hier les Rameaux, la fête des enfants, si heureux avec leurs
rameaux bénits, garnis de gâteaux dans l’église. Cette joyeuse
entrée leur est donnée sans doute en mémoire de l’hosanna que les
enfants chantèrent à Jésus dans le temple. Dieu ne laisse rien sans
récompense. Voilà mon cahier fini. En recommencerai-je un autre ?
Je ne sais. Adieu à celui-ci et à toi !
 II

Le 14 avril 1835. — Pourquoi ne continuerais-je pas de t’écrire,

mon cher Maurice ? Ce cahier te fera autant de plaisir que les deux
autres, je continue. Ne seras-tu pas bien aise de savoir que je viens
de passer un joli quart d’heure sur le perron de la terrasse, assise à
côté d’une pauvre vieille qui me chantait une lamentable complainte
sur un événement arrivé jadis à Cahuzac ? C’est venu à propos
d’une croix d’or qu’on a volée au cou de la sainte Vierge. La vieille
s’est souvenue que sa grand’mère lui disait qu’autrefois on lui avait
dit que, dans la même église, il avait été fait un vol plus sacrilége
encore, puisque ce fut le Saint-Sacrement qu’on enleva un jour qu’il
était seul exposé dans l’église. Ce fut une fille qui, pendant que tout
le monde était aux moissons, s’en vint à l’autel et, montant dessus,
mit l’ostensoir dans son tablier, et s’en alla le poser sous un rosier
dans un bois. Les bergers qui le découvrirent l’allèrent dénoncer, et
neuf prêtres vinrent en procession adorer le Saint-Sacrement du
rosier et le reportèrent à l’église. Cependant la pauvre bergère fut
prise, jugée et condamnée au feu. Au moment de mourir, elle
demanda à se confesser et fit au prêtre l’aveu du larcin, mais ce
n’était pas qu’elle fût voleuse, c’était, dit-elle, pour avoir le Saint-
Sacrement dans la forêt. « J’avais pensé que sous un rosier le bon
Dieu se plairait aussi bien que sur un autel. » A ces paroles, un ange
descendit du ciel pour lui annoncer son pardon et consoler la sainte
criminelle, qui fut brûlée sur un bûcher dont le rosier fut le premier
fagot. Voilà ce que m’a chanté la mendiante que j’écoutais comme
un rossignol. Je l’ai bien remerciée, puis lui ai offert quelque chose
pour la payer de sa complainte ; elle n’a voulu que des fleurs :
« Donnez-moi quelque brin de ce beau lilas. » Je lui en ai donné
quatre, grands comme des panaches, et la pauvre vieille s’en est
allée, son bâton d’une main et son bouquet de l’autre, et moi dedans
avec sa complainte.

Le 15. — A mon réveil, j’ai entendu le rossignol, mais rien qu’un

soupir, un signe de voix. J’ai écouté longtemps sans jamais entendre
autre chose. Le charmant musicien arrivait à peine et n’a fait que
s’annoncer. C’était comme le premier coup d’archet d’un grand
concert. Tout chante ou va chanter.
Je n’ai pas lu la vie du saint aujourd’hui, je vais la lire : c’est mon
habitude avant dîner. Je trouve que, tandis qu’on mange, qu’on est à
la crèche, il est bon d’avoir dans l’âme quelque chose de spirituel
comme une vie de saint.
Elle est charmante, la vie de saint Macédone, de celui qui, par
ses prières, obtint la naissance de Théodoret, et qui dit à un
chasseur étonné de rencontrer le saint sur la montagne : « Vous
courez après les bêtes, et moi je cours après Dieu. » Dans ces mots
est toute la vie des saints et celle des hommes du monde.
Nous avons un hôte de plus dans la cuisine, un grillon, qu’on a
rapporté parmi des herbes ce soir. Le voilà établi dans le foyer, où la
petite bête chantera quand elle sera joyeuse…

Le jeudi saint. — J’arrive tout embaumée de la chapelle de

mousse où repose le saint ciboire à l’église. C’est un beau jour que
celui où Dieu veut reposer parmi les fleurs et les parfums du
printemps. Nous avons mis tous nos soins, Mimi, moi et Rose la
marguillière, à faire ce reposoir, aidées que nous étions de M. le
curé. Je pensais, en le faisant, au cénacle, à cette salle bien ornée
où Jésus voulut faire la Pâque avec ses disciples, se donnant lui-
même pour agneau. Oh ! quel don ! que dire de l’Eucharistie ? Je
n’en sais rien : on adore, on possède, on vit, on aime, l’âme sans
parole se perd dans un abîme de bonheur. J’ai pensé à toi parmi ces
extases, et t’aurais bien désiré à mon côté à la sainte table, comme
il y a trois ans.

Le mardi de Pâques. — Voici plusieurs jours que je n’ai écrit ni à

toi ni à personne. Les offices m’ont pris le temps, et j’ai vécu, pour
ainsi dire, à l’église. Douce et belle vie que je regrette de voir finir,
mais je la retrouve ici quand je veux : j’ouvre ma chambrette, et là
j’entre au calme, au recueillement, à la solitude ; je ne sais pourquoi
j’en sors.
Voilà sur ma fenêtre un oiseau qui vient visiter le mien. Il a peur, il
s’en va, et le pauvre encagé s’attriste, s’agite comme pour
s’échapper. Je ferais comme lui si j’étais à sa place, et cependant je
le retiens. Vais-je lui ouvrir ? Il irait voler, chanter, faire son nid, il
serait heureux ; mais je ne l’aurais plus, et je l’aime, et je veux l’avoir.
Je le garde. Pauvre petit linot, tu seras toujours prisonnier : je jouis
de toi aux dépens de ta liberté, je te plains et je te garde. Voilà
comme le plaisir l’emporte sur la justice. Mais que ferais-tu si je te
donnais les champs ? Sais-tu que tes ailes, qui ne se sont jamais
dépliées, n’iraient pas loin dans le grand espace que tu vois à
travers les barreaux de ta cage ? Ta pâture, tu ne saurais la trouver,
tu n’as pas goûté de ce que mangent tes frères, et même peut-être
te banniraient-ils, comme un inconnu, de leur festin de famille. Reste
avec moi qui te nourris. La nuit, la rosée mouillerait tes plumes, et le
froid du matin t’empêcherait de chanter.
En travaillant le champ, on a soulevé une pierre qui recouvrait un
grand trou. Je vais la voir. Jeannot, muni d’un câble, est descendu
dans le souterrain et l’a exploré de tous côtés. Ce n’est autre chose
qu’une excavation incrustée de jolies petites pierres relevées en
bosses de pralines. J’en ai pris pour monument de notre découverte.
Un autre jour, je descendrai dans la grotte, et peut-être y verrai-je
autre chose que Jeannot.
 Le 24. — J’attendis tout hier le facteur, espérant que j’aurais de
tes lettres. Ce sera demain sans doute. Voilà comme je me console
à chaque courrier, depuis quinze jours que je suis en attente. C’est
bien long, et je commence à m’inquiéter de ton silence. Serais-tu
malade ? Cette idée me vient cent fois le jour, et la nuit quand je me
réveille. « Va-t’en, lui dis-je, je ne te crois pas. » Mais c’est possible :
le fils de M. de Fénelous vient bien de mourir à Paris. Mon Dieu, que
c’est triste, mourir loin des siens, loin de chez soi ! Demain je t’écris.
Parlons d’autres choses à présent. D’après la lettre de M.
Hippolyte, papa espère que nous le verrons ici. Ce nous serait un
grand bonheur de le posséder et de lui rendre un peu de ce que
nous lui devons pour son amitié pour toi. Qui sait ce que lui
semblerait notre Cayla, notre ciel et nous-mêmes ? On se fait sur
l’inconnu des idées que souvent la réalité désenchante. Au reste, je
ne voudrais pas qu’il vînt sans toi. Que serait pour lui le Cayla sans
Maurice ? Un désert où il s’ennuierait bientôt d’être seul. S’il
m’amenait sa fille, comme il me l’a dit, alors ce serait bien différent
pour lui : sa fille lui charmerait tout, et le Cayla pourrait lui sembler le
Val. Je serais aussi bien contente de voir cette enfant, de la tenir sur
mes genoux, de la caresser, de l’embrasser, de l’avoir en ma
possession pour quelques jours. Je ne saurais dire combien cette
petite créature m’intéresse, m’attache à elle, sans doute par le
souvenir de sa mère ; et puis, cette pauvre enfant est si intéressante
par son malheur ! N’avoir pas de mère, hélas ! c’est si triste, et
surtout à son âge, à deux ans ! Quoique si jeune, elle sent déjà sa
perte et la sentira tous les jours davantage. Le cœur apprend à
s’affliger comme il apprend à aimer. En grandissant, Marie aimera
toujours mieux sa mère et la pleurera davantage. Son avenir
m’occupe beaucoup ; je voudrais savoir si elle vivra, si Dieu ne la
retirera pas à lui avant l’âge où elle pourrait connaître le mal. Ce
serait un malheur pour son père, mais pour elle, oh non ! Peut-on
regretter qu’une âme s’en retourne au ciel avec toute son
innocence ? La belle mort qu’une mort d’enfant, et comme on bénit
ces petits cercueils que l’Église accompagne avec allégresse !
J’aime ceux-là, je les contemple, je m’en approche comme d’un
berceau ; je ne plains que les mères, je prie Dieu de les consoler, et
Dieu les console, si elles sont chrétiennes.
Je n’ai écrit qu’ici d’aujourd’hui. Je ne sais pourquoi cela m’est
devenu nécessaire d’écrire, quand ce ne serait que deux mots. C’est
mon signe de vie que d’écrire, comme à la fontaine de couler. Je ne
le dirais pas à d’autres, cela paraîtrait folie. Qui sait ce que c’est que
cet épanchement de mon âme au dehors, ce besoin de se répandre
devant Dieu et devant quelqu’un ? Je dis quelqu’un parce qu’il me
semble que tu es là, que ce papier c’est toi. Dieu, ce me semble,
m’écoute ; il me répond même de ces choses que l’âme entend et
qu’on ne peut dire. Quand je suis seule, assise ici ou à genoux
devant mon crucifix, je me figure être Marie écoutant tranquille les
paroles de Jésus. Pendant ce grand silence où Dieu seul lui parle,
mon âme est heureuse et comme morte à tout ce qui se fait là-bas,
là-haut, dedans, dehors ; mais cela ne dure guère. « Allons, ma
pauvre âme, lui dis-je, reviens aux choses de ce monde. » Et je
prends ma quenouille, ou un livre, ou une casserole, ou je caresse
Wolf ou Trilby. Voilà la vie du ciel en terre. Je trayais une brebis tout
à l’heure. Oh ! le bon lait, et que j’aurais voulu te le faire goûter, ce
bon lait de brebis du Cayla ! Mon ami, que de douceurs tu perds à
n’être pas ici !

A huit heures. — Il faut que je note en passant un excellent

souper que nous venons de faire, papa, Mimi et moi, au coin du feu
de la cuisine, avec de la soupe des domestiques, des pommes de
terre bouillies et un gâteau que je fis hier au four du pain. Nous
n’avions pour serviteurs que nos chiens, Lion, Wolf et Trilby, qui
léchaient aussi les miettes. Tous nos gens sont à l’église, à
l’instruction qui se fait chaque soir pour la confirmation. Ce repas au
coin du feu, parmi chiens et chats, ce couvert mis sur les bûches, est
chose charmante. Il n’y manquait que le chant du grillon et toi, pour
compléter le charme. Est-ce assez bavardé aujourd’hui ?
Maintenant, je vais écouter la Vialarette, qui revient de Cordes :
encore un plaisir.
 Le 25. — Me voici devant un charmant bouquet de lilas que je
viens de prendre sur la terrasse. Ma chambrette en est embaumée ;
j’y suis comme dans un bouquetier, tant je respire de parfums !

Le 26. — Je ne sais quoi m’ôta de sur les fleurs hier matin ;

depuis j’en ai vu d’autres dans le chemin de Cahuzac, tout bordé
d’aubépines. C’est plaisir de trotter dans ces parfums, et d’entendre
les petits oiseaux qui chantent par-ci par-là dans les haies. Rien
n’est charmant comme ces courses du matin au printemps, et je ne
regrette pas de me lever de bonne heure pour me donner ce plaisir.
Bientôt je me lèverai à cinq heures. Je me règle sur le soleil, et nous
nous levons ensemble. L’hiver, il est paresseux : je le suis et ne sors
du lit qu’à sept heures. Encore parfois le jour me semble long. Cela
m’arrive lorsque le ciel est nébuleux, que je suis triste et que
j’attends un peu de soleil ou quelque chose de rayonnant dans mon
âme ; alors le temps est long. Mon Dieu, trouver un jour long, tandis
que la vie tout entière n’est rien ! C’est que l’ennui s’est posé sur
moi, qu’il y demeure, et que tout ce qui prend de la durée met de
l’éternité dans le temps. Oh ! que je plains une âme en purgatoire,
où l’attente fait tant souffrir, et quelle attente ! Peut-on mettre en
comparaison celles d’ici-bas, soit de la fortune, de la gloire, de tout
ce qui fait haleter le cœur humain ? Une seule peut-être en est
l’ombre, c’est celle de l’amour quand il attend ce qu’il aime. Aussi
Fénelon compare-t-il la félicité céleste à celle d’une mère au moment
où elle revoit son fils qu’elle avait cru mort. Midi sonne. Ce n’est plus
le temps d’écrire.
Quand je vois passer devant la croix un homme qui se signe ou
ôte son chapeau, je me dis : « Voilà un chrétien qui passe ; » et je
me sens de la vénération pour lui, et je ne ferme pas à verroux, si je
suis seule à la maison ; au contraire, je me tiens à la fenêtre, et
regarde tant que je puis cette bonne figure de chrétien, comme je l’ai
fait tout à l’heure. On n’a rien à craindre de ceux qui craignent Dieu.
J’aurais volontiers ouvert la porte à l’inconnu que j’ai vu chevauchant
du côté de la croix. Que Dieu l’accompagne où qu’il aille ! Je vais
courir aussi, mais pas bien loin, jusqu’à l’église pour vêpres. Il est
dimanche, jour de sortie pour le corps et de recueillement pour
l’âme. Elle rentre donc en soi et te quitte. Encore jour de courrier
aujourd’hui, et je n’ai pas de lettre. A quoi penses-tu, mon ami ?

Le 27. — J’ai rencontré le petit du Cruchon. Le pauvre enfant a

perdu son père ; sa mère est morte aussi, et depuis, l’orphelin a une
coutume touchante. Il prend à côté de lui, dans son lit, un mouchoir
à la place où était sa mère et s’endort en le tetant. Douce illusion qui
le console et l’attache si fort à son bout de mouchoir qu’il pleure et
crie s’il se réveille sans l’avoir aux lèvres ! Il appelle sa mère alors,
lui dit de revenir, et ne se calme qu’avec sa poupée : naïf besoin que
cette poupée, bien digne d’une âme d’enfant, et même de tout
homme fait, car tout affligé a la sienne, et se plaît à la moindre
image du bonheur perdu !

Le 28. — Quand tout le monde est occupé et que je ne suis pas

nécessaire, je fais retraite et viens ici à toute heure pour écrire, lire
ou prier. J’y mets aussi ce qui se passe dans l’âme et dans la
maison, et de la sorte nous retrouverons jour par jour tout le passé.
Pour moi ce n’est rien ce qui passe, et je ne l’écrirais pas, mais je
me dis : « Maurice sera bien aise de voir ce que nous faisions
pendant qu’il était loin et de rentrer ainsi dans la vie de famille », et
je le marque pour toi.
Mais je m’aperçois que je ne parle guère de qui que ce soit, et
que mon égoïsme se met toujours en scène ; je dis : « J’ai fait ceci,
j’ai vu cela, j’ai pensé telle chose », laissant derrière le public à la
façon de l’amour-propre, mais le mien est celui du cœur qui ne sait
parler que de lui. Le petit peintre ne sait donner que son portrait à
son ami, le grand peintre offre des tableaux. Je continue donc le
portrait. Sans la pluie qu’il a fait ce matin, je serais à Gaillac
maintenant. Grâce à la pluie, j’aime bien mieux être ici. Quel salon
peut me valoir ma chambrette ? avec qui serais-je à présent, qui me
valût ceux qui m’entourent ? Bossuet, saint Augustin et d’autres