Plan Van Aanpak Robin Rossen en Tessa Van Dalen BML2W

Plan van aanpak
Tessa van Dalen |Robin Rossen

BML2WNick Rossen
Inhoud
Inleiding..................................................................................................................................................2
Materiaal en methode............................................................................................................................4
Maken IDH1 insert..............................................................................................................................4
Polymerase Chain Reactie..............................................................................................................4
Zuivering van het PCR product.......................................................................................................7
Restrictie enzym analyse................................................................................................................7
Zuivering product restrictie enzym analyse..................................................................................10
Maken expressievector....................................................................................................................12
Isolatie plasmide DNA...................................................................................................................12
Restrictie enzym analyse..............................................................................................................13
DNA purificatie.............................................................................................................................17
Creëren van het recombinant-DNA en transformatie van TOP10-cellen..........................................17
Microbieel transformatie.............................................................................................................17
Ligatie van DNA-fragmenten........................................................................................................18
Elektroporatie E. coli cellen..........................................................................................................20
Kolonie PCR..................................................................................................................................21
Restrictie-enzym digestie.............................................................................................................24
Transformatie in BL21(DE3) cellen...................................................................................................25
Transformatie in BL21(DE3) cellen...............................................................................................25
Flowchart.............................................................................................................................................26
Veiligheid..............................................................................................................................................27
Tijdschema...........................................................................................................................................28
Referentielijst.......................................................................................................................................29
1
Inleiding
In de wereld van de moleculaire biologie is er een groeiende interesse voor een specifiek enzym met
een cruciale rol in de ontwikkeling van gliomen, een agressieve vorm van hersenkanker. Dit
specifieke enzym staat bekend als IDH1, ook bekend als Isocitraat Dehydrogenase. IDH1 speelt een
cruciale rol in de omzetting van alfa-ketogluteraat in de citroenzuurcyclus. Het IDH1 enzym
katalyseert de oxidatieve decarboxylering van isocitraat, waarbij alfa-ketoglutaraat wordt gevormd
en CO2 in de vorm van NADH vrijkomt, zoals te zien is in figuur 1.1
Figuur 1: Citroenzuurcyclus, de omzetting van

isocitraat naar alfa-ketogluteraat1
IDH1 maakt deel uit van een groep enzymen genaamd

isocitraatdehydrogenase, dit bestaat uit IDH1, IDH2 en
IDH3. IDH1 bevindt zich in het cytoplasma en in
peroxisomen. Aan de andere kant zijn IDH2 en IDH3
allebei aanwezig in de mitochondriën. Alle IDH-enzymen
voeren de oxidatieve decarboxylering van isocitraat naar
alfa-ketoglutaraat uit, waarbij NADP+ of NAD+ wordt
gereduceerd om NADPH of NADH te vormen. IDH1 en
IDH2 maken gebruik van NADP+, terwijl IDH3 gebruikt
maakt van NAD+. Bovendien hebben IDH1 en IDH2 ook
de mogelijkheid om de omgekeerde reactie te
katalyseren, waarbij alfa-ketoglutaraat in aanwezigheid
van NADPH en CO2 wordt omgezet in isocitraat en
NADP+ via reductieve carboxylering.1
Puntmutaties in het gen dat codeert voor het enzym Figuur 2: Mutaties in IDH1/IDH2 zorgen voor
IDH1 en IDH2 hebben gevolgen voor de ontwikkeling van verhinderen demythylatie van het DNA en
gliomen en acute myloïde leukemie (AML). Deze histonen en wijzigen opigenitische regulatie. 2
mutaties leiden tot de productie van 2-Hydroxyglutaraat
(2-HG), een stof die bekend staat als een oncometaboliet. In plaats van alfa-ketoglutaraat wordt er 2-
2
HG geproduceerd. Dit zorgt ervoor dat er minder NADPH gevormd wordt, omdat 2-HG NADPH
verbruikt wordt in plaats van NADPH te generen uit NADP+.
Doordat de chemische structuren van 2-HG en alfa-ketoglutaraat op elkaar lijken, kan 2-HG binden
aan enzymen die normaal gesproken afhankelijk zijn van alfa-ketoglutaraat. Deze enzymen spelen
een belangrijke rol bij het methyleren van DNA en histonen. Echter, wanneer de enzymen gebonden
zijn aan 2-HG, kunnen de demethyleringsprocessen niet meer op de gebruikelijke manier worden
uitgevoerd. Dit resulteert in dat 2-HG de demethylatie van DNA en histonen remt. Dit proces leidt tot
hypermethylatie.
Hypermethylatie is een proces waarbij er een overmatige methylering van cytosine en adenosine in
het DNA optreedt. Dit heeft negatieve gevolgen voor de genexpressie. Als gevolg hiervan kan
hypermethylatie leiden tot een remming van de normale differentiatieprocessen in de cellen. 2
Er zijn verschillende mutaties van IDH1 en IDH2,

maar in dit onderzoek wordt er onderzoek
gedaan naar het IDH1 R314C mutant. Hierbij is
het aminozuur Argenine verwisselt naar het
aminozuur Cysteïne op de plaats 314 in de
sequentie, in figuur 3 is de verandering
weergegeven. Deze mutatie kan worden
onderscheiden van andere IDH1 mutaties, zoals
de veelvoorkomende R132 mutaties, is dat de
R314C mutatie geen D-2-hydroxyglutaraat (D-2-
HG) produceert, in tegenstelling tot andere IDH1
mutanten.
Normaal gesproken zet IDH1 isocitraat om in

alfa-ketoglutaraat, terwijl NADP+ wordt omgezet in NADPH. Dit proces wordt verstoord door IDH1-
mutaties, deze verminderen de productie van alfa-ketoglutaraat en produceren D-2-HG. De R314C
mutatie verschilt daarin, omdat het geen D-2-HG produceert, maar verliest ook de activiteit om
isocitraat om te zetten in alfa-ketoglutaraat vanwege een verminderde affiniteit voor NADP+.
De R314C mutatie kan leiden tot verstoringen in de cellulaire stofwisseling. Doordat R314C niet in
staat is om isocitraat om te zetten in alfa-ketoglutaraat, heeft dit invloed op de productie van NADH
en alfa-ketoglutaraat. En ontbreekt de productie van D-2-HG, een oncometaboliet die normaal
gesproken betrokken is bij epi genetische regulatie en tumorgroei.
Figuur 3: Puntmutatie in IDH1 gen R314C3
De unieke eigenschappen van de R314C mutatie maakt dat het waardevol is om verder onderzoek te
doen naar effecten van de mutatie op de celbiologische processen. In dit onderzoek wordt er
gekeken naar de enzymactiviteit en productie van oncometabloieten van de mutant R314C. Hierbij
wordt verwacht dat het geïsoleerde IDH1 R314C gen geen D-2-Hydroxyglutaraat en alfa-
ketoglutaraat produceert en geen NADP+ wordt omgezet in NADPH.
3
Materiaal en methode
Maken IDH1 insert
Polymerase Chain Reactie
PCR
Dit experiment is uitgevoerd volgens de richtlijnen van het protocol “Protocol guide – Course 5 –
Curriculum 2023-2024” “Protocol – PCR” blz. 12-13
In het experiment wordt er gebruik gemaakt van PCR. De PCR-methode zorgt ervoor dat het cDNA
van interesse kan worden geamplificeerd. Het cDNA van interesse is IDH1 wildtype en IDH1 mutant
R314C. De PCR-methode kan ook worden gebruikt om restrictie sites aan de sequenties te binden.
Onderstaand is de sequentie van is IDH1 wildtype weergegeven.
Sequentie IDH1 wildtype

atgtcca aaaaaatcag
tggcggttct gtggtagaga tgcaaggaga tgaaatgaca cgaatcattt gggaattgat
taaagagaaa ctcatttttc cctacgtgga attggatcta catagctatg atttaggcat
agagaatcgt gatgccacca acgaccaagt caccaaggat gctgcagaag ctataaagaa
gcataatgtt ggcgtcaaat gtgccactat cactcctgat gagaagaggg ttgaggagtt
caagttgaaa caaatgtgga aatcaccaaa tggcaccata cgaaatattc tgggtggcac
ggtcttcaga gaagccatta tctgcaaaaa tatcccccgg cttgtgagtg gatgggtaaa
acctatcatc ataggtcgtc atgcttatgg ggatcaatac agagcaactg attttgttgt
tcctgggcct ggaaaagtag agataaccta cacaccaagt gacggaaccc aaaaggtgac
atacctggta cataactttg aagaaggtgg tggtgttgcc atggggatgt ataatcaaga
taagtcaatt gaagattttg cacacagttc cttccaaatg gctctgtcta agggttggcc
tttgtatctg agcaccaaaa acactattct gaagaaatat gatgggcgtt ttaaagacat
ctttcaggag atatatgaca agcagtacaa gtcccagttt gaagctcaaa agatctggta
tgagcatagg ctcatcgacg acatggtggc ccaagctatg aaatcagagg gaggcttcat
ctgggcctgt aaaaactatg atggtgacgt gcagtcggac tctgtggccc aagggtatgg
ctctctcggc atgatgacca gcgtgctggt ttgtccagat ggcaagacag tagaagcaga
ggctgcccac gggactgtaa cccgtcacta ccgcatgtac cagaaaggac aggagacgtc
caccaatccc attgcttcca tttttgcctg gaccagaggg ttagcccaca gagcaaagct
tgataacaat aaagagcttg ccttctttgc aaatgctttg gaagaagtct ctattgagac
aattgaggct ggcttcatga ccaaggactt ggctgcttgc attaaaggtt tacccaatgt
gcaacgttct gactacttga atacatttga gttcatggat aaacttggag aaaacttgaa
gatcaaacta gctcaggcca aactttaa
De mutatie R314C ligt op de nucleotide 314 waarbij het aminozuur Argenine (R) is gewisseld met
Cysteïne (C).
Naast amplificeren van het DNA kunnen er met behulp van PCR ook restriction sites worden
toegevoegd aan het gen. Dit zijn EcoRI en Xhol en worden later gebruikt om restrictie-enzym digestie
uit te voeren op het PCR-product. De primer set die nodig is om de restrictie sites te hechten aan de
sequentie staan vermeld in tabel 1.
Tabel 1: Gebruikte primers PCR

Nr Gen Forward/Reverse Expressie vector Sequence RE site Tm
1232 IDH1 Forward pET15b/pBAD His A 5'ATTATTCCTCGAGATGTCCAAAAAAATCAGTGGCG'3 XhoI 69,2
1233 IDH1 Reverse pET15b/pBAD His A 5'ATTATTCGAATTCTTAAAGTTTGGCCTGAGCTAGTTTG'3 Eco RI 66,0
4
Een deel van de primers zal binden aan de sequentie. Het deel dat zich niet bindt aan de sequentie
zal het fragment groter maken. De grootte van het fragment zal dan niet 1245 bp zijn, maar 1271 bp.
Als negatieve controle wordt er een sample gemaakt met daarin de mastermix zonder DNA-
template, maar met extra milliQ. Hiermee kan er worden gecontroleerd of er geen contaminaties
aanwezig zijn in de mastermix.
Om PCR uit te voeren moet er een PCR-programma worden opgesteld op basis van de grootte van
het DNA-template en de smelttemperaturen van de primers. Het PCR-programma dat wordt gebruikt
is te zien in tabel 3.
Er wordt verwacht dat er een fragment van 1271 bp wordt gevormd. En dat er bij de negatieve
controle geen bandje zichtbaar is. Dit kan worden gecontroleerd door het fragment op gel te zetten.
Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:
Materiaal
 Reactie buffer zonder MgCl2 10x
 MgCl2 25 mM
 dNTP 2,5 mM
 Forward primer 1232 10 pmol/µL
 Reverse primer 1233 10 pmol/µL
 Pfu polymerase 1 U/µL
 cDNA template R314C of Wildtype 0,1 ƞg/µL
 MilliQ
 PCR tubes (0,2 mL)
 Thermocycler
Tabel 2.: Pipetteerschema PCR

Component Stock concentratie Volume per sample (µL) Master mix (µL) Eind concentratie
Reactie buffer (zonder MgCl2) 10 x 5 100 1x
MgCl2 25 mM 8 160 4 mM
dNTP's 2,5 mM 4 80 0,2 mM
Forward primer 10 pmol/µL 1,25 25 0,25 pmol/µL
Reverse primer 10 pmol/µL 1,25 25 0,25 pmol/µL
Pfu Polymerase 1 U/µL 1 20 0,02 U/µL
MilliQ - Aanvullen tot 50 µL Aanvullen tot 1000 µL -
DNA template 0,1 ng/µL 1 20 0,002 ng/µL
Totaal - 50 1000 -
Tabel 3: PCR-programma
Stappen Temperatuur Tijd (min)
Denaturatie 95˚C 03:00
Annealing 60˚C 02:00
Elongatie 72˚C 01:30
Herhaal stap 2,3 en 4 34-39x
Opslag 4˚C ∞
5
Gelelektroforese
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Agarose gel elektroforese” blz. 20-21
Elektroforese wordt toegepast om de resultaten van de PCR-reactie te analyseren. Dit wordt gedaan
door de mutant en het wildtype van IDH1 in een 1,00% agarose gel te pipetteren. Daarnaast wordt
een 1 kb ladder toegevoegd als een referentiepunt. Door de gel elektroforese uit te voeren, kan er
gekeken worden naar de lengtes van het wildtype en de mutant R314C. Voor het cDNA van zowel het
wildtype als de mutant wordt verwacht dat het cDNA een lengte te heeft van 1271 bp. Rondom deze
waarde zullen er dan ook bandjes zichtbaar zijn in de agarose gel. Om te controleren dat er geen
contaminatie heeft plaatsgevonden wordt er een negatieve controle van mastermix toegevoegd
waarin zich geen cDNA bevindt maar extra milliQ. Bij de negatieve controle wordt daarom verwacht
dat er geen bandjes zichtbaar zijn. Als er wel bandjes zichtbaar zijn is er sprake van contaminatie in
de mastermix.
Materiaal
 Agarose poeder
 TAE 50x Tris 2M, Glacial Acetic Acid 1M, EDTA 50mM, pH 8.0
 Sybr Safe
 Loading buffer
 Magnetron
 Gel casting tray, -kam, en -dam
 Elektroforesebak
 Power suply
 BioRad Gel Doc system & Trans-illuminator
Tabel 4: Pipetteerschema PCR gelelektroforese

Component Stock concentratie Volume per sample (µL) Eind concentratie
PCR product - 10 -
Orange LB 6x 2 1x
Totaal - 12 -
Zuivering van het PCR product

PCR purificatie
Curriculum 2023-2024” “Protocol – DNA/ Gel purification” blz. 23
PCR-purificatie is een belangrijke stap in het zuiveren van het PCR-product. Deze stap wordt
uitgevoerd om alle PCR-materialen die zijn gebruikt om het PCR-product te maken te verwijderen.
Hierdoor zal alleen het zuivere DNA overblijven. Om te bekijken of de purificatie van het PCR-product
heeft gewerkt wordt het PCR-product gemeten met behulp van de Nanodrop. Hierbij wordt verwacht
dat het sample een 260/280 waarde tussen de 1,8 en 2,0 heeft. Deze waarde geeft aan of er nog
overige eiwitten of zouten aanwezig zijn. Bij de 260/230 waarde wordt verwacht dat de waarde van
6
het sample tussen 2,0 en 2,2 ligt. Deze waarde geeft aan of er nog organische verontreinigingen
aanwezig zijn in het PCR-product. Ook wordt er een concentratie van 100 ng/uL verwacht na het
meten van het DNA via de nanodrop.
Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig.
Materiaal
 Ethanol 96-100%
 Isopropanol
 Sodium acetaat 3M pH 5.2
 Microcentrifuge
 Epjes
 Verwarmelement
Restrictie enzym analyse

Restrictie enzym digestie – Insert
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Restriction Enzyme digestion” blz. 18-19
Het gepurificeerde PCR-product van het wildtype bestaat uit het wildtype + primers met RE sites en
het gepurificeerde PCR-product van de mutant bestaat uit de mutant + primers met RE sites. Om
enzym digestie van de insert te kunnen uitvoeren is er een minimale concentratie van 100 ng/uL DNA
nodig. Doordat er nu RE sites bij het PCR-product zitten, kan er een dubbele restrictie-enzym digestie
worden uitgevoerd. Bij de insert digestie worden dezelfde restrictie-enzymen gebruikt als bij de
plasmide digeste. EcoRI en Xhol zijn de restrictie-enzymen die bij de toegevoegde RE sites horen.
Nadat de enzymen het insert geknipt, wordt het insert via ligatie toegevoegd aan het geknipte
plasmide DNA.
Na het knippen van de insert worden er twee fragmenten verwacht. Één fragment van 1255 bp en
één fragment van 12 bp. Het fragment van 1255 bp wordt gebruikt om in de vector te plaatsen.
Om te kijken of de restrictie-enzymen knippen worden er positieve controles gebruikt. Hiervoor

wordt pGFPuv (figuur 4) gebruikt, omdat dit plasmide dezelfde RE sites heeft als de insert. Één van de
positieve controles is een dubbele digestie met EcoRI en Xhol op pGFPuv, hierbij wordt verwacht dat
er twee fragmenten ontstaan van 3042 bp en 302 bp. Ook wordt van beide enzymen een enkele
digestie uitgevoerd op pGFPuv. Hierbij worden wordt voor beide enzymen een grootte van 3341 bp
verwacht. Als laatste wordt er geen digestie uitgevoerd op pGFPuv om te kijken of er contaminatie
aanwezig is van het sample.
7
Figuur 4: pGFPuv vector map
Materiaal
 DNA-template R314C
 Positieve controle: pGFPuv 200 ƞg/µL
 MilliQ
 Reactiebuffer Tango 10X
 Restrictie-enzymen EcoRI en XhoI
 Epjes
 Verwarmingselement
8
Tabe 5: Pipetteerschema dubbel digestie wildtype & R314C
DNA template - 10 1000 ng
Eco RI 1 U/µL 2 2 U per reactie
Xho I 1 U/µL 2 2 U per reactie
Reactie buffer 10 pmol/µL 0,5 0,25 pmol/µL
MilliQ - Aanvullen tot 20 µL -
Totaal - 20 -
Tabel 6: Pipetteerschema geen digestie pGFPuv

Eco RI 1 U/µL - 2 U per reactie
XhoI 1 U/µL - 2 U per reactie
Reactie buffer 10 x 4 2x
Totaal - 20 -
Tabel 7: Pipetteerschema enkele digestie EcoRI pGFPuv

Totaal - 20 -
Tabel 8: Pipetteerschema enkele digestie XhoI pGFPuv

XhoI 1 U/µL 2 2 U per reactie
Totaal - 20 -
Tabel 9: Pipetteerschema dubbel digestie pGFPuv

Totaal - 20 -
9
Gelelektroforese
Om te bekijken of het insert ook goed geknipt is door de restrictie-enzymen wordt er gebruik
gemaakt van gelelektroforese. Met het uitvoeren van dit experiment kan er bekeken worden of het
insert op de juiste plekken is geknipt en hierdoor ook de verwachte grootte heeft van 1255 bp en 12
bp. Dit kan aan de hand van een 1 kb ladder die is toegevoegd als een referentiepunt.
Om te kijken of de restrictie-enzymen hebben geknipt wordt er gebruik gemaakt van een positieve
controle. Hiervoor wordt pGFPuv gebruikt, omdat het plasmide dezelfde RE sites heeft als de insert.
De verwachtingen van de controles zijn dat er bij de dubbel digestie bandjes zijn te zien ter hoogte
van 3042 bp en 302 bp bij de enkele digesties één bandje te zien is ter hoogte van 3341 bp en dat er
bij geen digestie niks te zien is.
Materiaal
 Agarose poeder
 Sybr Safe
 Loading buffer
 Magnetron
 Power suply
Tabel 10: Pipetteerschema insert REA-gelelektroforese

REA product - 10 -
Orange LB 6x 2 1x
Totaal - 12 -
10
Zuivering product restrictie enzym analyse
PCR purificatie
Curriculum 2023-2024” “Protocol – DNA / Gel purification” blz. 23
Nadat de DNA-bandjes bekeken zijn via gelelektroforese wordt het sample gezuiverd. Deze zuivering
zorgt ervoor dat alleen het wildtype en de mutant overblijven in de oplossing. De restrictie-enzymen
en andere onderdelen van de oplossing worden tijdens deze stap verwijderd. Dit wordt gedaan zodat
de oplossing alleen zuiver DNA van het wildtype of mutant bezit. Om te controleren of de zuivering
heeft gewerkt wordt de concentratie met behulp van de Nanodrop gemeten. De verwachte
concentratie zal gelijk zijn aan 10 ng/µL. Door het meten met de Nanodrop kan er bekeken worden of
de oplossing zuiver is. Dit is te zien aan de 260/280 waarde en de 260/230 waarde. Als de 260/280
waarde tussen de 1,8 en 2,0 ligt en de 260/230 waarde tussen de 2,0 en 2,2 ligt betekent dit dat de
oplossing zuiver is.
Materiaal
 Ethanol 96-100%
 Isopropanol
 Sodium acetaat 3M pH 5.2
 Microcentrifuge
 Epjes
 Verwarmelement
11
Maken expressievector
Isolatie plasmide DNA
Spinkolom
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Spin column mini-plasmid DNA isolation from E. coli” blz. 8-9
De spinkolom wordt in dit experiment gebruikt om het plasmide DNA te scheiden van de overige
onderdelen die zich in de E. coli cel bevinden. Door het scheiden van het plasmide DNA van de rest
van de E. coli cel wordt er zuiver plasmide product verkregen. Om na te gaan of er een zuiver product
is verkregen wordt het plasmide DNA gemeten met behulp van de Nanodrop. Met het zuiver
plasmide kunnen er restrictie-enzymen aan toegevoegd worden. Deze restrictie-enzymen knippen
het plasmide DNA op de gewenste plekken waardoor er via ligatie een insert kan worden
toegevoegd. In dit onderzoek wordt er gewerkt met het plasmide pBad/his, deze is te zien in figuur 5.
Figuur 5: pBad/His vector map4
Er is gekozen voor de vector pBad/His A, omdat het antibiotica resistentie bevat en vanwege de
multiple cloning sites. De multiple cloning sites van pBad/His A bevat dezelfde RE sites als dat er bij
de insert is aangehecht tijdens de PCR. Dit zijn EcoRI en Xhol. Aan deze RE sites kan de insert binden
tijdens de ligatie. De antibiotica resistentie is ook belangrijk voor de keuze van de vector. pBad/His A
bevat het resistentie gen voor ampicilline. Hierdoor kan de bacterie met het getransformeerde
plasmide op een plaat worden uitgeplaat met het antibioticum ampicilline, waardoor alleen de
gewilde kolonies zullen groeien op de plaat.
Er wordt verwacht dat de concentratie gelijk zal zijn aan 1000 ng/µL. Ook wordt er verwacht dat de
260/280 waarde tussen de 1,8 en 2,0 ligt en de 260/230 waarde tussen de 2,0 en 2,2 ligt betekent dit
dat de oplossing zuiver is.
12
Materiaal
 Buffer P1 Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8.0, RNase 50 µg/mL
 Buffer P2 NaOH 0,2 M, SDS 1%
 Buffer N3 Guanidine HCl 4M, K-acetate 0,5 M, pH 4.2
 Buffer PE NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, pH 7.5, opgelost in ethanol 80%
 Buffer TE Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0
Restrictie enzym analyse

Restrictie enzym digestie – plasmide
In het begin van dit onderzoek is het plasmide pBad/His (figuur 6) geïsoleerd. Dit geïsoleerde
plasmide zal in dit experiment geknipt worden door restrictie-enzymen EcoRI en XhoI. De restrictie-
enzymen zorgen ervoor dat het plasmide op de gewenste plekken geknipt wordt. Vervolgens kan op
deze geknipte delen van het plasmide, het geknipte insert worden toegevoegd met behulp van
ligatie.
Om te kijken of de gekozen restrictie-enzymen op de verwachte manier het plasmide DNA knippen

wordt er gebruik gemaakt van positieve controles. Hiervoor wordt het plasmide pGFPuv (figuur 7)
gebruikt. Door een dubbel digestie met EcoRI en Xhol, geen digestie, en voor beide enzymen een
enkele digestie uit te voeren op pGFPuv kan dit worden gecontroleerd.
Volgens verwachting zal dit plasmide na het knippen bestaan uit twee fragmenten van 4078 bp en 32
bp lang. Het fragment van 4078 bp wordt later in volgende experiment gebruikt. Deze verwachting
kan worden gecontroleerd met behulp van gelelektroforese.
De verwachtingen voor de positieve controles zijn dat er bij de dubbele digestie twee fragmenten
ontstaan van 3034 bp en 302 bp. Voor beide enkele digesties wordt één fragment verwacht van 3341
bp en voor de geen digestie wordt een fragment van 3337 bp verwacht. Deze verwachtingen kunnen
ook op gel worden gecontroleerd.
13
Figuur 6: pBad/His vector map
Figuur 7: pGFPuv vector map
14
Materiaal
 DNA-template pBad/His 1 µg
 MilliQ
 Restrictie-enzymen EcoRI en XhoI
 Epjes
Tabel 10: Pipetteerschema dubbel digestie pBAD/his

Totaal - 20 -
Tabel 11: Pipetteerschema geen digestie pGFPuv

Totaal - 20 -
Tabel 12.: Pipetteerschema enkele digestie EcoRI pGFPuv

Totaal - 20 -
Tabel 13.: Pipetteerschema enkele digestie XhoI pGFPuv

Totaal - 20 -
15
Tabel 14: Pipetteerschema dubbel digestie pGFPuv
Totaal - 20 -
Gelelektroforese
Nadat het plasmide DNA door restrictie-enzymen is geknipt, worden de geknipte fragmenten hiervan
bekeken via gelelektroforese. Deze stap wordt uitgevoerd zodat er bekeken kan worden of de
restrictie-enzymen wel het plasmide DNA geknipt hebben en of de enzymen ook op de verwachte
plekken geknipt hebben. Dit kan aan de hand van een 1 kb ladder die is toegevoegd als een
referentiepunt. De verwachte lengte van de fragmenten na de dubbele digestie op de vector
pBad/His zijn 4078 bp en 32 bp. Om te achterhalen of er op de juiste plekken is geknipt, wordt er een
dubbele digestie met de restrictie-enzymen EcoRI en Xhol op pGFPuv uitgevoerd. Hierbij worden
twee fragmenten verwacht met de grootte 3034 bp en 302 bp. Ook worden voor beide enzymen
enkele digesties uitgevoerd. Hierbij wordt verwacht dat beide één fragment hebben van 3341 bp. En
als laatste controle is er geen digestie uitgevoerd op pGFPuv, waarbij één fragment van 3337 bp
wordt verwacht.
Materiaal
 Agarose poeder
 Sybr Safe
 Loading buffer
 Magnetron
 Power suply
Tabel 15: Pipetteerschema plasmide REA-gelelektroforese

REA product - 10 -
Orange LB 6x 2 1x
Totaal - 12 -
16
DNA purificatie
Gel purificatie
Curriculum 2023-2024” “Protocol – DNA/ Gel purification” blz. 22-23
Om DNA-fragmenten te isoleren en zuiveren, wordt gel purificatie toegepast. Deze stap is nodig,
omdat al het plasmide DNA op gel is gezet. Tijdens gelelektroforese worden DNA-fragmenten van
elkaar gescheiden op basis van de hoeveelheid baseparen en de lengte van de DNA-fragmenten.
Hierdoor ontstaan verschillende DNA-fragmenten door het verschil in aantal baseparen. Nadat de
gelelektroforese heeft plaatsgevonden worden de banden met behulp van Uv-licht uit de agarose gel
gesneden. De gel die zich om de DNA-fragmenten bevindt wordt doormiddel van verschillende
buffers opgelost en worden daarna verwijderd. Hierdoor blijven alleen de zuivere en geïsoleerde
DNA-fragmenten over. Nadat de DNA-fragmenten zijn geïsoleerd wordt er gekeken naar de
concentratie van de fragmenten door middel van de Nanodrop. De verwachte concentratie van de
verschillende DNA-fragmenten zal gelijk staan aan 10 ng/µL
Materiaal
 Restrictie digestie samples
 Gel Extraction Kit
o Spin kolom
o Binding buffer
o Washing buffer
o Elution buffer
 Wegwerp epjes 1,5 mL
 UV-kabinet
 Verwarmingsblok
 Balans
Creëren van het recombinant-DNA en transformatie van TOP10-cellen

Microbieel transformatie
Voorbereiden van elektro-competente E. coli cellen en BL21(DE3) cellen
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Preparation of electro-competent E. coli cells” blz. 24-25
Om elektroporatie uit te kunnen voeren zijn er eerst verschillende voorbereidingsstappen nodig. Op

het lab worden competente TOP10 cellen gekweekt. Competente cellen zijn instaat om externe DNA-
fragmenten op te nemen en deze toe te voegen aan hun eigen genoom. Doordat deze cellen dit
kunnen zijn ze erg belangrijk voor het onderzoek. De competente E. coli cellen hebben ook een hoge
transformatie efficiëntie, deze efficiëntie betekent dat een hoog percentage van de E. coli cellen het
externe DNA-fragment kan opnemen en tot expressie te brengen in hun eigen genoom. Zelf hebben
deze competente E. coli cellen ook een hoge kloneringstoelating van cDNA. Deze kloneringstoelating
zorgt ervoor dat de bacterie erg succesvol is in het zichzelf vermenigvuldigen.
17
Materiaal
 Glycerol (steriel ) 10%
 IJskoud miliQ water (steriel)
 LB medium
 LB agar plaat met E. coli TOP10 en/of BL21
 Ampicilline 100 mg/mL (stock), 100 µg/mL (eindconcentratie)
 Chlooramfenicol 34 mg/mL (stock), 34 µg/mL (eindconcentratie)
 Recipent host strain E. coli TOP10, BL21
 Steriele Erlenmeyer 500 mL
 Cryo-storage box
Ligatie van DNA-fragmenten

DNA ligatie
Curriculum 2023-2024” “Protocol – DNA ligation” blz. 27-28
DNA-Ligatie wordt gebruikt voor het samenvoegen van twee DNA-fragmenten. Deze fragmenten
worden samengevoegd doordat er fosfordiësterbindingen ontstaan. Deze bindingen worden
gemaakt doordat het enzym ligase aanwezig is in de oplossing. Ligase zorgt ervoor dat de
verbindingen tussen het insert en de vector gemaakt worden. Nadat deze bindingen zijn gemaakt kan
de gastheer zichzelf repliceren. Nadat Ligatie heeft plaats gevonden wordt er verwacht dat de RE
sites dicht hechten. Hierdoor vormt er een fragment van 5.325 basenparen. Dit fragment is te zien in
figuur 8.
Figuur 8: Vector map pBad/His met insert IDH1
18
Om de hoeveelheid insert te bepalen wat nodig is voor de ligatie wordt er gebruik gemaakt van de
formule die te is in figuur 9. Met deze formule kan de verhouding tussen insert en vector in
nanogram bepaald worden.
Materiaal
 DNA-template
 Reactie buffer
 Restrictie-enzymen
 Milli-Q
Tabel 16: Pipetteerschema ligatie

Vector DNA x ng/µL x x ng/µL
Insert DNA x ng/µL x x ng/µL
Ligatie buffer 10 x 2 1x
T4 DNA ligase 1 Weiss unit/µL 1 1 Weiss unit/sample
Totaal - 20 -
19
Elektroporatie E. coli cellen
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Electroporation of E. coli” blz. 25-26
Om het celmembraan van de bacteriën tijdelijk open te maken wordt er elektroporatie toegepast.
Deze techniek geeft een heat-shock aan de bacterie waardoor het celmembraan tijdelijk opengaat
door denaturatie. Doordat het celmembraan tijdelijk open is kan het DNA naar binnen gaan. Deze
methode wordt toegepast bij de TOP10 cellen, zodat het geligeerde cDNA naar binnen kan worden
gedwongen. Voor een betrouwbaar resultaat worden de bacteriën 2x op plaat gezet met
verschillende concentraties. Bij het succes van deze methode worden de cellen gekloneerd in de
TOP10 cellen. Dit wordt gecontroleerd door middel van kolonie PCR en door het uitplaten van de
cellen.
Verwachte resultaten bij het uitplaten van de E. coli cellen:
 E. coli TOP10 + wildtype + ampicilline (1e concentratie) --> groei

 E. coli TOP10 + wildtype + ampicilline (2de concentratie) --> groei
 E. coli TOP10 + R314C + ampicilline (1e concentratie) --> groei
 E. coli TOP10 + R314C + ampicilline (2de concentratie) --> groei
Controles die worden gebruikt bij elektroporatie:
 E. coli TOP10 + pGFPuv+ ampicilline (1e concentratie) = groei+ fluorescentie onder UV-lamp
 E. coli TOP10 + pGFPuv+ ampicilline (2de concentratie) = groei+ fluorescentie onder UV-lamp
 Lege E. coli TOP10 cellen zonder elektroporatie, zodat er gekeken kan worden of er cellen
kapot zijn geraakt tijdens het competent maken.
 Lege E. coli TOP10 cellen + ampicilline zonder elektroporatie, zodat er gekeken kan worden
of de lege cellen resistent zijn tegen ampicilline.
 Lege E.coli TOP10 getransformeerde cellen, zodat er gekeken kan worden of de cellen de
transformatie hebben overleefd.
Materiaal
 Ampicilline 100 mg/mL
 Chlooramfenicol 34 mg/mL
 Electrocompetent E. coli TOP10
 Ligatie-mix/plasmide 10 ƞg/µL
 pGFP-UV 10 ƞg/µL
 SOC medium SOB medium 1 mL, 20 µL glucose 1M
 LB agar platen
 LB medium
 Electroporation cuvetten 1mm
20
Kolonie PCR
Curriculum 2023-2024” “Protocol – colony PCR” blz. 15-17
Kolonie PCR is een experiment om te controleren of het plasmide waar de vector en insert inzit zich
in de gastheercel bevindt. Hierbij wordt er gekeken of het IDH1 wildtype en het R314C mutant zich
goed hebben geligeerd met de vector pBAD/his. Ook wordt hierbij bekeken of de gastheer de
plasmide goed heeft overgenomen en gekopieerd.
De kolonie PCR wordt op dezelfde manier uitgevoerd als een normale PCR. Er zal alleen geen DNA-
template in de samples aanwezig zijn. Het DNA-template wordt vervangen door een
getransformeerde gastheerbacterie. Deze bacterie is op een agar-plaat gegroeid.
Voor dit experiment wordt het pipetteerschema uit tabel 17 gebruikt. Voor zowel het wildtype als de
mutant worden twee epjes gebruikt. In elk daarvan zit een verschillende primer set. Ook wordt er
gebruik gemaakt van een negatieve controle bestaande uit de mastermix met extra milliQ.
Het PCR-programma wordt in elkaar gezet door naar de grootte van de template te kijken. En wordt
te smelttemperatuur van de gekozen primers bepaald. Er worde twee primersets gebruikt per DNA-
variant (wildtype + R314C mutant). De eerste primer set is een mix van een forward IDH1 primer en
een reverse IDH1 primer. De tweede primer set is een mix van een forward pBAD/his primer en een
reverse pBAD/His primer deze zijn weergegeven in tabel 19.
Nadat de kolonie PCR is uitgevoerd wordt er voor primer set 1 (Forward IDH1 primer + Reverse IDH1
primer) een fragment met de grootte 1271 bp en voor primer set 2 (Forward pBAD/His primer +
Reverse pBAD/His primer) een fragment met de grootte 4054 bp. Dit kan worden gecontroleerd met
behulp van de gelelektroforese.
Materiaal
 Reactie buffer zonder MgCl2 10x
 MgCl2 25 mM
 dNTP 2,5 mM
 Forward primer 1232 en 1082 10 pmol/µL
 Reverse primer 1233 en 1083 10 pmol/µL
 Taq polymerase 1 U/µL
 cDNA template R314C of Wildtype 0,1 ƞg/µL
 LB medium
 Ampicilline 100 mg/mL (stock), 100 µg/mL (eindconcentratie)
 Chlooramfenicol 34 mg/mL (stock), 34 µg/mL (eindconcentratie)
 PCR tubes (0,2 mL)
 Thermocycler
21
Tabel 17: Pipetteerschema kolonie PCR
Component Stock concentratie Volume per sample (µL) Master mix (µL) Eind concentratie
Reactie buffer (zonder MgCl2) 10 x 2,5 12,5 1x
MgCl2 25 mM 4 20 4 mM
dNTP's 2,5 mM 2 10 0,2 mM
Forward primer 10 pmol/µL 1 5 0,4 pmol/µL
Reverse primer 10 pmol/µL 1 5 0,4 pmol/µL
Taq Polymerase 1 U/µL 0,5 2,5 0,02 U/µL
MilliQ - Aanvullen tot 25 µL Aanvullen tot 125 µL -
Kolonie - 12,5 62,5 -
Totaal - 25 125 -
Tabel 18: Kolonie PCR programma

Stappen Temperatuur Tijd (min)
Annealing 57˚C 02:00
Herhaal stap 2,3 en 4 34-39x
Opslag 4˚C ∞
Tabel 19: Gebruikte primers kolonie PCR

Nr Gen Forward/Reverse Expressie vector Sequence RE site Tm
1232 IDH1 Forward pET15b/pBAD His A 5'ATTATTCCTCGAGATGTCCAAAAAAATCAGTGGCG'3 XhoI 69,2
1233 IDH1 Reverse pET15b/pBAD His A 5'ATTATTCGAATTCTTAAAGTTTGGCCTGAGCTAGTTTG'3 Eco RI 66,0
1082 - Forward pBAD-his 5'ATGCCATAGCATTTTTATCC'3 - 49,0
1083 - Reverse pBAD-his 5'CTGATTTAATCTGTATCAGG'3 - 47,0
Gelelektroforese
Na het uit te voeren van de kolonie PCR wordt het cPCR bekeken door middel van gelelektroforese.
Doordat cPCR alleen wordt uitgevoerd om de oriëntatie van het recombinante DNA te bekijken
wordt al het cPCR in de gelelektroforese gestopt. Nadat de gel gerund heeft wordt er bekeken of de
resultaten van het cPCR gelijk staan aan de verwachte resultaten. Dit kan worden gedaan aan de
hand van een 1 kb ladder die is toegevoegd als een referentiepunt. Hierbij wordt verwacht dat er een
bandje te zien is ter hoogte van 1271 bp voor primer set 1 en een bandje te zien is ter hoogte van
4054 bp voor primer set 2. Ook wordt er verwacht dat er geen bandje te zien is bij de negatieve
controle.
22
Materiaal
 Agarose poeder
 Sybr Safe
 Loading buffer
 Magnetron
 Power suply
Tabel 20: Pipetteerschema gelelektroforese kolonie PCR

REA product - 10 -
Orange LB 6x 2 1x
Totaal - 12 -
Spinkolom
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Spin column mini-plasmid DNA isolation from E. coli” blz. 8-9
De spinkolom wordt in dit experiment gebruikt om het plasmide DNA te scheiden van de overige
onderdelen die zich in de E.coli cel bevinden. Door het scheiden van het plasmide DNA van de rest
van de E.coli cel wordt er een zuiver plasmide product verkregen. Om na te gaan of er een zuiver
product is verkregen wordt het plasmide DNA gemeten met behulp van een Nanodrop. Hierbij wordt
verwacht op een opbrengst van 100 ng/µL, een 260/280 waarde tussen de 1,8 en 2,0 en een 260/230
waarde tussen de 1,8 en 2,2. Met dit zuivere plasmide product kunnen er restrictie-enzymen eraan
worden toegevoegd. Deze restrictie- enzymen knippen het plasmide DNA op de gewenste plekken.
Materiaal
 Buffer P1 Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8.0, RNase 50 µg/mL
 Buffer P2 NaOH 0,2 M, SDS 1%
 Buffer N3 Guanidine HCl 4M, K-acetate 0,5 M, pH 4.2
 Buffer PE NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, pH 7.5, opgelost in ethanol 80%
 Buffer TE Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0
23
Restrictie-enzym digestie
Nadat het cPCR door een spinkolom is geweest en daardoor het plasmide is geïsoleerd wordt er een
restrictie-enzym digestie uitgevoerd. Dit experiment wordt toegepast om te zorgen dat het nu
zuivere cPCR goed wordt samengevoegd met de plasmide-vector. Tijdens deze digestie wordt er
gebruik gemaakt van de restrictie-enzymen EcoRI en XhoI. Deze enzymen worden toegepast om te
bekijken of het insert tijdens de ligatie goed is geligeerd. Hiernaast worden ook nog de enzymen
EcoRI en EcoRV gebruikt om de oriëntatie van het insert te bekijken in het recombinante DNA. Hierbij
wordt een verwacht dat er twee fragmenten ontstaan met de grootte 4078 bp en 1255 bp. De de
controle worden geen fragmenten verwacht.
Materiaal
 DNA template pBad/His 1 µg
 MilliQ
 Restrictie-enzymen EcoRI EcoRV en XhoI
 Epjes
Tabel 21: Pipetteerschema REA

Xho I 1 U/µL 2 2 U per reactie
Totaal - 20 -
Gelelektroforese
De enzym digestie zal bekeken worden via gel elektroforese. Dit kan aan de hand van een 1 kb ladder
die als referentiepunt is toegevoegd. Hierbij wordt er verwacht dat de DNA-bandjes van de samples
te zien zijn rond de 4078 bp en 1255 bp. Bij de controle die is toegevoegd wordt geen bandje
verwacht.
24
Materiaal
 Agarose poeder
 Sybr Safe
 Loading buffer
 Magnetron
 Power suply
Transformatie in BL21(DE3) cellen

Transformatie in BL21(DE3) cellen
Curriculum 2023-2024” “Protocol – Electroporation of E. coli” blz. 25-26
Doordat de restrictie-enzym digestie is toegepast wordt het recombinante DNA in BL21(DE3) cellen
getransformeerd. Dit wordt gedaan zodat er over expressie plaats vindt in de geïnteresseerde genen.
Transformatie wordt uitgevoerd met behulp van elektroporatie.
Materiaal
 Ampicilline 100 mg/mL
 Chlooramfenicol 34 mg/mL
 Electrocompetent E. coli TOP10/BL21
 Ligatie-mix/plasmide 10 ƞg/µL
 pGFPuv 10 ƞg/µL
 SOC medium SOB medium 1 mL, 20 µL glucose 1M
 LB agar platen
 LB medium
 Elektroporatie cuvetten 1mm
25
Flowchart
26
Veiligheid
Stof Afval Veiligheidsmaatregele Toelichting
n
Sybr Safe Sybr Safe Handschoenen en Sybr Safe is
zuurkast kankerverwekkend
Binding Buffer Prullenbak Handschoenen -
Supernatant TOP10 Biohazard - Potentieel
besmettelijk materiaal
dus moet worden
geautoclaveerd
Bacterieculturen Biohazard - Potentieel
besmettelijk materiaal
dus moet worden
geautoclaveerd
UV-kamer - Draag een bril met UV licht kan gevaarlijk
oranje glazen zijn, zorg ervoor dat er
zo kort mogelijk met
het Uv-licht wordt
gewerkt
27
Tijdschema
Datum Experiment Tijd (uur)
28-08-2023 Mastermix maken 00:45
PCR runnen 04:00
LB medium en LB agar maken 00:45
29-08-2023 Agaraose gel klaar maken voor 01:15
gelelektroforese
PCR laten runnen op gel 02:00
Gelelektroforese analyseren 00:30
Agarplaten gieten en beënten 00:45
met pBad/his
Overnachtcultuur maken 00:45
pBad/his
Plasmide isoleren 02:00
Geïsoleerde plasmide 00:15
analyseren met de nanodrop
04-09-2023 Enzym digestie uitvoeren op 03:15
plasmide DNA
Competente E. coli cellen 01:30
voorbereiden
Voorbereiden BL21 cellen 02:30
05-09-2023 E. coli cellen competent maken 03:00
Plasmide op gel laten runnen 03:30
en analyseren
Gelpurificatie 01:00
11-9-2023 REA op PCR product 03:00
Purificatie REA producten 02:15
12-09-2023 Ligatie van insert en vector 03:15
18-09-2023 Electroporatie E. coli top 10 en 02:30
recombinant DNA
Uitplaten getransformeerde 01:00
cellen + controles
19-09-2023 Kolonie PCR uitvoeren 04:15
Overnachtcultuur en platen 00:45
maken
26-09-2023 cPCR gelelektroforese en 03:15
resultaten analyseren
02-10-2023 Plasmide isolatie 02:00
03-10-2023 Restrictie-enzym analyse 03:30
Analyse op gel 02:00
10-10-2023 Transformatie BL21(DE3) 03:30
E. coli cellen en uitplaten
Totaal aantal uren 59:00
28
Referentielijst
1. Bogdanovic E. (2015). IDH1, lipid metabolism and cancer: Shedding new light on old
ideas. Biochimica et biophysica acta, 1850(9), 1781–1785.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2015.04.014
2. Yang, H., Ye, D., Guan, K. L., & Xiong, Y. (2012). IDH1 and IDH2 mutations in tumorigenesis:
mechanistic insights and clinical perspectives. Clinical cancer research : an official journal of
the American Association for Cancer Research, 18(20), 5562–5571.
https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-12-1773
3. van Lith, S. A., Navis, A. C., Lenting, K., Verrijp, K., Schepens, J. T., Hendriks, W. J., Schubert, N.
A., Venselaar, H., Wevers, R. A., van Rooij, A., Wesseling, P., Molenaar, R. J., van Noorden, C.
J., Pusch, S., Tops, B., & Leenders, W. P. (2016). Identification of a novel inactivating mutation
in Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1-R314C) in a high grade astrocytoma. Scientific reports, 6,
30486. https://doi.org/10.1038/srep30486
4. PBAD/HIS Kit. (z.d.). https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V43001
29

Plan Van Aanpak Robin Rossen en Tessa Van Dalen BML2W

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Plan Van Aanpak Robin Rossen en Tessa Van Dalen BML2W

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Plan van aanpak

Tessa van Dalen |Robin Rossen

Figuur 1: Citroenzuurcyclus, de omzetting van

IDH1 maakt deel uit van een groep enzymen genaamd

Er zijn verschillende mutaties van IDH1 en IDH2,

Normaal gesproken zet IDH1 isocitraat om in

Figuur 3: Puntmutatie in IDH1 gen R314C3

Onderstaand is de sequentie van is IDH1 wildtype weergegeven.

Sequentie IDH1 wildtype

Tabel 1: Gebruikte primers PCR

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 2.: Pipetteerschema PCR

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 4: Pipetteerschema PCR gelelektroforese

Zuivering van het PCR product

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig.

Restrictie enzym analyse

Om te kijken of de restrictie-enzymen knippen worden er positieve controles gebruikt. Hiervoor

Tabel 6: Pipetteerschema geen digestie pGFPuv

Tabel 7: Pipetteerschema enkele digestie EcoRI pGFPuv

Tabel 8: Pipetteerschema enkele digestie XhoI pGFPuv

Tabel 9: Pipetteerschema dubbel digestie pGFPuv

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 10: Pipetteerschema insert REA-gelelektroforese

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Figuur 5: pBad/His vector map4

Restrictie enzym analyse

Om te kijken of de gekozen restrictie-enzymen op de verwachte manier het plasmide DNA knippen

Figuur 7: pGFPuv vector map

Tabel 10: Pipetteerschema dubbel digestie pBAD/his

Tabel 11: Pipetteerschema geen digestie pGFPuv

Tabel 12.: Pipetteerschema enkele digestie EcoRI pGFPuv

Tabel 13.: Pipetteerschema enkele digestie XhoI pGFPuv

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 15: Pipetteerschema plasmide REA-gelelektroforese

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Creëren van het recombinant-DNA en transformatie van TOP10-cellen

Om elektroporatie uit te kunnen voeren zijn er eerst verschillende voorbereidingsstappen nodig. Op

Ligatie van DNA-fragmenten

Figuur 8: Vector map pBad/His met insert IDH1

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 16: Pipetteerschema ligatie

Verwachte resultaten bij het uitplaten van de E. coli cellen:

 E. coli TOP10 + wildtype + ampicilline (1e concentratie) --> groei

Controles die worden gebruikt bij elektroporatie:

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig.

Tabel 18: Kolonie PCR programma

Tabel 19: Gebruikte primers kolonie PCR

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 20: Pipetteerschema gelelektroforese kolonie PCR

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Tabel 21: Pipetteerschema REA

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig:

Transformatie in BL21(DE3) cellen

Om het experiment uit te voeren zijn onderstaande materialen nodig.

4. PBAD/HIS Kit. (z.d.). https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V43001

You might also like