ĐỘT BIẾN DNA VÀ SỬA SAI

4/2017
Agents causing DNA damage

Copying UV light
errors or
(DNA ionizing
pol.) radiation

DNA Oxygen DNA

free
damage
radicals repair

Chemicals

2
 Dimer thymine

3
 What is mutations?
Đột biến là sự thay đổi trình tự nucleotide của một vùng ngắn
của bộ gen (mất đoạn, chèn thêm, sắp xếp lại)
- Đột biến tự phát: xảy ra do các quá trình tự nhiên trong tế
bào (lỗi sao chép DNA)
- Đột biến cảm ứng: xảy ra do sự tương tác của DNA với tác
nhân bên ngoài hoặc tác nhân gây đột biến gây tổn thương
DNA.
- Đột biến điểm chỉ thay đổi một cặp nucleotide duy nhất.

Nguồn biến đổi Hậu quả có hại Các công cụ

di truyền chính hoặc có lợi (hiếm nghiên cứu
dẫn đến thay đổi khi) đối với một sinh quan trọng
tiến hóa vật hoặc thế hệ sau
4
Types of mutations

Thay thế nucleotide (Đồng hoán và dị hoán : đột

biến câm lặng, sai nghĩa, vô nghĩa)

Chèn hoặc xóa : đột biến dịch chuyển khung

Sự mở rộng của các lần lặp lại trinucleotide dẫn đến

sự bất ổn định về mặt di truyền

5
Types of mutations – Nucleotide substitution

(Đồng hoán)

(Dị hoán)

In the human genome, the ration of transitions of transversions is

approximately 2:1.

Phenotypic effect of nucleotide substitutions depends on whether

they alter a critical nucleotide in a gene regulatory region, in the
template for a functional RNA molecule
Silent, missense, nonsense mutations in a protein – coding gene
6
Types of mutations – Nucleotide substitution

7
Types of mutations
Point mutations in protein coding sequences

8
Types of mutations
Insertions and deletions of nucleotides
 Xảy ra với tốc độ thấp hơn đáng kể so với tốc độ thay
thế nucleotide
 "Thay đổi" khung đọc của các codon trong mRNA
 Ex. The deletion of three base pairs in the nucleotide sequence
of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
(CFTR) gene results in the loss of the codon for phenylalanine
human hereditary disease cystic fibrosis (bệnh xơ nang)

9
 Types of mutations Sự mở rộng của trinucleotide lặp lại
 Sự có mặt của trinucleotide lặp đi lặp lại sự bất ổn định về mặt di truyền
của DNA (chuỗi xoắn ba DNA) sự không ổn định về mặt di truyền
 Sự mở rộng của trinucleotide lặp lại rối loạn thần kinh di
truyền như fragile X syndrome, Huntington’s disease, Kennedy’s
disease, Friedreich’s ataxia and myotonic dystrophy.

www.ncbi.nlm.nih.gov

10
Trinucleotide repeat expansion disorders caused by triplet
repeats in coding and noncoding gene regions
Các loại tổn thương DNA
Có ba loại tổn thương DNA chính:

Thay thế đơn

base

Sự biến dạng cấu trúc

Tổn thương khung

DNA

11
Thay đổi đơn base
- Ảnh hưởng đến trình tự DNA, nhưng chỉ ảnh hưởng nhỏ đến
cấu trúc tổng thể
- có thể dẫn đến việc tạo ra RNA đột biến hoặc sản phẩm
protein đột biến

- Sự đột biến (loại bỏ một nhóm amin khỏi phân tử, C U, meC
T) là loại thiệt hại thủy phân thường xuyên và quan trọng
nhất, và có thể xảy ra tự phát do tác dụng của nước hoặc do
một chất gây đột biến hóa học gây ra.

- DNA cũng có thể bị hư hại bởi quá trình alkyl hóa, oxy hóa và
bức xạ
8-oxoguanin (oxoG), một bazơ guanin bị hỏng có chứa thêm
một nguyên tử oxy, có thể tạo thành một cặp bazơ Hoogsteen
với adenin Chuyển đổi GC → TA, một trong những đột biến
phổ
12 biến nhất được tìm thấy trong bệnh ung thư ở người
13
Sự biến dạng cấu trúc
 Tia cực tím (UV) có tác động bất lợi đối với tế bào do sự
hấp thụ có chọn lọc tia UV.
 Bức xạ có bước sóng khoảng 260 nm bị các bazơ hấp thụ
mạnh.

 Các tổn thương do tia cực tím thường gặp nhất của DNA
là cảm ứng dimer pyrimidine giữa hai base thymine lân cận
bằng cách chiếu tia UV cyclobutane – pyrimidine dimers
(CPD) làm sai lệch cấu trúc của DNA duplex, có thể ảnh
hưởng đến sự sao chép và phiên mã bằng cách ngăn chặn
sự di chuyển của các polymerase .

 Gây ra bởi các hydrocacbon đa vòng, tác nhân xen phủ

(ethidium bromide) và các chất tương tự bazơ (5-
bromouracil ~ thymine).
14
Tổn thương khung DNA
 sự hình thành các vị trí abasic (mất bazơ nitơ từ nucleotide)
và đứt gãy DNA sợi kép.

 Sự thủy phân của liên kết N-glycosyl trong base purine

 Sự đứt gãy sợi đôi có thể được gây ra bởi bức xạ ion hóa
(ví dụ: tia X, vật liệu phóng xạ) và một loạt các hợp chất
hóa học.

 Bức xạ ion hóa ảnh hưởng khung DNA có thể trực tiếp hoặc
gián tiếp bằng cách tạo ra các loại oxy hoạt hóa (gốc tự do
oxy hóa).

 Đây là loại tổn thương DNA nghiêm trọng nhất, vì chúng

15 phá vỡ cả hai sợi DNA.
 How do cells respond to DNA damage?

16
 Khống chế sự thương tổn của DNA

 polymerase có độ nhạy cao sao chép chính xác DNA khuôn mẫu
không bị hư hại, nhưng không thể vượt qua các tổn thương DNA
gây ra sự biến dạng cấu trúc của chuỗi xoắn DNA.
 Các polymerase DNA có hoạt độ kém hoặc "dễ bị lỗi" được thay
thế tạm thời bởi các polymerase nhân bản và sao chép DNA bị
hư hỏng trong quá trình được gọi là tổng hợp chuyển đoạn
(TLS)
 Các polymerase dễ bị lỗi có tỷ lệ lỗi điển hình nằm trong
khoảng từ 10−1 to 10−3 trên mỗi cặp bazơ (trên DNA không bị
hư hại).
 Tổng hợp chuyển đoạn cho phép một tế bào tồn tại trước những
gì có thể là một mối nguy hại ngăn cản sao chép, nhưng với nguy
cơ tỷ lệ đột biến cao hơn.

Ở E. coli, tổng hợp của các polymerase chuyển đoạn (DNA

polymerase
17 IV và V) chỉ được tạo ra để đáp ứng với tổn thương
DNA, như một cách “phản ứng SOS”
18
 Sửa chữa trực tiếp

 Sự phá hủy của UV đối với DNA (dimer pyrimidine) có thể

được sửa chữa trực tiếp bằng một quá trình được gọi là quá
trình quang tái hoạt hóa (photoreactivation) hoặc “sửa chữa
bằng ánh sáng”.
Nhau thai động vật có vú, bao gồm cả con người, không có
con đường kích hoạt quang.
Quang tái hoạt hóa, enzyme DNA photolyase sử dụng năng
lượng từ tia cực tím đến ánh sáng xanh để phá vỡ các liên
kết cộng hóa trị giữ hai pyrimidine liền kề với nhau.
 Methyltransferase (E. coli đối với người) xúc tác loại bỏ
nhóm metyl khỏi gốc metyl hóa (O6-metylguanin.)
- Một nhóm sulfhydryl của một gốc cystein của
methyltransferase nhận nhóm metyl từ guanin.
- Một khi methyltransferase nhận nhóm metyl từ guanin, thì
enzym này không thể được sử dụng lại.
19
20
21
Sửa chữa bằng cách loại bỏ DNA tổn thương

Hệ thống sửa chữa DNA này bao gồm sửa chữa
thay đổi do thay thế base đơn lẻ, biến dạng cấu
trúc và hư hỏng DNA sợi đơn

nhiều tương tác protein động tham gia vào quá

trình sửa chữa
Các protein sửa chữa DNA có dạng mô-đun, bao
gồm nhiều vùng cấu trúc với các chức năng sinh
hóa riêng biệt
Hai con đường chính để sửa chữa thay đổi base
đơn: Sửa chữa cắt bỏ base (BER) và sửa chữa
không khớp
22
Base excision repair Repair by removal of DNA damage

 liên quan đến việc hiệu chỉnh các thay đổi bazơ đơn lẻ do
chuyển đổi (bazơ bị oxy hóa / khử, bazơ bị metyl hóa,
bazơ khử hoặc bazơ không phù hợp)

 bắt đầu bởi một nhóm các enzym được gọi là DNA
glycosylase phân cắt liên kết N-glycosidic nối đường
deoxyribose với base bị hư hỏng.

 Base tổn thương sau đó được cắt bỏ để tạo thành vị trí

abasic trong DNA

vị trí AP (vị trí apurinic / apyrimidinic hoặc vị trí abasic) là một vị trí trong DNA
(ít có khả năng xảy ra trong RNA) không có nhân purin cũng không có gốc
pyrimidine
23
 Base excision repair

 DNA glycosylase nhận ra và phân cắt liên kết N-glycosidic

nối đường deoxyribose với base bị tổn thương (bazơ bị
oxy hóa / khử, bazơ bị metyl hóa, bazơ khử hoặc bazơ
không khớp) hình thành vị trí abasic trong DNA
Ví dụ: uracil DNA glycosylase loại bỏ uracil khỏi các cặp
base UA hoặc UG

 Bản vá sửa chữa có thể là một nucleotide đơn (bản vá

ngắn) hoặc dài 2 - 10 nt (bản vá dài)

 Cả sửa chữa bản vá ngắn và sửa chữa bản vá dài đều

được đặc trưng bởi sự “chuyển giao” của DNA khỏi
endonuclease, giúp loại bỏ base bị hư hỏng, thành DNA
polymerase và ligase để tổng hợp sửa chữa.
24
Base excision repair

Nhận biết và loại

base sai hỏng

AP (apurinic)
endonuclease cắt
sợi đơn DNA ngay
vị trí đã mất base

Gắn base thích hợp

tại vị trí trống, tái
lập phân tử DNA
25
Base excision repair

26
27
Sửa chữa ghép đôi lệch Repair by removal of DNA damage
 Sửa chữa ghép đôi lệch (Mismatched repair) do lỗi DNA
polymerase trong quá trình sao chép

 Các đặc điểm cơ bản được bảo tồn từ E. coli sang người,
nhưng chỉ có các thể tương đồng MutS và MutL dường như
được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa.

 MutSα làm trung gian cho hầu hết các sự kiện nhận dạng không
phù hợp trong tế bào động vật có vú, trong khi MutSβ đóng một
vai trò hạn chế trong việc sửa chữa các điểm không khớp base -
base, nhưng sửa chữa việc chèn / xóa ghép sai hiệu quả hơn
MutSα

28
Mismatched repair Repair by removal of DNA damage

 Bước đầu tiên trong sửa chữa không phù hợp là nhận ra lỗi.
- Phương pháp phân biệt sợi (tức là sợi nào là sợi con bị sai) trong
tế bào động vật có vú chưa được biết
- Ở E. coli, sợi mới được tổng hợp có sai sót được xác định do
không có nhóm metyl trên trình tự GATC

 Sự đứt gãy sợi đơn 5 'hoặc 3' thường được tạo ra bởi
exonuclease EXO1.
 EXO1 kết hợp với PCNA sau đó dần dần loại bỏ phần
sợi ở giữa nick và không khớp.
 DNA polymerase δ và các yếu tố liên quan của nó
thay thế sợi bị cắt bỏ bằng DNA mới qua trung gian.
Cuối cùng, DNA ligase I đóng dấu nick bằng cách
hình thành liên kết phosphodiester cuối cùng.
29
Nucleotide excision repair- Repair by removal of DNA damage

 được sử dụng để sửa chữa sự biến dạng cấu trúc, ví dụ,

phồng lên từ các dimer thymine-thymine gây ra bởi bức
xạ UV.
Những khiếm khuyết trong quá trình sửa chữa cắt bỏ
nucleotide là nguyên nhân gây ra bệnh di truyền
xeroderma pigmentosum, được đặc trưng bởi độ nhạy
cao bất thường với tia UV.
 Quá trình sửa chữa và phiên mã cắt bỏ nucleotide được
kết hợp với nhau, và quá trình sửa chữa diễn ra nhanh
nhất thông qua chuỗi gen được phiên mã.
- Con đường sửa chữa chịu trách nhiệm nhận biết các
tổn thương trong toàn bộ bộ gen được gọi là sửa chữa
bộ gen toàn cầu (global genome repair GGR),
- Con đường sửa chữa khớp nối phiên mã (transcription-
coupled repair TCR) xác định các tổn thương trong chuỗi
30
phiên mã của các gen hoạt động.
31
Nucleotide excision repair- Repair by removal of DNA damage
 Đầu tiên, tổn thương DNA được nhận biết bởi sự liên kết bởi
tổ hợp của các yếu tố sửa chữa (RPA, XPA, XPC và phức
hợp TFIIH).
 Hoạt động 5 ′ → 3 ′ helicase của XPB và XPD tháo xoắn kép
DNA.
 một vết cắt được thực hiện ở phía 3 ′ của tổn thương (bởi
endonuclease, XPG; khoảng 6 nucleotide từ tổn thương) và
ở phía 5 ′ của tổn thương (bằng endonuclease thứ hai, XPF-
ERCC1, khoảng 20 nu tổn thương) tái tạo trình tự DNA
chứa tổn thương (24–32 nu)
 sửa chữa khi tổng hợp được thực hiện bởi DNA polymerase
ε (được sử dụng phổ biến nhất) hoặc DNA polymerase δ,
PCNA, RFC và RPA
 DNA ligase I tham gia vào các khoảng trống còn lại trên
khung DNA.
32
Double strand break repair by removal of DNA damage
 gây ra bởi các tác nhân như các loại ôxy hoạt hóa, bức xạ
ion hóa (ví dụ: tia X) và các hóa chất tạo ra các loại ôxy
hoạt hóa (các gốc tự do).
 Các mối đứt gãy của sợi đôi được sửa chữa bằng cơ chế tái
tổ hợp tương đồng hoặc cơ chế nối cuối không tương đồng.

 Sửa chữa tái tổ hợp tương đồng các đứt gãy sợi kép bằng
cách lấy thông tin di truyền từ nhiễm sắc thể tương đồng
không bị hư hại. Trong trường hợp hai nhiễm sắc thể không
tương đồng hoàn toàn, chuyển gen có thể diễn ra.

 Ngược lại, nối cuối không tương đồng sẽ nối lại các đứt sợi
kép thông qua việc thắt trực tiếp các đầu DNA mà không
cần bất kỳ yêu cầu nào đối với sự tương đồng trình tự.
33
Double strand break repair by removal of DNA damage

 Đã được bảo tồn qua quá trình tiến hóa và hoạt động ở cả
sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn.

 Tái tổ hợp tương đồng đóng một vai trò quan trọng trong
việc sửa chữa đứt gãy sợi kép ở sinh vật nhân sơ và sinh
vật nhân thực đơn bào;
- chủ yếu có chức năng sửa chữa đứt sợi đôi ở ngã ba sao
chép.
- Diễn ra ở pha S – G2 của chu kỳ tế bào.

 Trong các tế bào động vật có vú, các đứt gãy sợi kép trong
DNA chủ yếu được sửa chữa thông qua nối kết không
tương đồng; chức năng trong suốt chu kỳ tế bào.
Các yếu tố di truyền trong việc sửa chữa đứt gãy sợi đôi có
34
liên quan đến việc tăng tính nhạy cảm với ung thư vú.
35
 Homologous recombination
Recombination in prokaryotes
 kiến thức liên quan đến hóa sinh của sự tái tổ hợp đã được
thu thập thông qua các nghiên cứu về vi khuẩn (Escherichia
coli).
 một số protein quan trọng thực hiện các quá trình cơ bản
của trao đổi sợi, di chuyển nhánh và phân giải
 Việc cắt bỏ các đầu DNA bị hỏng để tạo ra các đuôi 3 ′
ssDNA được thực hiện chủ yếu bởi phức hợp RecBCD
(hoạt động exonuclease và endonuclease, cũng như khả
năng tháo xoắn DNA sợi đôi), bao gồm các sản phẩm
của gen recB, recC và recD .

Recombination in eukaryotes
Kiến thức liên quan đến sự tái tổ hợp ở sinh vật nhân chuẩn
đã được thu thập từ di truyền nấm men, nhưng hầu hết các
yếu
36
tố được xác định trong nấm men đều có tương đồng trực
tiếp ở người.
 Các protein RecB và
RecC phóng thích và
phân cắt một sợi
dsDNA

Protein RecA liên kết

và polyme hóa
ssDNA, và xúc tác
trao đổi sợi để tạo
thành một vùng của
DNA heteroduplex
(DNA kép bao gồm
các sợi DNA từ các
phân tử DNA khác
37 nhau)
38
39
40
 Homologous recombination
Sự tái tổ hợp tương đồng nguyên phân xảy ra chủ yếu
giữa các chromatic chị em giống hệt nhau.

Sự tái tổ hợp giảm phânxảy ra giữa các cặp nhiễm sắc thể
tương đồng (các nhiễm sắc thể không chị em), có thể dẫn
đến:

Tăng số lần sao chép của gen lặp lại chọn lọc tự
nhiên.
Ví dụ: một lượng lớn gen mã hóa cho histone được
tìm thấy trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn.

loại bỏ các gen bị suy giảm.

liên quan đến điều hòa biểu hiện gen.
kích hoạt gen (đặt gen sau trình tự khởi động)
mất đoạn cuối NST bệnh di truyền.
41
 TRANSPORTABLE ELEMENTS (nhân tố cơ động)
Được phát hiện trên cây ngô bởi Barbara McClintock vào cuối
những năm 1940
Có thể chèn vào các locus khác nhau trên nhiễm sắc thể trong
một bộ gen và có thể làm thay đổi một cách thuận nghịch sự
biểu hiện của các gen khác.
Insertion Sequences (IS)
Transposon (Tn)

42 Corn kernel specimens in McClintock’s experiment in 1978

(profiles.nlm.nih.gov)
 1902 -1992

Barbara McClintock, 1950.

The origin and behavior of mutable loci in
maize.PNAS 36 (6) 344-355.
43
 A tool for identification of mobile genetic elements (MGE)
44
 INSERTION SEQUENCE (IS)
 Lần đầu tiên được tìm thấy ở E. coli trong gal operon - một
bộ ba gen tham gia vào quá trình chuyển hóa đường
galactose.
 một thành phần quan trọng của hầu hết các bộ gen vi
khuẩn
 được định nghĩa là các đoạn DNA nhỏ (<2,5 kb), tổ chức di
truyền đơn giản và có khả năng chèn vào nhiều vị trí trong
phân tử đích (Mahillon và Chandler 1998)
 Bao gồm một trình tự trung tâm ở hai bên (thường mã hóa
cho transposase) bởi hai lần lặp lại ngược ngắn (15 - 25
bp) ở cả hai bên.
 Không mã hóa protein, chỉ có thể được phát hiện thông
qua ảnh hưởng của chúng.
 1500 trình tự IS khác nhau đã được tìm thấy (Siguier và
cộng sự.
45
 Organization of a typical IS. A single open reading frame
encoding the transposase is located within the IRR sequence

46
 TRANSPOSASE
 nhận ra các lần lặp lại
đảo ngược ở các đầu
của chuyển vị

nhận ra trình tự mục tiêu, trong

đó nó tạo ra một sợi kép đứt
gãy và chèn chuyển vị (Craig
1997)

47
 Transposon
 Trình tự DNA có khả năng thay đổi vị trí của chúng trong
bộ gen, tạo ra các đột biến mới và có thể thay đổi kích
thước bộ gen của tế bào và thường dẫn đến sự nhân đôi
của yếu tố chuyển vị riêng lẻ (TE)

Kích thước lớn hơn so với chuỗi IS (> 2kb)

Cấu trúc tương tự nhưng phức tạp hơn các trình

tự IS.
Các trình tự trung tâm mã hóa cho transposase và
phân giải.
 hai loại dựa trên cơ chế chuyển vị của chúng, và
tốt nhất có thể được mô tả là “sao chép và dán” (đối
48 với TE loại I) hoặc “cắt và dán” (đối với TE loại II)
49
 Structure of transposon Tn9 in E. coli. This transposon
includes chloramphenicol resistance gene (blue), flanked by
two IS1sequences (orange). During transposition, transposase
cleaves DNA at the sites of red arrows, the whole transposon
sequence is moved from the original position.

50
51 (Iyer et. al. 2013, http://file.scirp.org/Html/2-7300511_29273.htm)
52 Image courtesy of Lauren Solomon, Broad Communications
References
Craig NL. 1997.Target site selection in transposition. Annu. Rev.
Biochem. 66:437–474.
Robertson H M, Lampe D J. 1995. Recent horizontal transfer of a
mariner transposable element among and between Diptera and
Neuroptera. Mol Biol Evol. 1995;12:850–862
Mahillon, J. and Chandler, M. 1998. Insertion sequences.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3): 725–774.
Siguier, P., Perochon, J., Lestrade, L., Mahillon, and Chandler, M.
2006. ISfinder: the reference centre for bacterial insertion
sequences. Nucleic acid Res.34(Database issue): D32–D36.

53