I.

TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LEPTOSPIROSIS

1.1. Tình hình dịch bệnh Leptospirosis trên thế giới

Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền
nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được Tổ
chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal Health- OIE) xếp
vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm [39] và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề
nghiệp ở Việt Nam [55]. Nguyên nhân gây ra bởi một loại xoắn khuẩn Leptospira
interrogans (Blood, 1989). Bệnh lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc
các màng nhầy tiếp xúc với nước bị ô nhiễm nước tiểu động vật nhiễm bệnh. Theo
các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi trên thế giới,
nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn
nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng
nhiệt đới [1, 2, 58]. Tỷ lệ mắc bệnh hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân ở
các quốc gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở khí hậu nhiệt đới. Theo Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ 7 đến 10 triệu
người nhiễm xoắn khuẩn vàng da [38]. Do tính đa dạng của các triệu chứng, bệnh
do Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số vùng có thể lên đến 20%-
25%, thậm chí dù được điều trị, hội chứng Weil vẫn có tỷ lệ tử vong cao hơn 10%
[36]. Ở các nước đang phát triển, những người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và
người nghèo ở các thành phố. Ở các nước phát triển, những người thường phải làm
việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh [54].

Bệnh Leptospirosis rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm, như động
vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình, đồng
thời Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên. Đặc biệt bệnh này
càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp phát triển (kéo theo đàn gia súc
đông đúc) và có tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát
triển) [60].

Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặc tìm
DNA của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang mầm bệnh

1
[26]. Chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sử dụng để chẩn
đoán bệnh do xoắn khuẩn gây ra. Các phương pháp chẩn đoán khác như sử dụng
kính hiển vi tụ quang nền đen, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, PCR, phương
pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể cũng được sử dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật
PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của Leptospira chỉ thực hiện ở các trung tâm
lớn. Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã được thiết lập, trong đó một số đặc
hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một số loại đặc hiệu ở mức serovar.

1.2. Tình hình dịch bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh Leptospirosis được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu
tiên trên người năm 1931. Sau đó, xảy ra vụ dịch ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại
nhiều gia súc và nhiễm cho cả người [57]. Đến nay, bệnh có ở tất cả các vùng miền
trong cả nước. Trong những năm gần đây, nguy cơ bùng phát dịch bệnh nhiễm xoắn
khuẩn Leptospira có chiều hướng ngày càng gia tăng do tình hình vệ sinh môi
trường thấp kém, úng ngập thường xuyên, kéo dài, và hệ thống kiểm soát bệnh gia
súc còn yếu kém. Có ổ dịch lớn đã xảy ra ở lợn tại Nam Định, một vài nơi đã xuất
hiện ổ dịch nhỏ như ở lợn tại Bắc Ninh, ở bò tại Hải Dương, Vĩnh Phúc và Phú
Thọ. Bệnh gây thiệt hại nặng về kinh tế, đặc biệt ở những đàn gia súc sinh sản. Ở
người, theo TS. Lê Công Tảo, Phó trưởng khoa Sốt rét, Ký sinh trùng động vật
(Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội) cho biết, Leptospirosis vốn được coi là bệnh ở
các vùng núi, đầm lầy nông thôn, nhưng hiện nay đã tràn xuống vùng địa hình dân
cư đông đúc, nghèo nàn tại các thành phố lớn [25]. Mỗi năm ở Hà Nội có 10 - 15
người mắc. Từ tháng 4/1999 đến 12/2002, tại thành phố có 28 ổ dịch trên người.
Tại các khu dân cư, bến xe, bến tàu (nơi cư ngụ lý tưởng của chuột) nguy cơ bùng
phát dịch Leptospira là rất lớn. Kết quả xét nghiệm trên 103 mẫu chuột bắt tại 15
điểm ở Hà Nội trong tháng 5/2003 cho thấy: 62% nhiễm xoắn khuẩn Leptospira
(trong đó chuột cống chiếm 64%, còn lại là chuột nhà). Kết quả xét nghiệm huyết
thanh chuột tại ga Giáp Bát, nhà máy bia Hà Nội và nhiều chợ trên địa bàn cho
thấy, tỷ lệ nhiễm Leptospira đều ở mức 50 - 100%. Đặc biệt, 100% mẫu ở ga Giáp
Bát, chợ Cầu Giấy, 130 Thụy Khuê đều dương tính. Hằng năm, Sở Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn Hà Nội đều tổ chức diệt chuột, nhưng chỉ tập trung vào chuột

2
"đồng" tại một số huyện ngoại thành. Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội đã đề nghị
tổ chức diệt chuột đồng loạt trước mùa mưa bão (vào tháng 6, 7) để ngăn chặn sự
phát sinh và tạo thành các ổ bệnh Lepto. Tuy nhiên, công việc này không phải lúc
nào cũng thực hiện được đầy đủ. Do vậy, dịch bệnh xoắn khuẩn Leptospira vẫn là
một vấn đề sức khỏe cấp thiết cần quan tâm tại Việt Nam [30].

Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắn
khuẩn [31]. Nghiên cứu dịch tễ học mô tả sử dụng số liệu hồi cứu cho thấy tổng số
ca mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369 ca và
không có trường hợp tử vong. Tỷ suất mắc xoắn khuẩn trung bình trong 10 năm
nghiên cứu là 0,05 ca/100.000 dân/năm trong đó tỷ suất mắc cao nhất vào năm 2004
với 0,25 ca/100.000 dân/năm. Tây Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ là hai vùng sinh thái
tập trung nhiều nhất số trường hợp mắc Leptospira. Người mắc bệnh mang tính chất
nghề nghiệp rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa
chất, lâm nghiệp hay mắc bệnh. Mặc dù bệnh này luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm
cao cho người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng
như về nhận thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không được kiểm tra
chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng, đồng
thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo [56].

II. TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN VẮC XIN PHÒNG CHỐNG BỆNH
LEPTOSPIROSIS

Việc sử dụng kháng sinh để ngừa bệnh không đem lại hiệu quả rõ ràng [54].
Một số vắcxin dùng cho động vật để phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da có thể làm
giảm nguy cơ lây lan sang người. Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng
bệnh này vẫn còn hạn chế. Từ lâu đã được dự kiến sẽ tìm thấy một loại vắc xin hiệu
quả để ngăn ngừa bệnh do Leptospira thông qua tiêm chủng cho người và động vật
có nguy cơ lây nhiễm cao với chi phí cho nghiên cứu và ứng dụng lên tới hàng triệu
đô la. Có nhiều loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis: vắc xin sống [9, 34], vắc xin
lipopolysaccharide (LPS) [7, 16, 50, 65], vắc xin lipoprotein [10, 22, 27, 28, 52,
63], vắc xin protein màng ngoài (OMPs) [11, 18, 19, 23, 40, 61], và vắc xin các yếu
tố độc lực tiềm năng [9, 35, 51, 64]. Hiện nay, một loại vắc xin phòng chống bệnh
3
Leptospirosis cho người đã có sẵn ở một số nước như Cuba và Trung Quốc kết quả
tương đối khả quan, tuy nhiên chưa được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp
tục nghiên cứu về độ an toàn của vắc xin này. Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có
một vài chủng. Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong
phòng bệnh do Leptospira. Nó được xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học
hiện đại [3, 11, 18, 28, 43, 52, 53], nhưng trong đó vắc xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin
lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổ hợp được quan tâm hơn cả. Những
đặc trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đã được kiểm nghiệm, nó gồm: protein
ngoại màng (OmpL1), lipoprotein (LipL41) [13, 24], hemolysis-associated protein
1 (Hap1) [6], và protein miễn dịch (Lig) [42]. Năm 1993, lần đầu tiên OmpL1 được
báo cáo [21]. Sáu năm sau đó, nghiên cứu trên mô hình chuột đã chứng minh tác
dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xin OmpL1 và LipL41 [24]. Vào năm 2002,
LigA được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein [42], sau đó các phản
ứng miễn dịch của protein LigA, LigB cũng được xác nhận [28, 43, 53]. Hơn nữa,
gene Lig đã được chứng minh là hữu ích trong việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [41].
Một số protein ngoài màng khác như LAg42, Loa22 [29], Lk73.5 [3] cũng được
công nhận là ứng cử viên trong việc tạo vắc xin phòng bệnh do Leptospira, tuy
nhiên chúng vẫn chưa được tiến hành thử nghiệm trong các mô hình động vật để
phát triển thành vắc xin. Lipoprotein là protein quan trọng trong leptospires, những
protein có nhiều ở màng ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo. Mặc dù
khó khăn trong việc sản xuất lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một
số loại lipoprotein như LipL41 [20], LipL32 [22], LipL45 [35] và LipL21 [12] đã
được báo cáo là các ứng cử viên thích hợp cho việc tạo ra vắc xin lipoprotein tái tổ
hợp. Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng được dự đoán là một trong những ứng cử
viên, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử khối u, interleukin-10 và CD69
[15]. Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây bệnh L. interrogans hoặc chủng
không gây bệnh L. biflexa. Trong một vài công trình nghiên cứu trước đây đã có
báo cáo về yếu tố độc lực của Leptospira, bao gồm FlaA, FlaB [48], Hsp58 [45],
SphH [32, 33] và ChpK [47] đều có thể được coi là ứng cử viên cho vắc xin
Leptospirosis. Gene mã hóa yếu tố độc lực FlaB (gene flab) có thể được khuếch đại
từ hệ gene DNA của nhiều chủng.
4
 Chỉ có protein Lig, LipL41 và Hap1 được phê duyệt như vắc xin phòng chống
Leptospira ở động vật. Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hàng loạt các
protein ngoài màng (LAg42, Loa22, Lk73.5), lipoprotein (LipL32, LipL45, LipL21
và GLP) và các yếu tố độc lực mới được phát hiện (Hsp58, flaA, Flab, SphH và
ChpK) có thể giúp chúng ta tìm thấy vắc xin phù hợp hơn [4, 5, 8, 26, 36, 44, 49,
59, 62]. Bởi vì hệ gene của L. interrogans chủng Icterohaemorrhagiae Lai [51] và L.
interrogans chủng Copenhageni [37] có biểu hiện dị hợp của protein ngoài màng
(OMPs), điều này mở ra một khả năng mới cho việc phát triển vắc xin [65]. Tóm
lại, vắc xin phòng bệnh do Leptopira nói riêng cũng như các loại vắc xin khác nói
chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạo một bức tường bảo vệ con
người cũng như động vật khỏi những tác nhân gây bệnh.
Tại Việt Nam hiện có một số cơ sở đã sản xuất các loại vắc xin Leptospirosis,
như vắc xin Leptospira vô hoạt của Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương
(Vetvaco). Kháng nguyên là vi khuẩn Leptospira được vô hoạt bằng methiolat bao
gồm 6 chủng: L.pomona, L.canicola, L.mitis, L.ictero haemohagiae, L.bataviae và
L.grypothyphosa. Chúng tương đồng về mặt kháng nguyên với đa số các chủng gây
bệnh xoắn trùng (Leptospirosis) đang lưu hành tại Việt Nam. Với 2 lần tiêm cho gia
súc, nhưng thời gian tạo miễn dịch bảo hộ chỉ trong vòng 6 tháng. Hoặc vắc xin vô
hoạt PALATO.VACL của Công ty cổ phần Nanovet, có thể phòng 3 bệnh: khô thai,
sảy thai truyền nhiễm, và lepto. Tương lai của việc phát triển vắc xin phòng bệnh
Leptospirosis là tìm ra một loại có khả năng phòng bệnh cho một số lượng lớn
người khỏe mạnh và động vật để làm tăng khả năng kháng bệnh, như vậy, vắc xin
phải có độ an toàn cao [14, 17]. Tuy nhiện, hiện nay tại Việt Nam chỉ đang lưu hành
2 loại vắc xin Leptospirosis vô hoạt và nhược độc phòng bệnh cho gia súc. Trong
đó, các vắc xin nhược độc được thực hiện bằng cách tiêm truyền các xoắn khuẩn đã
được giảm độc lực vào vật chủ với hi vọng giúp vật chủ tạo kháng thể chống lại
bệnh xoắn khuẩn nhưng không kích thích sự phát triển của các loại xoắn khuẩn này
đủ để gây bệnh cho cơ thể đó. Rõ ràng, phương pháp này không thể đảm bảo đủ an
toàn. Vắc xin vô hoạt Leptospirosis đã được nghiên cứu rộng rãi trong thập kỷ 70-
80 của thế kỷ 20. Những năm gần đây, việc sử dụng kết hợp cả vắc xin nhược độc
và vô hoạt trong phòng bệnh cho hiệu quả phòng bệnh cao hơn.

III. Định hướng tiếp theo trong việc nghiên cứu chế tạo vacxin Lepto:
1. Đánh giá các chỉ tiêu của Protein tái tổ hợp
1.1 Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng Protein khác nhau
Để có cơ sở đánh giá chất lượng kháng nguyên (protein) chúng ta phải định
lượng hàm lượng protein có trong dung dịch mẫu theo nguyên tắc từ nồng độ
thấp đến nồng độ cao ( giả định 0,1; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 mg/ml … )
5
 Dung dịch mẫu sẽ được chia làm các nồng độ từ thấp đến cao sau đó tiêm
cho thỏ (2–2,5kg/con) 2 mũi cách nhau 7 ngày. Mỗi nồng độ tiêm cho 04 thỏ,
đối chứng là 02 thỏ không tiêm. Sau 14 - 21 ngày tiến hành lấy máu, chắt huyết
thanh và kiểm tra hàm lượng kháng thể trong huyết thanh bằng phản ứng Vi
ngưng kết.
Kháng nguyên là Leptospira sống (chứa 108 Leptospires/ml) được nuôi cấy
trong 4 – 8 ngày ở môi trường nuôi cấy thích hợp (Terskits).
Kiểm tra kết quả: kiểm tra qua phản ứng vi ngưng kết trên phiến kính với
từng chủng Lepto đang nghiên cứu với huyết thanh ở nồng độ pha loãng 1/50.
Đọc kết quả sau 20-30 phút trên kính hiển vi nền đen. Nếu có 2 mẫu huyết
thanh dương tính, trong khi đối chứng âm tính thì Protein ở nồng độ đó đạt yêu
cầu về tính sinh miễn dịch và có thể sử dụng để chế tạo vacxin.
Trên cơ sở các mẫu có hàm lượng Protein đạt yêu cầu về tính sinh miễn
dịch thì ta tiến hành xác định độc lực của kháng nguyên.
1.2. Kiểm tra Độc lực:
a, Với chuột lang non
Với chuột lang non (khối lượng từ 120 g/con đến 130 g/con): Tiêm dung dịch
mẫu đã xác định hàm lượng protein vào xoang bụng. Kết quả có thể sẽ gây sốt nhẹ
(tăng 0,5 0C đến 1 0C), loại bỏ các nồng độ gây hoàng đản ở niêm mạc mắt, hoặc
chết.
b, Với thỏ non
Với thỏ non (khối lượng từ 200 g/con đến 250 g/con): Tiêm dung dịch mẫu
đã xác định các hàm lượng Protein vào xoang bụng. Kết quả có thể gây sốt nhẹ
(tăng 0,5 0C đến 1 0C), không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt; Loại các nồng độ gây
hoàng đản ở niêm mạc mắt, hoặc chết hoăc có các triệu chứng lâm sàng khác của
bệnh.
2. Xây dựng qui trình chế tạo vacxin lepto phòng bệnh Leptosirosis
2..1. Chuẩn bị kháng nguyên (protein):
Dung dịch mẫu chứa Protein ở nồng độ (hàm lượng protein) tối ưu. Cụ thể:
không gây độc trên chuột lang non và thỏ non; đồng thời có tính sinh miễn dịch
và có miễn dịch chéo giữa 5 chủng Lepto nghiên cứu.
2.2. Chuẩn bị chất bổ trợ:
Chất bổ trợ là keo phèn đạt tiêu chuẩn như: hàm lượng Al2O3, SO4 , sức hút
1/800,…
Chất bổ trợ là nhũ dầu đạt tiêu chuẩn cơ sở, đảm bảo an toàn.
2.3. Phối trộn và chia liều vacxin
2.3.1 Công thức 1: Tỷ lệ phối trộn: Keo phèn / Kháng nguyên = ¼

6
- Chuẩn bị:
+ Keo phèn (Al(OH)3) đạt tiêu chuẩn được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210c/30 phút.
(Sức hút 1/800, Al2O3 đạt 2,5-6%, SO4 đạt <3%)
+ Protein chuẩn đã được kiểm tra các chỉ tiêu (hàm lượng protein, độc lực, tính
sinh miễn dịch) sẽ được kiểm tra vô trùng trên 4 loại môi trường cơ bản, theo dõi
trong thời gian 7 – 10 ngày. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển thì đạt và đưa
vào sản xuất vacxin.
- Phối trộn:
+ lắc đều bình chứa keo phèn đã được vô trùng. Bơm từ từ Protein chuẩn vào trong
bình chứa keo phèn. Lắc đều trong cả quá trình.
- Thu hoạch: Bình bán thành phẩm sẽ được kiểm tra vô trùng và bảo quản ở nhiệt
độ 2-80C. Sau khi có kết quả kiểm tra vô trùng đạt tiêu chuẩn thì tiến hành chia
liều.
2.3.2. Công thức 2: Tỷ lệ phối trộn: Nhũ dầu/ kháng nguyên = ½
- Chuẩn bị:
+ Nhũ dầu gồm 3 thành phần đơn với tỷ lệ là Eolan:Span:Tween 80 = 9:6:4
các chất được hấp vô trùng riêng biệt. Bơm Span vào cốc chứa Eolan và khuấy với
tốc độ 3.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút; tiếp tục bơm Tween 80 vào và duy
trì tốc độ 3.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Thu hoạch được nhũ dầu. Nhũ
tạo được sẽ được lọc vô trùng qua màng lọc 0,2 µm
+ Protein chuẩn đã được kiểm tra các chỉ tiêu (hàm lượng protein, độc lực,
tính sinh miễn dịch) sẽ được kiểm tra vô trùng trên 4 loại môi trường cơ bản, theo
dõi trong thời gian 7 – 10 ngày. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển thì đạt và
đưa vào sản xuất vacxin.
+ Máy tạo nhũ: Prioneer tốc độ vòng tối đa 7.000 vòng/phút
+ Chậu đá, cốc đong (hấp vô trùng 1210c/121’)
- Phối trộn:
Cho nhũ đã vô trùng vào cốc đong, khuấy với tốc độ 5.000 vòng/phút trong thời
gian 5 phút, bơm từ từ Protein chuẩn vào, vẫn duy trì tốc độ 5.000 vòng/phút. Sau
khi bơm hết lượng Protein vào thì duy trì tốc độ 5.000 vòng/phút trong thời gian 10
phút tiếp theo. Ta thu hoạch được bán thành phẩm vacxin. Lưu ý: Trong cả quá
trình phải để cốc đong thao tác (bình chứa) trong chậu đá để duy trì nhiệt độ.
- Thu hoạch: Bình bán thành phẩm sẽ được kiểm tra vô trùng và bảo quản ở nhiệt
độ 2 -80C. Sau khi có kết quả kiểm tra vô trùng đạt tiêu chuẩn thì tiến hành chia
liều.
Do đã xác định được hàm lượng Protein là bao nhiêu thì sẽ có khả năng sinh
7
miễn dịch như đã làm phía trên nên khi phối trộn ta phải tính toán để trong 1 liều
tiêm sẽ có đủ hàm lượng Protein cần thiết.
2.4. Định liều tiêm vacxin (LD50)
Căn cứ vào hàm lượng Protein đã tính ở trên, ta tiến hành định liều tiêm là 1-2ml.
Vấn đề quan trọng là trong liều tiêm có đủ hàm lượng kháng nguyên có khả năng
sinh miễn dịch trên động vật. Cụ thể:
Tiến hành gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da cho 4 thỏ mẫn cảm (2-2,5kg) mỗi
con một liều vắc xin quy định (1-2ml) lần một cho bản động vật. Sau 7 ngày thỏ
được miễn dịch tiếp, mỗi con một liều vắc xin quy định lần 2 cho bản động vật.
Sau 3 tuần kể từ lần tiêm đầu, hiệu lực của vắc xin được đánh giá bằng phản ứng vi
ngưng kết như sau:
Bốn mẫu huyết thanh của 4 thỏ miễn dịch cùng với 2 mẫu huyết thanh của 2 thỏ
đối chứng không tiêm vắc xin, pha loãng 1/50, được kiểm tra qua phản ứng vi
ngưng kết trên phiến kính với từng chủng Leptospira có trong vắc xin. Đọc kết quả
sau 20-30 phút trên kính tụ quang nền đen.
Phải có ít nhất hai mẫu huyết thanh miễn dịch có phản ứng dương tính với các
chủng Leptospira có trong vắc xin trong khi các mẫu huyết thanh đối chứng âm
tính. Ít nhất 4 chủng Leptospira phản ứng dương tính.
Vắc xin không có hiệu lực đối với những chủng có phản ứng âm tính (không
ngưng kết).
Thực chất bước làm này gần giống bước kiểm tra tính sinh miễn dịch của Protein
chỉ khác là không có chất bổ trợ.
2.5. Qui trình kiểm nghiệm vacxin Lepto
2.5.1. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng: kiểm tra trên 4 loại môi trương cơ bản.
Theo dõi ở nhiệt độ 370C trong 7 ngày. Riêng thạch nấm theo dõi ở nhiệt độ 28-
300c trong 10 ngày. Yêu cầu: 100% mẫu kiểm đều âm tính (không có vi khuẩn hay
nấm)
2.5.2. Đánh giá chỉ tiêu an toàn
Tiêm dưới da cho 02 chuột lang (250-350g) mỗi con 1 liều vắc xin sử dụng và
03 chuột nhắt trắng (18-20g) mỗi con 1/6 liều sử dụng. Theo dõi trong 10 ngày, tất
cả động vật phải sống khỏe.
2.5.3. Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực
Tiến hành gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da cho 4 thỏ mẫn cảm (2-
2,5kg) mỗi con một liều vắc xin quy định lần một cho bản động vật. Sau 7 ngày
thỏ được miễn dịch tiếp, mỗi con một liều vắc xin quy định lần 2 cho bản động vật.
Sau 3 tuần kể từ lần tiêm đầu, hiệu lực của vắc xin được đánh giá phương pháp
sau:
8
Phản ứng vi ngưng kết
Bốn mẫu huyết thanh của 4 thỏ miễn dịch cùng với 2 mẫu huyết thanh của 2 thỏ
đối chứng không tiêm vắc xin, pha loãng 1/50, được kiểm tra qua phản ứng vi
ngưng kết trên phiến kính với từng chủng Leptospira có trong vắc xin. Đọc kết quả
sau 20-30 phút trên kính tụ quang nền đen.
Phải có ít nhất hai mẫu huyết thanh miễn dịch có phản ứng dương tính với các
chủng Leptospira có trong vắc xin trong khi các mẫu huyết thanh đối chứng âm
tính. Ít nhất 4 chủng Leptospira phản ứng dương tính.
Vắc xin không có hiệu lực đối với những chủng có phản ứng âm tính (không
ngưng kết).
Phản ứng trung hòa
Hai thỏ miễn dịch cùng với hai thỏ đối chứng được tiêm tĩnh mạch mỗi con 3ml
huyễn dịch canh trùng của tất cả các chủng leptospira có trong vắc xin (theo tỷ lệ
bằng nhau). Sau 24 và 48 giờ, lấy máu tim từng thỏ cấy kiểm tra trên môi trường
chuyên dụng. Giữ trong tủ 280C đến 300C, theo dõi trong 7-14 ngày.
Môi trường cấy máu thỏ miễn dịch không có leptospira mọc trong khi môi
trường cấy máu thỏ đối chứng có leptospira mọc. Nếu máu thỏ miễn dịch có
leptospira mọc thì dùng huyết thanh đơn giá làm phản ứng vi ngưng kết. Vắc xin
không có hiệu lực với những chủng có phản ứng dương tính với huyết thanh đơn
giá tương ứng. Không quá 2 chủng có phản ứng dương tính.
2.6. Chế tạo thử nghiệm 500 liều vacixn tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis
Căn cứ kết quá trên ta tiến hành sản xuất thử nghiệm 500 liều vacxin Lepto
tái tổ hợp tại Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương Vetvaco.
IV. Đề xuất các nội dung làm thêm sau khi kết thúc Luận án:
1. Đánh giá độ dài bảo quản vacxin ở điều kiện 2-80c (dự kiến theo dõi 12-18
tháng).
2. Đánh giá độ dài miễn dịch của vacxin trong thời gian bảo quản từ 12-18
tháng ở nhiệt độ 2-80c.

9
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alston, J.M., The Leptospiroses. Practitioner, 1963. 191: p. 594-8.
2. Alston, J.M. and H.C. Brown, The Epidemiology of Weil's Disease: (Section
of Epidemiology and State Medicine). Proc R Soc Med, 1937. 30(6): p. 741-
56.
3. Artiushin, S., et al., Host-inducible immunogenic sphingomyelinase-like
protein, Lk73.5, of Leptospira interrogans. Infect Immun, 2004. 72(2): p.
742-9.
4. Bharti, A.R., et al., Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance.
Lancet Infect Dis, 2003. 3(12): p. 757-71.
5. Boutilier, P., A. Carr, and R.L. Schulman, Leptospirosis in dogs: a serologic
survey and case series 1996 to 2001. Vet Ther, 2003. 4(4): p. 387-96.
6. Branger, C., et al., Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a
cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-
mediated vaccination. Infect Immun, 2001. 69(11): p. 6831-8.
7. Bulach, D.M., et al., Lipopolysaccharide biosynthesis in Leptospira. J Mol
Microbiol Biotechnol, 2000. 2(4): p. 375-80.
8. Chandrasekaran, S., Review on human leptospirosis. Indian J Med Sci, 1999.
53(7): p. 291-8.
9. Charon, N.W. and S.F. Goldstein, Genetics of motility and chemotaxis of a
fascinating group of bacteria: the spirochetes. Annu Rev Genet, 2002. 36: p.
47-73.
10. Coutinho, M.L., et al., Evaluation of the anti-LipL32 monoclonal antibodies
potential for use in leptospirosis immunodiagnostic tests. J Immunoassay
Immunochem, 2007. 28(3): p. 279-88.
11. Cullen, P.A., et al., Global analysis of outer membrane proteins from
Leptospira interrogans serovar Lai. Infect Immun, 2002. 70(5): p. 2311-8.
12. Cullen, P.A., et al., LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of
pathogenic Leptospira species. Infect Immun, 2003. 71(5): p. 2414-21.
13. Dai, B., et al., [Alignment of DNA sequences of ompL1 genes of insert
fragment of recombinant plasmid, pDC38 of L. interrogans serovar lai and L.
kirschneri]. Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1999. 30(3): p. 236-40.
14. Day, M.J., Vaccine side effects: fact and fiction. Vet Microbiol, 2006. 117(1):
p. 51-8.
15. Diament, D., et al., Peripheral blood mononuclear cell activation induced by
Leptospira interrogans glycolipoprotein. Infect Immun, 2002. 70(4): p. 1677-
83.

10
16. Erridge, C., et al., Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia
trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2. J
Med Microbiol, 2004. 53(Pt 8): p. 735-40.
17. Francois, G., et al., Vaccine safety controversies and the future of vaccination
programs. Pediatr Infect Dis J, 2005. 24(11): p. 953-61.
18. Gamberini, M., et al., Whole-genome analysis of Leptospira interrogans to
identify potential vaccine candidates against leptospirosis. FEMS Microbiol
Lett, 2005. 244(2): p. 305-13.
19. Gebriel, A.M., G. Subramaniam, and S.D. Sekaran, The detection and
characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as potential
antigens and immunogens. Trop Biomed, 2006. 23(2): p. 194-207.
20. Guerreiro, H., et al., Leptospiral proteins recognized during the humoral
immune response to leptospirosis in humans. Infect Immun, 2001. 69(8): p.
4958-68.
21. Haake, D.A., et al., Molecular cloning and sequence analysis of the gene
encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic
Leptospira spp. J Bacteriol, 1993. 175(13): p. 4225-34.
22. Haake, D.A., et al., The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is
a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun, 2000.
68(4): p. 2276-85.
23. Haake, D.A. and J. Matsunaga, Characterization of the leptospiral outer
membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.
Infect Immun, 2002. 70(9): p. 4936-45.
24. Haake, D.A., et al., Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41
exhibit synergistic immunoprotection. Infect Immun, 1999. 67(12): p. 6572-
82.
25. Huỳnh, H.Q. Bệnh Leptospirose và những dấu hiệu lâm sàng cần phân biệt
với sốt rét ác tính thể gan mật. 2009; Available from: http://www.impe-
qn.org.vn:80/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?ID=3320.
26. Koizumi, N. and H. Watanabe, Leptospirosis vaccines: past, present, and
future. J Postgrad Med, 2005. 51(3): p. 210-4.
27. Koizumi, N. and H. Watanabe, Molecular cloning and characterization of a
novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain. FEMS Microbiol Lett,
2003. 226(2): p. 215-9.
28. Koizumi, N. and H. Watanabe, Leptospiral immunoglobulin-like proteins
elicit protective immunity. Vaccine, 2004. 22(11-12): p. 1545-52.
29. Koizumi, N. and H. Watanabe, Identification of a novel antigen of
pathogenic Leptospira spp. that reacted with convalescent mice sera. J Med
Microbiol, 2003. 52(Pt 7): p. 585-9.

11
30. LĐ, B., Hà Nội có nguy cơ bùng phát dịch Leptospirosis, in Báo Lao động.
2003.
31. Lê, T.T.X., Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh xoắn trùng Leptospira tại Việt
Nam giai đoạn 2002-2011. TẠP CHÍ Y HỌC DỰ PHÒNG, 2015. Tập
XXV(số 6(166) 2015. Số đặc biệt.): p. Trang: 358.
32. Lee, S.H., et al., Identification and partial characterization of a novel
hemolysin from Leptospira interrogans serovar lai. Gene, 2000. 254(1-2): p.
19-28.
33. Lee, S.H., et al., Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin
SphH as a pore-forming protein on mammalian cells. Infect Immun, 2002.
70(1): p. 315-22.
34. Li, C., et al., Spirochete periplasmic flagella and motility. J Mol Microbiol
Biotechnol, 2000. 2(4): p. 345-54.
35. Matsunaga, J., et al., Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed
to a 31-kilodalton growth-phase-regulated peripheral membrane protein.
Infect Immun, 2002. 70(1): p. 323-34.
36. McBride, A.J., et al., Leptospirosis. Curr Opin Infect Dis, 2005. 18(5): p.
376-86.
37. Nascimento, A.L., et al., Genome features of Leptospira interrogans serovar
Copenhageni. Braz J Med Biol Res, 2004. 37(4): p. 459-77.
38. NHS. Leptospirosis. Reporting of Injuries, Diseases and Dangerous
Occurrences Regulations on the website. 2014; Available from:
http://www.nhs.uk/conditions/Leptospirosis/Pages/Introduction.aspx.
39. OIE, MANUAL OF DIAGNOSTIC TESTS AND VACCINES FOR
TERRESTRIAL ANIMALS (mammals, birds and bees). 2008, OFFICE
INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES. Paris, FRANCE.
40. Oliveira, T.L., et al., Evaluation of the Leptospira interrogans Outer
Membrane Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate. PLoS One, 2015.
10(11): p. e0142821.
41. Palaniappan, R.U., et al., Evaluation of lig-based conventional and real time
PCR for the detection of pathogenic leptospires. Mol Cell Probes, 2005.
19(2): p. 111-7.
42. Palaniappan, R.U., et al., Cloning and molecular characterization of an
immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans. Infect Immun, 2002.
70(11): p. 5924-30.
43. Palaniappan, R.U., et al., Immunoprotection of recombinant leptospiral
immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar
Pomona infection. Infect Immun, 2006. 74(3): p. 1745-50.

12
44. Palaniappan, R.U., S. Ramanujam, and Y.F. Chang, Leptospirosis:
pathogenesis, immunity, and diagnosis. Curr Opin Infect Dis, 2007. 20(3): p.
284-92.
45. Park, S.H., B.Y. Ahn, and M.J. Kim, Expression and immunologic
characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species:
a major target antigen of the humoral immune response. DNA Cell Biol,
1999. 18(12): p. 903-10.
46. Picardeau, M., Diagnosis and epidemiology of leptospirosis. Med Mal Infect,
2013. 43(1): p. 1-9.
47. Picardeau, M., H. Bauby, and I. Saint Girons, Genetic evidence for the
existence of two pathways for the biosynthesis of methionine in the
Leptospira spp. FEMS Microbiol Lett, 2003. 225(2): p. 257-62.
48. Picardeau, M., A. Brenot, and I. Saint Girons, First evidence for gene
replacement in Leptospira spp. Inactivation of L. biflexa flaB results in non-
motile mutants deficient in endoflagella. Mol Microbiol, 2001. 40(1): p. 189-
99.
49. Plank, R. and D. Dean, Overview of the epidemiology, microbiology, and
pathogenesis of Leptospira spp. in humans. Microbes Infect, 2000. 2(10): p.
1265-76.
50. Priya, C.G., et al., Identification and evaluation of LPS antigen for
serodiagnosis of uveitis associated with leptospirosis. J Med Microbiol,
2003. 52(Pt 8): p. 667-73.
51. Ren, S.X., et al., Unique physiological and pathogenic features of Leptospira
interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature, 2003. 422(6934):
p. 888-93.
52. Seixas, F.K., et al., Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the
immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against
leptospirosis. Can J Microbiol, 2007. 53(4): p. 472-9.
53. Silva, E.F., et al., The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like
protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the
hamster model of leptospirosis. Vaccine, 2007. 25(33): p. 6277-86.
54. Slack, A., Leptospirosis. Aust Fam Physician, 2010. 39(7): p. 495-8.
55. TLĐLĐVN, Thông tư của liên Bộ Y tế, Bộ Lao động- Thương binh và xã hội,
số 29/TT-LB ngày 25 tháng 12 năm 1991 Bổ sung một số bệnh nghề nghiệp.
1991, Tổng Liên đoàn lao động Việt Nam.
56. Trần, Q.B., Nhân một số trường hợp nhiễm Leptospira khó chẩn đoán. . Tạp
chí Y Học TP. Hồ Chí Minh., 2010. Tập 14(Phụ bản của Số 2 – 2010): p.
603- 607.
57. Trần, T.P., Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. 1996: Tủ sách ĐHNL
TP.HCM
13
58. Vanasco, N.B., et al., Clinical characteristics and risk factors of human
leptospirosis in Argentina (1999-2005). Acta Trop, 2008. 107(3): p. 255-8.
59. Vinetz, J.M., Leptospirosis. Curr Opin Infect Dis, 2001. 14(5): p. 527-38.
60. Wasinski, B. and J. Dutkiewicz, Leptospirosis--current risk factors connected
with human activity and the environment. Ann Agric Environ Med, 2013.
20(2): p. 239-44.
61. Yan, Y., et al., An evaluation of the serological and epidemiological effects
of the outer envelope vaccine to leptospira. J Chin Med Assoc, 2003. 66(4):
p. 224-30.
62. Yanagihara, Y., et al., Current status of leptospirosis in Japan and
Philippines. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2007. 30(5-6): p. 399-413.
63. Yang, C.W., et al., The Leptospira outer membrane protein LipL32 induces
tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression in mouse proximal
tubule cells. J Am Soc Nephrol, 2002. 13(8): p. 2037-45.
64. Yang, H.L., et al., In silico and microarray-based genomic approaches to
identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans.
BMC Genomics, 2006. 7: p. 293.
65. Zuerner, R., et al., Technological advances in the molecular biology of
Leptospira. J Mol Microbiol Biotechnol, 2000. 2(4): p. 455-62.

14