-Thiết kế mồi: Cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin của A.

parasiticus được lấy từ Genebank

(Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia, NCBI) và được liên kết với phần
mềm Bioedit. Mồi được thiết kế dựa trên các nucleotide đặc trưng của A. parasiticus. Các
đoạn mồi được thiết kế được so sánh với tất cả các oligonucleotide khác có sẵn.
-Trích xuất DNA: Sợi nấm Aspergillus từ môi trường nuôi cấy được thu thập và rửa
bằng 1,5ml NaCl 0,85% trước khi được sấy khô trong không khí ở 65oC. Sợi nấm được
giữ ở -70oC trong 10 phút và nghiền kỹ trong cối trước khi tiến hành tách chiết DNA.
-Thiết lập PCR: Các xét nghiệm PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 10µl chứa
Bộ đệm 1X, 2,5mM Mg2+ , hỗn hợp 0,8mM dNTP, hỗn hợp mồi 7,2mM, 0,5 đơn vị Taq
polymerase, 1µl mẫu DNA. Chu trình nhiệt bao gồm 5 phút khởi tạo ở 95oC, 35 chu kỳ
30 giây ở 95oC để biến tính, 30s ở nhiệt độ ủ tối ưu và 30s ở 72oC để bảo quản. Sản phẩm
PCR được phân tích bằng điện di chứa gel agarose 2% trong đệm TBE 0,5X (Promega)
được nhuộm bằng bromua.
-PCR đơn: Nhiệt độ từ 58 – 66oC được thiết lập để phát hiện A. parasiticus. Nhiệt độ ủ
tốt nhất cho bộ mồi sẽ được lựa chọn dựa trên sự có mặt của sản phẩm PCR trên gel
agarose. Các thử nghiệm về độ đặc hiệu được thực hiện với 70ng DNA từ từng chủng
riêng lẻ hoặc hỗn hợp DNA của tất cả 12 chủng. Để đánh giá giới hạn phát hiện của xét
nghiệm, chuỗi pha loãng của yếu tố 10 đã được chuẩn bị cho nồng độ DNA riêng lẻ, và
đối với hỗn hợp DNA từ 12 loài Aspergillus, và các xét nghiệm PCR được thực hiện ở
mỗi độ pha loãng khác nhau.
-PCR đa kênh: Hai bộ mồi phát hiện thành công A.parasiticus trong PCR đơn phức đã
được sử dụng trong một xét nghiệm PCR và kiểm tra lại nhiệt độ ủ tốt nhất. Độ đặc hiệu
và LOD cũng được kiểm tra theo phương pháp tương tự như PCR đơn phức với mục tiêu
là hỗn hợp DNA của 12 loài