Курсова робота Висоцький БТ 3 2

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ
УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ
Кафедра біотехнології і мікробіології
КУРСОВА РОБОТА
з дисципліни «Методи контролю біотехнологічних, фармацевтичних та харчових

виробництв»
на тему: «Біосинтез біомаси Mesorhizobium ciceri для виготовлення добрива

Bionitro нут»
Здобувача (ки) ___3__ курсу ___2___ групи

спеціальності__162 «Біотехнології та
біоінженерія»_________________________
___________Висоцький О.І______________
(прізвище та ініціали, підпис)
Керівник, Доцент:
__________Красінько В.О.______________
(посада, вчене звання, науковий ступінь, прізвище та ініціали)
Національна шкала ____________________

Кількість балів:______Оцінка: ECTS _____
Члени комісії
________________ ____________________
(підпис) (прізвище та ініціали)
________________ ____________________
________________ ____________________
м. Київ – 2024 рік

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ
Факультет БТЕК
Кафедра Біотехнохнології та мікробіології
Спеціальність 162 «Біотехнології та біоінженерія»
ЗАВДАННЯ
на курсовий проект (роботу) здобувачеві
Висоцький Олег Ігорович
(прізвище, ім’я, по батькові)
1. Тема проекту (роботи)
Біосинтез біомаси Mesorhizobium ciceri для виготовлення добрива Bionitro нут
2. Термін здачі здобувачем закінченого проекту (роботи) 26 квітня 2024 р.

3. Вихідні дані до проекту (роботи)
Вихідні дані до проекту (роботи) вид бактерії Mesorhizobium ciceri ND-64, об'єм
ферментера 3,2 м3, коефіцієнт заповнення 0.6
4. Зміст розрахунково-пояснювальної записки (перелік питань, що їх

належить розробити):
РОЗДІЛ 1. Характеристика цільового продукту. РОЗДІЛ 2. Обґрунтування вибору біологічного
агента, складу поживних середовищ. РОЗДІЛ 3. Обґрунтування вибору технологічної схеми.
РОЗДІЛ 4. Опис технологічної схеми. РОЗДІЛ 5. Контроль виробництва
5. Перелік графічного матеріалу(з точним зазначенням обов’язкових

креслень):
Технологічна схема біосинтезу біомаси Mesorhizobium ciceri ND-64 на 1 аркуші формату А3
2
3
КАЛЕНДАРНИЙ ПЛАН
Пор. Назва етапів виконання проекту (роботи) Термін виконання Примітка

№ етапів проекту
(роботи)
1 Характеристика цільового продукту. 15.01.2024 –
26.01.2024
2 Обґрунтування вибору біологічного агента, складу 27.01.2024 –
поживних середовищ. 23.02.2024
3 Обґрунтування вибору технологічної схеми. 24.02.2024 –
08.03.2024
4 Опис технологічної схеми. 09.03.2024 –
05.04.2024
5 Контроль виробництва. 06.04.2024 –
19.04.2024
6 Вступ, реферат, список використаної літератури. 20.04.2024 –
26.04.2024
7 Креслення технологічної схеми. 09.03.2024 –
19.04.2024
Дата видачі завдання “15” січня 2024р.
Здобувач :
(підпис)
Керівник проекту (роботи) :

(підпис)
4
Реферат
Ця курсова робота присвячена розробці технологічної схеми біосинтезу
бактеріального добрива з використанням нового штаму бульбочкових
азотфіксувальних бактерій Mesorhizobium ciceri ND-64 . На основі широкого
аналізу та порівняння закордонних та відчизнянних високоефективних
штамів M. ciceri, складу поживних середовищ для їх культивування,
активності нітрогеназного комплексу та результатах у польових,
дослідженнях було обрано штам M. ciceri ND-64, який відзначається
дешевістю поживного середовища для культивування та високою
ефективністю симбіозу на широкому спектрі різновидів нуту. Технологічна
схема біосинтезу добрива включає підготовчі роботи (підготовка розчину
соляної кислоти для підкислення середовища під час стерилізації, підготовка
розчину NaOH, для контролю pH середовища, приготування горохового
бульйону та його подальша фільтрація, стерилізація композицій поживних
середовищ) та основний технологічний процес (три стадії вирощування
посівного матеріалу та біосинтез у ферментері об’ємом 3.2 м³ з коефіцієнтом
заповнення 0,6). Технологія виробництва добрива передбачає використання
одностадійної схеми культивування глибинним періодичним способом.
Курсова робота складається з вступу, п’яти розділів, списку

використаних джерел та технологічної схеми (формат А3). Загальний обсяг
роботи – 58 сторінок, 5 рисунків, 9 таблиць.
5
Зміст
НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ.................................................2
К А Л Е Н Д А Р Н И Й П Л А Н..........................................................................................................3
Реферат......................................................................................................................................................4
ВСТУП......................................................................................................................................................6
РОЗДІЛ 1: Загальна характеристика бактеріального добрива BiNitro Нут ENZIM Agro.........8
РОЗДІЛ 2: Обґрунтування вибору біологічного агента..................................................................10
2.1. Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його
культивування...................................................................................................................................10
2.2. Розрахунок потенційної максимальної біомаси, яку можливо отримати на
запропонованій суміші ростових субстратів для культивування Mesorhizobium ciceri ND-64
..............................................................................................................................................................20
РОЗДІЛ 3. Обґрунтування умов і способу культивування біологічного агента та підготовки
поживного середовища.........................................................................................................................22
3.2. Вибір типу ферментера..............................................................................................................22
3.4. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для культивування M.
ciceri ND-64..........................................................................................................................................26
РОЗДІЛ 4. Опис технологічної схеми біосинтезу цільового продукту.........................................31
РОЗДІЛ 5. КОНТРОЛЬ ДОПОМІЖНИХ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНИХ СТАДІЙ
КУЛЬТИВУВАННЯ M.CICERI...........................................................................................................45
5.1 Визначення концентрації цільового продукту (Біодобрива на основі Mesorhizobium
ciceri) За допомогою спектрофотометрії........................................................................................45
5.2 Контроль азотного живлення:...................................................................................................47
5.3 Методика визначення концентрації вуглецевого субстрату................................................49
Загальний принцип...........................................................................................................................49
5.4 Методика мікробіологічного контролю стерильності поживного середовища................51
СПИСОК ВИКОРИСТАННИХ ДЖЕРЕЛ........................................................................................55
ДОДАТКИ...............................................................................................................................................60
6
ВСТУП
Вирощування бобових культур, таких як соя, квасоля, нут, горох,
люцерна та інші, є одним з ключових елементів продовольчої безпеки на
глобальному рівні. Це зумовлено тим, що високий вміст білка, його
біологічна цінність та низька вартість роблять бобові рослини важливим
засобом для подолання дефіциту білка в харчуванні людей і тварин, особливо
в країнах, що розвиваються.[10] Бактерії роду Rhizobium є симбіотичними
азотфіксаторами, кожен вид яких має специфічну рослину-хазяїна, з якою
відбувається симбіоз. Зокрема, для Mesorhizobium ciceri таким хазяїном є нут.
Симбіоз реалізується через утворення бульбочок на коренях бобових рослин,
де колонії M. ciceri отримують вуглеводи у вигляді маніту та забезпечують
рослину значною кількістю фіксованого азоту у формі урейдів.[13]
Сьогодні використання добрив на основі азофіксуючих симбіотичних

бульбочкових бактерій є розповсюдженою практикою у майже всіх регіонах
світу, оскільки азотфіксуючі бактерії здатні фіксувати від 50 до 300
кілограмів азоту на гектар на рік,[10] причому ефективність азотфіксації
залежить від виду рослини-хазяїна, рівня азоту в ґрунті, штаму бактерій та
інших факторів. Використання азотфіксуючих мікроорганізмів є значно
економічнішим та екологічно доцільнішим порівняно з використанням
азотовмісних мінеральних чи органічних добрив. Тому пошук нових
високопродуктивних штамів Mesorhizobium ciceri та розробка на їх основі
біологічних добрив є перспективним і економічно вигідним напрямком
досліджень.
Новітність курсової роботи полягає у використанні новітнього

високоефективного штаму Mesorhizobium ciceri ND-64, як біологічного
агента добрива, який здатен утворювати стабільний та ефективний симбіоз зі
всіма основними виробничими видами нуту в Україні, підвищуючи середній
урожай від 35% до 45%. А також у дешевому напівнатуральному середовищі
його культивування, а саме гороховому бульйоні у розчиненому в ньому
наважками солей задля більш швидкого подолання лаг-фази продуцентом.
7
Основна проблематика виробництва біодобрив на основі
азотфіксуючих симбіотичних бульбочкових бактерій полягає у селекції
нових виробничих штамів, оскільки розбіжність між ефективністю симбіозу
між штамами є досить велика, а в деяких випадках штами M. ciceri і зовсім не
здатні створювати симбіоз з певними сортами нуту. Тому активна селекція
нових штамів, які б охоплювали найбільш широкий спектр різновидів нуту є
однією з ключових задач у цій сфері. Наразі здійснюються спроби
генетичної модифікації певних штамів M. ciceri задля більшої спорідненості
білків нодуляції та поверхневих білків нуту,[15] а також бактеріальних
екзополісахаридів, які і відповідають за здатність до симбіозу та здатність до
конкуренції між різними штамами. Але нараз ці дослідження знаходяться на
початкових стадіях, тому методики селекції та виділення штамів з полів, де
роками культивувався нут, залишаються найефективнішими методиками
відкриття нових виробничих штамів. M. ciceri ND-64 був відкритий та
досліджений саме з місць постійної культивації нуту в Україні.
Середовище для культивування також є одним з переваг даного штаму,

оскільки гороховий бульйон, який є основою поживного середовища є досить
багатим на поживні речовини, зокрема азотовмісні, проте його вартість
нижча ніж в меляси, чи гідролізованих борошнах. А деяка кількість
мінеральних солей та сахарози забеспечують швидкий розвиток культури у
період лаг-фази, оскільки гороховий бульйон є негідралізованим і бактерія
доводиться синтезувати власні ферменти для засвоєння всіх речовин.
8
РОЗДІЛ 1: Загальна характеристика бактеріального добрива BiNitro Нут
ENZIM Agro
Цільовим продуктом є бактеріальне добриво на основі бульбочкових
азотфіксувальних бактерій Mesorhizobium ciceri штаму MC285[1]
Органолептичні показники: Рідина жовтого кольору з вираженим

ароматом дріжджового живильного середовища. [2]
Тара: Біла полікарбонатна ємність білого кольору, об’ємом 2 літра.

Захищає від прямої дії сонячних променів, постачається в . [1]
Норми використання: 2 літри рекомендовано використовувати не

більше ніж на 2 тони насіння. Перед використанням розчин розводять у
розрахунку 4,5 літри робочого розчину на тонну насіння, тобто 2 літри
розчину доводять до 9 літрів перед використанням. Насіння оброблюється
шляхом передпосівної інокуляції.
Терміни та умови зберігання: Препарат зберігати за t° від +2°С до

+6°С в сухому, захищеному від прямих сонячних променів місці. Після
інокуляції треба провести посів не пізніше ніж за 15 діб.
Склад: Бульбочкові азотфіксувальні бактерії виду Mesorhizobium ciceri

штаму ND-64 в титрі не менше 2*109 КУО на мл. Виробниками зазначено що
також в продукті містяться продукти метаболізму бактерій, а саме
амінокислоти, фітогормони (ауксини), вітаміни та ферменти що
прискорюють зараження насіння нутом бактеріями.
Технологія створення добрива BiNitro Нут ENZIM Agro:

Культивація штаму Mesorhizobium ciceri в ферментері до досягнення
концентрації 2*109 КУО на мл. [1]
Сфера застосування: Біодобриво BiNitro Нут ENZIM Agro та вид

бактерій Mesorhizobium ciceri загалом, використовується у сільському
господарстві, у вигляді передпосівного інокулянту для вирощування рослин
виду Cicer arietinum (нут звичайний). Активне використання BiNitro Нут
9
ENZIM Agro та його аналогів зумовлене тим, що останніми десятиліттями на
хвилі популяризації органічного землеробства
широкої популярності набули біодобрива на
основі мікроорганізмів, які здатні здійснювати
позитивний вплив на ріст, розвиток та
врожайність різних культур рослин. Наразі в
Україні широко представлені різні препарати на
основі живих клітин або ферментів
мікроорганізмів, що мають імуномоделюючу, Рис. 1.1 Комерційне фото
препарату BiNitro Нут ENZIM
інсектицидну, фунгіцидну, гербіцидну Agro
активність або є симбіотичними
мікроорганізмами, які здатні виконувати широкий спектр функцій
допомагаючи нормальному розвитку сільськогосподарських культур.
10
РОЗДІЛ 2: Обґрунтування вибору біологічного агента
2.1. Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища
для його культивування
Широка популярність біодобрив на основі бактерій роду Rhizobium
зумовило велике розмаїття методик аналізу та визначення ефективних
штамів, що зумовило певні складності та великі розбіжності у ефективності
препаратів, аж до того, що деякі з них не показують жодної ефективності у
практичному використанні, що підриває довіру та доцільність вироблення
таких добрив. [7]
Підбір високоефективного штаму – одне із основних задач створення
якісного біодобрива, оскільки ефективність штаму залежить від фізико-
хімічних, генетичних та фізіологічних ознак як бактерій так і рослини, тому
для підбору біологічного агента варто застосовувати комплексний підхід,
який би включав в себе, як і економічні показники, так і показники, що
підтверджують здатність штаму створювати ефективний симбіоз.
Наразі кожен регіон світу має свої специфічні штами бактерій, які за
різними показниками були виявлені як ефективні, і на основі яких в
основному виробляють добрива в певних регіонах.[2] Наприклад штам M.
ciceri USDA 3100 є характерним для США, LMG 14989 характерний для
європейського регіону, СС1192 є характерним для посушливих регіонів,
таких як Австралія, Африка, Пакистан та Ізраїль.
Високоефективні штами здатні підвищити врожайність рослин нуту від
4 до 50% у порівнянні з контролем, за нормального зовнішнього збагачення
азотом та до 300% на бідних на поживні речовини та посушливих землях, це
зумовлюється широким спектром дій M.ciceri, які полягають не тільки в
фіксації атмосферного азоту, а і в солюбілізації фосфатів та сполук калію. [3]
. Також варто відзначити здатність деяких штамів M. ciceri, до синтезу
індолооцтової кислоти, яка згідно досліджень здатна стимулювати ріст та
щільність коренів [8] .
У науковій літературі наявні дані щодо серії проведених досліджень
взаємодії бактерій роду Rhizobium з іншими представниками азотфіксуючих
родів бактерій та навіть грибами. Поєднання різних мікроорганізмів може
провокувати грунтовні зміни на ґрунтовий мікробіом, пригнічуючи ріст
патогенних мікроорганізмів, або створюючи мікоризну біоплівку навколо
коренів рослин, захищаючи від негативного впливу навколишнього
середовища. Але створення комплексних препаратів ще тільки проектується і
більш глибокі симбіотичні відносини між різного роду ризосферними
мікроорганізмами ще тільки встановлюються [9]
11
Методики визначення високоефективних штамів органічно
еволюціонували з плином часу та розвитком наукових досягнень, якщо
раніше акцент у дослідженнях робився переважно на здатності
бактеріального штаму до фіксації азоту, то зараз частіше використовується
генетичний аналіз [10], [11] на відповідність певних генів нодуляції, але
наразі розуміння чого певні штами M. сiceri мають здатність до нодуляції на
певних сортах нуту, а інші ні тільки з’ясовується. Відомо лише, що штами M.
сiceri здатні поступово мутувати, і покращувати свою здатність до симбіозу з
сортами нуту, які найчастіше зустрічаються вирощуються в певному регіоні.
[7],[12] [13] [14] , Тому варто кожні декілька сезонів робити скрінінг наявних
аборигенних штамів в ризосфері на наявність нових високоефективних
штамів.
Однією з головних проблем, які наразі не вирішені – це питання
конкурентоспроможності різних штамів M. сiceri, оскільки як було виявлено
здатність та ефективність нодуляції не корелює з азотфіксуючою активністю
та у разі великої концентрації аборигенних штамів ризобій є великий шанс
витіснення високоефективного виробничого штаму, менш ефективним
диким, що безумовно призводить до зменшення врожайності. В Україні
використовуються промислові штами M. ciceri, починаючи з 70-х років 20
століття, що створило певне видове різноманіття, яке наразі активно
досліджується, і протягом останніх 20 років було 2 рази ґрунтовно
проскановано різновиди штамів M. сiceri у грунтах України, що відображено
в наступних дослідженнях:[12],[16][17][18] та ін. За результатом першого
скринінгу який був проведений у 2004-2006 роках було виведено
високоефективний штам H-12, який став наступником попереднього
виробничого штаму 522. Він мав приблизно ідентичну активність
нітрогенази, у порівнянні з попередником, але показував більшу
ефективність симбіозу та ефективність з більшим числом сорту нуту [13] .
Другий скринінг у 2016-2017 роках показав еволюційну мутацію штамів, які
мали ще більшу симбіотичну ефективність. Була виділена група штамі ND, з
яких найефективнішим виявився ND-64, який показав стабільну ефективність
на широкому спектрі сортів нуту, і стабільно випереджував всі інші штами, а
також мав велику конкурентоспроможність [20]. [21] Одними з
основних вимог до бактеріального добрива є підвищення урожайності с/г
культури, висока конкурентна спроможність штаму, швидкість росту, та
здатність до фіксації азоту.
Підвищення урожайності нуту виміряється різницею урожайності нуту
контрольного поля без інокуляції та поля що було інокульовано, або ж
різниця вирізняється відсотком приросту маси врожаю у порівнянні з
контролем, де контроль приймають за 100%, а все, що перевищує цей
показник вважається прибавко, пов’язаною з використання біопрепарату.
12
Також для більш швидкого аналізу часто користуються методикою
порівняння сухої біомаси зеленої рослини нуту на різних періодах вегетації.
Цей метод дозволяє прослідкувати ефективність симбіозу в динаміці. В
таблиці 2.1 результати підвищення урожайності нуту були проаналізовані на
основі даних з декількох статей, де було позначено мінімальний
зафіксований показник та максимальний. [22]
Оскільки методики визначення конкурентоспроможності є дуже
варіабельними та багато дослідників все ще ігнорують цей фактор [23], то
конкурентна спроможність різних штамів азотфіксуючих бактерій була
орієнтовно визначена кількістю бульбочок, що утворює штам на нуті. Є
гіпотеза, що кількість бульбочок показує ефективність хемотаксису бактерій
в епітелій коріння нуту.
Згідно аналізу літератури, досліджувані штами M. ciceri були поділені
на ті що ростуть до сприйнятливої концентрації КУО 120 годин та 72 години.
Сприйнятливою концентрацією КУО на мл було позначено як не менше
2×109, оскільки згідно аналізу біодобрив, як і вітчизняного так і закордонного
зразків концентрація нижче 1 мільярду КУО на мілілітр виявлено не було.
Орієнтовна концентрація біомаси була встановлена як не більше 15
грам на літр, оскільки більшу концентрацію згідно розрахунку
представленого в розділі 2.2 отримати неможливо
Здатність фіксації азоту була проаналізована ацетилен-етиленовим
методом, який вимірює кількість синтезованого етилену з ацетилену в ході
реакцій фіксації атмосферного азоту за допомогою нітрогеназного
комплексу. Цей метод надійно показує, що бульбочки Mesorhizobium ciceri
фіксують атмосферний азот і дає певне числове позначення цього, але згідно
досвіду дослідників активність нітрогеназного комплексу не завжди корелює
з приростом урожайності, особливо на ґрунтах, які були збагачені азотом.
13
Завдяки літературним джерелам були детально проаналізовані наступні
штами M. сiceri: CC1192, ND-64, LGM17149, H-12, USDA 3100, LGM 14989,
які є досить популярними виробничими штамами які показали себе як вкрай
ефективно у певних біоагроценозах.
На основі порівняльного аналізу характеристик штаму, витрат на
поживне середовище та вартості умовної одиниці продукції було
встановлено, що Mesorhizobium cicerі ND-64 виявився найбільш
конкурентоспроможним. Це пов'язано з його високою активністю
нітрогенази, найвищим рівнем симбіотичної ефективності, швидкістю росту
72 години та економічно вигідним середовищем культивування.
Найближчими конкурентами виявилися два попередні штами, H-12 та
LGM17149, які вирізняються схожістю середовища культивування та
тривалістю росту, проте відстають на 20-30% за показниками симбіотичної
ефективності
14
Таблиця 2.1
Економічні та біологічні показники активних штамів Mesorhizobium ciceri
Мікроорганіз Склад поживного Трива Особливості Нітрогеназ Мінім Кількість Ефекти

м середовища лість процесу на альни азотфікс вність
культ біосинтезу активність, й уючих симбіоз
Компоненти Концентраці ивува нмоль допус бульбочо у*
середовища я г/л ння С2Н4/росл. тимий к на Джерела
за год. титр рослину
бакте
рій на
мл
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M. ciceri CC1192 Глюкоза 5 120 Культивування в 1020 2*109 20-36 83-126% 1.Hill, Y., Colombi, E., Bonello, E.,
Манитол 5 колбах об'ємом КУО/мл Haskett, T., Ramsay, J., O’Hara, G., &
MgSO4*7H2O 0,8 750 мл з 100 мл Terpolilli, J. (2021). Evolution of
diverse effective N2-fixing
NaCI 0,1 середовища на
microsymbionts of Cicer arietinum
Дріжджовий 1,25 качалці (t = 28С; following horizontal transfer of the
екстракт n = 220 об/хв) pH Mesorhizobium ciceri CC1192
CaCI2*2H20 7-7,5. рівень symbiosis integrative and conjugative
K2HPO4 0,2 внесеного element. Applied and Environmental
KH2PO4 0,16 інокулянту 10% Microbiology, 87(5), e02558-20.
FeSO4*7H2O 0,13 2. Oparah, I. A., Deaker, R.,
Hartley, J. C., Sohail, M., Gemell,
0,1 L. G., Hartely, E., & Kaiser, B. N.
(2022). Symbiotic efficiency,
rhizosphere competence and
nodule occupancy of chickpea
root-nodule bacteria from
Australian soils.
3. Oparah, I. A., Hartley, J. C.,
Deaker, R., Gemell, G., Hartley,
E., & Kaiser, B. N. (2023).
Symbiotic effectiveness, abiotic
stress tolerance and phosphate
solubilizing ability of new chickpea
root-nodule bacteria from soils in
Kununurra Western Australia and
Narrabri New South Wales
Australia. Plant and Soil, 1-19.
M. ciceri ND-64 (NH4)SO4 1 72 Культивування в 638-3600** 2*109 15-43 112-154% 1. Логоша, О. В., Воробей, Ю. О.,
K2HPO4 0,5 колбах об'ємом КУО/мл Волкова, І. В., & Усманова, Т. О.
KH2PO4 0,5 750 мл з 100 мл (2021). ШТАМ MESORHIZOBIUM
MgSO4*7H2O 0,2 середовища на CICERІ ND-64 — ЕФЕКТИВНИЙ
МІКРОСИМБІОНТ НУТУ
CaCO3 1 качалці (t = 28С;
СУЧАСНИХ
Сахароза 10 n = 220 об/хв) pH СОРТІВ. Сільськогосподарська
Гороховий 1000 6.8-7 рівень мікробіологія, 32, 3-17.
бульйон (100g/l) внесення https://doi.org/10.35868/1997-
інокулянту 10% 3004.32.3-17
2. Lohosha, O., Vorobei, Y., &
Leonova, N. (2023). Symbiotic
Efficiency and Cytokinin Activity of
New Mesorhizobium cicerі
Strains. Mikrobiolohichnyi
Zhurnal, 85(1), 3-
11. https://doi.org/10.15407/microbiol
j85.01.003
3. Lohosha, O., & Vorobei, Y.
(2021). Dynamics of formation and
functioning of legume-rhizobial
symbiosis' Mesorhizobium ciceri-
Cicer arietinum'(variety
Pam'iat'). Australian Journal of
Crop Science, 15(1), 129-136.
M. ciceri MC-285 - - - - - 2*109 117% 1.СІПЛІВЕНКО, К. І. Вплив

КУО/мл елементів технології на
продуктивність нуту в умовах ФГ
«Яник» с. Гольма Балтського
району Одеської області..
Культивування в 2*109 1. Логоша, О. В., Воробей, Ю. О.,
M. ciceri H-12 (NH4)SO4 1 72 колбах об'ємом 450-2301 КУО/мл 9-21 111-121% Волкова, І. В., & Усманова, Т. О. (2021).
ШТАМ MESORHIZOBIUM CICERІ ND-
K2HPO4 0,5 750 мл з 100 мл 64 — ЕФЕКТИВНИЙ
KH2PO4 0,5 середовища на МІКРОСИМБІОНТ НУТУ СУЧАСНИХ
MgSO4*7H2O 0,2 качалці (t = 28С; СОРТІВ. Сільськогосподарська
CaCO3 1 n = 220 об/хв) pH мікробіологія, 32, 3-17.
https://doi.org/10.35868/1997-3004.32.3-17
Сахароза 10 7-7,5 рівень
2. Дідович, С. В., & Толкачов, М.
Гороховий 1000 внесення (2007). Ефективність нітрагінізації
бульйон (100g/l) інокулянту 10% сортів Cicer arietinum L. штамами
Mesorhizobium ciceri в умовах
південного степу України.
3. Lohosha, O., & Vorobei, Y. (2021).
Dynamics of formation and
functioning of legume-rhizobial
symbiosis' Mesorhizobium ciceri-
Cicer arietinum'(variety
Pam'iat'). Australian Journal of Crop
Science, 15(1), 129-136.
M. ciceri LGM (NH4)SO4 1 72 Культивування в 1600-2925 2*109 74-79 122% 1.Ефективні штами
17149(522) K2HPO4 0,5 колбах об'ємом КУО/мл Mesorhizobium ciceri для
KH2PO4 0,5 750 мл з 100 мл виготовлення ризобофіту під нут
(Cicer arietinum) / С.В. Дідович,
MgSO4*7H2O 0,2 середовища на
М.З. Толкачов, І.О. Каменєва //
CaCO3 1 качалці (t = 28С; Сільськогосподарська
Сахароза 10 n = 220 об/хв) pH мікробіологія: Міжвід. темат.
Гороховий 1000 7-7,5 рівень наук. зб. — Чернігів, 2006. —
бульйон (100g/l) внесення Вип. 4. — С. 147-158. —
інокулянту 10% Бібліогр.: 6 назв. — укр.
2. Wanjofu, E. I., Venter, S. N.,
Beukes, C. W., Steenkamp, E. T.,
Gwata, E. T., & Muema, E. K.
(2022). Nodulation and Growth
Promotion of Chickpea by
Mesorhizobium Isolates from
Diverse
Sources. Microorganisms, 10(12),
2467.
M.ciceri USDA K2HPO4 0,5 72 Культивування в - 2*109 44-55 82-129% 1. Imran, A., Mirza, M. S., Shah, T.
3100 MgSO4*7H2O 0,2 колбах об'ємом КУО/мл M., Malik, K. A., & Hafeez, F. Y.
NaCI 0,1 750 мл з 100 мл (2015). Differential response of
CaCO3 4 середовища на kabuli and desi chickpea
genotypes toward inoculation with
Дріжджовий 1 качалці (t = 28С;
PGPR in different soils. Frontiers
екстракт 10 n = 220 об/хв) pH in microbiology, 6, 859.
Манітол 1000 7-7,5 рівень
Вода внесення
інокулянту 10%
M.ciceri LMG K2HPO4 0,5 120 Культивування в - 2*109 - 104% Wanjofu, E. I., Venter, S. N.,
14989 MgSO4*7H2O 0,2 колбах об'ємом КУО/мл Beukes, C. W., Steenkamp, E. T.,
NaCI 0,1 750 мл з 100 мл Gwata, E. T., & Muema, E. K.
(2022). Nodulation and Growth
CaCO3 4 середовища на
Promotion of Chickpea by
Дріжджовий 1 качалці (t = 28С; Mesorhizobium Isolates from
екстракт n = 220 об/хв) pH Diverse
Манітол 10 7-7,5 рівень Sources. Microorganisms, 10(12),
Вода внесення 2467.
1000 інокулянту 10%
*Ефективність симбіозу розраховувалася за формулою ( врожай

врожай (контроль ) )
∗100=Ефективність симбіозу
** Показники можуть значно коливатися, оскільки рівень нітрогеназної активності в більшості залежить від сорту
Таблиця 2.2
Розрахунок вартості поживних середовищ для культивування
Mesorhizobium ciceri
Продуцен Компонент Концентрація Ціна Вартість Джерело Примітка. * – Ціни наведено станом на лютий
т поживного у ПС, г/л компонента, компонента інформації 2024 р. 1 - www.agreemarket.com.ua, 2 -
середовища грн/кг (грн) на 1 л (1, 2, 3)* http://prom.ua, 3 – www.shop-hlr.ua; 4 - . agro-
середовища ukraine.com
M. ciceri Глюкоза 5 50 0,25 3
CC1192 Манитол 5 228 1,14 3 Таблиця 2.3
MgSO4*7H2O 0,8 7.5* 0,006 1 Умовна вартість 1 г біодобрива синтезованого
NaCI 0,1 30 0,003 2 на суміші ростових субстратів
Дріжджовий 1,25 1540 1,925 3
екстракт
CaCI2*2H20 0,2 35 0,007 3
K2HPO4 0,16 261 0,04 2
KH2PO4 0,13 125 0,01 2
FeSO4*7H2O 0,1 39,5 0,00395 1
Загальна вартість 4.4 грн на літр
M. ciceri (NH4)2SO4 1 32 0,032 4
ND-64 K2HPO4 0,5 261 0,13 2
KH2PO4 0,5 125 0,0625 2
MgSO4*7H2O 0,2 7.5 0,0015 1
CaCO3 1 4 0,004 4
Сахароза 10 25 0,25 4
Гороховий 100 11 1,1 4
бульйон
(100g/l)
Загальна вартість 1.58 грн

M. ciceri (NH4)SO4 1 32 0,032 4
H-12 K2HPO4 0,5 261 0,13 2
KH2PO4 0,5 125 0,0625 2
MgSO4*7H2O 0,2 7.5 0,0015 1
CaCO3 1 4 0,004 4
Сахароза 10 25 0,25 4
Гороховий 100 11 1,1 4
бульйон
(100g/l)
Біологічни Гектарна Тривалість Виробництво Вартість 1 л Умовна
й агент норма культивування гектарної норми середовища вартість
внесення , год препарату % в , грн/л 1г
біодобрива з годину в одному цільового
концентраціє літрі продукту
ю клітин не середовища. , грн/г
менше 2*109
КУО), г
M. ciceri 750 120 2.13% 4.4 0.0044

CC1192
M. ciceri 600 72 4.6% 1.58 0.0015

ND-64
M. ciceri H- 600 72 4.6% 1.58 0.0015

12
M. ciceri 600 72 4.6% 1.58 0.0015

LGM
17149(522)
M. ciceri 600 72 4.6% 4 0.044

USDA 3100
M. ciceri 600 120 2.7% 4 0.044

LMG 14989
2.2. Розрахунок потенційної максимальної біомаси, яку можливо отримати на запропонованій суміші ростових
субстратів для культивування Mesorhizobium ciceri ND-64
Розрахунок концентрації карбону, що міститься в 1 літрі поживного середовища

Потреби для синтезу біомаси: Як джерело вуглецю для синтезу біомаси використовується сахароза у концентрації
10 г/л та гороховий бульйон на основі 100 грам сухого гороху. У біомасі міститься 50 % Карбону, оскільки з
літературних джерел невідома точна біомаса, яка необхідна для створення біодобрива, то варто розрахувати яка
максимальна концентрація біомаси може бути синтезована із запропонованого поживного середовища.
Оскільки основним цукром горохового бульйону є сахароза та крохмаль[24], які знаходиться там у відносній
концентрації 50 грам на літр, то отримаємо загальну концентрацію вуглеводів в поживному середовищі 60 грам на літр
(10+50=60). Оскільки в масова частка карбону в сахарозі та глюкозі дорівнює 42%, то за наступними розрахунками
отримуємо (60*0,42) 25.2 грам карбону в літрі середовища. Оскільки як відомо 40% джерела карбону виходить на
холосте окиснення (25.2*0.6), то потенційно, опираючись тільки на дані джерела карбону ми можемо отримати 15.12
грам біомаси в літрі середовища.
Розрахунок концентрації азоту, що міститься в 1 літрі поживного середовища

У запропонованому поживному середовищі джерелами азоту виступають 1 г/л (NH4)2SO4 та гороховий бульйон
зі 100 грам сухого зеленого гороху. (NH4)2SO4 містиць 21% відсоток азоту, згідно цієї інформації у 1 г (NH4)2SO4
міститься 0.21 г азоту. Згідно джерела відомо, що в 1 літрі 17 грам білку, а оскільки білок в середньому складається за
азоту на 16% [25], то отримаємо 2.72 грам азоту. Загалом концентрація азоту в середовищі дорівнює (2.72+0.21) 2.93
грам азоту. Припустимо клітина M.ciceri складається з 10% азоту, то тоді максимальний рівень біомаси згідно азотного
живлення має не перевищувати 29,3 грам на літр (2.93*10).
Розрахунок концентрації фосфору, що міститься в 1 літрі поживного середовища
В поживному середовищі джерелами фосфору виступають K2HPO4 та KH2PO4 у концентраціях по 0.5 грам
кожного, з чого отримуємо 1 грам солей фосфору у літрі середовища. Також варто відзначити, що джерелом
фосфорного живлення також виступає гороховий бульйон, який згідно джерела має концентрацію фосфору 0.4 г на літр.
Тепер варто визначити відсотковий склад фосфору у солі K2HPO4. Оскільки відомо що масова частка фосфору у
K2HPO4 становить 22.84%, то 0.5 містять (0.5*0.228) 0.114 грам фосфору. KH2PO4 містить 23% частку фосфору, що
становить (0.5*0.23) 0.115 грам фосфору на літр. Сумуючі всі дані (0.114+0.115+0.4) ми отримуємо 0.629 грам фосфору
на літр середовища. Оскільки відомо, що в середньому бактеріальна клітина складається з фосфору на 3%, то ми можемо
припустити, що максимальний рівень біомаси, який може бути досягнений при культивуванні за такої концентрації
фосфору буде ((0.629/3)*100) 20.9 грам на літр
Інші компоненти середовища.

Інші компоненти середовища представляють собою елементи солей, наприклад K2HPO4 та KH2PO4 також
виступають джерелами іонів K+ , джерелом сірки виступає (NH4)2SO4 та MgSO4*7H2O, джерелом магнію
MgSO4*7H2O, джерелом кальцію CaCO3, також ця сполука може виступати як буфер проти закислення середовища в
результаті метаболізму бактерій. Джерелом інших мікроелементів виступає гороховий відвар, який згідно джерела
потенційно містить всі необхідні мікроелементи.
Висновок: згідно аналізу запропонованого поживного середовища, максимальна потенційна концентрація біомаси буде
15.12 грам на літр, і головним обмежуючим елементом буде виступати карбон. Підняття рівня загального карбону до 32
г/л може збільшити рівень біомаси до 20 грам на літр, і тоді вже головним обмежуючим фактором потенційно буде
фосфор.
РОЗДІЛ 3. Обґрунтування умов і способу культивування біологічного агента та підготовки поживного

середовища
3.1. Вибір умов і способу культивування Mesorhizobium ciceri
Mesorhizobium ciceri є бактерією ризосфери землі, що зумовлює певні відмінності у культивуванні, що зумовлено
природнім ареалом існування цих бактерій:
Оптимальні умови культивування M. ciceri ND-64:
Оптимальна 28℃
температура
росту
Оптимальний 6.8-7
pH
Відношення до Облігантний аероб
кисню
Згідно з зазначеними характеристиками штаму, можна впевнитися в необхідності проведення асептичного

культивування, оскільки більшість мікроорганізмів, що відносяться до бактерій та грибів, можуть бути культивовані у
схожих умовах, тому ризик контамінації сторонньою мікрофлорою є досить великим, що недопустимо для цільового
продукту, оскільки концентрація життєздатних клітин напряму виражає вагу насіння, яка може бути цим препаратом
оброблена. З дослідження ко-культивування відомо, що при наявності сторонньої мікрофлори, концентрація клітин
M. ciceri може падати до 105- 107 КУО/мл, що зменшує кількість ефективно обробленого насіння в сотні разів. [26]
Культивування буде проводитися глибинним методом, оскільки в цьому режимі є можливість забезпечити
асептичні умови та більш ефективний розвиток бактеріальної маси. Кінцевий продукт буде розливатися у рідкому стані,
тож не має необхідності у жодних додаткових технологічних процесах після культивування. Що робить глибинний
метод культивування технологічно та економічно доцільним.
Асептичні умови культивування, будуть забезпечені попередньою стерилізацією обладнання, комунікації,
поживного середовища та піногасників. Культивування буде проводитися за підвищеного тиску, задля контролю
герментичності процесу.
3.2. Вибір типу ферментера
Оснащення для культивування M. ciceri ND-64 представляє собою ферментер, який би відповідав наступним
вимогам:
Оскільки M. сiceri ND-64 є облігатним аеробом, то наявність системи подачі стерильного повітря та барботера є
обов’язковою. Згідно досліджень було встановлено, що концентрація розчиненого кисню та швидкість росту біомаси
напряму корелюють [27], тому реалізація перемішування за допомогою барботера та турбінної мішалки, швидкість якої
від 100 до 500 об/хв є необхідною складовою ферментера.
Оскільки M. сiceri ND-64 активно закислює середовище під час розвитку культури, і при pH нижче за 5
спостерігається значне інгібування росту, тому стерильне внесення розчину титрантів є необхідною функцією
ферментера.
Контроль концентрації цільового продукту є ключовим аналітичним відстеженням процесу культивування, тому у
ферментері має бути присутня функція стерильного відбирання проб.
Фізико-хімічні показники є ключовими в аналізі процесу культивування, тому ферментер має бути оснащений
датчиками pH, концентрації розчиненого кисню, концентрації СО 2, датчиками температури та термо-сорочкою, яка б
підтримувала стабільну температуру культивування.
Оскільки в процесі культивування передбачається виділення СО 2, тому важливими компонентами ферментера
також є патрубок викачування вуглекислого газу та барботер для подачі стерильного повітря.
Оскільки процес культивування M. ciceri ND-64 є асептичним, ферментер має бути повністю герметичним та
здатним підтримувати умови стерилізації та підвищеного тиску.
Оскільки поживне середовище для культивування M. ciceri ND-64 включає в себе гороховий бульйон, то
очікується високий рівень піноутворення, що є згубним для ферментації. Високий рівень піноутворення можна
ефективно видалити силіконовими піногасниками, які варто стерильно вносити в поживне середовище у концентрації
0.1-0.5% від загального об’єму.[28].
Оскільки ферментери для асептичного культивування об’ємом 3200 літрів вважаються велико-габаритними,
знайти «Ready-to-use» модель досить складно, тому пропонується звертатися в компанії які займаються розробкою
ферментерів під замовлення, наприклад компанія BaoxingBIO, що займається проєктуванням та продажем ферментерів.
Згідно представленної веб-сторінки
[29], велико-габаритні ферментери цієї фірми оснащуються всіма необхідними компонентами, згаданими у цьому
підрозділі.
3.3. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу для синтезу біомаси M. ciceri ND-64
Виробничий біосинтез здійснюють у ферментері об’ємом 3.2 м3 з коефіцієнтом заповнення 0,6.
Робочий об’єм ферментера (Vроб) визначають за формулою:
Vроб = Vг.ф × Кзап,
де: Vг.ф. – геометричний об’єм ферментера; Kзап – коефіцієнт заповнення, 0,6.
Vроб = 3.2 × 0,6 = 1,92 м3
Кількість посівного матеріалу становить 10 % від об’єму поживного середовища. Отже, для одержання 1,92 м 3
культуральної рідини потрібно:
Vроб.1 = 1,92 × 0,1 = 0,192 м3 посівного матеріалу
Таку кількість інокуляту можна одержати під час культивування у посівному апараті об’ємом 0,192м 3 (192л). Для
одержання 0,192 м3 культуральної рідини потрібно мати:
Vроб.2 = 0,192 × 0,1 = 0,0192 м3 посівного матеріалу.
Таку кількість посівного (19,2л) можна одержати у процесі вирощування штаму M. сiceri ND-64 у стандартному
інокуляторі об’ємом 0,0192 м3 (19,2 л). 19,2 л культуральної рідини можна одержати з використанням:
Vроб.3 = 19,2 × 0,1 = 1,92 л посівного матеріалу.
Приготування такої кількості інокуляту здійснюють в колбах качалках об’ємом 0,00192 м3 (1,92 літрів).
Задля зручності використання загальні дані з етапів підготовки інокуляту були висвітлені в таблиці 3.2
Таблиця 3.2
Результати розрахунку об’ємів ферментаційного обладнання для підготовки посівного матеріалу і виробничого
біосинтезу.
Об’єм Коефіцієнт Робочий Об’єм Конденсат Об’єм

ферментера, заповнення об’єм посівного (10%), м3 підготовки
3
м ферментера, матеріалу поживного
м3 (10%), м3 середовища,
м3
3.2 0.6 1.92 0,192 0,192 1,534
0,3 0.6 0,192 0,0192 0,0192 0,1534

(192 дм3) (19.2 дм3) (19.2 дм3)
0,03 0.6 0,0192 0,00192 0,00192 0,01534

(1.92 дм3) (1.92 дм3)
(19.2 дм3)
0,003 0.2 (150 мл 0,00975 0,000192 -* 0,00192

(3дм3) рідини на (9.75 дм3) (0,192 дм3) (1,92 дм3)
(у колбах на 750 мл (13 колб
качалках) колбу) об’ємом 750
мл)
*Конденсат не враховано, оскільки стерилізація композицій поживного середовища відбуватиметься у колбах в
автоклаві
Рис. 3.1. Схематичне зображення етаі підготовку посівного матеріалу для культивування M. ciceri ND-64: 1.1-1.3 -
підготовка посівного матеріалу спочатку в пробірках зі скошеним агаризованим середовищем, а потім у колбах-
качалках. 2 - ферментер об’ємом 32 літри; 3 - ферментер для інокуляту 3200 літрів; 4 - основний ферментер для
виробничого біосинтезу об’ємом 3200 літрів.
3.4. Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для культивування M. ciceri ND-64
Для культивування біологічного агента використовується поживне середовище з наступним складом г/л:
(NH4)2SO4 1
K2HPO4 0,5
KH2PO4 0,5
MgSO4*7H2O 0,2
CaCO3 1
Сахароза 10
Гороховий бульйон 1000
(100г сухого гороху/
літр)
Процес підготовки посівного матеріалу був розбитий на 4 етапи, виходячи з об’єму кінцевого виробничого
ферментера. Кожен з цих етапів характеризується необхідністю використовування ємностей різного об’єму. Підбір
всього необхідного обладнання був реалізований на базі даних з таблиці 3.2. Оскільки в процесі стерилізації та
культивування можливе підкислення розчину, то для корекції pH під час культивування необхідно підготувати стерильні
розчини HCl та NaOH, а також піногасник.
В першому етапі культивування, а саме в колбах на качалці всі компоненти середовища будуть стерилізовані в
автоклаві.
Оскільки всі солі є добре розчинними у воді (окрім CaCO 3), всі вони будуть попередньо розведені в певному об’ємі
води, виходячи з концентрації солі. Якщо об’єм необхідний для внесення більше ніж 3 літри, для стерилізації будуть
використовуватись спеціальні реактори.
Вирощування інокуляту в колбах на качалках
Після аналізу поживного середовища був зроблений висновок про необхідність розділення інгредієнтів на декілька
окремних композицій з власними режимами стерилізації:
Композиція А: (NH4)SO4 та MgSO4*7H2O обидві ці солі є термостійкими, тому їх розчин можна піддати
максимально жорсткому режиму стерилізації, а саме 131 °С, 40 хв
Композиція Б: Гороховий бульйон та сахароза. Оскільки гороховий бульйон є складною системою, яка містить в
собі, як вуглеводи, так і жири з білками, то її варто стерилізувати при 112 °С, 30 хв.
Композиція В: Солі K2HPO4 та KH2PO4 при 131 °С, 40 хв

Композиція Г: СаCO3 оскільки це є буфером для регулювання кислотності середовища і нерозчинною сіллю, ця
композиція потребує окремої стерилізації при 131 °С, 40 хв.
Вирощування інокуляту в ферментері об’ємом 32 літри
Композиція А: (NH4)SO4 та MgSO4*7H2O обидві ці солі є термостійкими, тому їх розчин можна піддати
Композиція Б: Гороховий бульйон. Оскільки гороховий бульйон є складною системою, яка містить в собі, як
вуглеводи, так і жири з білками, то її варто стерилізувати при 112 °С, 30 хв
Композиція В: Солі K2HPO4 та KH2PO4 при 131 °С, 40 хв. Фосфатні солі були відведені в окрему композицію,
оскільки вони можуть утворювати осад при взаємодії з іншими солями.
Вирощування інокуляту в ферментері об’ємом 320 літрів
Композиція А: Солі (NH4)SO4, MgSO4*7H2O обидві ці солі є термостійкими, тому їх розчин можна піддати
Композиція В: Солі K2HPO4 та KH2PO4 при 131 °С, 40 хв. Фосфатні солі були відведені в окрему композицію,
оскільки вони можуть утворювати осад при взаємодії з іншими солями.
Стерилізація основного об’єму ферментаційного середовища

Композиція А: Солі (NH4)SO4, MgSO4*7H2O, K2HPO4 та KH2PO4 обидві ці солі є термостійкими, тому їх розчин
можна піддати максимально жорсткому режиму стерилізації, а саме 131 °С, 40 хв при pH 4
Таблиця 3.2
Розрахунок вмісту та особливості приготування деяких компонентів поживного середовища
Об’єм Складові поживного середовища
підгото Кількість Сахароза (NH4)SO4 MgSO4 K2HPO4 KH2PO4 CaCO3
вки гороху для ** *7H2O**
бульйону
поживн
ого
середов Вмі Ємн Вмі Єм Вмі Ємн Вмі Єм Вмі Єм Вмі Єм Вмі Ємн
ища в ст г Ість. ст г н ст г Ість ст г н ст г н ст г н ст г ість*
літрах * іст л.* іст ість іст
ь* ь* * ь*
1.92 192 колб 15. -* 1.5 Колб 0.3 - 0.7 Коб 0.7 - 1.5 Коба
а на 3 3 а 7 а на 7 3 на
3 100м 100 100м
літри л мл л
15.3 1530 Реак 153 - 15. Коба 3 - 7.7 Кол 7.7 - 15. Коба
тор 3 100 ба 3 100
на 20 мл на мл
л 100
мл
153 1530 Реак 153 - 153 Колб 30 - 77 Кол 77 - 153 Колб
0 тор 0 а2л ба а2
на на 2 літри
300 л л
1530 1530 Реак 153 - 153 Реак 300 - 770 - 770 - 153 Реак
00 тор 00 0 тор 0 тор
на 20 л 20 л
3000
л
*Компонент поживного середовища стерилізується в одній ємності з іншим компонентом
Для реалізації всіх етапів підготовки посівного матеріалу знадобяться наступні ємності: 6 колб на 100 мл, 3 колби
на 2 літри, 1 колба на 3 літри, 3 реактори на 20 літрів, 1 реактор на 300 літрів, 1 реактор на 3000 літрів.
Отже, технологічна схема, окрім стадій підготовки поживного середовища, включає такі додаткові стадії:
● приготування 6% розчину HCl як титрувального агента при стерилізації поживного середовища та культивуванні
посівного матеріалу в посівних ферментерах об’ємом 32, 320 л та ферментаторі 3.2 м3;
● приготування та стерилізація 6% розчину NaOH для стабілізації рН середовища перед початком культивування в
посівних ферментерах об’ємом 32, 320 л та ферментаторі 3.2 м3 ;
● Також додатково перед початком створення посівного матеріалу та виробничої ферментації необхідно виконати
стерилізацію та внесення хімічного піногасника (SILFOAM® SE 4260) в об’ємі до 0.2% від загального об’єму
середовища, це пропонується виконати стерилізацією в реакторі об’ємом 10 літрів при температурі 131℃ 40
хвилин.
Окрім реакторів та ферментерів для створення посівного матеріалу, необхідно передбачити окремі реактори для
стерилізації води для розведення концентрованого розчину HCl до 6% розчину, окремий реактор для стерилізації
розчину NaOH, окремий реактор для стерилізації розчину піногасника.
РОЗДІЛ 4. Опис технологічної схеми біосинтезу цільового продукту
ДР 1. Підготовка та стерилізація допоміжних розчинів
ДР 1.1 Приготування та стерилізація розчину піногасника
Оскільки технологічний процес культивування Mesorhizobium ciceri ND-64 передбачає використання середовища
основою якого є гороховий бульйон, то високий рівень утворення піни на межі поділу фаз є передбачуваним, тому
необхідно підготувати стерильний розчин піногасника, задля використання під час культивування. Піногасник
SILFOAM® SE 4260 має бути внесений у концентрації 0.2% від об’єму середовища, тобто для виробничого біосинтезу
та підготовки інокуляту у ферментерах на 32 та 320 літрах, необхідно підготувати 3.4 літра піногасника. Піногасник
буде стерилізований у реакторі з електричним нагрівом ТЕНами об’ємом 10 літрів при 131℃ протягом 40 хвилин.
ДР 1.2. Приготування 6%-го розчину HCl
Створювати розчини для коригування pH планується з розрахунку 2 мл 6% розчину HCI на літр виробничого
середовища, тому для всього виробничого процесу, необхідно приготувати 3.84 літри (2*1920). Для приготування 3.84
літрів 6%-го розчину HCl у реактор об’ємом 5 літрів подається попередньо стерилізовані 3.16 літри дистильованої води
в стерильних умовах подають 640 мл 36% соляної кислоти.
ДР 1.3. Приготування і стерилізація 6%-го розчину NaOH
Для коригування pH протягом ферментаційного процесу варто підготувати 6-% розчин NaOH в об’ємі 3.84 літри.
Для цього необхідно в реакторі об’ємом 5 літрів розчинити 230 грам безводного NaOH в 3.84 літрах води та
стерилізуватися при температури 131⁰С 40 хв.
ДР 2. Приготування та стерилізація поживних середовищ

ДР 2.1 Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у колбах на качалках
ДР 2.1.1 Підготовка горохового бульйону
Для першої стадії підготовки інокуляту, а саме культивуванню в колбах качалках нам необхідно підготувати 1.62
літра горохового бульйону з співвідношенням гороху до води 1:10, що буде досягнуто шляхом відважування 200 грамів
сухого гороху на технічних вагах, та подальшим його перемелюванням на молотковій дробарці «МЛИН-3©»[30], після
чого утворене горохове борошно поміщають в металеву ємність, після чого воно заливається 2.3 літрами кип’яченої
води (варто додавати трохи більше води, бо в процесі кип’ятіння частина вологи випарується, а частина залишиться в
гороховому борошні після фільтрування) та розварюється при постійній температурі (приблизно 100 ℃) протягом 40 хв.
Після приготування утворений гороховий бульйон настоюється протягом години задля осадження зважених часточок та
фільтрується завдяки фільтру «Базука30©»[31] довжиною 30 см. Після завершення фільтрування утворений бульйон
варто перевірити на зважені частки шляхом візуального огляду, якщо утворений розчин має напівпрозорий світлий
колір, (допускаються легкі темно-жовті, коричневі чи зеленуваті відтінки) тоді 1.62 літри фільтрати зливають у ємність
задля подальшого використання.
Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у колбах на качалках

Таблиця 4.1
Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці
Компонент Вміст, г/л Кількість для Композ Об’єм композиції,

поживного приготування 1.92 иції V, мл
середовища л середовища, г
(мл)
Гороховий 1000 1620 Б 1620

бульйон
сахароза 10 19.2
вода
(NH4)2SO4 1 1.92 А 0.1

MgSO4 0.2 0.38
*7H2O
Вода 100
K2HPO4 0.5 0.96 В 0,1
KH2PO4 0.5 0.96
Вода 100
CaCO3 1 1.92 Г 0,1
Вода 100
Усього 1.92 літри
ДР 2.1.2. Приготування і стерилізація композиції А

У колбу ємністю 200 мл наливають 100 мл питної води після чого наважку солей 1.53 г (NH4)2SO4 та 0.3 г
MgSO4*7H2O зважують на технічних терезах та заносять у колбу та за допомогою обертових рухів розчиняють солі до
повного зникнення осаду. Після чого щільно закривають колбу ватно-марлевим короком, та відправляють на
стерилізацію в автоклав при температурі 131℃ на 40 хв.
ДР 2.1.3. Приготування і стерилізація композиції Б
У ємність з 1.53 літри горохового бульйону (від ДР 1.) засипають 15.3 грами сахарози та ретельно перемішують до
повного розчинення кристалів сахарози після чого розливають розчин у колбу ємністю 3 літри, яку щільно закривають
кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять на стерилізацію за температури 112℃ на 30 хв.
ДР 2.1.4 Приготування і стерилізація композиції В
В колбу об’ємом 200 мл наливають 100 мл питної води та зважену на технічних вагах наважку солей 0.77 г K2HPO4
та 0.77 г K2HPO4 засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами до повного
розчинення кристалів, колбу закривають щільно спеціальною кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в
автоклав для стерилізації за умов 131℃ на 40 хв
ДР 2.1.5. Приготування і стерилізація композиції Г

В колбу об’ємом 200 мл наливають 100 мл питної води та зважену на технічних вагах наважку 1.53 г CaCO 3
засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами для рівномірного суспендування
розчину, колбу закривають щільно кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в автоклав для стерилізації за
умов 131℃ на 40 хв.
ДР 2.2 Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у реакторі об’ємом 32 літри
Оскільки для наступного етапу вирощування посівного матеріалу нам необхідно 15.3 літри нового поживного
середовища, 15 літрів з якого займає гороховий бульйон, то нам необхідно 1.5 кг горохової муки перемолотій на
молотковій дробарці «МЛИН-3©»[30], залити 16 літрами окропу. Процес варіння буде відбуватися у кастрюлі-виварці
об’ємом 21 літр «BENSON BN-603 PROF©»[32]. Після 40 хв варіння горохової муки, утвореному бульйону дають
відстоятися протягом 1 години задля осадження зважених часточок, а після цього бульйон пропускають через фільтр
«model-273©»[33]. 15 літрів відфільтрованого бульйону зливають у реактор на 30 літрів задля подальшої стерилізації.
Таблиця 4.2
Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в реакторі об’ємом 32 літрів
Компонент Вміст, г/л Кількість для Компо Об’єм
поживного приготування зиції композиції, V, л
середовища 15.3 л
середовища, г
(мл)
Гороховий 1000 15 000 Б 15

бульйон
сахароза 10 153
(NH4)2SO4 1 15,3 А 0.1
MgSO4 0.2 3.8

*7H2O
Вода 100
K2HPO4 0.5 7.7 В 0,1
KH2PO4 0.5 7.7
(NH4)2SO4 100
CaCO3 1 15.3 Г 0,1

Вода 100
Усього 15.3 літри
У колбу ємністю 200 мл наливають 100 мл питної води після чого наважку солей 15.3 г (NH4)2SO4 та 3.8 г
повного зникнення осаду, потім щільно закривають колбу та відправляють на стерилізацію в автоклав при температурі
131℃ на 40 хв.
15 літрів горохового бульйону заливають у 30 літровий реактор змішувач (від ДР 2.3.1) після чого додають 153
грами сахарози та запускають перемішуючий пристрій реактора (150 об/хв), задля повного та швидкого розчинення
сахарози, та ставлять на режим стерилізації за температури 112 ℃ протягом 30 хв подачею пари усередину апарату
(гострої пари) через нижній спуск та одночасною подачею пари (глухої) у сорочку апарату.

В колбу об’ємом 200 мл наливають 100 мл питної води та зважену на технічних вагах наважку солей 7.7 г K2HPO4
та 7.7 г K2HPO4 засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами до повного
розчинення кристалів, колбу закривають щільно кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в автоклав для
стерилізації за умов 131℃ на 40 хв
ДР 2.2.5 Приготування і стерилізація композиції Г
засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами для рівномірного суспендування
кальцій карбонату. Колбу закривають спеціальною кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в автоклав для
стерилізації за умов 131℃ на 40 хв.
ДР 2.3.1 Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у реакторі об’ємом 320 літрів
Для наступної стадії підготовки посівного матеріалу нам необхідні 150 літрів горохового бульйону, для цього нам
15.3 кг горохової муки перемеленої на молотковій дробарці «МЛИН-3©»[30], помістити в «Котел харчоварильний
КПЕЕ-250М Ефес»[34] ємністю 250 літрів, залити 160 літрами води та варити 40 хвилин при температурі приблизно
100℃. Після процесу варіння утворений бульйон зливається у ємність об’ємом 170-200 літрів і настоюється протягом
години задля осадження зважених часточок, після чого 150 літрів бульйону фільтрується на фільтрі «model-273©»[33].
Таблиця 4.3
Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в реакторі об’ємом 320 літрів

середовища 153 л
(мл)
Гороховий 1000 15 000 Б 150

бульйон
сахароза 10 1 530
(NH4)2SO4 1 153 А 1
MgSO4 0.2 38,4

*7H2O
Вода 1000
K2HPO4 0.5 77 В 1
KH2PO4 0.5 77
Вода 1000
CaCO3 1 153 Г 1
Вода 1000
Усього 153 літри
ДР 2.3.2 Приготування і стерилізація композиції А
У колбу ємністю 2000 мл наливають 1000 мл питної води після чого наважку солей 153 г (NH4)2SO4 та 38 г
повного зникнення осаду, після чого щільно закривають колбу ватно-марлевим короком та відправляють на
стерилізацію в автоклав при температурі 131℃ на 40 хв.
ДР 2.3.3 Приготування і стерилізація композиції Б
149.7 літрів горохового бульйону (від ДР 2.4.1) заливають у реактор об’ємом 300 літрів, засипають у реактор з
бульйоном 1.5 кг сахарози та включають мішалку в реакторі та перемішують до повного розчинення, після чого реактор
переводять в режим стерилізації за температури 112℃ протягом 30 хв подачею пари усередину апарату (гострої пари)
через нижній спуск та одночасною подачею пари (глухої) у сорочку апарату.
В колбу об’ємом 2000 мл наливають 1000 мл питної води та зважену на технічних вагах наважку солей 77 г
K2HPO4 та 77 г K2HPO4 засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами до повного
розчинення кристалів, колбу закривають щільно кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в автоклав для
стерилізації за умов 131℃ на 40 хв
ДР 2.3.5 Приготування і стерилізація композиції Г
засипають у колбу та перемішують або скляною паличкою, або обертовими рухами до рівномірного розподілення
кальцій карбонату, колбу закривають щільно кришкою або ватно-марлевим короком та ставлять в автоклав для
стерилізації за умов 131℃ на 40 хв.
ДР 2.4. Підготовка та стерилізація компонентів поживного середовища для виробничого біосинтезу

Для наступної стадії підготовки посівного матеріалу нам необхідні 1500 літрів горохового бульйону, для цього нам
150 кг горохової муки перемеленої на молотковій дробарці «ДТЗ КР-20С©»[35], за допомогою технічних терез
розділити горохову муку на 2 композиції на 128 кг та на 22 кг. Композиція на 22 кг буде завантажена в «Котел
харчоварильний КПЕЕ-250М Ефес»[34] ємністю 250 літрів, а композиція 128 кг буде завантажена в реактор на 1300
літрів від ТОВ ВК «ЕНЕРГОПРОМ»[36]. Композиція з 22 кг горохової муки заливається 230 літрами води та вариться
40 хвилин при температурі приблизно 100℃, а композиція на 128 кг заливається 1300 літрами води та також вариться 40
хвилин при приблизно 100℃. Після процесу варіння утворений бульйон у двох реакторах бульйон нестерильно
зливається у збірник об’ємом 2000 літрів і настоюється протягом години задля осадження зважених часток, після чого
збірник підключається до фільтру «model-273©»[33] і 1500 літрів бульйону фільтрується. Фільтрат нестерильно стікає в
реактор об’ємом 3000 літрів
Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у виробничому ферментерів об’ємом

3200 літри.
Таблиця 4.4
Композиції стерилізації компонентів для виробничої ферментації в реакторі об’ємом 3200 літрів

середовища 1530 л
(мл)
Гороховий 1000 1 510 000 1 510

бульйон Б
сахароза 10 15 300
(NH4)2SO4 1 1 530 10
MgSO4 0.2 384

*7H2O А
K2HPO4 0.5 770
KH2PO4 0.5 770
Вода 10000
CaCO3 1 1 530 Г 10
Вода 10000
Усього 1530 літрів
У реактор ємністю 20 літрів наливають 10 л питної води після чого наважку солей 1 530 г (NH4)2SO4 380 г
MgSO4*7H2O, 77 г K2HPO4 та 77 г K2HPO4 зважують на технічних терезах та заносять у реактор та розчиняють солі за
допомогою мішалки реактора після чого нестерильним розчином 6-% HCI доводять pH до 4 та налагоджують режим
стерилізації в реакторі на наступні умови 131℃ на 40 хв подачею пари усередину апарату (гострої пари) через нижній
спуск та одночасною подачею пари (глухої) у сорочку апарату.
1497 літрів горохового бульйону попередньо залитого у реактор на 3000 літрів (від ДР 2.5.1) засипають 15 кг
сахарози та ретельно перемішують, за допомогою вбудованої в реактор мішалки, до повного розчинення кристалів
сахарози після чого реактор переводиться в режим стерилізації з за температури 112 ℃ протягом 30 хв подачею пари
усередину апарату (гострої пари) через нижній спуск та одночасною подачею пари (глухої) у сорочку апарату.
ДР 2.4.4. Приготування і стерилізація композиції Г

В реактор об’ємом 20 л наливають 10 л питної води та зважену на технічних вагах наважку 15.3 г CaCO 3 засипають
у реактор та перемішують за допомогою мішалки реактора і стерилізують при 131 ℃ 40 хв , подачею пари усередину
апарату (гострої пари) через нижній спуск та одночасною подачею пари (глухої) у сорочку апарату.
TП 3. Виробничий біосинтез
Підготовка посівного матеріалу
Т.П. 3.1. Підтримання колекційної культури
Колекційну виробничу культуру Mesorhizobium ciceri ND-64 зберігають у пробірці на скошеному щільному
агаризованому середовищі YMA (дріжджово-манітоловий агар), при температурі 2-4 ℃. Пересіви на свіже поживне
середовище проводять 1-2 рази на місяць. Всі роботи з колекційною культурою мають проводитися в умовах асептики.
ТП 3.2. Одержання робочої культури для культивування
Mesorhizobium ciceri ND-64 пересівається зі скошеного YMA на чашку Петрі з YMA методом виснажуючого
штриха задля виділення окремих колоній, після чого інкубують у термостаті при 27℃ протягом 3-х діб.
ТП 3.3. Вирощування інокуляту на агаризованих поживних середовищах

Отримані ізольовані колонії з чашки Петрі (від ТП 3.2) пересівають петлею в пробірки зі скошеним YMA (по одній
колонії на пробірку). В пробірки пересівають ізольовані колонії, що знаходяться на відстані не менше 1 см. Культивують
в термостаті при t = 27 ºC (48-72 год).
В асептичних умовах у колбу об’ємом 3 л з стерильною композицією Б (від ДР 2.2.3) зливають простерилізовані
композиції Б, В, Г (від ДР 2.2.2.–ДР 2.2.4., ДР 2.2.5), перемішують і розливають по 150 мл у 13 качалочних колб об’ємом
750 мл.
У пробірку з робочою культурою Mesorhizobium ciceri ND-64 (від ТП 3.3) вносять 5 мл фіз. Розчину та
суспендують клітини з агару, піпеткою відбирають одержану бактеріальну суспензію 7-10 мл і вносять у качалочні
колби з поживним середовищем. Для засіву однієї колби використовують бактеріальну суспензію, одержану з однієї
пробірки. Культивують у термостатичному шейкері (220 об/хв) при t = 27 ºC (24-36 год).
ТП 3.5. Вирощування інокуляту в інокуляторі об’ємом 32 л
Гороховий бульйон (від ДР 2.2.3) за допомогою асептичної передачі через стерильні труби подається з реактора-
змішувача до інокулятора об'ємом 32 літри. Тим часом в боксі в асептичних умовах у спеціальний балон для асептичної
передачі зливають розчин композиції А,В та Г, (від ДР 2.2.2., ДР 2.2.3, ДР 2.2.4), перемішують і отриманий розчин
асептично через конектор передають у інокулятор з гороховим бульйоном (від ДР 2.2.3.). Через засівну колбу вносять
1.92 л посівного матеріалу (від ТП 3.4.) На датчику перевіряють значення pH, та титрують розчинами 6% HCI або 6%
NaOH (від ДР 1.1., ДР 1.2), доводячи pH до нейтрального (6.8-7.1) Культивують до концентрації 1*10 7-10*108 КУО/мл
при t = 27 ºC з частотою обертів перемішуючого пристрою 200 об/хв і постійною аерацією впродовж 24-36 год.
ТП 3.6. Вирощування інокуляту в інокуляторі об’ємом 320 літрів
Гороховий бульйон (від ДР 2.3.3) за допомогою асептичної передачі через стерильні комунікації подається з
реактора-змішувача об’ємом 300 літрів до інокулятора об'ємом 320 літрів. Тим часом в боксі в асептичних умовах у
спеціальний балон для асептичної передачі об’ємом 3.5 літри зливають розчин композиції А,В та Г(від ДР 2.3.2., ДР
2.3.3, ДР 2.3.4), перемішують і отриманий розчин асептично через конектор перекачують у інокулятор з гороховим
бульйоном (від ДР 2.3.3.).. Через стерильне з’єднання між інокулятором на 32 літри та інокулятором на 320 літрів
перекачують 15.3 л посівного матеріалу (від ТП 3.5.) На датчику перевіряють значення pH, та титрують розчинами 6%
HCI або 6% NaOH (від ДР 1.1., ДР 1.2), доводячи pH до нейтрального (6.8-7.1) Культивують до концентрації 1*10 7-
10*108 КУО/мл при t = 27 ºC з частотою обертів перемішуючого пристрою 200 об/хв і постійною аерацією впродовж 24-
36 год.
ТП 4. Виробничий біосинтез
ТП 4.1 Виробниче культивування M. cireri ND-64
У попередньо простерилізований ферментер об’ємом 3.2 м 3 з реактора в на 3000 літрів перекачують

простерилізований гороховий бульйон (від ДР 2.4.3.). За допомогою відцентрового насосу по стерильним комунікаціям в
ферментер з реакторів об’ємом 20 літрів з композиціями А,В,Г (від ДР.2.5.2, ДР 2.5.4. ДР 2.5.5) перекачують в
виробничний ферментер з стерильним гороховим бульйоном. Вмикають перемішуючий пристрій і доводять 6 %–м
розчином NaОН (від ДР 1.3.) рН середовища за показником датчика рН до 6.8-7,1, підтримуючи ці значення протягом
всього періоду культивування. Через стерильні комунікації перекачують інокулят (від ТП 3.6.) та культивують до
концентрації 2-5*109 КУО/мл, відповідно, при t = 27±1 ºC з частотою обертів перемішуючого пристрою 200 об/хв і
постійною аерацією протягом 72 годин або до досягнення оптичної густини OD=1.2 при 600 нм у порівнянні з чистим
поживним середовищем. [48]
РОЗДІЛ 5. КОНТРОЛЬ ДОПОМІЖНИХ ПЕРЕДФЕРМЕНТАЦІЙНИХ СТАДІЙ КУЛЬТИВУВАННЯ M.CICERI
5.1 Визначення концентрації цільового продукту (Біодобрива на основі Mesorhizobium ciceri) За допомогою
спектрофотометрії.
Принцип методу: Полягає у вимірюванні оптичної густини на довжині хвилі світлового потоку у 600 нм, для
відстеження розвитку бактеріальної культури у поживному середовищі. Зміна оптичної щільності середовища показує
зміну концентрації клітин, які роблять суспензію оптично більш щільною, і за допомогою побудови калібрувальної
кривої, можна відстежити зміну концетрації клітин протягом всього періоду культивування, що дає змогу зрозуміти
динаміку росту та розвитку бактеріальної культури та вчасно зупинити культивування. Аналіз бажано робити кожні
декілька годин, але не рідше 1 разу на 12 годин. Головним недоліком методу є те, що ним неможливо визначити КУО, а
перевага заключається в швидкості та дешевизні аналізу.
Перелік необхідних матеріалів:
 Культуральна рідина певної години культивування

 Чисте, незасіяне, поживне середовище
 2 Кювети 1 см висотою з пластику або скла
 Спектрофотометр здатний працювати в на довжині хвилі 600 нм
 Дистильована вода для очистки кювет
Умови проведення дослідження:
Відберіть 3 мл культуральної рідини з поживного середовища де культивується M. ciceri та 3 мл чистого

поживного середовища, яке назначалося для культивування M. ciceri. Налаштуйте спектрофотометр на 600 нм. Заповніть
одну кювету ультуральною рідиною, а іншу поживним середовищем. Спочатку встановіть кювету з поживним
середовищем у прилад та обнуліть значення щільності на приладі. А потім не змінюючи жодних налаштувань замініть
кювету на кювету з культуральною рідиною та запишіть показник. За результатами декількох вимірювань на різних
етапах культивування зробіть калібрувальний графік.
*Якщо культуральне середовище є оптично дуже щільним рекомендується розвести його до рівня оптимальних показників приладу (0.05 ОД
для чистого поживного середовища).
Обладнання для проведення робіт:
Спектрофотометр видимої області Thermo Scientific GENESYS 140 являє собою базовий спектрофотометр, який є
водночас економічно вигідним та надійним пристроєм, який може бути використаний для вимірювання оптичної
густини культурального середовища на 600 нм, завдяки своїй здатності інтеграції з ПК, результати можуть автоматично
записуватись у базу даних виробництва. Пристрій має зручний інтерфейс та деякі функції здатен виконати автоматично.
Оптична схема 2-лучева
Завдяки невеликій ціні може бути встановлений на всі виробничі Оптичний 325… 1100 нм
дільниці підприємства.[37] діапазон
Одиниця поділу 0,2; 0,5; 1; 2 або 5 нм
шкали довжини
Характеристики: хвилі:
Відтворюваність < ± 0,2 нм
довжини хвилі:
Точність ± 0,5 нм
встановлення
довжини хвилі:
Фотометричний -3А…+3,5А
діапазон:
Фотометрична ±0.002A при 0.5A;±0.004A при
точність: 1.0A;±0.008A при 2.0A
Рівномірність <0.005A
базової лінії:
Дрейф значення <0.005A/год при 500 нм після 1
оптичної години роботи
Рис. 5.1 Спектрофотометр видимої щільності:
області Thermo Scientific Розсіяне світло: < 1.0%T 198 нм (KCl), <0.05%T
GENESYS 140[38] при 220 нм (NaI), <0.03%T при
340 нм (NaNO2)
Детектор подвійний кремнієвий фотодіод
5.2 Контроль азотного живлення:
Оскільки поживне середовище для культивування Mesorhizobium ciceri представляє собою в основному гороховий
бульйон з розчиненому в ньому солями та сахарозою, то для точного аналізу всіх нітрогеновмісних компонентів
поживного середовища, а саме: білків (амінного/органічного азоту) та амоній сульфату, нам необхідно використовувати
аналіз, який би був придатний для багатокомпонентних сумішей з невизначеним складом органічних сполук.
Оскільки такі суміші найчастіше зустрічаються саме серед харчових продуктів, то мною було прийняте рішення
все ж застосувати методику визначення загального азоту методом К’єльдаля, оскільки цей метод все ще активно
застосовується, а у процесі культивування важлива наявність азотовмісних сполук, але не їх якісний аналіз. До того ж,
як було згадано вище до складу середовища також входить амоній сульфат, що також визначається методом К’єльдаля,
що робить його універсальним для цього середовища. [39]
Метод К’єльдаля з мідно-титановим каталізатором
Загальна концепція – метод К’єльдаля є офіційним арбітражним методом визначення загального органічного та
амонійного азоту в харчовій, фармацевтичній та агропромисловості. Його концепція полягає в тому, що зразок спочатку
мінералізується та окиснюється при жорскому кіп’ятінні у розчині сульфатної кислоти та за участі мідних та калійних
каталізаторів. Завдяки цій реакції весь амонійний і амінний азот переходить в амоній сульфат. Потім завдяки дистиляції
у лужному розчині борної кислоти утворюється комплексна сіль амонію і борної кислоти, яка створює буфер. Після
дистиляції проводять титрування сірчаною кислотою і в залежності скільки знадобилося сірчаної кислоти щоб
підкислити середовище й розраховують кількість амонійного азоту, який потім перераховують у білок.[40]
Апаратна методика
Реагенти:
Індикатор метилового червоного: 1 г
Стандартний розчин хлористої або сірчаної кислоти: 0.5N
Стандартний розчин гідроксиду натрію: 0.1N
Зразок: 20-30 мл
K2SO4: 16.7 г
Безводний CuSO4: 0.01 г
TiO2: 0.6 г
Пемза: 0.3 г
H2SO4: 20 мл
Для аналізу джерела азотного живлення варто використовувати обладнання від компанії Velp scientifico, яке можна
придбати в Україні за досить низькою ціною.
До комплекту для автоматичного аналізу К’єльдаля входять:
 Мінералізатор DKL 8
 Скубер з насосом KS 1000
 Дистилятор UDK 169
Послідовність дій в апартній методиці
1) Стерильно відібрати та центрифугувати 30 мл культуральної рідини при 13000 об/хв 4℃ 10 хв
2) Змішайте реактиви в аналітичній колбі: 10 мл центрифугату культуральної рідини, 16,7 г K2SO4, 0,01 г
безводного CuSO4, 0,6 г TiO2, 0,3 г пемзи, 0,5-1,0 г і 20 мл H2SO4. (Додайте додатково 1,0 мл H2SO4 для
кожних 0,1 г жиру або 0,2 г інших органічних речовин, якщо вага зразка > 1 г.)
3) Підключить scrubber ks 1000 до мінералізатора DKL 8 задля забеспечення нейтралізаціїї шкідливих газів при
мінералізації.
4) Установить колбу/колби в мінералізатор DKL 8
5) На інфомаційній панелі виставте параметри згідно рекомендацій мануалу та чекайте завершення процесу
кип’ятіння та охолодження.
6) Після завершення мінералізації візьміть колбу з досліджуванним зразком та помістіть в дистилятор UDK 169
до якого мають бути підключені каністри з розчином дистильованої води та лугу.
7) Налаштуйте параметри дистилятору UDK 169 згідно мануалу та запустіть процес дистиляції та титрування.
8) Процес титрування та дистиляції завершується автоматично, дані про кількість білку виводяться на екран
автоматично без необхідності жодних перерахунків. [41]
Рис. 5.2. Зображення повної Рис. 5.3. Зображення

аналітичної установки для Мінералізатора DKL 8 та Рис. 5.4. Зображення
напівавтоматичного аналізу білку скруберу ks 1000 в Дистилятора UDK 169
методом К’єльдаля 5.3 Методика визначення
робочому стані
концентрації вуглецевого субстрату
Загальний принцип
В методі ВЕРХ (Високоефективна рідинна хроматографія) речовини розділяються за допомогою рухомої і
нерухомої фаз під тиском. Рухома фаза це розчин, в якому розчинена речовина, а нерухома фаза це матеріал, який
заповнює колонку. Під час пройдення рухомої фази через нерухому фазу речовини зразка взаємодіють з нерухомою
фазою. Це може призводити до сповільнення протікання речовини або повної адсорбції. Цей процес дозволяє розділити
різні речовини за молекулярною масою та фізичним об’ємом. Для ідентифікації речовин застосовуються різноманітні
детектори, а також вимірюється час, що знадобився кожній речовині для проходження хроматографічної колонки.
Методика визначення частки моно- та дисахаридів

Рухомою фазою виступає 480 мМ розчин NaOH, що попередньо готується розведенням 50 мл 50% розчину NaOH у 1950
мл чистої деіонізованної, стандартизованої води.
Контроль готується шляхом створення розчину глюкози, фруктози, сахарози та інших вуглеводів, що очікується зустріти
в розчині у концентрації 10 мМ на мл.
Характеристики:
Швидкість рухомої фази: 0.4 мл/хв
Розмір колонки: CarboPac PA1 Dionex 4 мм діаметр 250 мм довжина
Рухома фаза: 480 мМ розчин NaOH
Стаціонарна фаза: перікулярні смоли низької пористості
Температура аналізу: 30 ℃
Детектор: Електрохімічного детектора ED40 із золотим робочим електродом, що працює в режимі інтегрованої
амперометрії
Орієнтовний результат основних цукрів, що наявні у поживному середовищі:
Глюкоза: час очікування хв = 24
Фруктоза: час очікування хв = 29
Сахароза: час очікування хв = 44,9
Підготовка хроматографічної системи: Використовують деіонізовану воду, попередньо пропущену через фільтр з
діаметром пор 0.2 мкм для видалення всіх часточок.
Між насосом та інжекційним клапаном встановлюють колонку «BorateTrap» для виділення слідів боратних іонів, які
здатні псувати результати аналізу.
Готують розчини порівняння об’ємом 10 мкл та концентрацією цукру 10 мкл/мл.
Перед ін’єкцією зразку промивають колонку ілюєнтом протягом 16 хв.
Підготовка та аналіз зразка: 2.5 мл стерильно відібраної культуральної рідини центрифугують за наступних умов:
13000 об/хв 4℃ 10 хв. Після чого відбирають 10 мкл утвореного центрифугату та вводять через хроматографічну
систему, після 50 хв аналізу завершують процес та аналізують графік порівнявши площі та час піків з референтними
значеннями і контролем.[42].
Кількісний аналіз крохмалю в середовищі
Оскільки більшість вуглеводів горохового бульйону представлена саме крохмалем, який майже неможливо
аналізувати за допомогою ВЕРХ, то була розроблена окрема методика для швидкого визначення крохмалю в сировині.
Осад після центрифугування для методики ВЕРХ розводять 1 мл води та вилти у мірну колбу, потім цей розчин
заливають 25 мл. дистильованої води, після чого додають 0.1мл 0.5% розчину йоду, залишають розчин на 15 хв. А потім
за допомогою спектрофотометра вимірюють оптичну густину на довжині хвилі 590 нм. [47].
5.4 Методика мікробіологічного контролю стерильності поживного середовища

Мікробіологічний контроль стерильності поживного середовища є ключовою частиною передферментаційних
процесів, бо у разі допущення сторонніх мікроорганізмів у процесі культивування Mesorhizobium ciceri чисельність КУО
та рівень біомаси може знизитися в рази, що призведе до погіршення якості продукції, або навіть повного її псування.
Тому варто передбачити надійну методику, що б підтверджувала стерильність поживного середовища перед
основним ферментаційним процесом.
Проаналізувавши літературні джерела та валідовані практики представлені в ДФУ та ДСТУ ISO[42], я дійшов
висновку, що ці методики є досить точними, але вони не мають достатньої швидкості, оскільки згідно зазначених у
нормативних документах методах поживне середовище можна вважати стерильним, тільки після 14 дня інкубування в
термостаті, що є досить великим проміжком часу.
Тому мною була запропонована інструментальна система визначення присутності або відсутності контамінації в
зразку BacT/Alert® 3D ефективність якої була підтверджена відповідними дослідами[43] та схвалена FDA до
використання. Загалом у разі контамінації система BacT/Alert® 3D здатна автоматично визначити її за 18-30 годин.
Визначення проводиться шляхом визначення зміни концентрації CO2 у зразку методом колориметрії, а саме зміні
забарвлення індикатора що реагує CO2.[43]
Послідовна інструкція з роботи за BacT/Alert® 3D
1) Стерильно відібрати пробу простерилізованого поживного середовища 30-40 мл.

2) В стерильних умовах використовуючи шприц об’ємом 20-30 мл відібрати пробу об’ємом 10 мл та спочатку
вштрихнувши стерильну голку для шприца в фірмову ємність BacT/Alert® з поживним середовищем, а потім
з’єднавши шприц та голку інокулювати поживне середовище 10 мл зразка. Загалом для аналізу необхідно додати
10 мл зразку у три ємності з поживними середовищами BacT/Alert® SА: Використовується для виявлення
аеробних мікроорганізмів, BacT/Alert® SN: Призначене для виявлення анаеробних мікроорганізмів, стерильне
повітря замінене атмосферою азоту.
Та BacT/Alert® iAST для виявлення дріжджів та грибів.
3) Після чого за допомогою програмного забезпечення, що вбудоване в сам апарат задати шифр зразка та
роздрукувати штрих-код, наклеївши його на спеціально відведеному на фірмовій ємності місці.
4) Відсканувати код кожного зразка та позначити їх місце в інкубаторі на сенсорній
панелі.
5) Вставити зразки у відповідні ячейки інкубатора дном від себе та закрити апарат.
6) Через 15-20 годин перевірити сенсорну аналітичну панель на повідомлення щодо
виявлення або не виявлення контамінації.
Рис. 5.5. Зображення
7) В разі будь яких сумнівів щодо результату апарату BacT/Alert® тестування, зразок можна стерильно
відібрати шприцем та висіяти на чашку Петрі з iAST поживним середовищем, інкубувати
протягом 24 годин і перевірити результат.[44]
Методику мікробіологічного контролю чистоти виробничої культури
Методика чистоти виробничої культури визначається за допомогою фенотипового аналізу виробничої культури,
шляхом висіву на поживне середовище задля візуального аналізу колоній та мікроскопіюванню задля аналізу морфології
клітин.
Висів робиться на 3 типи поживного середовища, МПА, Сусло-агар та YMA агар. Як відомо літературних джерел
МПА є селективним до бактерій, але згідно даних наведених у патенті ріст Mesorhizobium ciceri на цьому середовищі не
спостерігається, Сусло-агар є селективним середовищем для грибів та дріжджів, а YMA використовується як селективне
середовище для бактерій роду Rhizobium. [45],[46]
Тож задля аналізу необхідно посіяти 0,1 мл зразка на зазначені поживні середовища, та культивувати протягом 72-
144 годин, або до появи виражених колоній Mesorhizobium ciceri, ріст має бути виражений лише на середовищі YMA, на
середовищах МПА та Сусло-агар ріст має бути або відсутній або мінімальний. [17],[19]
Колонії на середовищі YMA представляють собою: випуклі, глянцеві, діаметром 2-4 мм, мають білий колір, що по
краях колоній переходить в мутно-прозорий. [19]
Мікроскопіювання проводять за допомогою світлового мікроскопа, вживаючи всіх необхідних заходів для мікро
копіювання при збільшенні в 90 або більше разів.
При мікроскопіюванні Mesorhizobium ciceri представляють собою: грамнегативні, паличкоподібні клітини 1 мкм в
довжину та 0,5 мкм в ширину, спор не утворюють, рухливі, часто збиваються в конгломерати по 3-6 клітин. [19]
Загалом можна сказати, що відсутність або дуже слабкий ріст на середовища МПА та Сусло-агар, наявність тільки
білих колоній на середовищі YMA, та наявність тільки малих грамнегативних паличкоподібних клітин під час
мікроскопіювання підтверджують чистоту виробничої культури.
СПИСОК ВИКОРИСТАННИХ ДЖЕРЕЛ
1. «BioNitro Нут®» інтернет-портал ENZIM [Електронний ресурс] : Режим доступу:
https://market.enzim.biz/agro/inokulyanti/binitro-nut
2. Гамаюнова, В. В., & Базалій, С. Ю. (2018). Вплив застосування сучасних біопрепаратів на врожайність нуту в
умовах південного Степу України.
3. «Вплив мінеральних добрив на властивості ґрунту та ҐВК» інтернет-портал Superagronom.ua [Електронний
ресурс] : Режим доступу: https://superagronom.com/blog/894-vpliv-mineralnih-dobriv-na-vlastivosti-gruntu-ta-gvk
4. «Азотфіксація За Допомогою Рослин Та Бактерій» інтернет-портал Eos data analytics [Електронний ресурс] Режим
доступу: https://eos.com/uk/blog/azotfiksatsiia/#mikroorhanizmy
5. Лавриненко, Ю. О., Кузьмич, В. І., Боровик, В. О., & Михаленко, І. В. (2016). Стан і динаміка виробництва
зернових бобових культур у світі та Україні. Зрошуване землеробство, (65), 143-148.
6. Liu, A., Contador, C. A., Fan, K., & Lam, H. M. (2018). Interaction and regulation of carbon, nitrogen, and phosphorus
metabolisms in root nodules of legumes. Frontiers in Plant Science, 9, 1860.
7. Wanjofu, E. I., Venter, S. N., Beukes, C. W., Steenkamp, E. T., Gwata, E. T., & Muema, E. K. (2022). Nodulation and
Growth Promotion of Chickpea by Mesorhizobium Isolates from Diverse Sources. Microorganisms, 10(12), 2467.
8. Zaw, M., Rathjen, J. R., Zhou, Y., Ryder, M. H., & Denton, M. D. (2022). Rhizobial diversity is associated with inoculation
history at a two-continent scale. FEMS Microbiology Ecology, 98(5), fiac044.
9. Imran, A., Mirza, M. S., Shah, T. M., Malik, K. A., & Hafeez, F. Y. (2015). Differential response of kabuli and desi
chickpea genotypes toward inoculation with PGPR in different soils. Frontiers in microbiology, 6, 859.
10.Gebremariam, M., & Tesfay, T. (2021). Effect of P application rate and rhizobium inoculation on nodulation, growth, and
yield performance of chickpea (Cicer arietinum L.). International Journal of Agronomy, 2021, 1-14.
11.Hill, Y., Colombi, E., Bonello, E., Haskett, T., Ramsay, J., O’Hara, G., & Terpolilli, J. (2021). Evolution of diverse
effective N2-fixing microsymbionts of Cicer arietinum following horizontal transfer of the Mesorhizobium ciceri CC1192
symbiosis integrative and conjugative element. Applied and Environmental Microbiology, 87(5), e02558-20.
12.Zaw, M., Rathjen, J. R., Zhou, Y., Ryder, M. H., & Denton, M. D. (2022). Rhizobial diversity is associated with inoculation
history at a two-continent scale. FEMS Microbiology Ecology, 98(5), fiac044.
13.Hill Y, Colombi E, Bonello E, Haskett T, Ramsay J, O'Hara G, Terpolilli J. Evolution of diverse effective N 2-fixing
microsymbionts of Cicer arietinum following horizontal transfer of the Mesorhizobium ciceri CC1192 symbiosis
integrative and conjugative element. Appl Environ Microbiol. 2021 Mar 1;87(5):e02558-20. doi: 10.1128/AEM.02558-20.
Epub 2020 Dec 18. PMID: 33355157; PMCID: PMC8090884.
14.Логоша, О. В., Воробей, Ю. О., Волкова, І. В., & Усманова, Т. О. (2021). ШТАМ MESORHIZOBIUM CICERІ ND-64
— ЕФЕКТИВНИЙ МІКРОСИМБІОНТ НУТУ СУЧАСНИХ СОРТІВ. Сільськогосподарська мікробіологія, 32, 3-17.
https://doi.org/10.35868/1997-3004.32.3-17
15.Chibeba, A. M., Kyei-Boahen, S., de Fátima Guimarães, M., Nogueira, M. A., & Hungria, M. (2017). Isolation,
characterization and selection of indigenous Bradyrhizobium strains with outstanding symbiotic performance to increase
soybean yields in Mozambique. Agriculture, Ecosystems & Environment, 246, 291-305.
16.Lohosha, O., Vorobei, Y., & Leonova, N. (2023). Symbiotic Efficiency and Cytokinin Activity of New Mesorhizobium
cicerі Strains. Mikrobiolohichnyi Zhurnal, 85(1), 3-11. https://doi.org/10.15407/microbiolj85.01.003
17.Логоша, О. В., Воробей, Ю. О., Усманова, Т. О., & Стрекалов, В. М. (2019). ХАРАКТЕРИСТИКА
ВЛАСТИВОСТЕЙ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ НУТУ, ПОШИРЕНИХ В АГРОЦЕНОЗАХ ЛІСОСТЕПОВОЇ ТА
СТЕПОВОЇ ЗОН УКРАЇНИ. Сільськогосподарська мікробіологія, 29, 21-28. https://doi.org/10.35868/1997-
3004.29.21-28
18.Логоша, О. В., Воробей, Ю. О., Усманова, Т. О., & Бушулян, О. В. (2021). Screening of modern chickpea varieties by
response to bacterization. Сільськогосподарська мікробіологія, 33, 44-54.
19.Штам бульбочкових бактерій Mesorhizo-bium ciceriND-64 (IMB-7835) для одержаннябактеріального препарату
під нут: пат. 141783 Україна. МПК С12N 1/02, С05F 11/08, О. В. Ло-гоша, Ю. О. Воробей, Т. О. Усманова;
заявник і патентовласник: Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробницт-ва
НААН України; заявл. 21.10.2019; опубл. 27.04.2020, Бюл. No 8
20.Логоша, О. В., Воробей, Ю. О., Волкова, І. В., & Усманова, Т. О. (2021). ШТАМ MESORHIZOBIUM CICERІ ND-64
— ЕФЕКТИВНИЙ МІКРОСИМБІОНТ НУТУ СУЧАСНИХ СОРТІВ. Сільськогосподарська мікробіологія, 32, 3-17.
https://doi.org/10.35868/1997-3004.32.3-17
21.Штам бульбочкових бактерій mesorhizobium ciceri h-12, активний симбіотичний азотфіксатор, який
використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує врожайність нуту : пат. 17664 Україна :
C12P 1/04, C12N 1/00. № 17664 ; опубл. 16.10.2006. 8 с.
22.Howieson, J. G., & Dilworth, M. J. (2016). Working with rhizobia (p. 173). Canberra: Australian centre for international
agricultural research.
23.Mendoza-Suárez, M., Andersen, S. U., Poole, P. S., & Sánchez-Cañizares, C. (2021). Competition, nodule occupancy, and
persistence of inoculant strains: key factors in the rhizobium-legume symbioses. Frontiers in plant science, 12, 690567.
24.Braham, J. E., & Bressani, R. (1985). Effect of bean broth on the nutritive value and digestibility of beans. Journal of the
Science of Food and Agriculture, 36(10), 1028-1034.
25.МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКА - Дослідницький практикум Частина 1. Навчальні матеріали ТДАТУ.
URL: https://elib.tsatu.edu.ua/dep/ate/tpzpsg_1/page16.html (дата звернення: 26.02.20
26.Das, K., Rajawat, M. V. S., Saxena, A. K., & Prasanna, R. (2017). Development of Mesorhizobium ciceri-Based Biofilms
and Analyses of Their Antifungal and Plant Growth Promoting Activity in Chickpea Challenged by Fusarium Wilt. Indian
journal of microbiology, 57(1), 48–59. https://doi.org/10.1007/s12088-016-0610-8
27.Begom, M. F., Ahmed, M. G. U., Sultana, R., & Akter, F. (2021). Culture optimization for mass production of Rhizobium
using bioreactor made of readily available materials and agitated by air flow.
28.Силіконовий піногасник для бурових розчинів SILFOAM® SE 4260 URL: https://siloxane.com.ua/ua/p181321744-
silfoam-4260.html (дата звернення: 11.04.2024).
29.Mini Bioreactor,Glass Fermenters,Parallel Bioreactor(Glass)- Shanghai BaoXing bio-engineering equipment. Mini
Bioreactor,Glass Fermenters,Parallel Bioreactor(Glass)- Shanghai BaoXing bio-engineering equipment. URL:
https://www.china-fermenter.com/ (date of access: 15.04.2024).
30.МЛИН-ОК МЛИН-3 Кормоподрібнювач – купити за 3 470 грн в Україні | інтернет-магазин budpostach.ua.
budpostach.ua. URL: https://budpostach.ua/product/kormoizmelchitel-mlin-ok-mlin-3/ (дата звернення: 17.05.2024).
31.Фильтр "Базука" 30см. klampi.com.ua. URL: https://klampi.com.ua/filtr-bazuka-30sm (дата звернення: 10.05.2024).
32.Большая кастрюля с крышкой 21 литров BN-603. Benson. URL: https://benson.com.ua/product/большая-кастрюля-с-
крышкой-25-литров-bn-604/ (дата звернення: 12.05.2024).
33.Model 273 Automatic Self-cleaning filter. JX Filtration. URL: https://shop.filtrationchina.com/products/model-273-
automatic-self-cleaning-filter (date of access: 13.05.2024).
34.Котел харчоварильний ЕФЕС КПЕ-250 з міксером. Primus-Shop. URL: https://primus-shop.com.ua/ua/teplovoe-
oborudovanie/kotly-pishevarochnye/kotel-pishevarochnyi-efes-kpe-250-s-meshalkoi (дата звернення: 03.05.2024).
35.Кормоизмельчитель ДТЗ КР-20С. ДТЗ. URL: https://dtz.ua/ru/oborud-pererabotki-kormov/dtz-kr-20c (дата звернення:
10.05.2024).
36.Реактор 1300 літрів: продаж, ціна у Запоріжжі. Фармацевтичні гранулятори від "ТОВ "ВК ЕНЕРГОПРОМ"" -
1151925671. "ТОВ "ВК ЕНЕРГОПРОМ"". URL: https://energoprom.in.ua/ua/p1151925671-reaktor-1300-litriv.html
(дата звернення: 12.05.2024).
37.Howieson, J. G., and M. J. Dilworth. Working with rhizobia. Canberra: Australian centre for international agricultural
research, 2016, - 119 page
38.Спектрофотометр видимой области Thermo Scientific™ GENESYS™ 140. ITR GROUP.
URL: https://itrgroup.com.ua/spektrofotometri/spektrofotometr-scientific-genesys-140 (дата звернення: 08.03.2024).
39.Economou, C., Aggelis, G., Pavlou, S., & Vayenas, D. V. (2011). Modeling of single‐cell oil production under nitrogen ‐
limited and substrate inhibition conditions. Biotechnology and bioengineering, 108(5), 1049-1055.
https://sci-hub.se/10.1002/bit.23026
40.Horwitz, W., & Latimer, G. W. (1990). Official methods of analysis (Vol. 222). Washington, DC: Association of Official
Analytical Chemists.
41.VELP Kjeldahl Systems. Velp Scientifica, Analytical Instrument. URL: https://www.velp.com/en-ww/kjeldahl-
apparatus.aspx (date of access: 10.04.2024).
42.Jojima, T., Omumasaba, C.A., Inui, M. et al. Sugar transporters in efficient utilization of mixed sugar substrates: current
knowledge and outlook. Appl Microbiol Biotechnol 85, 471–480 (2010). https://doi.org/10.1007/s00253-009-2292-1
https://sci-hub.se/10.1006/abio.2000.4653
43.Bugno A, Saes DPS, Almodovar AAB, Dua K, Awasthi R, Ghisleni DDM, Hirota MT, de Oliveira WA, de Jesus Andreoli
Pinto T. Performance Survey and Comparison Between Rapid Sterility Testing Method and Pharmacopoeia Sterility Test. J
Pharm Innov. 2018;13(1):27-35. doi: 10.1007/s12247-017-9303-z. Epub 2017 Dec 5. PMID: 29497461; PMCID:
PMC5816116.
44.“BioMérieux. (2004). Bact-Alert 3D User Manual. Retrieved from
http://www.frankshospitalworkshop.com/equipment/documents/automated_analyzer/user_manuals/Biomerieux%20Bact-
Alert%203D%20-%20User%20Manual.pdf”
45.“Oxoid. (2015). Product Details. Retrieved from http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?
pr=CM0247&org=149&c=UK&lang=EN”
46.Е.З Теппер и др. «Практикум по микробиологии» М. «Колос» 1979
47.Спосіб кількісного визначення крохмалю в рослинній сировині : пат. 65517 Україна : A01G 1/00. Опубл. 12.12.2011.
48.Soussi, M., Santamaria, M., Ocana, A., & Lluch, C. (2001). Effects of salinity on protein and lipopolysaccharide pattern in
a salt-tolerant strain of Mesorhizobium ciceri. Journal of Applied Microbiology, 90(3), 476–481. doi:10.1046/j.1365-
2672.2001.01269.x
ДОДАТКИ
M. ciceri CC1192
76
M. ciceri ND-64, H-12
77
78
M. ciceri USDA 3100
79
80

Курсова робота Висоцький БТ 3 2

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Курсова робота Висоцький БТ 3 2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

Кафедра біотехнології і мікробіології

з дисципліни «Методи контролю біотехнологічних, фармацевтичних та харчових

на тему: «Біосинтез біомаси Mesorhizobium ciceri для виготовлення добрива

Здобувача (ки) ___3__ курсу ___2___ групи

Національна шкала ____________________

м. Київ – 2024 рік

2. Термін здачі здобувачем закінченого проекту (роботи) 26 квітня 2024 р.

ферментера 3,2 м3, коефіцієнт заповнення 0.6

4. Зміст розрахунково-пояснювальної записки (перелік питань, що їх

5. Перелік графічного матеріалу(з точним зазначенням обов’язкових

Пор. Назва етапів виконання проекту (роботи) Термін виконання Примітка

Дата видачі завдання “15” січня 2024р.

Керівник проекту (роботи) :

Курсова робота складається з вступу, п’яти розділів, списку

Сьогодні використання добрив на основі азофіксуючих симбіотичних

Новітність курсової роботи полягає у використанні новітнього

Середовище для культивування також є одним з переваг даного штаму,

Органолептичні показники: Рідина жовтого кольору з вираженим

Тара: Біла полікарбонатна ємність білого кольору, об’ємом 2 літра.

Норми використання: 2 літри рекомендовано використовувати не

Терміни та умови зберігання: Препарат зберігати за t° від +2°С до

Склад: Бульбочкові азотфіксувальні бактерії виду Mesorhizobium ciceri

Технологія створення добрива BiNitro Нут ENZIM Agro:

Сфера застосування: Біодобриво BiNitro Нут ENZIM Agro та вид

Мікроорганіз Склад поживного Трива Особливості Нітрогеназ Мінім Кількість Ефекти

M. ciceri MC-285 - - - - - 2*109 117% 1.СІПЛІВЕНКО, К. І. Вплив

*Ефективність симбіозу розраховувалася за формулою ( врожай

Розрахунок вартості поживних середовищ для культивування

Загальна вартість 1.58 грн

M. ciceri 750 120 2.13% 4.4 0.0044

M. ciceri 600 72 4.6% 1.58 0.0015

M. ciceri H- 600 72 4.6% 1.58 0.0015

M. ciceri 600 72 4.6% 1.58 0.0015

M. ciceri 600 72 4.6% 4 0.044

M. ciceri 600 120 2.7% 4 0.044

Розрахунок концентрації карбону, що міститься в 1 літрі поживного середовища

Розрахунок концентрації азоту, що міститься в 1 літрі поживного середовища

Інші компоненти середовища.

РОЗДІЛ 3. Обґрунтування умов і способу культивування біологічного агента та підготовки поживного

Згідно з зазначеними характеристиками штаму, можна впевнитися в необхідності проведення асептичного

Виробничий біосинтез здійснюють у ферментері об’ємом 3.2 м3 з коефіцієнтом заповнення 0,6.

Робочий об’єм ферментера (Vроб) визначають за формулою:

Vроб = Vг.ф × Кзап,

де: Vг.ф. – геометричний об’єм ферментера; Kзап – коефіцієнт заповнення, 0,6.

Vроб = 3.2 × 0,6 = 1,92 м3

Vроб.1 = 1,92 × 0,1 = 0,192 м3 посівного матеріалу

Vроб.2 = 0,192 × 0,1 = 0,0192 м3 посівного матеріалу.

Об’єм Коефіцієнт Робочий Об’єм Конденсат Об’єм

0,3 0.6 0,192 0,0192 0,0192 0,1534

0,03 0.6 0,0192 0,00192 0,00192 0,01534

0,003 0.2 (150 мл 0,00975 0,000192 -* 0,00192

Вирощування інокуляту в колбах на качалках

Композиція В: Солі K2HPO4 та KH2PO4 при 131 °С, 40 хв

Вирощування інокуляту в ферментері об’ємом 320 літрів

Стерилізація основного об’єму ферментаційного середовища

ДР 1.1 Приготування та стерилізація розчину піногасника

ДР 1.2. Приготування 6%-го розчину HCl

ДР 1.3. Приготування і стерилізація 6%-го розчину NaOH

ДР 2. Приготування та стерилізація поживних середовищ

ДР 2.1.1 Підготовка горохового бульйону

Приготування і стерилізація поживних середовищ для культивування у колбах на качалках

Здобувача (ки) _3 курсу _2_ групи