Professional Documents
Culture Documents
реферат лаб.диагностика
реферат лаб.диагностика
Реферат
Дніпро -2021
Зміст
Вступ
Вступ
Загальний принцип.
В даний час використовується величезна кількість всіляких різновидів і
модифікацій ІФА. Широке поширення одержали різні варіанти
твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA).
Твердофазний ІФА був запропонований у 1971 році. Основні принципи
твердофазного ІФА, незалежно від модифікації, полягають в наступному:
1. На 1 етапі реакції адсорбують антигени або антитіла на твердій фазі.
При цьому ви не пов'язані з твердою фазою реагенти легко видаляються
відмиванням.
2. У сенсибілізованих лунках інкубують досліджуваний зразок. У лунках
з позитивним контролем - стандартні реагенти. При цьому на поверхні
твердої фази формуються імунні комплекси. Незв'язаних компонентів
видаляють відмиванням.
3. При додаванні кон'югату антитіло-фермент або антиген-фермент і
зв'язуванні його з іммобілізованим імунним комплексом активний центр
ферменту залишається доступним для подальшої взаємодії з субстратом.
Інкубація субстрату в лунках з іммобілізованим кон'югатом призводить до
розвитку кольорової реакції. Цю реакцію можна зупинити на потрібній
стадії, вираженість фарбування можна оцінити візуально або за оптичної
щільності.
Важливий етап будь-якого варіанту твердофазного аналізу - процедура
відмивання від непов'язаних реагентів. Важливо не просто сполоснути
фіксовані на твердій фазі компоненти, а видалити реагенти з усієї глибини
шару. Це найбільш тривалі і трудомісткі етапи аналізу. Промивання проб
може проводитися в автоматичному режимі за допомогою спеціального
приладу - вошера або вручну, багатоканальної піпеткою. Для проведення
ІФА необхідні:
- Полістироловий планшет або інші використовуються варіанти твердої
фази;
- Відмивати розчин;
- Кон'югат (мічені ферментної міткою антигени або антитіла);
- Суміш використовуваних субстратів;
- Зупиняє розчин (Стоп-реагент - розчин для останавліванія реакції);
- Зразки, що використовуються для позитивного і / або негативного
контролю;
- Стандартний антиген (для побудови калібрувальної кривої);
- Одно-і багатоканальні піпетки;
- Вошер (промивач);
- Оптичний прилад для визначення оптичної щільності досліджуваного
розчину (ІФА-рідер, зчитувач, який послідовно Фотометрують всі лунки);
- 5-100 мкл досліджуваного біологічного матеріалу.
Прямий ІФА
1. У лунках панелей адсорбують антигени або антитіла (досліджуваний
матеріал). Вище зазначалося, що антигени істотно розрізняються за
здатністю адсорбуватися на різних видах пластику в залежності від того, до
якого класу речовин (білків, вуглеводів або ліпопротеїнів) вони належать.
Часто в прямому ІФА антиген, іммобілізований на твердій фазі, це клітини та
інші корпускулярні антигени.
Контроль. В якості контролю використовують лунки з адсорбованим
позитивним контрольним зразком, в якому обов'язково міститься шуканий
антиген, і негативним контрольним зразком свідомо не містить
досліджуваного антигену. При наявності очищеного стандартного антигену
реакцію проводять у кількох розведеннях, так щоб можна було побудувати
калібрувальну криву.
2. «Блокують вільні місця зв'язування, що залишилися на твердій фазі, за
допомогою БСА казеїну та ін (для запобігання неспецифічної сорбції
кон'югату на твердій фазі).
3. В лунки вносять мічені ферментом антитіла або антигени (кон'югат),
інкубують. Зв'язування кон'югату з твердою фазою буде відбуватися лише у
випадку комплементарності обох компонентів системи. Після інкубації з
кон'югатів лунки відмивають, видаляючи, таким чином, не пов'язану частина
кон'югату.
4. Потім у лунки вносять субстрат, специфічний для використовуваного
ферменту, і інкубують. Після досягнення оптимального рівня фарбування в
лунках з позитивним контролем, ферментативну реакцію зупиняють.
5. Облік реакції. Спочатку результати реакції враховують візуально. Для
більш точного обліку результатів інтенсивність фарбування оцінюють на
ІФА-рідері з відповідним світлофільтром. За результатами проведеного
аналізу будують графік залежності оптичної плотносгі від концетраціі (рис.
2).
Непрямий ІФА
Цей варіант ІФА використовують зазвичай для виявлення специфічних
антитіл. У лунках панелей адсорбують стандартний антиген і інкубують з
зразками сироватки або іншого біологічного матеріалу, отриманого від
хворого (спинномозкова рідина, слина та ін.) Специфічні антитіла, що
зв'язалося з антигеном на твердій фазі, виявляють за допомогою
антіглобуліновой кон'югату. Залежно від мети аналізу використовують різні
антіглобуліновой реагенти, що виявляють антитіла всіх ізотипів, або
специфічні до окремих класів і підкласів імуноглобулінів. Основна перевага
методу полягає в універсальності кон'югату. Один і той же кон'югат може
служити для виявлення антитіл людини до самих різних антигенів у будь-
яких зразках. Реакція методично проста.
Основні етапи непрямого ІФА для визначення антитіл:
1. Антиген адсорбують на твердій фазі, потім відмивають від незв'язаних
компонентів.
2. Блокують вільні месга зв'язування. Відмивають.
3. В лунки вносять досліджуваний матеріал, інкубують і потім проводять
процедуру відмивання. Паралельно ставлять проби з позитивним і
негативним контролями.
4. Додають антіглобуліновой кон'югат у робочому розведенні, інкубують,
відмивають від незв'язаних компонентів.
5. Вносять субстрат, інкубують. Після досягнення оптимального рівня
фарбування в лунках з позитивним контролем реакцію зупиняють, додаючи
стоп-розчин.
6. Вимірюють кількість продукту реакції на ІФА-рідері (рис.3).
За оптимальних умов проведення аналізу метод високоспеціфічен і
чутливий. Він дозволяє виявляти нанограммовие кількості антитіл у
сироватках досліджуваних хворих. Для отримання задовільних результатів
необхідна стандартизація реагентів і методичних прийомів. Цей варіант ІФА
може також використовуватися для тестування моноклональних антитіл.
«Сендвіч» - варіант ІФА для виявлення антигенів.
Антигени, що визначаються за допомогою даного варіанту ІФА, повинні
мати кілька епітопів, здатних зв'язувати антитіла, або володіти
повторюваними, просторово розділеними епітопи однаковою специфічності.
При проведенні цього варіанту ІФА високоспецифічні полі-або
моноклональні антитіла, адсорбовані на твердій фазі, інкубують з
досліджуваним зразком. Після процедури відмивання в лунки вносять мічені
ферментом антитіла (кон'югат) до того ж антигену і далі проводять всі інші
етапи реакції. Ефективність освіти специфічного комплексу на кожній стадії
аналізу залежить від константи зв'язування реакції антиген-антитіло.
Основні етапи аналізу:
1. На твердій фазі мобілізують моноклональні антитіла або афінно-
очищені поліклональні антитіла.
2. У лунки панелей вносять досліджуваний зразок, паралельно ставлять
позитивний контрольний зразок і негативний контрольний зразок у різних
розведеннях. Інкубують і відмивають.
3. В лунки вносять мічені ферментом моноклональні або поліклональні
антитіла - кон'югат. Після інкубації проводять відмивання.
4. Вносять субстрат, інкубують. Реакцію зупиняють при досягненні
оптимального фарбування в лунках з позитивним контролем.
5. Облік результатів на ІФА-рідері.
Основною перевагою методу є висока чутливість, що перевершує
можливості інших схем ІФА (рис. 4).
Конкурентний ІФА.
Цей варіант аналізу заснований на конкуренції мічених (кон'югат) і
немічених (досліджуваних) антитіл за зв'язування з антигеном, адсорбованим
на твердій фазі. Кількість ферменту, який приєднався до твердої фази,
зменшиться пропорційно вмісту в суміші вільних антитіл. Для визначення
антигену використовується той же варіант, але в цьому випадку шуканий
антиген конкурує з міченим, стандартним антигеном за зв'язування з
антитілами, іммобілізованими на поверхні твердої фази.
Конкурентний метод вимагає мінімального числа операцій, незначного
витрати реагентів і легко може побут автоматизований. При проведенні
конкурентного ІФА для виявлення антитіл краще використовувати мічені
моноклінальних антитіла, тоді конкуренція кон'югату з досліджуваним
зразком відбувається за єдиний епітопи адсорбованого на твердій фазі
антигену. Цей варіант ІФА застосовується для визначення різних сполук,
таких як імуноглобуліни людини, раково-ембріональний антиген, інсулін та
ін Він дозволяє виявляти антитіла до діагностично значимим епітопів
інфекційних агентів.
Основні етапи аналізу для виявлення антигену (рис.5):
1. На твердій фазі мобілізують специфічні для виявляється антиген
моноклональні антитіла.
2. У лунки панелей вносять у відомій концентрації антиген, мічений
ферментом, і досліджуваний зразок. Проводять інкубацію та відмивання.
Паралельно в сусідніх лунках ставлять позитивний і негативний контролі.
Для побудови калібрування використовують стандартний немічених антиген
в різних розведеннях.
3. Додають субстрат, інкубують, зупиняють реакцію при розвитку
оптимального фарбування в лунках з позитивним контролем.
4. Облік реакції на ІФА-рідері.
У цьому випадку кількість антигену в досліджуваному зразку назад
пропорційно ферментативної активності на твердій фазі.
Інгібіторний ІФА.
У цьому варіанті ІФА антиген, присутній в досліджуваному зразку,
зв'язується з моноклональними антитілами, міченими ферментної міткою, та
інгібує їх взаємодія зі стандартним антигеном, іммобілізованим на твердій
фазі. Присутність у зразку навіть слідових кількостей специфічного до
кон'югату антигену буде пригнічувати зв'язування мічених антитіл з
іммобілізованим антигеном. Ступінь інгібування прямо пропорційна вмісту
антигену у розчині. Для проведення кількісного аналізу будують
калі6ровочную криву за допомогою послідовних розведень стандартного
антигену. Основні етапи інгібіторного ІФА для виявлення антигену (рис.6).
1. У лунках панелей адсорбують стандартний антиген. Підбирають
робоче розведення мічених антитіл за допомогою титрування.
Малюнок 4. «Сендвіч» - варіант ІФА.
2. Проводять попередню інкубацію кон'югату в розведенні, що передує
робітникові, з разведениями досліджуваного зразка, стандартного антигену і
позитивних контрольних проб.
3. Суміш переносять в лунки панелей. Для контролю 100%-ного
зв'язування в кілька лунок вносять тільки мічені антитіла, без інгібуючої
антигену. Конфіденційність інкубують, потім проводять відмивання.
4. Додають субстрат.
5. Проводять облік результатів.
Концентрація визначається антигену в досліджуваному зразку обернено
пропорційна ферментативної активності на твердій фазі.
ІФА може використовуватися не тільки для визначення розчинного
антигену чи антитіла, але і клітин, що виробляють різні білки.
Метод імуноферментних плям (ELISPOT).
У 1983 році адаптували технологію твердофазного ІФА для визначення
лімфоїдних клітин, які секретують антитіла або антигени (наприклад,
цитокіни), in vitro. Метод отримав назву ELISPOT (метод імуноферментних
зон або плям). Основний принцип методу:
1. На поверхні полистироловом лунки (використовують 24-х ямковий
панелі для культивування клітин) сорбують антигени або антитіла, які
служать «пасткових» реагентами.
2. Додають досліджувані лімфоїдні клітини, культивують кілька годин
при 37 ° С, даючи їм можливість зайняти певне місце і виконати секреторну
функцію. Антитіла або антигени, секретуються такими клітинами,
уловлюються адсорбованими на твердій фазі реагентами.
3. Клітини видаляють, використовуючи для цього відмивають розчин з
детергентом, лизирующие клітини.
4. Ділянки накопичення секреторних продуктів виявляють, додаючи
пов'язані з ферментом антитіла (антіглобуліновой реагент).
5. Додають суміш субстрату з агарози (використовувані субстрати
повинні розчинятися в агарози і утворювати нерозчинні продукти реакції), на
поверхні твердої фази утворюються коричневі або блакитні плями (у
залежності від використовуваних ферментів і субстратів), виявляючи
ділянки, де розташовувалися клітини.
• Утворилися плями підраховують під мікроскопом, це і буде кількість
секретирующих клітин.
В якості твердої фази може бути використана нітроцелюлозна мембрана
У цьому випадку є ряд переваг: із-за високої адсорбційної здатності НЦМ
потрібна значно менша кількість антигену, що використовується як
«ловушечного» реагенту, крім того, відпадає необхідність у включенні
агарози в субстрат.
При паралельному визначенні кількості секретують клітин та загальної
кількості секретується антигену чи антитіла в лунці, що можливо при
використанні іншого субстрату, можна виявити кількість секретується
речовини одиничної клітиною.
Даний метод знайшов широке застосування для оцінки кількості клітин,
які секретують антиген, вловлює адсорбованими антитілами,
використовується для визначення кількості клітин, які секретують цитокіни
(ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІФН-у, ФНП-а) .
Системи посилення сигналу.
При використанні високоаффінних антитіл чутливість окремих варіантів
ІФА дуже висока і теоретично дозволяє виявити поодинокі молекули
антигену, але на практиці чутливість обмежується низкою факторів:
активністю ферменту, інтенсивністю сигналу і методами обліку сигналу.
Системи посилення сигналу дають можливість підвищувати чутливість
різних варіантів ІФА. Розглянемо деякі такі системи:
На основі взаємодії авидин-біотин.
Молекули коферменту біотину (м.м. 244 Да) кон'югують з антитілами за
допомогою біотин-N-гідроксісукціміда. Невеликих розмірів молекулу
біотину простіше приєднати до імуноглобуліну або іншого білка без
порушення його імунних або ферментативних властивостей. Фермент в
цьому випадку пов'язують з глікопротеїном яєчного білка авидин.
Аффінносгь зв'язування авидин з біотином дуже висока (константа дисоціації
комплексу - 10-15 моль), кон'югат авидин-фермент міцно фіксується на
комплексі антиген-антитіло-біотин. Після додавання відповідного субстрату
проводять визначення продукту реакції спектрофотометрично або за
інтенсивністю люмінесценції.
Одна молекула авидин складається з чотирьох ідентичних субодиниць,
здатна взаємодіяти з чотирма молекулами біотину, що дозволяє
використовувати його як сполучну молекулу між двома біотінсодержащімі
сполуками. У цьому випадку фермент теж біотініліруют, а авидин виконує
функцію містка, поєднуючи дві молекули, що містять залишки біотину. До
комплексу, антиген-антитіло-біотин додають вільний авидин, а потім
біотінілірованний фермент. Проводять облік реакції.
Білок авидин може неспецифічно сорбироваться на інших молекулах,
тому все частіше використовують інший біотінсвязивающій білок -
стрептавідин, виявлений в бактеріях Streptomyces avidinii. Стрептавідин
також утворює міцний комплекс з біотином і складається з чотирьох
ідентичних субодиниць.
Застосування авидин-біотінового комплексу дозволяє значно підвищити
чутливість ІФА, тому що при синтезі кон'югату з однією молекулою АТ
можна зв'язати десятки молекул біотину. Отримання кон'югатів (антитіл і
ферментів з біотином) здійснюється досить легко і супроводжується
мінімальними змінами їх імунологічної та ферментативної активності.
Кон'югати ферментів з біотином можуть бути використані як універсальні
реагенти.
Використання хемілюмінесцентних реакцій.
Хемілюмінесцентні реакції можна використовувати для отримання
сигналу в ІФА, при цьому підвищується чутливість методу і скорочується час
проведення аналізу. У якості мітки в ІФА широко застосовують пероксидазу
хрону, для її виявлення можна використовувати і різні Хемілюмінесцентні
реакції. Хемілюмінесцентні реакції засновані на здатності люмінолу
світитися при окисленні перекисом водню. У прямому аналізі при
ферментативної реакції утворюється перекис водню і окисляє люмінол,
каталізатором цієї реакції виступає пероксидаза хрону. Для посилення
сигналу використовуються різні сполуки, наприклад, люціферін, феноли, в
цьому випадку інтенсивність люмінесценції посилюється в 10-100 разів, в
окремих випадках у 500 разів (посилений хемілюмінесцентний аналіз).
Люмінесцентний сигнал дуже стабільний, його рівень досягає максимуму за
30 с (для порівняння: кольорова реакція з ОФД як індикатор повністю
розвивається лише за 30 хв).
При непрямому аналізі люмінолом або його похідними метится антитіло.
Така мітка у вільному стані здатна окислюватися перекисом водню з
виділенням світла. Якщо вона утворила комплекс, то втрачає здатність
окислюватися.
На основі каскадних систем.
Для підвищення чутливості ІФА можна використовувати ферментні
каскадні системи. У цьому випадку перший фермент, пов'язаний з
антитілами, призводить до утворення відновлюваного субстрату для другої
ферментної системи. Друга ферментна система може бути субстрат-
циклічною чи редоксіцікліческой. Ферментними мітками в цьому випадку
можуть служити фосфо-глюкоізомераза, альдолаза, лужна фосфатаза.
Кінцевий продукт реакції визначають візуально або спектрофотометрично.
Системи ампліфікації в ІФА дозволяють домогтися високої чутливості.
Такі ІФА-системи використовуються для визначення рівня гормонів (ти-
реостімулірующего, прогестерону та ін.)
Практичне застосування ІФА.
ІФА знайшов широке застосування в різних областях медицини і біології
завдяки відносній простоті і високої чутливості методу. ІФА успішно
застосовується для:
• масової діагностики інфекційних захворювань (виявлення різних
специфічних антигенів або антитіл до них);
• виявлення і визначення рівня гормонів та лікарських препаратів у
біологічних зразках;
• визначення ізотипів (IgG, IgM та інші) антитіл проти конкретного
антигену;
• виявлення імунних комплексів;
• виявлення онкомаркерів;
• визначення білків сироватки крові (феритин, фібронектину і ін);
• визначення загального IgE і специфічних IgE антитіл;
• скринінгу моіоклональних антитіл;
• визначення цитокінів в біологічних рідинах.
Чутливість методу
ІФА прийшов на зміну широко використовуваним раніше в клінічній
практиці методам аглютинації, преципітації і РІА. У порівнянні з
вищеназваними методами ІФА менш трудомісткий і менш тривалий за часом,
зручний для виконання великого числа однотипних аналізів.
У ІФА поєднується унікальна специфічність иммунохимического аналізу
з високою чутливістю визначення ферментної мітки. Чутливість методу (під
чутливістю розуміють мінімальну виявляється кількість антитіл або
антигену) визначається наступними факторами: афінності антитіл, краще
використання моноклональних антитіл; специфічною активністю ферменту;
інтенсивністю сигналу; чутливістю обліку сигналу. Різні варіанти ІФА
різняться за своєю чутливості. Окремі варіанти твердофазного ІФА
дозволяють виявляти в зразку поодинокі молекули. Середня чутливість ІФА -
10-9 - 10-12 моль.
Список літератури
Галактионов В.Г. Імунологія. Видавництво Московського університету,
1998 р.
Кішкун А.А. Імунологічні дослідження та методи діагностики
інфекційних захворювань в клінічній практиці. Медичне інформаційне
агентство, 2009 р.
Кондратьєва І.А. Практикум з імунології. Навчальний посібник для ВНЗ.
Академія, 2004 р.
Лефковітс І., Перніс Б. Імунологічні методи дослідження. Світ, 1988 р.
Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Імунологія. Світ, 2000 р.
Соколов Є.І. Клінічна імунологія. Медицина, 1998 р.
Фримель Г. Імунологічні методи. Медицина, 1987 р.
Хаитов Р. М. Імунологія. Медицина, 2000 р.
Шигіна Ю.В. Імунологія: Навчальний посібник. Видавництво РІОР, 2007
р.
Ярилин А.А. Основи імунології. Медицина, 1999 р.