Quá trình tái bản DNA

(DNA replication)
Sự tái bản DNA trong chu kì tế bào
.

Chu kì tế bào. Quá trình sao chép DNA diễn ra

trước khi tế bào phân chia
2
Các mô hình tái bản
Dựa trên mô hình DNA của Watson và Crick, các
giả thuyết về mô hình tái bản của DNA đã được
đề xuất, gồm:
• Bán bán bảo toàn (semiconservative): mỗi phân
tử DNA mới gồm 1 sợi khuôn và 1 sợi mới tổng
hợp.
• Bảo toàn (conservative): chỉ 1 phân tử tạo thành
mang sợi khuôn kết hợp với nhau, các phân tử
còn lại mang DNA hoàn toàn mới.
• Phân tán (dispersive): các phân tử tạo thành
mang 1 phần DNA mạch khuôn và 1 phần DNA
mới tổng hợp.
3
Các mô hình tái bản DNA. Dựa trên mô hình DNA của
Watson và Crick, các giả thuyết về mô hình tái bản của
DNA đã được đề xuất, gồm: A. Bảo toàn, B. Bán bảo
toàn; C. Phân tán
4
 Thí nghiệm Meselson - Stahl
Kiểu tái bản DNA
được xác định bởi M.
Meselson và F. W.
Stahl vào năm 1958.

Thí nghiệm phân biệt phân tử DNA ban đầu và DNA

mới được tổng hợp dựa vào sự phát triển của E. coli
trong môi trường chứa 1 đồng vị nặng của ni-tơ 15N
trước khi chuyển sang môi trường chứa 14N. Mật độ
DNA qua các thế hệ được phân tích bằng phương
pháp ly tâm gradient tỷ trọng sử dụng CsCl
5
Thí nghiệm Meselson - Stahl

6
Thí nghiệm Meselson – Stahl (tt)

Meselson, M., Stahl, F. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli,

7
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 44 : 671 – 682.
Quá trình tái bản DNA
Các đặc điểm của quá trình tái bản
• Bán bảo toàn
• Tổng hợp sợi DNA mới theo chiều 5’ – 3’
• Quá trình tái bản bắt đầu từ Vị trí khởi đầu tái bản
• DNA mới được tổng hợp liên tục ở mạch khuôn 3’→5’
và gián đoạn trên sợi 5’→3’
Đa số các quá trình tái bản diễn ra theo kiểu nửa gián đoạn
(semidiscontinuous); tái bản liên tục, tái bản cuộn vòng
(rolling circle replication)
Cơ chế tái bản thay đổi tùy vào cấu trúc bộ gen (dạng vòng
hay thẳng) và dạng tế bào hay bào quan.

8
Sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ – 3’ 9
 Khởi đầu quá trình tái bản
• Phân tử DNA phải được tháo xoắn, nhờ topoisomerase.
✓ Topoisomerase loại 1 tháo dạng siêu xoắn bằng cách
cắt 1 trong hai mạch phân tử DNA (protein ω ở E. coli)
✓ Topoisomerase loại 2 tháo các nút nảy sinh, cắt cả hai
mạch của phân tử DNA (gyrase ở E. coli)
• Sự sao chép bắt đầu từ điểm khởi đầu sao chép (Ori).
• Một đơn vị tái bản (replicon) là vùng DNA được sao chép
từ điểm khởi đầu sao chép.
Một replicon ở người dài khoảng 100 – 200 kb.

10
Các vị trí khởi đầu tái bản ở NST eukaryote
11
12
QUÁ TRÌNH TÁI BẢN DIỄN RA NHƯ
THẾ NÀO?

13
 Tái bản nửa gián đoạn (semidiscontinuos)
Dạng tái bản chính ở DNA nhân, một số virus
(papovavirus, SV40) và vi khuẩn với một số đặc điểm
chính được duy trì từ tế bào E. coli đến tế bào người.
Điểm khác biệt: các enzyme và protein tham gia.
Sự tổng hợp liên tục trên sợi “dẫn đầu” (leading
strand) (3’-5’), cùng với chiều di chuyển của chẻ 3 tái
bản (replication fork).
Sự tổng hợp không liên tục trên sợi “chậm” (lagging
strand). DNA được sao chép ở dạng những đoạn ngắn
hay đoạn Okazaki (1000 – 2000 nt ở prokaryote, 100-
200 nt ở eukaryote)
Quá trình gồm 4 bước: tổng hợp primer, kéo dài, loại
bỏ primer và lắp khoảng trông, nối các đoạn Okazaki14
 Quá trình tái bản
•Chuỗi xoắn DNA được tách rời bởi helicase và giữ ở
dạng sợi đơn nhờ các protein SSB.
•Tổng hợp mồi RNA nhờ phức hợp primosome và
primase (enzyme tổng hợp mồi RNA).
•DNA pol III xúc tác tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3’-
OH tự do của mồi RNA.
•Khi kết thúc sao chép, mồi RNA bị phân hủy bởi
RNaseH.
•Vị trí của mồi được lắp đầy nhờ DNA polymerase I.
•Ligase nối các chỗ gián đoạn trên mạch mới tổng hợp.

15
Tái bản nửa gián đoạn
(semidiscontinuos) 16
Quá trình tái bản ở vi
khuẩn. Tái bản diễn ra
theo 2 hướng ở NST E.
coli (1300 µm).

17
 Tái bản cuộn vòng (Rolling circle replication)
• Kiểu tái bản phổ biến của nhiều vi khuẩn, virus
DNA xâm nhiễm sinh vật nhân chuẩn (eukaryotic
DNA virus), của F plasmid (quá trình tiếp hợp
của vi khuẩn), DNA lục lạp.
• Một liên kết phosphodiester bị phá vỡ ở 1 sợi của
DNA dạng tròn, tạo đầu 3’OH tự do để các dNTP
gắn vào với mạch khuôn là sợi còn lại.

18
Tái bản cuộn vòng. Đầu 3’ của sợi (+) đóng vai trò là
primer cho quá trình sao chép; đầu 5’ được thay thế
bởi DNA mới tổng hợp. Sợi (-) là sợi khuôn. 19
Tái bản cuộn vòng. Sợi dẫn đầu được tổng hợp liên tục, sợi
chậm được tổng hợp gián đoạn với sợi khuôn là sợi dẫn đầu. 20
 Chiều tổng hợp trên sợi dẫn đầu

Các protein tham gia quá trình tái bản 21

 DNA polymerase
• Vi khuẩn có 5 loại DNA polymerase khác nhau (I-V)
• Tế bào động vật có vú có ít nhất 14 loại DNA
polymerase đặc trưng.
• Các polymerase tái bản ở eukaryote: DNA
polymerase α, δ và ε. DNA polymerase γ chỉ có ở
quá trình tái bản của mtDNA. Ngoài ra, còn có các
polymerase tham gia vào quá trình sửa sai.
• Xúc tác sự hình thành liên kết giữa 5’-P và 3’OH
của các nucleotide.
• Không thể tổng hợp DNA ngay từ đầu (de novo) (trừ
DNA polymerase α) ; cần phải có RNA primer
• Tốc độ (vi khuẩn, ĐV có vú): ~500 và ~50 nt/giây.
22
DNA Polymerase không thể khởi đầu sợi DNA mới
5’

Fig. 11.9a(TE Art)

Không thể nối 2
nucleotide độc lập 3’
với nhau 5’

5’
3’
5’

3’
3’
Có thể nối 5’

5’
3’
23
 DNA polymerase ở eukaryote
Tên Chức năng
Enzyme tái bản độ chính xác cao Tạo mồi cho sự tổng hợp DNA và sửa
Pol α sai

Pol δ (delta) Tái bản sợi dẫn đầu và sửa sai

Pol ε (epsilon) Tái bản sợi chậm và sửa sai
Pol γ (gamma) Tái bản DNA ti thể và sửa sai
Enzyme sửa sai độ chính xác cao Base excision repair (BER)
Pol β Double stranded break repair (DSBR)

Pol η (eta) Tổng hợp DNA bỏ qua T-T dimer

(translesion)
Enzyme sửa sai độ chính xác thấp
Pol ζ (zeta), Pol θ (theta), Pol ι (iota),
Pol κ (kappa), Pol λ (lambda), Pol μ
(mu), Pol ν (nu), Rev1

(Theo Allison 2007) 24

 Các protein tham gia quá trình tái bản
Chức năng E. coli Người
Helicase DnaB Mcm2-7 (kháng nguyên T)
Mang helicase/primase DnaC Mcm2-7 (Kháng nguyên T)
Ổn định sợi đơn SSB RPA (replication protein A)
Priming DnaG (primase) Pol α/primase
Bám và di chuyển β PCNA (proliferating cell
nuclear antigen)

Hỗ trợ bám (ATPase) phức hợp αδ RFC (replication factor C)

Kéo dài sợi Pol III Pol δ/pol ε
Loại bỏ RNA primer Pol I FEN-1, Rnase H1
Nối đoạn Okazaki Ligase Ligase 1

(Theo Allison 2007)

25
 DNA polymerase vi khuẩn
E. coli có 5 DNA polymerase chính (DNA polymerase I – V)
DNA polymerase I
• Loại bỏ primer, lắp đầy khoản trống giữa các đoạn Okazaki,
sửa sai (loại bỏ nucleotide)
• Gồm 2 tiểu đơn vị (Klenow, hoạt tính DNA polymerase 5’ – 3’;
3’-5’ và 5’ – 3’ exonuclease)
• Ứng dụng trong SHPT: “nick translation” tạo DNA đánh dấu
phóng xạ hay “random priming”
DNA polymerase III gồm 10 tiểu đơn vị, có chức năng tái bản
DNA polymerase II, IV và V tham gia vào quá trình sửa sai
(tương đối)

26
DNA polymerase III thực hiện quá trình tái bản

27
Arthur Kornberg. Người đầu tiên phân lập DNA
polymerase vào năm 1956 và đoạt giải Nobel với phát hiện
này vào năm 1959.
28
 Quá trình tái bản DNA nhân ở tế bào eukaryote
Được nghiên cứu thông qua quá trình tái bản của
DNA simian virus 40 (SV40) bởi enzyme của
eukaryote. SV40 có bộ gen ~5 kb và vùng khởi đầu
65 bp
Các nhà máy tái bản chứa các yếu tố tái bản ở
nồng độ cao.
Loại bỏ histone, nới lỏng sợi nhiễm sắc
Hình thành phức hợp tiền tái bản (điểm khác so
với ở vi khuẩn) ngừa trường hợp tái tổ hợp thừa.
Phức hợp nhận biết điểm khởi đầu (ORC) gồm 6
tiểu đơn vị Orc 1-6.
29
 Quá trình tái bản DNA nhân ở tế bào nhân thật
• Vị trí khởi đầu tái bản là vị trí cặp chẻ ba tái bản
hình thành trên DNA NST, nằm ở phần trong của
NST và cách nhau khoảng 50 kb, thường giàu cặp
base AT.
- Động vật có vú vị trí khởi đầu khó nhận biết
- Ở S. cerevisiae, trình tự tái bản tự động (ARS)
* Trình tự OriC của E. coli cho phép DNA tái bản
ở vi khuẩn
• Hoạt hóa chọn lọc điểm khởi đầu tái bản. Các yếu
tố chi phối có thể bao gồm: thay đổi về mức độ tập
trung nucleotide, thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, tỉ lệ
protein khởi động và DNA 30
 ORC: origin recognition
complex
Cdc: cell division cycle
Mcm: minichromosome
maintenance
Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote (bước 1 – 3)
31
 RPA: replication protein A

Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote (bước 4 – 5)

32
RFC: replication factor C
PCNA: proliferating cell
nuclear antigen

Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote (bước 6)

33
Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote (bước 7-9) 34
 CAF: chromatin
assembly factor

Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote (bước 10 -12) 35

Cơ chế tái bản DNA ở eukaryote

• DNA tái bản 1 lần duy nhất/chu kì tế bào. Mức

độ của cyclin-dependent kinase (CDKs) chi phối sự
hình thành và hoạt hóa phức hợp tiền tái bản (pre-
RC).
• Sửa sai (proofreading). Tỉ lệ sai sót 10-4 - 10-5
/base pair. DNA polymerase δ (exonuclease 3’ -5’)
• Kết thúc tái bản. Khi các chẻ 3 tái bản gặp nhau
hay đọc đến trình tự tín hiệu chuyên biệt cho sự kết
thúc tái bản.

36
Mô hình chức năng sửa sai của DNA polymerase 37
Mô hình tái bản DNA ở ty thể

38
Vai trò của telomere trong tái bản DNA, lão hóa và ung thư
• DNA nhiễm sắc thể có thể bị ngắn đi sau mỗi lần
tái bản →NST kém bền, chết tế bào, bào quan.
• Telomere được xác định bởi Barbara McClintock
(1938) và định nghĩa bởi H.M. Muller; vùng tạo
bởi các trình tự lặp lại đơn giản giàu G, vd:
(TTAGGG)1000 ; rất cần thiết cho sự sống của tế
bào.
• Giải pháp: telomerase terminal transferase xúc
tác sự tổng hợp de novo trình tự telomere.

39
Hoạt tính của telomerase làm tăng thời gian sống của tế bào
Bonard, A.G, Ouellette, M., Frolkis, M., et al 1998. Extension of life-span by introduction of
telomerase into human cells. Science 279: 349 - 352 40
Sự sinh tổng hợp DNA và RNA ở virus
Nucleic acid của Họ virus Đặc điểm sinh tổng hợp

time/Weber/Microbiology%20Majors/SoftChalkeCoursesubmission/chapter13sub/chapter13sub_print.html
virus
ssDNA Parvoviridae Enzyme ở nhân phiên mã DNA virus trong nhân

dsDNA Herpesviridae Enzyme ở nhân phiên mã DNA virus trong nhân

Papovaviridae Enzyme virus phiên mã DNA virus ở virion trong tế
Poxiviridae bào chất.

DNA, reverse Hepadnaviridae Enzyme của nhân phiên mã DNA virus trong nhân;
transcriptase reverse transcriptase sao chép mRNA để tạo DNA
virus.

http://www2.raritanval.edu/departments/Science/full-
RNA, sợi + Picornaviridae RNA virus đóng vai trò làm khuôn cho RNA
Togaviridae polymerase tổng hợp sợi (-) RNA để tạo mRNA
trong tế bào chất.

RNA, sợi - Rhabdoviridae Enzyme virus sao chép RNA virus để tạo mRNA
trong tế bào chất.
dsRNA Reoviridae Enzyme virus sao chép RNA sợi (-) để tạo mRNA
trong tế bào chất.
RNA, reverse Retroviridae Enzyme virus sao chép RNA để tạo DNA trong tế
transcriptase bào chất, DNA di chuyển vào trong nhân. 41
Sự sinh tổng hợp của DNA virus 42
Vòng đời của retrovirus 43