GIDA ANALİZLERİ-II DERSİ

Uygulama Konusu: Askorbik Asit Analizi

Askorbik asit bilindiği gibi antiskorbutik bir vitamindir. Eksikliği kılcal damar çeperlerinin zayıf
bir yapı kazanmasına, diş etlerinin kolaylıkla kanamasına dişlerin gevşemesine ve eklem
hastalıklarına neden olmaktadır. Ayrıca cildin ve bağ dokuların önemli bir unsuru olan kollagen
ile proteinin normal oluşumu için gerekli bulunmaktadır. Askorbik asit vücudun birçok
hastalıklara karşı direncini artırmaktadır. Askorbik asidin günlük ihtiyaç miktarı, 30-45 mg
arasında değişmektedir.

Askorbik asit, bitkisel kökenli gıdaların içerdiği temel vitamindir. En zengin askorbik asit
kaynakları; turunçgiller, domates, yeşil biber ve lahanadır. En fazla miktarda kuşburnu
meyvelerinde bulunmakla birlikte bunun yaygın bir tüketimi olmadığından insan için önemli bir
kaynak sayılmaması gerekir. Ülkemizde normal koşullarda askorbik asit yetersizliğine
rastlanmamaktadır.

Askorbik asit, oksidasyonla ve ayrıca özellikle yüksek sıcaklıklarda termik yolla çok kolaylıkla
parçalanır. Gıdaların işlenmesi, depolanması ve pişirilmesinde en fazla kaybolan vitamin
askorbik asittir. Çeşitli işlemlere bu kadar duyarlı olması nedeniyle gıdalara uygulanan birçok
işlemin olumsuz etkisinin belirlenmesinde askorbik asitteki kayıp miktarı bir ölçüt olarak
kullanılmaktadır.

Gerçekte askorbik asit kristalleri kuru koşullarda ve normal oda sıcaklığında. hem gün ışığına
ve hem de hava oksijenine karşı uzun süre oldukça dirençlidir. pH 7.6'nın altındaki sulu
çözeltilerde, eğer ortamda bakır iyonları gibi reaksiyonu katalize eden metal iyonları
bulunmuyorsa hava oksijenine yine de oldukça dirençlidir. Ancak eğer ortamda uygun bir
katalizatör varsa, askorbik asit, hava oksijeni ile derhal okside olarak dehidroaskorbik aside
dönüşmektedir. Oluşan dehidroaskorbik asit. pH 4.0'ün altında az da olsa stabil olmakla
birlikte. pH 4.0'ün üstünde artık biyolojik bir aktivitesi olmayan daha ileri aşamadaki ürünlere
dönüşmektedir. Bilindiği gibi dehidroaskorbik asit, insan vücudunda kolaylıkla askorbik aside
indirgenebilmektedir. Askorbik asit kaybı, yukarda anlatıldığı şekilde kimyasal yolla
gerçekleştiği gibi, biyokimyasal yolla da olmaktadır. Nitekim bitkisel dokularda yaygın olarak
bulunan askorbik asit oksidaz enzimi, askorbik asidin enzimatik yolla oksidasyonuna neden
olmaktadır. Bu nedenle bu enzim, askorbik asit kaybında rol oynayan en önemli faktör olarak
kabul edilmektedir. Böylece parçalanmış bir meyve veya sebzede örneğin preslenerek elde
edilmiş bir turunçgil suyunda hızla gerçekleşen askorbik asit kaybının nedeni, açıkça ortaya
çıkmaktadır. Bu kaybın önlenmesi bu enzimin ısı uygulanarak hemen inaktive edilmesiyle
sağlanabilmektedir.

Askorbik asidin oksidasyon-redüksiyon açısından gösterdiği özelliklerden yararlanarak birçok

analiz yöntemi geliştirilmiştir. Bunların hemen hepsinde temel ilke askorbik asit tayini yapılacak
materyalden önce asidik bir ekstrakt hazırlanması ve sonra, uygun bir oksitleyici bileşik
kullanarak bu ekstraktın indirgeme gücünün belirlenmesidir. Oksitleyici bileşik olarak başta,
2,6-diklorofenolindofenol veya iyot kullanılmaktadır.
Spektrofotometrik Yöntem

Askorbik asit, 2,6-diklorofenolindofenolü indirgeyerek rengini gidermektedir. Buna göre;

askorbik asit bulunan ortama eklenen 2,G-diklorofenolindofenol çözeltisinin rengi, askorbik asit
miktarıyla orantılı olarak giderilmekte geri kalan indirgenmemiş 2,6-diklorofenolindofenol
ksilenle ekstrakte edildikten sonra Spektrofotometrede absorbans değeri saptanmaktadır. Bu
yolla örnekteki askorbik asit miktarı belirlenebilmektedir. Doğal renk maddeleri ksilende
çözünmediğinden bu yöntem renkli örneklere kolaylıkla uygulanabilmektedir.

Ayraç ve gereçler

Asetat tampon, pH 4.0 : 300 g susuz sodyum asetat (CH3COONa) veya 497.5 g kristal sulu
sodyum asetat (CH3COONa.3H2O) tartılıp, üzerine 700 mL su ve 1000 mL glasiyal asetik asit
eklenir.
2- diklorofenolindofenol çözeltisi (boya çözeltisi) : 2.6-diklorofenolindofenol'ün sodyum
tuzundan, 25 mg tartılıp, ılık damıtık suda çözündürülür. Filtre edilerek damıtık su ile 200 mL'ye
tamamlanır.

Ksilen : Analitik saflıkta olması ve okside edici unsurlar taşımaması gerekir. Bunu test etmek
için, az miktarda boya çözeltisine askorbik asit ekleyerek rengi giderilir. Üzerine 5 mL ksilen
eklenip kuvvetle çalkalanır ve 10 dakika sonunda ksilen tabakasında hiçbir renk görülmezse
ksilen amaca elverişli demektir. Ksilenden tasarruf için analizde kullanılmış ksilene, %20'Iik
NaOH çözeltisi eklenip iyice çalkalandıktan sonra (böylece asetik asit nötralize edilmiş olur)
damıtılır. Damıtma 136°-138°C'ler- de gerçekleşir. Bu şekilde geri kazanılan ksilen tekrar
kullanılabilir.

Metafosforik as8it çözeltisi : 60 g HPO3 ısıtılmaksızın 900 mL damıtık su içinde çözündürülür.

Sonra 1 litreye tamamlanır ve buzdolabında saklanır.

Askorbik asit standart çözeltisi : 100 mg askorbik asit, %6'lık HPO3 çözeltisinde çözündürülüp
100 mL'ye tamamlanır.

İşlem
Örneğin analize hazırlanması : Bir blenderin haznesine 200 g %6'lık metafosforik asit konur ve
üzerine aynı ağırlıkta materyal eklenip, blender çalıştırılarak homojen bir ezme haline getirilir.
Eğer analiz taze bir meyvenin suyunda yapılmak isteniyorsa, materyal istenilen oranda
seyreltilmelidir.
Boya çözeltisinin örnekteki askorbik asitle indirgenmesi :
Bu aşama 2 paralel hazırlanır. Ancak aşağıda anlatım kolaylığı için tüpün birisi yokmuş gibi
1. Tüp, 2 tane (örnek) 2. Tüp, 1 tane (kör)
a b a
Örnek filtratı, mL 5 5 %6’lık HPO3, mL 5
Asetat tamponu, mL 5 5 Asetat tamponu, mL 5
Boya, mL 1 1 Boya, mL 1
Hafifçe çalkalanır Hafifçe çalkalanır
açıklama yapılmıştır.

 Bir tüpe (tüp-1) alınan filtrat(Örnek) miktarına eşdeğer miktarda %6'lık HPO3 çözeltisi
konur. Bu tüp, "tüp-2" olarak simgelenir. Bir deney serisinde bundan bir tane
hazırlanması yeterlidir.
 Her iki tüpe, içindekilerin hacmine eşit miktarda asetat tampon çözeltisi konulur. Bunu
takiben derhal her ikisine 2 mL boya çözeltisi eklenip hafifçe sallanarak, tam anlamıyla
karıştırılır.

 Her tüpe derhal 10 mL ksilen ekleyip, tüpün ağzı kapatıldıktan sonra, kuvvetli bir şekilde
6-10 saniye süreyle çalkalanıp boyanın arta kalanı ekstrakte edilir.
 Her tüpün içeriği santrifüj yapılarak katmanlar ayrılır.
 Ksilen katmanı dikkatle alınarak spektrofotometre küvetine aktarılır. Ksilen tabakasının
rengi direkt güneş ışığından korunursa, saatlerce stabil kalmaktadır.

Spektrofotometrik Ölçüm

 Tüp-1 ve tüp-2'den ekstrakte edilmiş renkli ksilen tabakalarının absorbansı 500 nm'de,
ksilene karşı okunur. Tüp-1 'in absorbansı A1 ve Tüp-2'nin absorbansı A2 olarak
simgelenip kaydedilir.
 A2 değeri daima A1’den yüksektir ve aradaki fark, örneğin askorbik asit içeriği ile
ilgilidir. Bu ilgi askorbik asit standart eğrisi yardımıyla aşağıda açıklandığı gibi belirlenir.

Askorbik asit standart eğrisinin hazırlanması

 Askorbik asit standart çözeltisinden 20 mL alınıp %6 HPO3 çözeltisiyle 200 mL'ye
tamamlanarak seyreltilir. Bu çözelti 0.1 mg/mL düzeyinde askorbik asit içerir.
 8 tane 100 mL balon alınıp, bunlara seyreltik askorbik asit çözeltisinden sıra ile, 4, 6,
8, 10, 15, 20, 25 ve 30 mL aktarılır. Böylece her balona sıra ile 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5,
2.0 ve 2.5 mg askorbik asit aktarılmış olur. Balonlar %6'lık HPO3 ile hacmine
tamamlanırlar. Bu şekilde elde edilen çözeltilerin mL'sinde sıra ile 0.004, 0.006, 0.008,
0.01, 0.015, 0.02 ve 0.025 mg askorbik asit bulunur.
 Askorbik asit içeren bu standart çözeltilerin her birine, yukarıda "boya çözeltisinin
askorbik asit/e indirgenmesî' başlığı altında verilen işlemler sıra ile aynı şekilde
uygulanır ve her birinden elde edilen ksilen ekstraktlarının absorbansı ölçülüp (As)
simgesiyle kaydedilirler. Bir tane de tüp-2 (şahit) deneyi yürütülüp, ona ait absorbans
değeri (At) olarak kaydedilir.
 Her konsantrasyon için saptanan (At - As) farkı, askorbik asit konsantrasyonlarına
(mg/L) karşı bir grafiğe aktarılarak, "askorbik asit standart eğrisi" elde edilir. Standart
eğri, orijinden geçen doğrusal bir eğridir. Deneyde elde edilmiş değerlere linear
regresyon analizi uygulanarak eğrinin eğimi (a) hesaplanır.
Hesaplama

Ömekteki askorbik asidin hesaplanması için önoelikle seyreltme faktörünün (sf) hesap-
lanması gerekmektedir. Bunun için aşağıdaki eşitlikten yararlanılır
+
= ×

Sf : Seyreltme faktörü
W : Orijinal örnek miktarı (g)
H : Orijinal örneğe eklenen metafosforik asit miktarı (g)
M : Örnek + metafosforik asit homojenatından alınan miktar (g veya mL)
V : M homojenatının tamamlandığı hacim (mL)

Sf değeri hesaplandıktan sonra örnekteki askorbik asit miktarı aşağıdaki eşitlik yardımıyla
hesaplanır.
( 2 − 1)
( )= ×

A1 : Örnek tüpünde saptanan absorbans değeri

A2 : Şahit tüpünde saptanan absorbans değeri

Sf : Seyreltme faktörü

A: Askorbik asit standart eğrisinin eğimi

Not: Uygulama dersine gelirken önlüklerinizi mutlaka getiriniz. Teşekkürler.