Bài: Thẩm định quy trình phân tích

A. Quy Trình Phân Tích

- Quy trình thử nghiệm (test procedure)
- Mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện:
+ Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử, sử dụng trang thiết bị
+ Xử lý, tính toán và biện giải kết quả, v.v...
- Phân loại:
+ Quy trình định tính: đảm bảo chất phân tích có trong mẫu thử
+ Quy trình thử tinh khiết (xác định tạp chất): xác định mức độ tinh khiết của mẫu cần thử:
* Định lượng tạp chất (quantitative test for impurities’ content)
* Thử giới hạn tạp chất (limit tests for the control of impurities)
* Yêu cầu thẩm định của quy trình định lượng tạp chất nhiều hơn thử giới hạn tạp chất
+ Quy trình định lượng hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác: đo lường chất cần thử trong
mẫu thử (nguyên liệu, chế phẩm, độ hòa tan, dược liệu, dịch sinh học, …)
Câu hỏi: Quy trình phân tích là gì? Quy trình phân tích còn được gọi là quy trình thử nghiệm.
Quy trình thử nghiệm là sự mô tả một cách chi tiết các bước cần thực hiện
Câu hỏi: Có bao nhiêu loại quy trình phân tích cần phải được thẩm định? Có 4 loại quy trình
phân tích cần được tiến hành để thẩm định:
- Liên quan đến hoạt chất thì mình có 2 quy trình là quy trình phân tích định tính và quy trình
phân tích định lượng
- Liên quan đến tạp chất thì mình có 2 quy trình là quy trình định lượng tạp chất và quy trình xác
định giới hạn tạp chất
(Quy trình định tính mình hiểu là dạng bào chế nào cũng phải kiểm nghiệm)
(Quy trình định lượng là để xác định nồng độ, hoạt chất trong chế phẩm là bao nhiêu)
Câu hỏi: Quy trình định lượng tạp chất và quy trình xác định giới hạn tạp chất khác nhau
như thế nào?
Trả lời
- Quy trình định lượng tạp chất thì mình hiểu sau quá trình phân tích mình phải trả lời được chính
xác nồng độ, hàm lượng của tạp chất trong thuốc là bao nhiêu.
- Quy trình thử giới hạn tạp chất thì sau quá trình phân tích mình sẽ không biết được một cách
chính xác nồng độ, hàm lượng của tạp chất mà mình chỉ biết được nó có đạt hay không đạt trong
một khoảng giới hạn nhất định mà thôi
B. Thẩm định quy trình phân tích
- Quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp
- Chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến
- Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được
- Mục đích: Giúp thực hiện các chỉ tiêu và kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn
- Công việc bắt buộc, có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích phù hợp và kết
quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích
- Có thể đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở
C. Phạm vi thẩm định của quy trình phân tích
- Quy trình phân tích mới chưa có trong Dược điển (qui trình do nhà sản xuất xây dựng, từ các
bài báo,…) hoặc những quy trình có trong Dược điển nhưng có sự thay đổi
- Quy trình phân tích trong Dược điển: chứng minh sự phù hợp của phương pháp ghi trong
Dược điển cho sản phẩm. Thẩm định lại các qui trình phân tích sau:
+ Định tính: tính đặc hiệu
+ Định lượng (hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác, tạp chất, lượng giải phóng hoạt chất ở chỉ
tiêu độ hòa tan): tính đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại
+ Thử giới hạn tạp chất: tính đặc hiệu
D. Tái thẩm định quy trình phân tích
Tái thẩm định một phần hoặc hoàn toàn khi có sự thay đổi:
+ Thay đổi quy trình tổng hợp dược chất
+ Thay đổi thành phần công thức thuốc
+ Thay đổi quy trình phân tích hoặc thông số trong quy trình
+ Thay đổi trang thiết bị phân tích có các đặc tính khác
+ Thay đổi phòng thí nghiệm có điều kiện môi trường khác
+ Thay đổi hóa chất, thuốc thử hoặc nguồn cung cấp chất chuẩn
+ Thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống ngoài tiêu chuẩn chấp nhận khi thẩm định lần đầu
+ Xét duyệt tại các Cơ quan kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành mặt hàng
(thẩm định định kỳ)
→ Mục đích của tái thẩm định quy trình phân tích là để chứng minh sự thay đổi của quy trình phân
tích không làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích
Lưu ý: Trong quá trình tái thẩm định, tiêu chuẩn chấp nhận của các thông số khi thử nghiệm tính
phù hợp của hệ thống nên được xem xét lại nếu cần thiết
B. Các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với quy trình phân tích
Tùy loại quy trình phân tích mà mình sẽ thẩm định một trong các chỉ tiêu này:
- Tính phù hợp (tương thích) của hệ thống (system suitability) → Để biết được thiết bị của mình
có đáp ứng được các quy trình, yêu cầu trong Dược điển hay không (Đặc biệt là hệ thống sắc ký)
- Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity)
- Độ đúng (accuracy)
- Độ chính xác (precision)
+ Độ lặp lại (repeatability)
+ Độ chính xác trung gian (intermediate precision)
+ Độ tái lặp (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness)
- Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD)
- Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ)
- Tính tuyến tính (linearity) và miền giá trị (khoảng xác định, range)
- Độ bền (robustness)
Mình hiểu thẩm định là mình đi chứng minh, vận dụng quy trình phân tích vào để tiến hành phân
tích, sai số của mắc phải của mình phải nhỏ và có thể chấp nhận được.
Giờ mình sẽ tìm hiểu từng chỉ tiêu cụ thể:
1. Tính Đặc Hiệu (hay còn gọi là: Tính Chọn Lọc)
- Khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng
bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử
- Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện thử nghiệm
- Nếu một quy trình phân tích không thể thực hiện được thì phải phối hợp nhiều quy trình phân
tích hỗ trợ khác để chứng minh
Mình nhớ bất kỳ quy trình phân tích nào mình cũng phải thẩm định tính đặc hiệu
Câu hỏi: Mục đích việc thẩm định tính đặc hiệu để làm gì? Thẩm định tính đặc hiệu là mình đi
chứng minh: Khi mình đi vận dụng quy trình này để phân tích thì chỉ có chất đang phân tích mới
cho ra tín hiệu mà thôi, còn những thành phần khác thì không cho tín hiệu đáp ứng (không ảnh
hưởng đến kết quả)
Quy trình định lượng:
- Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác, tránh ảnh
hưởng của các thành phần khác có trong mẫu
- Đối với phép định lượng không hoặc kémđặc hiệu với hoạt chất cần phân tích (vídụ như định
lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ thể tích) cần có phương pháp phân tích hỗ trợ khác
(để chứng minh tính đặc hiệu) ví dụ như phải cóchỉ tiêu thử tạp chất thích hợp.
* Đối với qui trình sắc ký
+ Cần đưa ra các sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu trong đó từng thànhphần riêng
biệt phải được ghi lại (chú thích) rõ ràng.
+ Độ tinh khiết của pic cần được xác định bằng đầu dò PDA hay khối phổ.
+ Tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần được rửa giải gần
nhau nhất.
+ Phải đệ trình các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử.
+ Các thông số đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ
số đối xứng của pic v.v.
Ví dụ 3: Xác định tính đặc hiệu của quy trình định lượng desloratadin trong chế phẩm và trong
khảo sát độ ổn định của desloratadin trong quá trình xây dựng công thức bào chế siro và thành
phẩm bằng HPLC với đầu dò PDA
+ Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng (pha động), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu
phân giải (mẫu được để trong các điều kiện khắc nghiệt)
+ Tiến hành sắc ký các mẫu trên
+ Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 𝜇m). Bước sóng phát hiện 278 nm. Tốc độ
dòng 1,2 ml/phút. Thể tích tiêm 20 𝜇l. Pha động: hỗn hợp gồm 25 thể tích acetonitril và 75 thể tích
dung dịch đệm phosphat 10 mM (pH 2,5) có chứa 10 mM triethylamin
Yêu cầu
- Thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải tương đương thờigian lưu của
pic desloratadin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng không có pic trùng với pic desloratadin
- Khi thêm một lượng chất chuẩn desloratadin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của
desloratadin tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn
- Pic desloratadin tách hoàn toàn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu phân giải (nếu
có)
- Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải giống phổ UV-
Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn
- Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic desloratadin không có các thành phần
khác trong tất cả các mẫu
Câu hỏi: Dung dịch chuẩn là gì? Dung dịch chuẩn là dung dịch mà mình biết có chứa chắc chắn
hoạt chất mình cần
Câu hỏi: Dung dịch thử là gì? Là dung dịch mình đang tìm kiếm coi có chứa hoạt chất mình cần
trong đó không
Câu hỏi: Khi định tính bằng phương pháp sắc ký đồ mình sẽ đánh giá thông qua đại lượng
là gì? Thời gian lưu (tR): Tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất huyệt một cái pic
trên sắc ký đồ
(Nếu mình thấy thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau thì mình kết luận trong mẫu
thử có hoạt chất mình cần tìm)
Câu hỏi: Mẫu trắng là gì? Mẫu trắng là mẫu chỉ chứa toàn hóa dược hong có chứa hoạt chất
(Tại thời gian lưu của mẫu chuẩn thì mẫu trắng không được xuất hiện các pic sắc ký → Vì
nếu lúc này mà mẫu trắng xuất hiện các pic sắc ký thì nguy cơ cái pic mình thu được của mẫu thử
sẽ là của hỗn hợp tá dược + hoạt chất chứ không phải của riêng hoạt chất thôi)
Mình nhớ diện tích pic của mẫu thử tiêu chuẩn sẽ lớn hơn của mẫu thử (Nếu pic của mẫu thử
tiêu chuẩn không lớn hơn thì quy trình của mình sẽ không đặc hiệu)
Quy trình được gọi là đặc hiệu khi pic hoạt chất được tách khỏi các pic tạp chất
2. Tính tuyến tính
- Khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đườngbiểu diễn sự phụ thuộc giữa độ
đáp ứng (response) của đại lượng đo được (y) và nồng độ (concentration) là một đường thẳng (x)
(hay trự̣c̣̣ tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ lệ giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ (x))
- Thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bҵng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/hoặc cân riêng
biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dược chất dựa trên quy trình đã đặt ra. Cần tiến hành
ít nhất với 5 nồng độ. Trong những trường hợp khác cần nêu rõ lý do.
- Kết quả thử phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê thích hợp, ví dụ bằng cách tính
đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương cực tiểu theo phương trình y = ax + b. Thông
thường, hệ số tương quan r phải nằm trong khoảng 0,998- 1,002, nếu giá trị thu được nằm
ngoài khoảng này cần phải có thuyết minh về sự phùhợp của việc chấp nhận giá trị này.
Mình hiểu để thiết lập được phương trình đường tuyến tính thì mình sẽ pha 1 dãy nồng độ dung
dịch chuẩn từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp rồi sau đó mình đo tín hiệu đáp ứng (Tùy theo
phương pháp mà mình sẽ đọc được những tính hiệu đáp ứng khác nhau).
+ Nếu mình dùng phương pháp quang phổ để đo đạc thì sẽ có tín hiệu đáp ứng là: Độ hấp thụ
+ Nếu mình dùng phương pháp sắc ký thì mình sẽ đo được tín hiệu đáp ứng là: Diện tích pic sắc
ký
+ Nếu mình dùng phương pháp thể tích thì mình sẽ đo được đại lượng là: Thể tích
Sau đó mình sẽ tìm mối tương quan giữa tính hiệu đáp ứng với nồng độ bằng cách thiết lập phương
trình đường thẳng y = ax + b
Để đánh giá sự tuyến tính thì mình sẽ đánh giá thông qua đại lượng r2 (hệ số tương quan).
Khi r2 ra kết quả có càng nhiều số 9 sau dấu phẩy thì sẽ có độ tuyến tính càng cao.
Để tiến hành đánh giá hệ số của phương trình thì mình sẽ kiểm định giả thuyết thống kê.
3. Miền giá trị (Khoảng xác định)
- Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc
ứng dụng dự định của quy trình, được thiết lập bởi việc khẳng định quy trình đã xây dựng có tính
tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng định lượng chất phân tích.
- Ví dụ: Trong phần kết luận của phương pháp đo quang “Khoảng nồng độ tuyến tính hay khoảng
nồng độ tuân theo định luật Lambert-Beer là 4 mcg/ml –12 mcg/ml” được xác định bằng cách
+ Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính
+ Khẳng định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại hay không
- Còn phụ thuộc vào mục đích của quy trình
Mình hiểu miền giá trị là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp đến nồng độ cao (Khi mình muốn
định lượng, muốn thực hiện định tính thì đòi hỏi nồng độ mẫu thử phải nằm trong miền giá trị.
Nếu nồng độ lớn quá thì nó sẽ vượt quá ngưỡng phát hiện của thiết bị, còn nếu nồng độ thấp quá
thì thiết bị sẽ không đo đạt được kết quả có độ chính xác cao, độ đúng cao).
Yêu cầu tối thiểu của khoảng xác định theo mục đích của quy trình phân tích

Quy trình phân tích Yêu cầu tối thiểu của miền giá trị

Định lượng 80% - 120% của nồng độ thử

Xác định độ đồng đều 70% - 130% nồng độ thử. Có thể mở rộng miền giá trị tùy thuộc
hàm lượng vào bản chất của dạng bào chế (ví dụ: thuốc hít có phân liều)
Cần rộng hơn ± 20 % khoảng qui định trong tiêu chuẩn
Ví dụ: Nếu tiêu chuẩn phóng thích hoạt chất của một loại thuốc
Thử độ hòa tan phóng thích có kiểm soát là 20% sau 1 giờ và 90% sau 24 giờ thì
miền giá trị là 0% – 110% so với hàm lượng ghi trên nhản của
thuốc

4. Độ chính xác – độ đúng (Nhìn hình trong đề cương cho dễ hiểu)

Mình hiểu khi tiến hành đánh giá chỉ tiêu định lượng thì mình phải tiến hành định lượng tối thiểu
2 lần rồi lấy giá trị trung bình. Người ta chỉ quy định giới hạn tối thiểu chứ không quy định giới
hạn tối đa vì nếu mình làm càng nhiều thì kết quả càng thu được càng đạt được độ chính xác
Mình nhớ độ đúng là biểu hiện: Mức độ sát gần (Closeness) của giá trị tìm thấy so với giá trị thực
Mình nhớ độ chính xác là biểu hiện: Mức độ sát gần (closeness) giữa các kết quả thử riêng lẽ xi
với giá trị trung bình
Mình nhớ độ chính xác sẽ phản ánh mức độ lặp lại của từng lần làm phân tích, còn độ đúng sẽ
phản ánh mức độ sát gần giữa giá trị trung bình và giá trị thực.
Một quy trình yêu cầu phải vừa đạt độ đúng + vừa đạt độ chính xác
Độ chính xác
- Mức độ sát gần (closeness) giữa các kết quả thử riêng lẽ xi với giá trị trung bình
- Ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên (Sai số ngẫu nhiên là sai số mình không biết rõ nguyên nhân.
Để loại trừ sai số ngẫu nhiên thì mình sẽ tiến hành phân tích mẫu nhiều lần để coi kết quả có đạt
sự lặp lại không)
- Biểu thị bằng RSD hoặc CV
- Tiêu chuẩn chấp thuұn cho độ chính xác phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích:
+ Thông thường RSD ≤ 2% nếu không có quy định riêng
+ Phân tích các mẫu sinh học: RSD≈ 20% ở LLOQ và 15%ở nồng độ cao hơn
+ Phân tích mẫu thực phẩm và mẫu môi trường: RSD 2% - 20%
- Phân loại
+ Độ lặp lại (repeatability)
+ Độ chính xác trung gian (intermediate precision)
+ Độ tái lặp (reproducibility)
1. Độ lặp lại (repeatability)
- Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là
việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, trên
cùng một trang thiết bị và trong cùng một thời gian.
- Tiến hành tối thiểu ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 lần trong miền giá trị của phương pháp hoặc
tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%.
Mình hiểu độ lặp lại tức là mình đi tiến hành phân tích mẫu thuốc thật nhiều lần rồi từ đó tính toán
coi kết quả có đạt được sự lặp lại hay không → Độ lặp lại được đánh giá thông qua đại lượng là
RST
Đạt được độ lặp lại là khi RST ≤ 2%
2. Độ chính xác trung gian (Intermediate precision)
- Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác
nhau (độ chính xác liên ngày), với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với các trang thiết bị
khác nhau, …
- Việc xác định độ chính xác trung gian phụ thuộc vào tình hình cụ thể đối với từng phương pháp
phân tích được áp dụng. Những thay đổi điển hình cần xem xét bao gồm : ngày phân tích, kiểm
nghiệm viên, thiết bị, v.v... So sánh kết quả được thực hiện trong cùng một phòng thí nghiệm nhưng
bởi các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác, thiết bị khác. Các kết quả thu được không được
khác nhau có ý nghĩa thống kê (có thể dùng test F với khoảng tin cậy 95% để đánh giá).
Mình hiểu độ chính xác trung gian là mình sẽ làm thí nghiệm ở nhiều điều kiện khác nhau (thay
đổi các biến số của phòng thí nghiệm) như: Mình cho nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau để làm,
tiến hành thí nghiệm trên nhiều ngày khác nhau, tiến hành trên những trang thiết bị máy móc khác
nhau…để mình xem coi kết quả có đạt sự lặp lại hay không?
3. Độ tái lặp (reproducibility)
Biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm (hợp tác nghiên cứu) tiến hành nghiên cứu trên
cùng một mẫu đồng nhất đã được phân thành nhiều mẫu nhỏ.
Mình hiểu độ tái lập là mình sẽ cho nhiều phòng thí nghiệm khác nhau tiến hành phân tích để xem
coi kết quả có khác biệt có ý nghĩa hay không?
Câu hỏi: Để đánh giá độ chính xác thì mình sẽ dựa vào đại lượng thống kê nào? CV hoặc
RSD (độ lệch chuẩn tương đối). Đối với các quy trình phân tích thường quy thì yêu cầu RSD ≤
2% (Mình hiểu tức là sai số không được vượt quá 2%) (Mình hiểu khi RST càng nhỏ, càng tiến về
0 thì càng đạt độ chính xác cao)
Độ Đúng
- Mức độ sát gần (Closeness) của giá trị tìm thấy so với giá trị thực
- Ảnh hưởng bởi sai số hệ thống (Mình hiểu sai số hệ thống sẽ có tính chất lặp đi lặp lại. Sai số
hệ thống là sai số mình biết rõ nguyên nhân)
- Độ đúng cần được thiết lập trong miền giá trị (khoảng xác định) của phương pháp phân tích
- Biểu thị bởi một trong các hình thức sau
𝑋̅
Tỷ lệ % thu hồi × 100%
𝜇
𝜇: Hàm lượng chất chuẩn cho vào

𝑋̅: Hàm lượng xác định được (tìm lại được)

+ Tỷ lệ phục hồi phụ thuộc vào mẫu phân tích, qui trình xử lý mẫu và nồng độ chất phân
tích
+ Độ lệch giữa giá trị trung bình đo được và giá trị thực cùng với khoảng tin cậy.
Câu hỏi: Để đánh giá độ đúng thì mình sẽ dựa vào đại lượng thống kê nào? Tỷ lệ % thu hồi
(Hay còn gọi là tỷ lệ phục hồi) → Khi tỷ lệ càng tiến về 100% thì phương pháp càng đạt được độ
đúng)