III tipas

jų efektorių kompleksai apima fermentų domenus, kurie suskaido RNR ir ssDNR ir kurie sintetina
antrąsias pasiuntinių molekules, kad aktyvuotų antivirusines nukleazes trans
jų efektorių kompleksai koordinuoja sudėtingą, daugialypę gynybą nuo invazinių genetinių
elementų, įskaitant DNR ir RNR fagus, plazmides. Jie skirstomi į šešis potipius (III-A iki III-F),
tačiau dažniausiai yra III-A ir III-B tipo sistemos.

III tipo CRISPR-Cas

interferencijos(lasteles
dauginimosi slopinimas veikiant
virusais)mechanizmas..
1. III tipo Csm arba Cmr
kompleksai atpažįsta ir skaido
komplementaria tikslinę target
RNR (oranžines linijas). Tie
kompleksai skaido ssDNR
(raudonos linijos) tose R kilpose
2. tuomet yra sintetinama antra
pasiuntinio molekulė , ciklinis
oligoadenilatas (cOA, pilkuosius
deimantus).
3. cOA prisijungia ir suaktyvina
papildomą nukleazę, Csm6 arba Csx1, kad nespecifiškai suskaidytų pagrindinio host ir virusų
transkriptus. Apačioje matomas cOA sintezės mechanizmas su Cas10. ATP molekulės (pilki
apskritimai, pažymėti A) polimerizuojamos į linijinius oligoadenilatus su 3′,5′-fosfodiesterio
jungtimis. Po to žiedas uždaromas, kad susidarytų cOA su 3–6 AMP viename žiede (cOA3–6).
cOA4 ir cOA6 molekulės jungiasi su Csm6/Csx1 ir aktyvinamas RNases aktyvumas. B, cOA
signalizaciją reguliuoja Csm6 / Csx1 (viršutinė eilutė) ir specialios žiedinės nukleazės (vidurinė
eilutė), kurios naudoja savo CARF domenus, kad suskaidytų cOA4 arba cOA6. Žiedinės nukleazės
gali būti išvestos iš šeimininko arba iš fagų. Apatinėje eilutėje parodyta, kaip cOA4 skaidomas
žiedinėmis nukleazėmis arba Csm6/Csx1 į linijinius diadenilatus su 2′,3′-cikliniais fosfatais (A2>P).

RNA-guided RNA cleavage by type III CRISPR-Cas complexes

III tipo CRISPR-Cas efektorių kompleksai atpažįsta RNR per bazių poravimo sąveiką su jų crRNR
ir suskaido ją naudodami savo Cas7 tipo subvienetus, Csm3 arba Cmr4 .
Kaip ir I tipo kompleksuose, crRNR įvesta efektoriaus kompleksu į nepertraukiamus segmentus,
bazių poravimui su tiksline target nukleino rūgštimi. Be to, kiekvienas Csm3 / Cmr4 įterpia "piršto"
kilpą į dulplex, apversdamas kiekvieną 6-ąją bazinę porą.
Tai labai panašu į ssDNR prisijungimą R loop kilpose vykstančią I tipo efektorių kompleksuose. III
tipo efektorių kompleksai neturi aiškios RNR surišimo srities(seed region).
Kiekvienas tikslinės RNR segmentas yra atpažįstamas ir suskaidomas nepriklausomai Csm3 arba
Cmr4; crRNR:tiksliniai neatitikimai arba deoksinukleotidų modifikacijos, kurios trukdo skilimą
vienoje vietoje, neslopina skilimo kitose vietose. Target komplementarumas nereikalingas RNR
skilimui, nors sumažėjęs bazių poravimas lemia lėtesnį skilimo greitį. III-B tipo Cmr 5′ taikinio gale
buvo užfiksuotas seed arba "target capture" motyvas, tačiau šio regiono sutrumpinimas nevisiškai
slopino RNR surišimą ar skilimą.
Skirtingai nei I tipo efektoriuose, III tipo efektorių kompleksų Cas7 tipo subvienetai (Csm3/Cmr4)
yra kataliziškai aktyvūs.
Skilimui reikalingas konservuotas Asp residue ir jis atsiranda 3 ′ kiekvienam apverstam base, todėl
gaunamas būdingas šešių nukleotidų skilimo periodiškumas. RNR skilimui reikalingas 2′-OH
tikslinėje ( target )RNR skilimui, o gautas reakcijos produktų termini turi 5′-OH ir 3′-fosfatą arba
2′,3′-ciklinį fosfatą . Tai rodo nuo metalo nepriklausomą skilimo mechanizmą, tačiau eksperimentai
rodo, kad RNR skilimui reikalingi dvivalenčiai metalo jonai.
III tipo kompleksų atominės skiriamosios gebos struktūros neleido nustatyti skilimo mechanizmo.
Taigi, norint suprasti RNR skilimo katalizinį mechanizmą III tipo efektoriais, reikės atlikti
komplekso struktūrinius tyrimus.

RNA-activated DNA cleavage by type III CRISPR-Cas effector complexes

Csm ir Cmr atpažįsta ir suskaido komplementarią viengrandę RNR in vitro . Tačiau III-A ir III-B
tipo CRISPR-Cas sistemos turi nuo transkripcijos priklausomą DNR targeting in vivo . RNR
atpažinimas alosteriškai suaktyvina ssDNR endonukleazės aktyvumą tameCas10 . DNR skilimą
katalizuoja Cas10 HD nukleazės domenas ir efektoriaus kompleksas reikalauja RNR surišimo, bet
ne RNR skilimo. HD domenas suskaido atsitiktines ssDNR sekas ir paprastai reikalauja
pereinamųjų metalų (Ni2+ arba Mn2+) maksimaliam aktyvumui, panašiai kaip Cas3 .
Kaip Cas10 aktyvuojamas surišimas ar suskaldymas ssDNR, nėra aišku, nes ssDNR nebuvo galima
vizualizuoti Csm/CMR struktūrose, o HD domene buvo pastebėta nedaug konformacinių pokyčių,
kai RNR jungėsi. Cas10 mutacijų, kurios iš esmės aktyvina ssDNR skilimą, nustatymas rodo, kad
RNR jungimasis gali palengvinti autoinhibituotą būseną.
Dėl III tipo efektorių kompleksų gebėjimo suskaidyti tiek ssDNR, tiek RNR, buvo pasiūlyta, kad III
tipo kompleksas kartu transkripcijos būdu surištų augantį transkripciją ir sukeltų tiek RNR, tiek
nevyniotos ssDNR skilimą. Tačiau eksperimentai, kurių metu Csm buvo pridėtas prie in vitro
transkripcijos reakcijų arba užstrigusių transkripcijos kompleksų, parodė, kad III-A tipo Csm
mieliau iškirpia RNR transkriptus, o ne ssDNR .
Csm gali suskaidyti ssDNR laisvose R kilpose, kurios nėra sujungtos su RNR polimeraze .
Norint nustatyti III tipo CRISPR-Cas efektorių kompleksų DNR taikinį ląstelėje, reikalingi tolesni
tyrimai. Potencialūs taikiniai gali būti nesujungtos R kilpos arba DNR replikacijos tarpiniai
produktai . III tipo efektoriai taip pat gali suskaidyti DNR transkripcijos inicijavimo metu, kai
ilgesnio ilgio ssDNR yra paveikiama su RNR polimeraze proceso, vadinamo "scrunching", metu .
DNR skilimas yra svarbus siekiant padėti išvalyti fagų infekciją, tačiau jis taip pat gali būti žalingas
šeimininko genomo vientisumui, jei jis išlieka neribotą laiką. Taigi, Cas10 laikui bėgant palaipsniui
inaktyvuojamas skilimo ir RNR disociacijos nuo efektoriaus komplekso
RNA-guided cOA synthesis in Type III complexes
Be DNR skilimo, RNR jungimasis taip pat suaktyvina Cas10 subvienetą cOA sintezei ir signalinių
efektorių aktyvavimui. cOA prisijungimas prie pagalbinių nukleazių, Csm6 (III-A) arba Csx1 (III-
B), dramatiškai stimuliuoja jų fermentinį aktyvumą. Tai sukelia virusų ir šeimininkų transkriptų
degradaciją, sukelia augimo sustojimą šeimininko ląstelėje ir skatina plazmidžių klirensą. Target
RNR skilimas ir disociacija nuo crRNR valdomo efektoriaus komplekso galiausiai inaktyvuoja
Cas10 palm domenus reikalingus cOA sintezei, o tai užkirstų kelią nuolatiniam šeimininko
transkriptų degradavimui po to, kai fagų infekcija buvo išvalyta.
III-A tipo kompleksų biocheminiai ir struktūriniai tyrimai rodo tokį cOA sintezės mechanizmą.Be
HD nukleazės domeno, Cas10 taip pat turi du Palm domenus, kurie sudaro cOA sintezės vietą.
Katalizinis cOA sintezės motyvas, GGDD, yra tik vienoje iš šių sričių. Dviejų ATP molekulių
kooperacinis surišimas palmių domenuose lemia vienos ATP molekulės 3′-OH ataką antrosios
molekulės 5′-α-fosfatui, kad būtų sukurta 3′–5′ fosfodiesterinė jungtis.
Specialus ATP atpažinimas yra tarpininkaujamas per vandenilio - surišimo sąveiką. Tolesnė šio
substrato reakcija su gaunamomis ATP molekulėmis lemia oligoadenilato grandinės ilgėjimą ir
galiausiai žiedo uždarymą per galinio nukleotido 5′-α-P ataką su 3′-OH. Ciklinių oligoadenilatų
išsiskyrimas vyksta per kanalą, kurį sudaro Cas10 ir Csm4 (99). Be to, taip pat nesuprantama, kaip
tiksliai RNR surišimas alosteriškai suaktyvina Cas10 Palm domenus cOA sintezei.

RNA-guided cOA signaling in Type III CRISPR-Cas systems

CRISPR- Cas loci sudarytas iš genų koduojančių Csm6 ir Csx1, kurie N gale turi CARF , C gale
HEPN domenus. Kai prijungiamas Coa4 RNAZĖS AKTYVUMAS padidinamas.
Nespecifinis RNR arba DNR skilimas nukleazėmis gali turėti žalingą poveikį šeimininko ląstelei.
Taigi ląstelės sukūrė specialius fermentus, vadinamus "žiedinėmis nukleazėmis", kurie skaido cOA
ir išjungia signalizacijos kelią. Žiedinės nukleazės skaido cOA4 arba cOA6, naudodamos
kataliziškai aktyvų CARF domeną (3B pav.) (110). Kai kurie Csm6/Csx1 ortologai savo CARF
domenuose taip pat turi vidinį žiedo nukleazės aktyvumą, dėl kurio laikui bėgant lėtai
inaktyvuojasi. Skilimas vyksta dviem etapais: pirmasis etapas sukuria linijinį oligoadenilatą su 2′,3′-
cikliniu fosfatu, po to seka antrasis etapas, kuriame jis padalijamas į dvi dalis. Įdomu tai, kad anti-
CRISPR baltymai, kurie inaktyvuoja III tipo CRISPR-Cas sistemas, yra arba labai aktyvios žiedinės
nukleazės arba baltymai, kurie jungiasi su Cas10 ir slopina jo ciklinį oligoadenilato aktyvumą.
Tolesni tyrimai, matuojantys faktinę cOA koncentraciją ląstelėse ir tiek šeimininko, tiek viruso
transkripcijos lygį infekcijos metu, atskleis, ar šie kinetiniai modeliai tiksliai apibūdina, kaip III tipo
cOA signalizavimo kelias apsaugo ląsteles nuo įsibrovėlių.

Regulation of Type III Cas10 by tag:anti-tag pairing

Visos imuninės sistemos turi atskirti save nuo nesavęs. Antisence transkripcija visoje CRISPR array
matricoje gamina RNR molekules, kurios komplementarios crRNR . Kad šie antisence transkriptai
nesukeltų autoimuniškumo komplementarumo tarp crRNR 5′tag-žymos ir "anti-tag žymos" sekos,
esančios šalia 3′ galo, tikslinė RNR slopina Cas10 fermentinę veiklą.
III-A tipo sistemose bazių poravimas tarp padėčių nuo −2 iki −5 crRNR 5′-ir atitinkamose anti-tag
padėtyse yra labai svarbios atpažįstant savo RNR.
III-B tipo sistema iš Thermotoga maritima, slopinimas panašiai tarpininkaujamas tag:anti-tag
komplementarumu, tačiau jį papildomai sustiprina guanino priešinga padėtis -1 crRNR tag
žymoje .Kaip šis guaninas skatina Cas10 slopinimą, neaišku.
III-B TIPO CRISPR-Cas sistema iš Pyrococcus furiosus taip pat atpažįsta "protospacer-flanking
seką" pirmuosiuose trijuose nukleotiduose, esančiuose šalia 3′ taikinio galo. Neaišku, kaip
protospacer-flanking seką atpažįsta P. furiosus Cmr ir ar tag:anti-tag komplementarumas vis dar
vaidina svarbų vaidmenį. Tolesnė analizė, kaip III tipo kompleksai jungia skirtingas anti-tag sekas,
pagerins mūsų supratimą apie tai, kaip RNR surišimas reguliuoja tiek ssDNA skilimą, tiek cOA
signalizavimą Cas10.

Comparison of type III CRISPR-Cas systems with other nucleotide-based immune systems in bacteria
and eukaryotes
Naujausi tyrimai rodo, kad III tipo CRISPR-Cas sistemos nėra vienintelės bakterinės imuninės
sistemos, kurios signalizacijai naudoja ciklinius nukleotidus. Pavyzdžiui, ciklinis GMP-AMP
sintazės (cGAS) tipo fermentas bakterijų gynybos modulyje sintezuoja ciklinį GMP-AMP,
reaguodamas į fagų infekciją, kuri sukelia membranos skilimą veikiant fosfolipaze ir ląstelių mirtį.

Editing and applications of Class 1 CRISPR-Cas effectors

Nors 1 klasės sistemos yra mažiau naudojamos nei 2 klasės sistemos redaguojant genomą, jos
atsiranda kaip genomo ir transkriptomos manipuliavimo įrankiai tiek mikrobų tiek eukariotinėse
ląstelėse.
Bakterijose, I tipo CRISPR-Cas efektorių nukreipimas į DNR sekas, kai nėra Cas3 arba kai Cas3
yra slopinaamas, anti-
CRISPR, sukelia
transkripcijos slopinimą.
Transkripcijos slopinimas yra
stipriausias, kai guide RNR
nukreiptos į promotorių, o ne
į ORF.

A, I tipo CRISPR-Cas
efektorių kompleksų
taikymas apima
transkripcijos slopinimą /
aktyvavimą, genominių
delecijų generavimą, dsDNR skylimo generavimą ir didelių DNR fragmentų įterpimą (iš kairės į
dešinę). III tipo efektorių programos apima RNR išmušimą su Csm arba Cmr (kairėje).
C, būsimas 1 klasės CRISPR-Cas sistemų pritaikymas. Multisubunit I ir III tipo kompleksai galėtų
būti sulieti į įvairius funkcinius domenus DNR ir RNR redagavimui. Keli subvienetai vienam
efektoriaus kompleksui taip pat galėtų palengvinti multiplexing. III tipo sistemų cOA signalizacijos
kelias galėtų būti panaudotas ląstelių būsenų kontrolei prokariotuose ar eukariotuose, sujungiant
cOA surišančias nukleazes su cOA sintetaze.
I tipo sistemos taip pat buvo įvestos į įvairius ląstelių tipus DNR modifikavimui.
I tipo efektoriaus komplekso ir Cas3 spiralės-nukleazės įvedimas į žinduolių ląsteles lemia tolimas
chromosomų delecijas DNR. Šios delecijos yra vienakryptės, atitinkančios Cas3 skilimo
biocheminius tyrimus.I-E tipo efektoriai, sulieti su FokI nukleaze, taip pat gali būti užprogramuoti
su pora guide RNR, kad sukeltų dsDNR lūžius, sukeliančius mažas delecijas.
Įrodyta, kad su transpozaze susijusios I-F tipo sistemos specialiai įterpia sintetinę "cargo" DNR iki
10 kb ilgio į E. coli su dideliu tikslumu, todėl tai žada kaip metodą išjudinti genus nereikalaujant
homologinės rekombinacijos. Naujausi išankstiniai spaudiniai pranešė apie su TRANSPOZAZE
susijusių I-F tipo sistemų naudojimą tiksliniam atsparumo antibiotikams genų įterpimui į mikrobus
ir sutankintą genų įterpimą į bakterijų rūšis.
I ir III tipo kompleksai įvedami į eukariotines ląsteles naudojant nukleofection, ar vektorius.
III tipo sistemose RNR atpažinimas sukelia nespecifinį ssDNR skilimą ir cOA signalizavimo kelio
inicijavimą, kuris suaktyvina papildomas nukleazes DNR ar RNR skilimui trans. III tipo sistemose
taip pat yra laikmatis, skirtas savaiminiam inaktyvavimui, lėtai skylant RNR taikiniui ir skaidant
cOA, antrąjį pasiuntinį. Kritinius trukdžių žingsnius slopina anti-CRISPR baltymai prieš abi
sistemas.