ANÀLISI INSTRUMENTAL

Bloc 2: Tècniques òptiques d’anàlisi

Lliçó 2.4: Espectroscòpia de luminescència molecular UV i

visible.
Fonaments
Lleis quantitatives
Instrumentació
Aplicacions

Anàlisi Instrumental curs 2019-2020

Fonaments
Transicions possibles:
- Principi d’exclusió de Pauli
(vida mitjana 10-8 a 10-5 s)
singulet excitat
(més probable)

singulet
fonamental

(menys probable)
triplet excitat
(vida mitjana 10-4 a 10 s)

 L’estat triplet és menys energètic que el singulet excitat

 Estats
Singulets Excitats Estat
Triplet Excitat

Excitació Emissió

Absorció Fluorescència Fosforescència

Fenòmens implicats:
- Relaxació vibracional
- Conversió externa
- Conversió interna
- Creuament entre sistemes
- Fluorescència de ressonància
(vapors atòmics diluïts)
- Desplaçament de Stokes
(molècules en solució)
Velocitat d’absorció i emissió:
Absorció: Molt ràpida (10-15 – 10-14 s)
Emissió: Força més lenta i depenent de e
• Amb e ~ 103 – 105, temps vida mitja estat excitat ~ 10-9 – 10-7 s
• En sistemes poc absorbents ~ 10-6 – 10-5 s
• Transició triplet → singulet molt més lenta: 10-4 – 10 s o superior

Rendiment quàntic o eficàcia quàntica:

Nombre de molècules que emeten luminescència

Nombre total de molècules excitades
Fluorescència i estructura molecular

• Compostos més fluorescents: GRUPS FUNCIONALS AROMÀTICS

(transicions p  p*)
• Presenten també fluorescència els compostos amb:
- GRUPS CARBONIL en estructures alifàtiques i alicícliques
Pocs
- Estructures amb DOBLES ENLLAÇOS altament conjugats

• Substituents:
• Grups donadors d’electrons: augmenten la fluorescència
( -NH2 -OH -OCH3 )
• Grups atraients d’electrons: disminueixen la fluorescència
(-COOH -NO2 -N=N- )
• Àtoms pesants (heterocicles): disminueixen la fluorescència, però
augmenten la fosforescència
Fluorescència i estructura molecular
Anells aromàtics presenten fluorescència (p  p*)

Substitució a l’anell benzènic:

 Desplaçament de la longitud d’ona d’absorció i fluorescència
 Afecta a l’eficàcia de la fluorescència
 Efecte de l’àtom pesant: augment del creuament entre sistemes
Grups funcionals aromàtics amb transicions p → p* de baixa energia :
hidrocarburs aromàtics no substituïts.
- L’eficàcia quàntica agumenta amb el nombre d’anells
- L’eficàcia quàntica augmenta amb el grau de condensació

NO FLUORESCENTS

piridina furà tiofè pirrol

FLUORESCENTS

quinoleïna isoquinoleïna indol

Efecte de la rigidesa estructural: La rigidesa augmenta la fluorescència
(La manca de rigidesa augmenta la velocitat de
conversió interna)

Ex: el complex de la 8-hidroxiquinolina amb

Zn és més fluorescent que la 8-hidroxiquinolina
perquè és més rígid

fluorè bifenil
Ex: Eficàcia quàntica: 1.0 0.2
Fluorescència i entorn químic

• TEMPERATURA: quan augmenta, disminueix la fluorescència

(augmenta l’agitació tèrmica i disminueix la viscositat
del solvent augment de la conversió externa)

• SOLVENT: si conté àtoms pesants (ex. CCl4, CH3CH2I) disminueix la

fluorescència i augmenta la fosforescència

• pH: a major nombre de formes ressonants, major fluorescència

(augmenta l’estabilitat del 1er estat excitat)
Cal un control estricte del pH

ex.
anilina ió anilini
(fluorescent) (no fluorescent)

• O2 DISSOLT: disminueix la fluorescència Quenching

(amortiguació, major creuament entre sistemes)
Fluorescència i concentració
Potència de l’emissió fluorescent (F)

• És proporcional a la potència
del feix d’excitació absorbit : IF = K’ (I0 – I)

• K’ depèn de l’eficàcia quàntica

• IF és directament proporcional a la concentració: IF = k C
• La linealitat es perd quan l’absorbància > 0.05 degut a:
- Autoamortiguació (col·lisions entre molècules)
- Autoabsorció (la l d’emissió se solapa amb la l d’absorció)
Espectres d’excitació i emissió

• Espectre excitació: I =f(lem=fixa lex=variable)

• Espectre fluorescència/fosforescència: I =f(lex=fixa lem=variable)

Instrumentació
- Components semblants als dels instruments per a UV-visible
- La majoria d’instruments són d’UN SOL FEIX
- La radiació d’emissió es mesura en ANGLE DE 90º
- Fonts: Làmpada d’arc de mercuri: emet línies útils per a l’excitació
(254, 302, 313, 546, 578, 691 i 773 nm)

Làmpada d’arc de xenó: espectre continu (300 – 1300 nm)

Làsers: sintonitzables de colorants
- Selectors de longitud d’ona: Normalment, xarxes de difracció
- Detectors: El senyal pot ser de baixa intensitat fotomultiplicadors
o sèries de díodes
- Cubetes: Totes les cares són
transparents:

cel·la de fluorescència

cel·la d’absorció
 Arc de xenó
Espectre continu des de 200 nm fins a
700 nm, després línies intenses

Arc de mercuri
Fluorímetres i espectrofluorímetres
Fluorímetres

ex: Thermo Quantech fluorometer

Font: Halògena (vis) o Hg (UV)
Selector l: Diferents filtres
Detector: Fotomultiplicador (PMT)
Espectrofluorímetres
Exemples d’instruments:

Espectrofluorímetre (λ variable)

Cambra
per a les
cubetes

 Làmpada de Xe
 Monocromador d’excitació i d’emissió de xarxes hologràfiques còncaves
 Detector de referència un fotodíode
 Detector d’emissió un fotomultiplicador
Espectrofluorímetre (λ variable)

Agilent Cary Eclipse

 Font: làmpada de Xe (xenon flash lamp)
 Selector l: Xarxa difracció (Czerny-Turner)
 Interval l: 190 - 1100 nm
 Detector: Fotomultiplicador (PMT)
Aplicacions Els mètodes fluorescents són molt sensibles

Determinació d’espècies inorgàniques:

a) Mètodes directes: Formació d’un quelat fluorescent i mesura de la seva

emissió
b) Mètodes indirectes: Mesura de la disminució de la fluorescència per
l’acció amortidora de l’anàlit
(generalment per a determinar anions)

Aplicacions sobretot per a ions

Ions de metalls de transició:
metàl·lics NO de transició
- Alguns són paramagnètics i afavoreixen el creuament entre sistemes
(redueixen la fluorescència i afavoreixen la fosforescència)
- Els seus complexos presenten molts nivells d’energia propers
(alta probabilitat de desactivació per conversió interna)
Característiques dels mètodes de fluorescència molecular:

Linealitat: Diversos ordres de magnitud. La linealitat es perd a

normalment a concentracions de l’ordre de 10-4 - 10-3 M
LODs: ≈ 10 - 0,01 mg L-1 (≈ 10-8 - 10-9 M)

Selectivitat: El nombre d’espècies fluorescents és menor en

comparació amb les espècies absorbents. Bandes amples, possibilitat
d’interferències

Precisió ≈ 1% - 0.1%

Influència notable de la matriu

Reactius fluorimètrics: Quelats fluorescents
(Estructures aromátiques amb dos o més grups funcionals donadors d’electrons)
Determinació d’espècies orgàniques

Anàlits:
• Compostos orgànics
• Enzims i coenzims
• Agents medicinals
• Productes naturals
• Esteroides
• Vitamines

Camps d’anàlisi:
• Productes alimentaris
• Indústria farmacèutica
• Anàlisi clínica
• Productes naturals
Exemple d’aplicació de l’espectrofotometria de fluorescència
molecular: Determinació de quinina en tònica

quinina

tònica: 25 - 60 mg L-1 quinina

Condicions de treball:
lex = 350 nm lem = 450 nm
Interval de treball: 0.1 – 0.6 mg L-1 quinina

Medi: H2SO4 0.05 mol L-1.

Interferències: cap
 mostra (desgasificada) solució auxiliar solució patró
H2SO4 1 mol L-1 quinina1000 mg L-1

Procediment: 5 mL
dilucions
intermèdies

aforats
100 mL

solucions de la mostra blanc solucions patró quinina

CQ = ? CQ = 0

H2SO4 0.05 mol L-1

 lex = 350 nm lem = 450 nm

patró més
concentrat
Iem= 100
blanc
Iem= 0

aforats
100 mL

solucions de la mostra blanc solucions patró quinina

CQ = ? CQ = 0
 Iem
100

Imostra

Csol.mostra CQ
dilucions

Ctònica

aforats
100 mL

solucions de la mostra blanc solucions patró quinina

CQ = ? CQ = 0
 Exemple d’aplicació: Determinació de lisina en mostres de pinsos
S’han d’utilitzar reactius derivatitzants fluorescents i fluorogènics (estructures
aromàtiques amb diversos grups donadors d’electrons)
S-R'
CHO
+ R-CH-COOH + R'-SH N CH-COOH
CHO NH2 Reactiu R
OPA (no Anàlit auxiliar Derivat
fluorescent) (fluorescent)

Matriu molt complexa

Molts aminoàcids interferències mútues
Solució: cromatografia
Exemple: Derivatització d’aminoàcids

R-CH-COOH +
NH2
H2C-O-C-Cl H2C-O-C-NH-CH-COOH
Anàlit
O O R
FMOC Derivat
(fluorescent) (fluorescent)

Problemes d’interferències!!!!!!!!!

Extracció de l'excés de reactiu