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Medicine 2nd Edition

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Edition

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Contents vii

A.  Structure of Cardiac Muscle 161 III.  Cell Transplants 230

B.  Amphibian and Zebrafish Cardiomyocytes A.  Characteristics of the Ideal Cell for
Regenerate from Pre-Existing Transplant 230
Cardiomyocytes 162 B.   Are Adult Stem Cells Pluripotent? 230
C.  Mammalian Cardiomyocytes Can C.  Effects of Age on Adult
Self-Replicate 166 Regeneration-Competent Cells 234
D.  Mammalian Cardiac Muscle Harbors D.  Embryonic Stem Cells (ESCs) 239
Cardiac Stem Cells 167 E.   Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) 243
III.  Regeneration of Hematopoietic Cells 169 F.   ESC-like Cells Derived from Long-term
A.  Origin of Hematopoietic Stem Cells 169 in vitro Cultures 247
B.  Characteristics of Adult Hematopoietic IV.  Bioartificial Tissue Construction 248
Stem Cells 171 A.   Types of Bioartificial Tissues 248
C.  Lineage Maps of HSCs 171 B.  Challenges to Bioartificial Tissue
D.  Niche Factors for Hematopoiesis 172 Construction 248
Summary 177 V.  Chemical Induction of Regeneration in situ 251
References 178   Summary 251
References 253
8. Regeneration of Appendages
I.  Introduction 183
10. Regenerative Medicine of Epidermal
II.  Urodele Limb Regeneration 183
Structures
A.  Stages of Limb Regeneration 183 I.  Introduction 261
B.  Origin of Blastema Cells 184 II.  Repair of Skin Wounds and Burns 261
C.  Mechanisms of Blastema Formation 186 A.  Acute Wounds 261
D.  Blastema Cell Proliferation: Role of the B.  Chronic Wounds 269
Nerve and Wound Epidermis 190 C.  Future Research 273
E.  Mechanisms of Blastema Patterning 196 III.  Stimulation of Hair Regeneration 274
III.  What Inhibits Limb Regeneration in Adult A.  Pattern Baldness 274
Frogs, Birds and Mammals? 205 B.  Treatments for Pattern Baldness 274
A.  Loss of Limb Regeneration in Anuran IV.  Limbal Cell Transplants to Regenerate
Tadpoles is Associated with Spatial the Cornea 275
Deficiencies in Patterning Gene Summary 278
Expression 205 References 279
B.  Hypotheses to Explain Loss of Anuran
Tadpole Regeneration 207 11. Regenerative Medicine of Neural
IV.  Regeneration of Mammalian Appendages 208 Tissues
A.  Ear Tissue of Rabbits and Rodents 208
I.  Introduction 285
B.  Deer Antlers 210
II.  Therapies for Regeneration of Peripheral
C.  Mouse and Human Digit Tips 211
Nerves 285
V.  Stimulation of Regeneration in Anuran
A.  Nerve Autografts 285
and Mammalian Appendages 213
B.  Biomaterial Conduits 286
A.  Frog Limbs 213
C.  Cell Transplants 287
B.  Mouse Digit Tips 215
D.  Infra-Red Light and LEDs 288
VI.  Comparative Analysis as a Tool to
III.  Therapies for Trauma to the Mammalian
Understand Limb Regeneration 216
Central Nervous System 288
Summary 217
A.  Injured Spinal Cord 288
References 218
B.  Therapies for Stroke and Traumatic
Brain Injury 299
Part II IV.  Therapies for Neurodegenerative
Diseases 301
Regenerative Medicine
A.  Parkinson’s Disease 302
B.  Huntington’s Disease 306
9. Strategies of Regenerative Medicine
C.  Amyotrophic Lateral Sclerosis 308
I.  Introduction 229 D.  Prospects for Deeper Understanding
II.  Biomimetic Devices and Organ Transplant 229 of Neurodegenerative Diseases 311
viii Contents

Summary 312 A.  Meniscal Allografts 365

References 315 B.  Acellular Scaffolds and Bioartificial
Meniscus 365
12. Regenerative Therapies for Digestive, V.  Regenerative Therapies for Non-Union
Respiratory and Urinary Tissues Fractures and Critical Size Gaps in Bone 367
A.  Non-Union Fractures and Osteotomies 367
I.  Introduction 325 B.  Critical Size Defects 368
II.  Regenerative Therapies for the Liver 325 C.  Ilizarov Distraction Technique
A.  Drug Treatments 325 for Lengthening Bones 374
B.  Hepatocyte Transplants 325 D.  Use of the Body as a Bioreactor
C.  New Sources of Hepatocytes to Regenerate Skeletal Structures 375
for Transplant 326 VI.  Regenerative Therapies for Teeth
D.  Bioartificial Liver 328 and Periodontium 376
III.  Regenerative Therapies for the Pancreas 330 A.  Growth Factors 376
A.  Suppression of Autoimmunity B.  Dental Stem Cells 377
and Regeneration from Remaining C.  Scaffolds for Periodontal Regeneration 378
β-Cells in Diabetic Mice 331 VII.  Regenerative Therapies for Tendon
B.  Clinical Islet Transplants 332 and Ligament 380
C.  Beta Cell Transplants in Experimental A.  Tendon 381
Animals 333 B.  Ligament 382
D.  Gene Therapy and Transdifferentiation Summary 383
of Acinar Cells in situ 334 References 385
E.  Bioartificial Pancreas 335
IV.  Regenerative Therapies for the Esophagus
and Intestine 337 14. Regenerative Therapies for
A.  Esophagus 337 Hematopoietic and Cardiovascular
B.  Intestine 337 Tissues
V.  Regenerative Therapies for the Respiratory I.  Introduction 393
System 339 II.  Therapies for Hematopoietic Disorders 393
A.  Trachea 339 A.  General Strategies 393
B.  Distal Lung 340 B.  Myeloablative Therapy 394
VI.  Regenerative Therapies for the Urinary C.  Non-Myeloablative Therapy 397
System 343 D.  Gene Therapy for Genetic Deficiency
A.  Kidney 343 Diseases 399
B.  Urinary Conduit Tissues 344 III.  Therapies for Damaged Blood Vessels 401
Summary 347 A.  General Strategies 401
References 348 B.  Decellularized Matrix 402
C.  Bioartificial Blood Vessels 403
13. Regenerative Therapies for D.  Progenitor and Stem Cell Transplants 405
Musculoskeletal Tissues E.  Soluble Factors 407
IV.  Therapies for Infarcted Myocardium 408
I.  Introduction 355 A.  Stem Cell Transplants 408
II.  Therapies for Skeletal Muscle 355 B.  Transdifferentiation 412
A.  Muscle Injured by Trauma 355 C.  Soluble Factors 412
B.  Duchenne Muscular Dystrophy 355 D.  Bioartificial Cardiac Muscle 415
C.  Bioartificial Muscle 358 Summary 417
III.  Regenerative Therapies for Articular References 420
Cartilage 359
A.  Types of Cartilage Defects 359
B.  Surgical Repair 359 Part III
C.  Induction of Regeneration by Growth
Factors, Acellular Biomaterial Scaffolds
Perspective
and Combinations 360
D.  Cell Transplants 361
15. Retrospect and Prospect
E.  Bioartificial Articular Cartilage 364 I.  Introduction 429
IV.  Regenerative Therapies for Meniscus 365 II.  Achievements and Challenges 429
Contents ix

A.  Biology of Regeneration 429 A.  Cell Transplants to Replace Tissues

B.  Regenerative Medicine 430 and Identification of Paracrine Factors 441
III.  Bioethics in Regenerative Medicine 434 B.  Using iPSCs to Investigate Disease and
A.  In vitro Fertilization 435 for Drug Discovery 441
B.  Reproductive Cloning 436 C.  Bioartificial Tissues and Organs 442
C.  Human ESCs and “Therapeutic Cloning” 436 D.  Chemical and Physical Induction of
D.  The Ethical Controversy Over Human Regeneration 443
ESC Research 436 V.  Concluding Remarks 446
E.  The Specter of Interspecies Grafting 438 References 447
F.  Resolving Unresolvable Dilemmas 439
IV.  Exciting Future Prospects for Regenerative Index 451
Biology and Medicine 441
This page intentionally left blank

Since the publication of the first edition of Regenerative
Biology and Medicine in 2006, we have made steady
advances in understanding the origin and characteristics of
stem cells in epithelia, skeletal muscle, and bone, and in
the niche signals that regulate the activities of these cells.
Simultaneously, we witnessed one of the most remarkable
breakthroughs ever in regenerative biology, the epigenetic
reprogramming of somatic cells to cells remarkably similar
to embryonic stem cells, dubbed induced pluripotent stem
cells (iPSCs). The creation of these cells from skin fibrob-
lasts of animals was announced in 2007, and then from
human skin fibroblasts in 2008. The result has been a mega
explosion of research papers to find safer, more efficient
ways to make these cells, understand the process by which
reprogramming takes place, and compare iPSCs to bona
fide ESCs. The creation of iPSCs is a tide that has raised all
boats in regenerative biology, and it is one with enormous
implications for regenerative medicine. A potentially even
greater breakthrough has been the transdifferentiation of one
cell type directly to another in situ. We now can think with
more confidence that the ultimate goal of regenerative medi-
cine, the chemical induction of regeneration directly at the
site of an injury, something that urodele amphibians know
how to do naturally, is attainable for a whole list of mamma-
lian tissues and organs that do not regenerate.
Like the first edition, the second edition of this book
is directed to multiple audiences: research investigators,
graduate students, medical students and postdoctoral fel-
lows who want a single overall synthesis of this young
field, as well as investigators from fields not directly
related to regenerative biology and medicine such as
chemistry, informatics, computer science, mathemat-
ics, physics and engineering who have expertise that can
contribute to its advance. Regenerative biology and medi-
cine has now developed to the point where it is becoming
a topic for advanced undergraduate courses, and the book
was written with this audience in mind as well.
I have re-organized the content of the book into three
parts. Part One, consisting of Chapters 1–8, covers the
biology of regeneration. Part Two consists of Chapters
9–14 and covers regenerative medicine. Part Three is
Preface
Chapter 15, a perspective on what we have achieved in
regenerative biology and medicine, and what I think are
the most exciting prospects that lie ahead. For those using
the book as a course text, this organization allows the
instructor to focus on either regenerative biology or regen-
erative medicine, or to combine the two by using doublet
chapters. I initially tried to present the material accord-
ing to regenerative mechanism, but this was not practical
because nearly all biological systems use more than one
mechanism of regeneration. Thus it was better to separate
organ systems for the discussion of both regeneration and
regenerative medicine. Reading Chapters 1, 9 and 15, or
the summaries of Chapters 1–15, will provide an abridged
content for purposes of short courses.
Regenerative biology and medicine has generated an
enormous literature, of which I have sampled probably
no more than 5%, as was the case with the first edition.
Moreover, by the time this work is published, many new
ideas and facts will have emerged, due to the ever-greater
increase in the number of research papers appearing each
week. In fact, each topic of this book could warrant a sepa-
rate volume of its own, and this has been done already for
a number of the topics. What I have hoped to accomplish
here is to provide a panoramic view of regenerative biol-
ogy and medicine within which to integrate old and new
data into an ever-clearer global picture, like that of a jig-
saw puzzle that emerges as more and more pieces are fitted
to it.
I thank my colleagues Jo Ann Cameron, Fengyu Song,
Xiaoping Chen, Deepali Jhamb, and Nandini Rao who
have read parts of the manuscript at various stages. My
editor Christine Minihane and the production team of
Julia Haynes, Halima Williams, and Carolyn Holleyman
have made this project much easier with their patience and
discerning eyes. I thank them for their wonderful efforts.
The W.M. Keck Foundation and the U.S. Army Research
Office supported research cited from my laboratory from
2006 to the present.
David L. Stocum
Indianapolis
February, 2012
xi
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 Part I

Regenerative Biology
This page intentionally left blank

An Overview of Regenerative Biology
I. INTRODUCTION
We live in a dangerous world. Each day, our bodies are
subjected to injuries ranging from small cuts and bruises
that are easily repaired, to more serious traumas and dis-
eases that can cause extensive structural and functional
loss. Even in the absence of injury, many cell types nor-
mally have a limited life span and must be continually
replaced to maintain tissue integrity. The evolutionary
process has provided vertebrate animals with two mecha-
nisms for cell replacement and tissue repair. The first is
regeneration, a homeostatic process that maintains or
restores the original architecture and function of a tissue.
The second is fibrosis, in which damaged tissues are
invaded by fibroblasts that do not restore the original tis-
sue architecture, but instead patch the damaged area with
collagenous scar tissue.
Modern medicine is able to replace body parts through
cell, tissue and organ transplantation, but these technolo-
gies have drawbacks that can exact a high price on patients
in terms of side effects and morbidity. What we really
desire are ways to inhibit fibrosis and evoke regeneration
in situ where it fails to occur naturally. Achieving this goal
requires that we obtain a much deeper understanding of the
cellular and molecular mechanisms of regeneration, and
how these mechanisms differ from those that lead to fibro-
sis, than we currently possess. When sufficiently complete,
this understanding will drive a revolutionary transforma-
tion of medicine.
II. A BRIEF HISTORY OF REGENERATIVE
BIOLOGY
Historically, regenerative biology has its roots in observa-
tions on the healing of wounds and of appendage regenera-
tion (see Goss, 1991). Severe injuries such as penetrating
wounds, multiple fractures, spinal cord compression, or
damage to the eyes have occurred throughout the his-
tory of the human species, due to conflict and accidents.
Testimony to the importance of wounds is found on the
walls of Paleolithic caves, which bear the imprints of hands
with amputated fingers. Early humans would have noted
the kinds of wounds that were survivable and those that
Regenerative Biology and Medicine. DOI: 10.1016/B978-0-12-384860-4.00001-0
© 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
Chapter 1
were not, and attempted rudimentary means to facilitate
their repair. They were also likely to have been aware of
the phenomenon of regeneration from observations on food
animals such as crustaceans and deer, which can regenerate
their legs and antlers, respectively. The fact that trees renew
their leaves and seeds on a cyclical basis, and re-grow sev-
ered limbs in another direction would also have contributed
to an awareness of, and curiosity about, regeneration.
Treatments to aid wound repair preceded by many
millennia any knowledge of how the repair was actu-
ally accomplished. Methods to facilitate wound healing,
including surgical interventions, were central to the medi-
cine of ancient Sumerian, Egyptian, Chinese, Indian, and
Inca civilizations (Majno, 1975; Brown, 1992; Falabella,
1998). The cleansing and debridement of wounds was
a common practice in ancient cultures and many differ-
ent vegetable and mineral concoctions were applied topi-
cally to treat wounds. The ancient Chinese and Egyptians
used honey and wine as antiseptics and the Chinese have
used a bread mold to treat minor burns for over 2000
years (Majno, 1975; Fu et al., 2001). Trephination to
relieve intracranial pressure was performed by the Incas
in the treatment of head wounds (Majno, 1975). A thou-
sand years ago, as shown in Fig. 1.1, the Indian physician,
Sushruta, described the use of autogeneic skin transplants
to reconstruct severed noses and ears (Majno, 1975).
The Greek and Roman physicians Hippocrates
(460–370 BC), Celsus (25 BC–50 AD), and Galen
(130–201 AD) contributed greatly to the development
of medicine, including the treatment of wounds (Brown,
1992). Part of Galen’s career was spent caring for injured
gladiators, which gave him extensive experience in treat-
ing wounds to many parts of the body. Galen compiled
virtually all that was known about anatomy, physiology,
and medical treatment at the time (much of it erroneous)
into at least 35 volumes. When the Western Roman Empire
collapsed near the end of the 5th century AD, Galen’s texts
were translated into Arabic, the language of medicine in
the Eastern Roman Empire, and later from Arabic into
Latin. These texts were the dominant guides for medical
practice until the end of the Middle Ages.
A creative blossoming of biology and medicine
took place from the 14th to the 17th centuries, based
3
4 PART | I
(A) (B) (C)
FIGURE 1.1 Autotransplant of forehead skin flap to reconstruct the
nose, described by Sushruta ~1000 AD. The flap was cut to conform to
the outline of a nose, peeled down and twisted 180° at the stalk (arrows).
It was then positioned over the nasal area with the dermal side down and
held in place with wooden rods until healed.
on more accurate and detailed observations of form
and function. Major contributions were the anatomical
descriptions of embryonic and adult structure made by
Da Vinci (1452–1519), Vesalius (1514–1564), Paracelsus
(1493–1541), Fallopius (1523–1562), and Fabricius
(1537–1614). Descartes (1596–1650) and Borelli
(1608–1679) wrote important texts on physiology, and
Harvey (1578–1657) produced his famous treatises on the
circulation of the blood and the reproduction of animals.
The surgeon Guy de Chruliac (1300–1370) published
“Wounds and Fractures” in 1363, a book that detailed
many kinds of wounds and how to treat them. Wilhelm
Fabry (1560–1634) described nearly 70 topically applied
formulations for treatment of wounds, many of which have
been re-examined and found to have true therapeutic value
(Kirkpatrick et al., 1996).
The technological and conceptual revolutions that
brought forth modern science took place in the 17th cen-
tury. The technological revolution was the beginning of
experimentation in chemistry and the development of
the telescope and microscope, with new results and ideas
being disseminated by the printing press, which had been
invented two centuries earlier. The conceptual revolu-
tion began with a challenge to the Aristotelian view of
the motion of celestial bodies, which were considered to
move in perfectly circular orbits on invisible spheres (Van
Doren, 1991). Kepler (1571–1630) showed that the plan-
ets moved in elliptical orbits and that the time required
for each orbit was proportional to their distance from the
sun. Galileo (1564–1630) proved mathematically what
Copernicus had concluded a century earlier: that the earth
orbits around the sun, not the reverse, which was the doc-
trinaire religious view of the time. Newton (1642–1727)
related forces and motion in his three general laws of
motion, now generally referred to as “Newtonian mechan-
ics”. Descartes (1596–1650) generalized these physi-
cal and mathematical relationships into the philosophy
of mechanism—that everything in the material universe,
including organisms, could be treated as machines that
behave according to strict mathematical laws of physics.
Regenerative Biology
In 1687, Newton published his “Mathematical Principles
of Natural Philosophy”, in which he formalized four rules
of reason to guide scientific investigation.
1. The best explanation for a natural phenomenon is the
simplest one that is true and sufficient (William of
Ockham’s razor).
2. The same causes should be assigned to the same natu-
ral effects (inductive reasoning).
3. Those qualities common to all objects or phenomena
within our realm of experience are assumed to be uni-
versal (deductive reasoning).
4. The most important rule of all: accept no explanations
not directly supported by observation or experiment.
These rules provided a powerful way of answering
questions about how things work, changing our view of the
world forever.
In biology, the invention of the compound microscope
in the early 1600s made it possible to view biological
structure in greater detail than ever before and thus better
understand the nature of biological phenomena. This tech-
nological leap forward led to development of the science
of microscopic anatomy in the 18th century. The compara-
tive anatomist John Hunter (1728–1793) studied healing
skin wounds and discovered granulation tissue and the
transitional role it played in scar tissue formation (Brown,
1992). The dogma of preformation, which held that the
mechanism of ontogeny was the growth of a tiny pre-
delineated adult within the egg, was toppled by the stud-
ies of C.F. Wolff on chick embryos, which showed that the
embryo developed by a series of epigenetic steps that built
form out of amorphous substance.
The 19th century saw numerous medical and surgical
advances that improved the prospects of recovery from
serious injury and disease (Allan, 1977). The develop-
ment of ether anesthesia made pain-free surgery possible
and thus increased the types of surgical interventions that
could be made in the human body to treat different con-
ditions. Surgery, however, also increased the possibility
of death by systemic bacterial infection. Joseph Lister, a
student of Pasteur, introduced the use of dressings soaked
in carbolic acid and strict hygienic measures in hospitals
to combat sepsis after surgical operations (Brown, 1992).
Nineteenth century surgeons revived the techniques of
skin grafting described by Sushruta many centuries earlier
(Majno, 1975).
The most significant development of the 19th cen-
tury for the future of biology and medicine, however,
was the rise of materialistic biology, which was an out-
come of Descarte’s philosophy of mechanism. Until the
mid-18th century, it was thought that the properties of life
forms were due to an immaterial vital force, not the mate-
rial chemical and physical forces that regulated the prop-
erties of inanimate objects (Coleman, 1977). However,
Chapter | 1 An Overview of Regenerative Biology
experiments begun by Lavoisier (1743–1794) in the second
half of the 18th century and carried on by others into the
19th century showed that life depended on chemical reac-
tions that were reproducible in the laboratory. With the
formulation of the cell theory by Schleiden and Schwann
in 1838–1839 and the later microscopic observations of
Virchow, Remak and others, it became clear that cells are
the fundamental units that carry out the chemical reactions
of life and that new cells are created by the division of exist-
ing cells, thus explaining growth and reproduction.
The 20th century saw an unparalleled explosion of
biological and medical knowledge. Major advances were
the discovery and production of antibiotics, the develop-
ment of molecular replacement therapies for diseases such
as diabetes, an understanding of the immune system that
revealed the antigenic differences between “self ” and
“non-self ”, and the development of highly sophisticated
imaging and surgical technologies. These advances, cou-
pled with advances in engineering and materials science
and the development of immunosuppressive drugs, have
given us the ability to transfuse blood and replace dam-
aged and dysfunctional tissues and organs through tissue
and organ transplants and implants of bionic devices.
Without question, however, the most fundamental and
far-reaching event of 20th century biology was the dis-
covery, in mid-century, that DNA is the hereditary mate-
rial (Avery et al., 1944; Hershey and Chase, 1952) and
that it has a helical structure consisting of two deoxyribose
sugar–phosphate backbones held together by complemen-
tary base pairs, adenine to thymine and guanine to cytosine
(Watson and Crick, 1953). The enormous power of this
structure to explain how the genetic material is replicated
and mutates, and how information for protein structure is
encoded in it and expressed, led to exponential advances
in our knowledge of cell, developmental, and evolutionary
biology.
Regeneration became a focus of systematic scientific
investigation only in the 18th century, though it figured
prominently in the ancient Greek myths of the Hydra and
Prometheus recounted by Homer and Hesiod (Dinsmore,
1998) and in the medieval accounts of the regeneration
of severed human arms and legs (Goss, 1991). Abraham
Trembly performed detailed experiments on the regenera-
tion of hydra that made a deep impression on the biologists
of the time (Lenhoff and Lenhoff, 1991), while Reaumer
and Spallanzani reported observations on the regeneration
of limbs in crustaceans and newts, respectively (Skinner
and Cook, 1991; Dinsmore, 1991). Studies on limb devel-
opment and regeneration in the latter part of the 19th and
the early part of the 20th centuries made major contribu-
tions to the understanding of development. Prior to the 20th
century, limb regeneration in amphibians and crustaceans
was explained in the context of preformation. The limbs of
these animals were presumed to contain multiple copies of
5
preformed appendages, the growth of which was stimulated
by amputation. In the early 20th century, regeneration was
recognized as a regulative process that restored the whole
from the remaining part. A major research aim of Thomas
Hunt Morgan (1866–1945), before he turned to genet-
ics, was to explain regeneration in terms of chemical and
physical principles (Morgan, 1901). Over a century later,
we are still in the process of formulating this explanation
and simultaneously advancing the age-old dream of being
able to regenerate tissues and organs that do not regenerate
spontaneously. Now, in the second decade of the 21st cen-
tury, rapid advances in multidisciplinary biological science,
chemistry and informatics have put that goal within reach.
III. REGENERATION OCCURS AT ALL
LEVELS OF BIOLOGICAL ORGANIZATION
All organisms regenerate, though the degree of regenera-
tive ability varies among species and with level of biologi-
cal organization within the individual organism (Goss,
1969). Some invertebrates, such as ascidians, coelenter-
ates, flatworms and annelid worms, can regenerate whole
organisms from fragments of the body. The roots, stems,
and leaves of plants have extensive regenerative capacity,
and entire plants can be grown from single cells or small
cuttings (Carlson, 2007; Birnbaum and Sanzhez-Alvarado,
2008, for reviews). For example, a single carrot cell can
regenerate a whole carrot (Steward et al., 1964). Compared
to these life forms, the regenerative capacity of vertebrate
tissues, including humans, is limited, but no less vital.
All molecules, cells and tissues experience turnover,
and thus must be continually regenerated to maintain the
integrity of the organism. On the molecular level, regener-
ation is ubiquitous. All cells can adjust the balance of pro-
tein synthesis and degradation in response to biochemical
or mechanical load. For example, cardiomyocytes replace
most of their molecules over the course of two weeks and
adjust their rate of protein synthesis upwards under a sus-
tained increase in blood pressure, becoming hypertrophied
(Gevers, 1984). At the level of the single-cell free-living
unicellular protozoans such as the amoeba, Tetrahymena,
Stentor and Acetabularia can regenerate themselves after
removal of large cytoplasmic fragments, as long as nuclear
material is present in the remaining fragment (Goss, 1969).
As little as 1/80 of an amoeba is capable of reconstituting a
complete amoeba (Vorontsova and Liosner, 1960).
Regeneration is most complex at the tissue level and
above. On the one hand, it is thought that some differenti-
ated cells, such as neurons of the human cerebral cortex,
are never renewed. On the other hand, we know that the
cells of many tissues turn over and that the rate of turnover
varies with the tissue. Rapid turnover and replacement is
characteristic of epithelial cells of the skin and linings of
the digestive, respiratory and urogenital tracts, as well as
6 PART | I
the myeloid and lymphoid cells of the hematopoietic sys-
tem. The liver, on the other hand, turns over once a year,
and the skeletal system once a decade. This type of regen-
eration, which involves cell replacement within an intact
tissue, can be termed maintenance regeneration. By con-
trast, massive cell loss caused by injury or disease (i.e.,
tissue loss) elicits a much more intense local response to
restore the missing tissue. This response can be termed
injury-induced regeneration. It is important to remember
that both forms of regeneration are homeostatic mecha-
nisms (see Galliot and Ghila, 2010, for review).
Regeneration and asexual reproduction are intimately
related in some invertebrates (Birnbaum and Sanzhez-
Alvarado, 2008). Coelenterates and flatworms appear
to use the same mechanisms for regeneration as they do
for reproduction. Thus, planaria and hydra can undergo
reproduction by fission, with two new individuals being
reconstituted from the fission products. Although verte-
brates cannot reproduce by fission, regeneration is never-
theless relevant to their reproduction, since it allows them
to survive to reproductive age and thereby propagate the
species. The relationship between reproduction and regen-
eration in vertebrates has been exquisitely summed up in
two quotes. The great cell biologist E.B. Wilson wrote
in the second edition of his classic book “The Cell in
Development and Heredity” (1925) that “…life is a contin-
uum, a never-ending stream of protoplasm in the form of
cells, maintained by assimilation, growth and division. The
individual is but a passing eddy in the flow who vanishes
and leaves no trace, while the general stream of life goes
forward”. Forty-three years later, in his book “Principles
of Regeneration” (1969) the 20th century master of regen-
erative biology Richard J. Goss observed that “If there
were no regeneration there could be no life. If everything
regenerated there would be no death. All organisms exist
between these two extremes. Other things being equal,
they tend toward the latter end of the spectrum, never quite
achieving immortality because this would be incompatible
with reproduction”. In other words, as individuals we use
regeneration to locally reverse the second law of thermo-
dynamics for a short time, a struggle we ultimately lose,
but one that we win as a species over a longer span of time
through reproduction.
IV. MECHANISMS OF VERTEBRATE
REGENERATION
We ask four basic questions when exploring how regen-
eration occurs. The questions are: (1) what is the origin
(cell type and anatomical location) of the cells that per-
form regeneration; (2) what are the characteristics of the
cells; (3) what kinds of activities do the cells engage in to
accomplish regeneration; and (4) what are the factors that
regulate these activities? Only partial answers to these
Regenerative Biology
questions have been obtained, but they have revealed four
potential mechanisms of tissue regeneration in vertebrates.
These are cellular re-growth, regeneration from pre-
existing differentiated parent cells, transdifferentiation, and
the activation of adult stem cells (Fig. 1.2).
A. Cellular Re-Growth
Regeneration by cellular re-growth involves the loss of
a cytoplasmic part and its subsequent restoration by re-
growth from the remainder of the cell. This occurs in ver-
tebrate tissues in which elongated cells or cell processes
are bundled together to form the tissue. For example,
within skeletal muscle, myofibers regenerate across small
gaps after transection by re-sealing the membranes of their
cut ends followed by membrane extension and re-fusion.
The most spectacular regeneration by cell re-growth in
vertebrates occurs in the transected axons of peripheral
nerves, where the part of the transected axon that is con-
tinuous with the nerve cell body grows back to its target
tissue (Yannas, 2001).
B. Regeneration from Pre-Existing
Parent Cells
This is a versatile form of regeneration that can involve
three different mechanisms: compensatory hyperplasia;
epithelial to mesenchymal transformation (EMT) and the
reverse, mesenchymal to epithelial transformation (MET);
and dedifferentiation/redifferentiation.
1. Compensatory Hyperplasia
Compensatory hyperplasia is the proliferation of cells
while they maintain their differentiated structure and
function. The classic example is liver regeneration
(Michalopoulos and DeFrances, 1997; Trembly and Steer,
1998). After partial hepatectomy the hepatocytes of the
liver, as well as its non-parenchymal cell types (Kupffer,
Ito, bile duct epithelial, and fenestrated epithelial cells),
divide while continuing to perform their functions of glu-
cose regulation, synthesis of blood proteins, secretion of
bile, and drug metabolism, until the original mass of the
liver is restored. Other cell types regenerated by this mech-
anism are β-cells of the pancreatic islets, cardiomyocytes
of the heart, and endothelial cells of regenerating blood
vessels.
2. Epithelial to Mesenchymal and
Mesenchymal to Epithelial Transformation
(EMT/MET)
Epithelial and mesenchymal cells can be transformed
into one another, a phenomenon called epithelial to
Chapter | 1 An Overview of Regenerative Biology 7

(A) Cellular re-growth

M
AX

MN

(B) Regeneration from parent differentiated cells

1. CH P

2. D/R D P R

3. EMT
E M

(C) Transdifferentiation

1. Direct T

2. Indirect D T

(D) Adult stem cells

P
ASC

SR LC PC Differentiate

FIGURE 1.2 The four mechanisms of regeneration. (A) Cellular re-growth. Axon re-growth to muscle target (M) after transecting the axon (Ax) of
a motor neuron (MN). Arrow indicates direction of re-growth. (B) Regeneration from parent differentiated cells. (1) Compensatory hyperplasia (CH),
in which a differentiated cell proliferates (P) to expand the population. (2) Dedifferentiation/redifferentiation (D/R), in which the cell first reverts to an
undifferentiated state (dedifferentiates, D), proliferates (P), and redifferentiates (R) into the parent cell type. (3) Epithelial (E) to mesenchymal (M) and
mesenchymal to epithelial transformation, allowing epithelial cells to migrate and proliferate as mesenchymal cells before redifferentiating into epithe-
lial cells again. (C) Transdifferentiation, which may occur directly by initiation of a new pattern of gene expression simultaneously with repression of
the old one, or indirectly by dedifferentiation (D) to a more primitive state, then transdifferentiating (T) to a new cell type. (D) Activation of adult stem
cells. Adult stem cells (ASC) typically divide to produce a lineage-committed daughter (LC) and another stem cell, a process called self-renewal (SR).
The lineage committed cell proliferates (P) to form precursor cells (PC) that differentiate into the terminal cell type. The diagram depicts a unipotent
ASC, but many ASCs are multipotent.

mesenchymal transformation (EMT) and mesenchymal to
epithelial transformation (MET). These transformations
are prominent mechanisms of development and of pathol-
ogies such as fibrosis and cancer (Thiery et al., 2009, for
review). EMT allows epithelial cells to migrate, whereas
MET restricts migration by establishing an epithelium.
Developmental examples of EMT and MET are the trans-
formation of epithelial cells into mesenchymal cells during
the morphogenetic movements of gastrulation and the for-
mation of kidney tubules from metanephric mesenchyme,
respectively (Gilbert, 2010, for review). EMT in cancer
is responsible for metastasis. EMT/MET is also essential
8 PART | I
for epithelial wound repair, where epithelial cells assume
a state in which they can migrate across a wound surface
while maintaining loose contacts, then re-form into a tight
epithelium. In urodele (salamander) spinal cord regenera-
tion, EMT of ependymal epithelial cells allows a gap in
the cord to be bridged by mesenchymal cells. MET then
restores the epithelium, the cells of which form end-feet
channels for axon re-growth (Chernoff et al., 2003).
3. Dedifferentiation/Redifferentiation (D/R)
Dedifferentiation is a reverse epigenetic reprogramming
resulting in the loss of phenotypic specialization and rever-
sion of cells to a less differentiated state that allows them
to proliferate and redifferentiate into their parent cell type.
Dedifferentiation/redifferentiation is a relatively common
mechanism of regeneration in lower vertebrates. Teleost
fish regenerate fins and barbels by D/R and certain spe-
cies of lizards can regenerate tails by this mechanism.
The divas of D/R in the vertebrate world, however, are
the larval and adult urodele amphibians. These animals
use dedifferentiation to regenerate complex structures that
adult frogs, birds, reptiles and mammals cannot, including
limbs, tails, jaws, lens, spinal cord, neural retina, and intes-
tine (Brockes and Kumar, 2008, for review).
C. Transdifferentiation
Transdifferentiation is the conversion of one cell type to
another cell type, usually with an intervening dedifferen-
tiation step that confers plasticity on the cell. This plas-
ticity allows local injury factors to direct proliferation
and differentiation of the dedifferentiated cells into the
cell type that needs to be regenerated. Good examples of
this type of regeneration are the regeneration of lens cells
from pigmented epithelial cells of the dorsal iris in newts,
and the regeneration of cartilage from fibroblasts during
urodele limb regeneration. Theoretically, it is also possible
that instead of going through a dedifferentiation step, the
activity of the set of genes specifying the old cell type is
suppressed simultaneously with the activation of suites of
genes characteristic of the new cell type.
D. Activation of Adult Stem Cells (ASCs)
ASCs are sequestered as relatively rare undifferentiated
cells within regeneration-competent tissues as they differ-
entiate during embryonic development, where they reside
in environmental microniches that maintain their stem cell
character. When activated by other niche factors, they can
divide symmetrically to give rise to two stem cells or two
lineage-committed cells, or asymmetrically to give rise to
a lineage-committed cell and another stem cell (Morrison
and Spradling, 2008). The production of another stem cell
Regenerative Biology
by a stem cell division is termed self-renewal. There are
two major classes of ASCs, epithelial and mesenchymal.
ASCs have varying degrees of developmental potential,
depending on the tissue they serve. Some are multipoten-
tial and give rise to several cell types, as in the hematopoi-
etic system, others such as epidermal stem cells appear to
be unipotent and give rise only to keratinocytes. Activation
of ASCs may take place differently in maintenance vs.
injury-induced regeneration. In maintenance regenera-
tion, the stem cells undergo continual but slow division
in response to environmental signals, feeding a constant
stream of progeny into a new microenvironment that
induces them to differentiate, but ramp up stem cell activa-
tion and proliferation in response to injury.
1. Epithelial Stem Cells
Epithelia make up 60% of the differentiated tissue types in
the body (Slack, 2000) and are derived from the ectoder-
mal and endodermal layers of the gastrula. Epithelial cells
are anchored to one another and to a basement membrane
by specialized cell junctions. The principal intracellular
proteins that distinguish them are keratins. Epithelial cells
constitute the epidermis of the skin, and line cavities of
organ systems such as the digestive, respiratory, and uri-
nary tracts, and central nervous system. The olfactory and
optic nerves are derived from nasal epithelium and the reti-
nal ganglion epithelium, respectively. The hepatocytes of
the liver, the acinar cells of the pancreas, and their associ-
ated ductule and duct cells are arranged as epithelia. The
cardiovascular system is lined with specialized epithelial
cells called endothelial cells that are distinguished from
epithelial cells by their heart and blood vessel-specific
location, morphology and expression of vimentin rather
than keratins, as well as specific cell surface antigens.
The stem cells that regenerate the epidermis of the skin
and the epithelia of tubular organ systems are located in
the basal layers of their respective tissues. The liver and
pancreas regenerate by reproduction of parental cells after
surgical loss of tissue, but their ductules harbor stem cells
for regeneration after injury by other means. Endothelial
cells are regenerated by stem cells residing in the bone
marrow and the circulation, and by cells in the endothe-
lium itself that have regenerative capacity.
2. Mesenchymal Stem Cells
The remainder of the tissue types of the body is derived
from the mesodermal and ectomesodermal (neural crest)
layers of the gastrula and neurula. These include the
musculoskeletal system, cardiac muscle, smooth mus-
cle, and loose connective tissues associated with these
tissues, and the dermis of the skin. Mesenchymal stem
cells (MSCs) were originally isolated from bone marrow
Chapter | 1 An Overview of Regenerative Biology
cell cultures in vitro by Friedenstein et al. (1966) as an
adherent population of fibroblast-like cells. These arche-
typal MSCs are capable of differentiating into osteoblasts,
adipocytes, chondroblasts, and skeletal and smooth muscle
cells (Pittenger et al., 1999). They co-exist with hemat-
opoietic stem cells (HSCs), the other major population of
mesodermally-derived stem cells in the marrow. The cell
surface protein profile of marrow MSCs is distinguished
from that of HSCs by the absence of the cell differentia-
tion markers CD31, CD34 and CD45, but it has been diffi-
cult to define a group of MSC-specific cell surface proteins
(Roche et al., 2006). Populations of MSCs that share
similar but not identical features with bone marrow MSCs
have been isolated from the periosteum and endosteum of
bones, tooth pulp, adipose tissue, skeletal muscle, heart,
and perivascular tissue (Liu et al., 2009 for review). There
is evidence that most MSCs may actually be perivascular
pericytes, which would explain why they seem to be found
in so many tissues (Caplan, 2008).
E. The Regeneration of Many Tissues
Involves More than One Mechanism
Most tissues use one of these four mechanisms as their pri-
mary means of regeneration, but a substantial number can
regenerate by more than one mechanism. Thus, red blood
cells and intestinal epithelium regenerate solely by adult
stem cells, whereas the liver and pancreas use compensa-
tory hyperplasia to regenerate after surgical injury, but
stem cells for chronic chemical injury. Urodele append-
ages regenerate primarily by dedifferentiation/redifferen-
tiation, but adult stem cells, EMT/MET, cellular re-growth
and transdifferentiation also contribute to the regenerative
process.
V. THE NICHE CONCEPT IN TISSUE
REPAIR
The cells of all tissues reside in microenvironments
(niches) consisting of an extracellular matrix (ECM) and
a variety of soluble molecules, some of which are made
locally and others by tissues some distance away and cir-
culating in the blood (Fig. 1.3). The composition and spa-
tial organization of the niche determine the activities of the
cells. Both the ECM and soluble molecules can act as sig-
naling molecules (ligands) that bind to receptors embedded
in cell plasma membranes or residing in the nucleus of the
cells. Ligand binding triggers a conformational change in
the receptor that sets off a chain of intracellular reactions
resulting in changes in the configuration of the cytoskel-
eton or a change in the short-term or long-term pattern of
gene transcription of the cell.
Niche composition has been particularly well stud-
ied in wound repair by fibrosis (Barrientos et al., 2008)
9
P: cell extension
P
L R
L
E NR L R A
J R
IN
ECM
FIGURE 1.3 Niche factors regulating cell behavior. Two cells are
shown interacting with self or with one another in autocrine (A), para-
crine (P) and juxtacrine (J) fashion, via ligands (L) and receptors (R). The
cells also receive long-distance paracrine signals via cell extensions (e.g.,
axons) and endocrine (E) signals via the blood that activate nuclear recep-
tors (NR). In addition, the extracellular matrix (ECM) surrounding the
cells or on which the cells rest contains multiple peptide sequences that
signal through integrin receptors (IN).
and regeneration by ASCs (Scadden, 2006; Knoblich,
2008; Morrison and Spradling, 2008; Voog and Jones,
2010, for reviews). Current evidence suggests that many
niches direct tissue repair via the recapitulation of devel-
opmental programs (Voog and Jones, 2010), but this is not
always the case. Anatomically, the niches of ASCs can be
widely distributed throughout tissues (e.g., satellite cells of
muscle), confined to restricted spaces (e.g., bulge of hair
follicle, subventricular zone of the lateral ventricles), or
scattered as facultative spaces (hematopoietic stem cells of
the bone marrow).
A. Niche Signaling Molecules
The signaling molecules of the niche can be classified as
paracrine, autocrine, juxtacrine, and endocrine. Paracrine
signals are secreted by cells and diffuse over short ranges
to bind with receptors on neighboring cells. Signals can be
propagated from cell to cell in this way. Many (but not all)
paracrine signals can be grouped into four families on the
basis of their structure. These are the fibroblast growth fac-
tor (FGF) family, the Hedgehog family, the Wnt family, and
the TGF-β superfamily, consisting of the TGF-β family, the
bone morphogenetic protein (BMP) family, the Nodal pro-
teins, the Vg1 family, and several other proteins (Gilbert,
2010). An autocrine signal is one that binds to receptors
on the surface of the cell that produces it. Juxtacrine sign-
aling involves contact between cells, in which a ligand on
one cell surface binds to a receptor on the other. Endocrine
signals circulate in the blood and bind to nuclear receptors.
Some paracrine signals, such as retinoic acid (RA), also
bind to nuclear receptors (Deuster, 2008).
Short amino acid sequences of cell adhesive ECM
components also act as signals by binding to cell surface
10
(A) OB
HSC
Cp
FIGURE 1.4 Maintenance of (A) hematopoietic stem cell (HSC), and (B) epithelial stem cell (EpSC) niches. The HSC niche is maintained by para-
crine signals between HSCs (double arrows) and from capillaries (Cp, single arrows) and by juxtacrine contact (bars) of HSCs with stromal cells such
as osteoblasts (OB). Epithelial cells are maintained in their niche by juxtacrine contact (bars) between themselves and with their basement membrane
(BM) and by paracrine signals between the EpSCs and capillaries.
receptors called integrins (Hynes, 2002). For example,
maintenance of HSCs in a quiescent state relies on their
adherence to osteoblasts of the bone marrow stroma
through N-cadherin of adherens junctions and fibronec-
tin-binding integrins (α4β1, α5β1) (Zhang et al., 2003).
Blocking this adhesion inhibits hematopoiesis in long-
term bone marrow cultures (Whetton and Graham, 1999).
Mechanical properties of the ECM such as porosity, stiff-
ness, elasticity, tension and compression play key roles in
cell behavior as well (Ingber, 2006; Engler et al., 2006;
Guilak et al., 2009). Whether or not cells interact with
each other and the ECM in two dimensions (as in tissue
culture monolayers) or three dimensions also influences
cell behavior. Solid tissues, for example, behave much
more normally if cultured in three-dimensional scaffolds.
Figure 1.4 illustrates examples of stem cell regulation by
niche factors.
Cells often need to signal one another at long range by
juxtacrine or paracrine means. Such signaling is achieved
by structural extensions of the signaling cell to the target
cell, for example the extension of motor axons from spinal
neuron cell bodies to muscles and the extension of filopo-
dia from ingressing mesenchymal cells to the ectoderm in
gastrulating sea urchin embryos (Rorth, 2003).
B. Signal Transduction Pathways
Six main signaling pathways used by cells have been
identified that fall into two groups based on recep-
tor structure (Fig. 1.5). In the first group, ligands bind to
monomeric receptors. This group includes the Notch, Wnt,
and Hedgehog pathways. Notch is a juxtacrine pathway,
whereas Wnt and Hedgehog are paracrine pathways. In
the second group, ligands bind to dimeric receptors. This
group includes the receptor tyrosine kinase (RTK), JAK-
STAT, and TGF-β pathways, all of which are paracrine. In
general, these pathways use variations on a common theme
to signal to the interior of the cell. The change in receptor
conformation by a ligand gives the cytoplasmic domain of
PART | I Regenerative Biology
OB (B)
BM
EpSC
Cp
Cp
Cp
the receptor kinase activity that initiates a chain of phos-
phorylation reactions by other kinases using ATP that
alters the cytoskeleton or activates/suppresses transcription
factors (Gilbert, 2010). Many kinases also regulate intra-
cellular signaling by endocytosis of receptors or ligands
(Polo and Di Fiore, 2006). There are two intracellular des-
tinations for endosomes. In one, the receptor is delivered
to compartments involved in signaling, and in the other
the receptor is delivered to a degradative compartment,
thereby keeping the intensity and duration of the signal
within a normal range. In addition, there is an apoptotic
pathway to eliminate unwanted or unneeded cells, and an
autophagic pathway for intracellular remodeling.
1. Notch Pathway
The Notch receptor is a major mediator of stem cell self-
renewal and fate determination during embryonic develop-
ment and regeneration (Lai, 2004). Vertebrate cells have
four different Notch receptors (Lundkvist and Lendhal,
2001). Notch is a transmembrane protein that is sig-
naled (activated) by the membrane-bound ligands Delta,
Jagged and Serrate on neighboring cells. Endocytosis and
membrane trafficking regulate ligand and receptor avail-
ability at the cell surface. Endocytosis of bound ligand is
thought to generate a mechanical force that causes a con-
formational change in Notch that allows its extracellular
domain to be cleaved off by a metalloprotease called
ADAM (Kopan and Ilagan, 2009). Next, the presenelin
enzyme cleaves off the Notch intracellular domain (NICD)
(Lecourtis and Schweisguth, 1998; Schroeter et al., 1998).
The NICD translocates to the nucleus, where it interacts
with the DNA-binding protein RBP-Jκ and the histone
acetyltransferases p300 and PCAF (Wallberg et al., 2002)
to activate target genes whose products act as transcrip-
tional repressors of genes encoding products that promote
cell differentiation (Nakamura et al., 2000).
The activity of the NICD is inhibited by the Numb
protein (Jan and Jan, 1998). Asymmetric localization of
Chapter | 1 An Overview of Regenerative Biology 11

(A) Notch (B) Wnt

Wnt
LRP6
Fz
HAT RBP-Jκ D P
PAR-1

GSK-3
L P β-c
ICD
Ax
N Nrp-1 APC
Lef/
Tcf
Nu mRNA
Nu

(C) Hedgehog (D) RTK

H GF
Smo
Ptc P P AP

Gli Ras
1,2
P
P
Gli
1,2 ERK
P

P TF

(E) TGF-β TGF-β or BMP (F) JAK-STAT

GF

P P
P P P P
ΙΙ P JAK JAK
P
Ι P STAT STAT P
TGF-β BMP

S 2,3 P S 1,5,8 P H H HT

S4 S4
S 2,3 P S 1,5,8 P

FIGURE 1.5 Simplified sketches of six major signaling pathways used for development and regeneration. Descriptions in text. The signal in the
Notch pathway actively maintains cells as stem cells whereas the signals in the other pathways activate cells to divide asymmetrically. (A) Notch path-
way. L  ligand, N  notch protein, ICD  intracellular domain, P  presenelin, HAT  histone acetyltransferases, RBP-Jκ  DNA binding protein.
The ICD, HAT and RBP-Jκ form a complex that binds to the regulatory regions of differentiation genes to block their transcription. The blockade is
maintained by the protein NRP-1, which prevents the translation of Numb (Nu) mRNA. If translated, Numb inhibits the removal of the ICD from Notch
and the transcription-inhibiting complex is not formed, activating the cell. (B) Wnt pathway. Fz and LRP6  co-receptors for Wnt. PAR-1  protein
kinase that phosphorylates (P) the Disheveled protein (D). GSK-3  glycogen synthase kinase-3, Ax  axin, APC  adenomatous polyposis coli pro-
tein, β-C  beta catenin. Lef and Tcf  transcription factors that in the absence of Wnt signaling inhibit transcription of genes that activate stem cells.
(C) Hedgehog pathway. Ptc  patched protein, Smo  smoothened protein, Gli  transcription factor that is the counterpart of cubitus interruptus in
Drosophila. (D) RTK pathway. GF  growth factor, P  phosphate, AP  adaptor protein that recognizes phosphorylated receptor and activates the
Ras protein, leading to a chain of phosphorylation reactions that ends in ERK, a mitogen activated protein kinase (MAPK) that phosphorylates tran-
scription factors (TFs). (E) TGF-β (Smad) pathway. P  phosphate, S  Smad proteins. The type I and II receptors are each dimers. (F) JAK-STAT
pathway. P  phosphate. The STAT proteins form transcriptional complexes that are homodimers (H) or heterodimers (HT).
12 PART | I Regenerative Biology

Numb in one daughter cell during the division of an ASC 3. Hedgehog Pathway
thus leads to lineage commitment of that cell, whereas
The hedgehog family of signaling molecules has three
the other daughter remains as a stem cell. Expression of
members, sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh),
the Numb protein is regulated at the translational level by
and desert hedgehog (Dsh). These proteins are important in
Nrp-1 (Musashi-1 in Drosophila), a RNA-binding protein
stem cell self-renewal, proliferation and fate specification,
(Sakakibara et al., 1996). Nrp-1 binds numb mRNA, pre-
and tissue patterning (Zhang et al., 2001; Reya et al., 2001;
venting it from being translated (Imai et al., 2001). Thus
Lai et al., 2003). Unlike the Notch ligands or the Wnts, the
in the absence of Nrp-1, Numb will be made and localized,
hedgehog signal acts to inhibit the action of its receptor,
leading to lineage commitment.
Patched. Patched is bound to, and inhibits, the actual sig-
nal transducer for hedgehog, Smoothened. When hedgehog
2. Canonical Wnt Pathway binds to Patched, Smoothened is activated. To be active,
hedgehog must be cleaved to form an amino-terminal pep-
An important set of transcriptional factors that maintains
tide that is esterified at its C-terminus to a cholesterol mol-
ASCs in a quiescent state is the Tcf/Lef family, down-
ecule (Porter et al., 1996; Taipale and Beachy, 2001).
stream effectors of the canonical Wnt signaling pathway.
Smoothened is phosphorylated and, in Drosophila,
The family consists of four members, Tcf-1-3 and Lef-1.
releases the Cubitus interruptis (Ci) protein that is tethered
These transcription factors are widely expressed dur-
to microtubules. Ci is a transcription factor that acts as a
ing embryonic development and in stem cells, where in
repressor or activator, depending on whether it is cleaved.
combination with Groucho-related proteins, they serve as
In the absence of hedgehog signal, the carboxy-terminal
transcriptional repressors in the absence of a Wnt signal
domain of Ci is cleaved off and moves to the nucleus,
(Cavallo et al., 1998; Roose et al., 1998; Brantjes et al.,
where it acts as a transcriptional repressor. In the presence
2001). In the absence of Wnt signaling, β-catenin is contin-
of hedgehog signal, the entire Ci molecule is released and
ually degraded by a destruction complex consisting of two
translocated to the nucleus, where it acts as a transcrip-
tumor suppressor proteins axin and adenomatous polyposis
tional activator (Van den Heuvel, 2001; Lum and Beachy,
coli (APC) that act as the scaffold for the complex, and two
2004). Different sets of genes are activated depending
kinases, CK1 and GSK-3 that continually phosphorylate
on the concentration of Ci. In vertebrates, three different
β-catenin (Clevers, 2006). Phosphorylated β-catenin is ubi-
proteins, Gli 1–3, have evolved to effect transcriptional
quinated and targeted for degradation by the proteasome.
repression or activation in the hedgehog pathway (Stecca
Wnt proteins, of which 15 have been identified, bind
and Ruiz i Altaba, 2002). In the absence of hedgehog sig-
to the Frizzled (Fz) receptor and its co-receptor LRP5/6
nal, the carboxy termini of Gli 2 and 3 are enzymatically
(Wehrli et al., 2000). This interaction phosphorylates
cleaved off so that transcription cannot be activated. The
LRP5/6, leading to loss of the ability of the β-catenin
carboxy terminus of Gli-1 is not removed, but intact Gli-1
destruction complex to phosphorylate β-catenin, which is
cannot activate transcription by itself. In the presence of
now stabilized and accumulates in the nucleus, where it
hedgehog signal, the enzymes that cleave off the carboxy
displaces Groucho proteins and synergizes with Lef and
terminus of Gli 2 are inhibited by Smoothened. Gli-2 and
Tcf to activate transcription. Inhibition of the β-catenin
Gli 1 and 2 now act together as transcriptional activators,
destruction complex is via both inhibition of GSK3 by
while Gli-3 acts as a transcriptional repressor (Wang et al.,
the Disheveled protein, which is phosphorylated by the
2000; Aza-Blanc et al., 2000). The hedgehog and Wnt
PAR-1 kinase, and by the recruitment of axin away from
pathways share certain similarities, suggesting that they
the complex by LRP5/6 (Clevers, 2006; Bilic et al., 2007).
may be sister pathways that synergize to affect stem cell
Canonical Wnt signaling is inhibited by a number of
proliferation (Lum and Beachy, 2004).
antagonists that mimic the molecular structure of Fz and
also by the Dickkopf (DKK) proteins, which bind directly
4. Receptor Tyrosine Kinase (RTK) Pathway
to LRP-5/6 (Bafico et al., 2001).
Dsh may have a role in a “non-canonical” Wnt sig- The receptor tyrosine kinase (RTK) pathway is used by a
naling pathway through its ability to interact with Rho wide variety of growth factors such as fibroblast growth
GTPase, an enzyme that can activate kinases to phospho- factors (FGFs), platelet derived growth factor (PDGF), epi-
rylate cytoskeletal proteins and alter cell shape, polarity dermal growth factors (EGFs), vascular endothelial growth
and motility (Bejsovec, 2005; Katoh, 2005). A second non- factor (VEGF), and stem cell factor (SCF) (Schlessinger,
canonical Wnt pathway works through Fz by its activa- 2000). These ligands bind to specific RTKs. RTKs are
tion of a phospholipase enzyme that leads to the release of transmembrane proteins that are dimerized by their ligands
stored calcium from the endoplasmic reticulum (Kohn and and undergoes a conformational change that results in the
Moon, 2005). Calcium activates many proteins involved in autophosphorylation of specific tyrosines on the cytoplas-
a wide variety of biological functions. mic domain of the receptor. An adaptor protein recognizes
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tan buena...! Usted, en el primer año, estuvo una temporada en el
primer banco de la izquierda, cerca de la ventana. ¡Vea usted si me
acuerdo! Me parece que estoy viendo su cabeza rizada”. Luego se
quedó un rato pensativo. “¡Era muchacho vivo...! ¡Vaya! ¡Mucho! el
segundo año estuvo enfermo del crup. Me acuerdo cuando volvió
usted a la escuela, delgado y envuelto en un mantón. Cuarenta años
han pasado, ¿no es verdad? Ha sido muy bueno al acordarse de su
maestro. Han venido otros en años anteriores a buscarme, antiguos
discípulos míos: un coronel, sacerdotes, varios señores”. Preguntó a
mi padre cuál era su profesión. Luego dijo: “Me alegro, me alegro de
todo corazón. Se lo agradezco. Hacía tanto tiempo que no veía a
nadie, que tengo miedo de que usted sea el último”. “¡Quién piensa
en eso!—exclamó mi padre—, usted está bien y robusto; no debe de
decir semejante cosa”. “¡Eh, no!—respondió el maestro—. ¿No ve
usted este temblor?—y enseñó las manos—. Ésta es mala señal:
me atacó hace años, cuando todavía estaba en la escuela. Al
principio no hice caso; me figuré que pasaría. Pero, al contrario, fué
creciendo. Llegó un día en que no podía ya escribir. ¡Ah! aquel día,
la primera vez que hice un garabato en el cuaderno de un discípulo,
fué para mí un golpe mortal. Aun seguí adelante algún tiempo, pero
al fin no pude más, y después de sesenta años de enseñanza tuve
que despedirme de la escuela, de los alumnos y del trabajo. Me
costó mucha pena. La última vez que di lección me acompañaron
todos hasta casa y me festejaron mucho; pero yo estaba triste y
comprendía que mi vida iba acabando. El año anterior había perdido
mi mujer y mi hijo. No me quedaron más que dos nietos labradores.
Ahora vivo con algunos cientos de liras que me dan de pensión. No
hago nada y los días me parece que no concluyen nunca. Mi única
ocupación consiste en hojear mis viejos libros de escuela,
colecciones de periódicos escolares y algún libro que me regalan.
Allí están—dijo señalando a la pequeña biblioteca—, allí están mis
recuerdos, todo mi pasado... ¡No que queda más en el mundo!”.
Luego, cambiando de improviso, dijo alegremente: “Voy a
proporcionar a usted una sorpresa, querido señor”. Se levantó, y
acercándose a la mesa, abrió un cajoncito largo que contenía
muchos paquetes pequeños, atados todos con un cordón, y con una
fecha escrita de cuatro cifras. Después de buscar un momento,
abrió uno, hojeó muchos papeles, sacó uno amarillento y se lo
presentó a mi padre. ¡Era un trabajo suyo de hacía cuarenta años!
En la cabeza había escrito lo siguiente: (el nombre de mi padre) y
dictado, 3 de abril, 1838. Mi padre al momento reconoció su letra,
gruesa, de chico, y se puso a leer sonriendo. Pero de pronto se le
nublaron los ojos. Yo me levanté para preguntarle qué tenía.

Me pasó un brazo en derredor de la cintura, y apretándome contra

él, me dijo: “Mira esta hoja. ¿Ves? Éstas son las correciones de mi
pobre madre. Ella siempre me duplicaba las eles y las erres. Las
últimas líneas son todas suyas. Había aprendido a imitar mi letra, y
cuando estaba cansado y tenía sueño, terminaba el trabajo por mí.
¡Santa madre mía!”. Y besó la página. “He aquí—dijo el maestro,
enseñando los otros paquetes—. ¡Mis memorias! Cada año ponía
aparte un trabajo de cada uno de mis discípulos, y aquí están
numerados y ordenados. Muchas veces los hojeo, y así, al pasar,
leo una línea de uno, otro línea de otro, y vuelven a mi mente mil
cosas que me hacen resucitar tiempos añejos. ¡Cuántos han
pasado, querido señor! Yo cierro los ojos, y empiezo a ver caras y
más caras, y clases y más clases, ciento y cientos de muchachos,
de los cuales Dios sabe cuántos han muerto ya. De muchos me
acuerdo bien. Me acuerdo bien de los mejores y de los peores, de
aquéllos que me han dado muchas satisfacciones y de aquéllos que
me hicieron pasar momentos tristes; los he tenido verdaderamente
endiablados, porque en tan gran número no hay remedio. Ahora,
usted lo comprende, estoy ya como en el otro mundo, y a todos los
quiero igualmente”. Se volvió a sentar, cogiendo una de mis manos
entre las suyas. “Y de mí—preguntó mi padre riéndose—. ¿No
recuerda ninguna travesura?”. “¿De usted, señor?—respondió el
viejo con la sonrisa también en los labios—. No, por el momento.
Pero no quiere esto decir que no me las hiciera. Usted tenía, sin
embargo, juicio, y era serio para su edad. Me acuerdo el cariño tan
grande que le tenía su señora madre... ¡Qué bueno ha sido y qué
atento al venir a verme aquí! ¿Cómo ha podido dejar sus
ocupaciones para llegar hasta la pobre morada de un viejo
maestro?”. “Oiga, señor Croseti—respondió mi padre con viveza—.
Recuerdo la primera vez que mi pobre madre me acompañó a su
escuela. Era la primera vez que debía separarse de mí por dos
horas, y dejarme fuera de casa en otras manos que las de mi padre,
al lado de una persona desconocida. Para aquella buena criatura, mi
entrada en la escuela era como la entrada en el mundo, la primera
de una larga serie de separaciones necesarias y dolorosas: era la
sociedad que le arrancaba por primera vez al hijo para no
devolvérselo jamás por completo. Estaba conmovida, y yo también.
Me recomendó a usted con voz temblorosa, y luego, al irse, me
saludó por la puerta entreabierta, con los ojos llenos de lágrimas.
Precisamente en aquel momento usted le hizo un ademán con una
mano, poniéndose la otra sobre el pecho, como para decirle:
‘Señora, confíe en mí’. Pues bien: aquel ademán suyo, aquella
mirada por la cual me di cuenta de que usted había comprendido
todos los sentimientos, todos los pensamientos de mi madre;
aquella mirada, que quería decir: ‘¡Valor!’; aquel ademán que era
una honrada promesa de protección, de cariño y de indulgencia,
jamás la he olvidado; aquel recuerdo es el que me ha hecho salir de
Turín. Heme aquí después de cuarenta y cuatro años, para decirle:
Gracias, querido maestro”. El maestro no respondió; me acariciaba
los cabellos con la mano, la cual temblaba, saltando de los cabellos
a la frente, de la frente a los hombros.

Entretanto mi padre miraba aquellas paredes desnudas, aquel pobre

lecho, un pedazo de pan y una botellita de aceite que tenía sobre la
ventana, como si quisiese decir: Pobre maestro, después de
sesenta años de trabajo, ¿es éste tu premio? Pero el pobre viejo
estaba contento, y comenzó de nuevo a hablar con viveza de
nuestra familia, de otros maestros de aquellos años y de los
compañeros de escuela de mi padre, el cual se acordaba de
algunos, pero de otros no; el uno daba al otro noticias de éste o
aquél; mi padre interrumpió la conversación para suplicar al maestro
que bajase con nosotros al pueblo para almorzar; él contestó con
espontaneidad: “Se lo agradezco, muchas gracias”; pero parecía
indeciso. Mi padre, cogiéndole ambas manos, le suplicó una y otra
vez. “Pero ¿cómo voy a arreglarme—dijo el maestro—para comer
con estas pobres manos, que siempre están bailando de este
modo? ¡Es un martirio para los demás!”. “Nosotros le ayudaremos,
maestro”, dijo mi padre. Aceptó moviendo la cabeza y sonriendo.
“¡Hermoso día!—dijo cerrando la puerta de fuera: ¡un día hermoso,
querido señor! Le aseguro que me acordaré mientras viva”. Mi padre
dió el brazo al maestro; éste me cogió por la mano, y bajamos.
Encontramos dos muchachillas descalzas que conducían vacas, y
un muchacho que pasó corriendo con una gran carga de paja al
hombro. El maestro nos dijo que eran dos alumnas y un alumno de
segunda, que por la mañana llevaban las bestias al pasto y
trabajaban en el campo, y por la tarde se ponían los zapatitos e iban
a la escuela. Era ya cerca del mediodía. No encontramos a nadie
más. En pocos minutos llegamos a la posada, nos sentamos a una
gran mesa, colocándose el maestro en el centro, y empezamos en
seguida a almorzar. La posada estaba silenciosa como un convento.
El maestro rebosaba de alegría, y la emoción aumentaba el temblor
de sus manos; casi no podía comer. Pero mi padre le partía la
carne, le preparaba el pan y le ponía la sal en los manjares. Para
beber era necesario que tomase el vaso con las dos manos, y aun
así le golpeaba contra los dientes. Charlaba mucho, con calor, de
los libros de lectura, de cuando era joven, de los horarios de
entonces, de los elogios que los superiores le habían otorgado, de
los reglamentos de los últimos años, sin perder su fisonomía,
serena, más encendida que en un principio, con la voz simpática y la
cara animada de un muchacho. Mi padre no se cansaba de mirarle,
con la misma expresión con que a veces le sorprendo yo cuando me
mira en casa, pensando y sonriendo a solas, con la cabeza algo
inclinada hacia un lado. Al maestro se le vertió el vino sobre el
pecho, y mi padre se levantó y le limpió con la servilleta. “¡No, eso
no, señor, no lo permito!”, decía riéndose. Pronunciaba algunas
palabras en latín. Al fin levantó el vaso, que le bailaba en la mano, y
dijo con mucha seriedad: “A su salud, querido señor... a la de sus
hijos y a la memoria de su buena madre!”. “¡A vuestra salud, mi
buen maestro!”, respondió mi padre apretándole la mano. En el
fondo de la habitación estaba el posadero y otro, que miraban y
sonreían de tal modo, que parecía que gozaban en aquella fiesta en
honor del maestro de su pueblo.
A más de las dos salimos, y el maestro se empeñó en
acompañarnos a la estación. Mi padre le dió el brazo otra vez, y él
me cogió de nuevo de la mano; yo le llevaba el bastón. La gente se
detenía a mirar, porque todos le conocían; algunos le saludaban.
Cuando llegábamos a determinado sitio del camino, oímos muchas
voces que salían de una ventana, como de muchachos que leían
juntos. El viejo se detuvo y pareció entristecerse. “He aquí querido
señor mío—dijo—, lo que me da pena: oír la voz de los muchachos
en la escuela, y no estar con ellos y pensar que está otro. He
escuchado sesenta años seguidos esta música, y mi corazón estaba
hecho a ella. Ahora estoy sin familia. Ya no tengo hijos”. “No,
maestro—le dijo mi padre reanudando la marcha—; usted tiene
ahora muchos hijos esparcidos por el mundo, que se acuerdan de
usted como me he acordado yo siempre”. “No, no—respondió el
maestro con tristeza—; ya no tengo escuela, ya no tengo hijos. Y sin
hijos no puedo vivir más. Pronto sonará mi última hora”. “No diga
eso maestro; no lo piense—repuso mi padre—. De todos modos,
¡usted ha hecho tanto bien...! Ha empleado su vida tan
noblemente...”. El viejo maestro inclinó un momento su blanca
cabeza sobre el hombro de mi padre, y me apretó la mano.
Habíamos entrado ya en la estación. El tren iba a partir. “¡Adiós,
maestro!”, dijo mi padre abrazándole y besándole la mano. “¡Adiós,
gracias, adiós!”, respondió el maestro cogiendo con sus temblorosas
manos una de mi padre, que apretaba contra su corazón.

Luego le besé yo; tenía la cara mojada por las lágrimas. Mi padre
me empujó hacia dentro del coche, y en el momento de subir cogió
con rapidez el tosco bastón que llevaba el maestro en su mano,
poniéndole en su lugar una hermosa caña con puño de plata y sus
iniciales, diciéndole: “Consérvela en mi memoria”. El viejo intentó
devolvérsela y recobrar la suya; pero mi padre estaba ya dentro y
había cerrado la portezuela. “¡Adiós, mi buen maestro!”. “¡Adiós, hijo
mío...!—contestó él (el tren se puso en movimiento)—¡y Dios le
bendiga por el consuelo que ha traído a un pobre viejo!”. “¡Hasta la
vista!”, gritó mi padre con voz conmovida. Pero el maestro movió la
cabeza, como diciendo: “No, ya no nos veremos más”. “Sí, sí—
repitió mi padre—; hasta la vista”. Él respondió levantando su
trémula mano al cielo: “¡Allá arriba!”. Y desapareció a nuestra vista
en la misma postura, señalando con la mano al cielo.
 CONVALECENCIA
Jueves 20.—¡Quién me había de decir, cuando volvía tan alegre de
aquella hermosa excursión con mi padre, que pasaría diez días sin
ver el campo ni el cielo! He estado muy malo, en peligro de muerte.
He oído sollozar a mi madre, he visto a mi padre muy pálido,
mirándome con los ojos fijos, a mi hermana Silvia y mi hermano que
me hablaban en voz baja, al médico de los anteojos, que no se
separaba de mi lado, y me decía cosas que yo no comprendía. He
estado bien cerca de dar un último adiós a todos. ¡Ah, pobre madre
mía! Pasé tres o cuatro días por lo menos, de los cuales no me
acuerdo nada, como si hubiese estado en medio de un sueño
embrollado y obscuro. Me parece haber visto al lado de mi cama a
la buena maestra de la sección primaria superior, que se esforzaba
por sofocar la tos con el pañuelo para no molestarme; recuerdo,
confusamente también, a mi maestro, que se inclinó para besarme,
y me pinchó un poco la cara con sus barbas; he visto pasar, como
en medio de una niebla, la cabeza roja de Crosi, los rizos rubios de
Deroso, al calabrés vestido de negro, a Garrón, que me trajo una
naranja mandarina con hojas, y se marchó en seguida porque su
madre estaba enferma. Me desperté como de larguísimo sueño, y
comprendí que estaba mejor al ver a mi padre y a mi madre que
sonreían, y al oír a Silvia que cantaba. ¡Oh, qué sueño tan triste ha
sido! Luego, cada día que pasaba me sentía mejor. Vino el
albañilito, que me hizo reír al poner el hocico de liebre, que ahora lo
hace admirablemente porque se le ha alargado algo la cara con la
enfermedad; ¡pobrecillo! Vino Coreta, y también Garofi, a regalarme
dos billetes para su nueva rifa de “un cortaplumas con cinco
sorpresas”, que compró a un tendero amigo suyo. Ayer, mientras
dormía, entró Precusa, puso su cara sobre mi mano, sin
despertarme, y como venía del taller de su padre, negro de polvo del
carbón, me dejó una marca negra en la manga, que luego, al
despertarme, he visto con mucho gusto. ¡Qué verdes se han puesto
los árboles en estos pocos días! ¡Y qué envidia me dan los
muchachos que veo ir corriendo a la escuela con sus libros, cuando
mi padre me acerca a la ventana! Pero poco tardaré en volver yo
también. ¡Estoy tan impaciente por volver a ver a todos, mi banco, el
jardín, aquellas calles; saber todo lo que en este tiempo haya
pasado; coger de nuevo mis libros y mis cuadernos, que me parece
que ya hace un año que no los veo! ¡Pobre madre mía, qué delgada
y qué pálida está! ¡Pobre padre mío, qué aire tan cansado tiene! ¡Y
mis buenos compañeros que han venido a verme, y andaban de
puntillas y me besaban en la frente! Me da tristeza pensar que
llegará un día en que nos separemos. Con Deroso y con algún otro
quizá continuaré haciendo mis estudios; pero ¿y los demás? Una
vez que concluyamos el cuarto año, ¡adiós!, no nos volveremos a
ver; no los veré ya al lado de mi cama cuando esté malo; Garrón,
Precusa, Coreta, tan buenos muchachos, tan queridos compañeros
míos, esos no los volveré a ver probablemente.

LOS AMIGOS ARTESANOS

Jueves 20.—“¿Por qué, Enrique, no los volverás a ver? Esto
dependerá de ti. Una vez que termines el cuarto año, irás a la
Escuela Secundaria, y ellos se dedicarán a un oficio. Pero
permaneceréis en la misma ciudad quizá por muchos años. ¿Por
qué entonces no os habéis de ver más? Cuando estés en la
Universidad o en la Academia, los irás a buscar a sus tiendas o a
sus talleres, y te dará mucho gusto encontrarte con tus compañeros
de la infancia, ya hombres, en su trabajo. ¿Cómo es posible que tú
no vayas a buscar a Coreta y a Precusa, donde quiera que estén?
Irás y pasarás con ellos horas enteras en su compañía, y verás,
estudiando la vida y el mundo, cuántas cosas puedes aprender de
ellos, y que nadie te sabrá enseñar mejor, tanto sobre sus oficios,
como acerca de su sociedad, como de tu país. Y ten presente que si
no conservas estas amistades, será muy difícil que adquieras otras
semejantes en el porvenir; amistades, quiero decir, fuera de la clase
a que tú perteneces; así vivirás en una sola clase; y el hombre que
no frecuenta más que una clase sola, es como el hombre estudioso
que no lee más que un solo libro. Proponte, por consiguiente, desde
ahora, conservar estos buenos amigos aun para cuando os hayáis
separado, y procura cultivar su trato con preferencia, precisamente
porque son hijos de artesanos. Mira: los hombres de las clases
superiores son los oficiales, y los operarios son los soldados del
trabajo; pero tanto en la sociedad civil como en el ejército, no sólo
es el soldado tan noble como el oficial, toda vez que la nobleza está
en el trabajo y no en la ganancia, en el valor y no en el grado, sino
que si hay superioridad en el mérito, está de parte del soldado y del
operario, porque sacan de su propio esfuerzo menor ganancia. Ama,
pues, y respeta sobre todo, entre tus compañeros a los hijos de los
soldados del trabajo; honra en ellos los sacrificios de sus padres;
desprecia las diferencias de fortuna y clase; porque sólo las gentes
despreciables miden los sentimientos y la cortesía por aquellas
diferencias; piensa que de las venas de los que trabajan en los
talleres y los campos salió la sangre bendita que redimió a la patria;
ama a Garrón, ama a Precusa, ama a Coreta, ama a tu albañilito,
que en sus pechos de operarios encierran corazones de príncipes;
júrate a ti mismo que ningún cambio de fortuna podrá jamás
arrancar de tu alma estas santas amistades infantiles. Jura que si
dentro de cuarenta años, al pasar por una estación de ferrocarril,
reconocieras bajo el traje de maquinista a tu viejo Garrón, con la
cara negra... ¡Ah! No quiero que lo jures: estoy seguro que saltarás
sobre la máquina y que le echarás los brazos al cuello, aun cuando
seas senador del Reino”. Tu padre.

LA MADRE DE GARRÓN
Sábado 29.—Apenas volví a la escuela, recibí muy triste noticia.
Hacía varios días que Garrón no iba porque su madre estaba
gravemente enferma. Murió el sábado por la tarde. Ayer mañana, en
seguida de que entré en la escuela, nos dijo el maestro: “Al pobre
Garrón le ha cabido la más negra desgracia que puede caer sobre
un niño. Su madre ha muerto. Mañana volverá a clase. Desde ahora
os suplico, muchachos, que respetéis el terrible dolor que destroza
su alma. Cuando entre, saludadlo con cariño, estad serios; nadie
juegue, nadie sonría al mirarlo, nadie, os lo recomiendo”. Y en
efecto, esta mañana, algo más tarde que los demás, entró el pobre
Garrón. Sentí una grande angustia en el corazón al verlo. Tenía la
cara sin vida, los ojos encendidos, y apenas se sostenía sobre las
piernas: parecía que había estado enfermo un mes; era difícil
reconocerlo; vestía todo de negro, y daba compasión. Nadie respiró;
todos le miraron. Apenas entró, al ver por primera vez la escuela,
donde su madre había venido a buscarle casi todos los días; aquel
banco sobre el cual tantas veces se había inclinado ella los días de
examen para hacerle la última recomendación, y donde él tantas
veces había pensado en ella, impaciente por salir a encontrarla, no
pudo menos que estallar en un golpe de llanto desesperado. El
maestro lo trajo a su lado, y apretándole contra su pecho, le dijo:
“¡Llora, llora, pobre niño, pero ten valor! Tu madre ya no está aquí;
pero te ve, te ama todavía, vive a tu lado, y la volverás a ver, porque
tienes un alma buena y honrada como ella. Ten valor”. Dicho esto, le
acompañó al banco, cerca de mí. Yo no me atreví a mirarle. Sacó
sus cuadernos y sus libros, que hacía muchos días que no había
abierto; al abrir el libro de lectura, donde hay una viñeta que
representa una madre con su hijo de la mano, no pudo contener el
llanto, y dejó caer su cabeza sobre el brazo. El maestro nos hizo
señal para que lo dejásemos estar así, y comenzó la lección. Yo
hubiese querido decirle algo, pero no sabía. Le puse una mano
sobre el brazo, y le dije al oído: “No llores, Garrón”. No contestó, y
sin levantar la cabeza del banco, puso su mano en la mía, y así la
tuvo un buen rato. A la salida nadie le habló; todos pasaron a su
lado con respeto y silencio. Yo vi a mi madre, que me esperaba, y
corrí a su encuentro para abrazarla; pero ella me rechazaba y
miraba a Garrón. En el primer momento no comprendí por qué; pero
luego advertí que Garrón solo, a un lado, me miraba; me miraba con
implacable tristeza, que quería decir: “¡Tú abrazas a tu madre; yo ya
no la abrazaré más! ¡Tú tienes todavía madre, y la mía ha muerto!”.
Entonces comprendí por qué mi madre me rechazaba, y salí sin
darle la mano.
 JOSÉ MAZZINI
Sábado 29.—Garrón vino también hoy por la mañana a la escuela;
estaba pálido y tenía los ojos hinchados por el llanto; apenas miró
los regalillos que le habíamos puesto sobre el banco para
consolarle. El maestro había llevado, sin embargo, una página de un
libro de lectura para reanimarle. Primero nos advirtió que fuésemos
todos mañana a las doce al Ayuntamiento, para ver dar la medalla
del valor a un muchacho que ha salvado a un niño en el Po, y que el
lunes nos dictaría él la descripción de la fiesta, en vez del cuento
mensual. Luego, volviéndose a Garrón, que estaba con la cabeza
baja, le dijo: “Garrón, haz un esfuerzo y escribe tú también lo que
voy a dictar”. Todos cogimos la pluma. El maestro dictó: “José
Mazzini, nació en Génova en 1805, murió en Pisa en 1872; patriota
de alma grande, escritor de preclaro ingenio, inspirador y primer
apóstol de nuestra revolución italiana, por amor a la patria vivió
cuarenta años pobre, desterrado, perseguido, errante, con heroica
fidelidad a sus principios y a sus propósitos. José Mazzini, que
adoraba a su madre, y que había heredado de ella todo lo que en su
alma fortísima y noble había de más elevado y puro, escribía así a
un fiel amigo suyo para consolarle de la mayor de las desventuras.
Poco más o menos he aquí sus palabras: ‘Amigo: No, no verás
nunca a tu madre sobre esta tierra. Ésta es la tremenda verdad. No
voy a verte, porque el tuyo es de aquellos dolores solemnes y
santos que es necesario sufrir y vencer cada cual por sí mismo.
¿Comprendes lo que quiero decir con estas palabras? ¡Es preciso
vencer el dolor! Vencer lo que el dolor tiene de menos santo, de
menos purificante; lo que, en vez de mejorar el alma, la debilita y la
rebaja. Pero la otra parte del dolor, la parte noble, la que
engrandece y levanta el espíritu, ésta debe permanecer contigo y no
abandonarte jamás. Aquí abajo nada substituye a una buena madre.
En los dolores, en los consuelos que todavía puede darte la vida, tú
no la olvidarás jamás. Pero debes recordarla, amarla, entristecerte
por su muerte de un modo que sea digno de ella. ¡Oh, amigo,
escúchame! La muerte no existe, no es nada. Ni siquiera se puede
comprender. La vida es vida, y sigue la ley de la existencia: el
progreso. Tenías ayer una madre en la tierra: hoy tienes un ángel en
otra parte. Todo lo que es bueno sobrevive con mayor potencia a la
vida eterna. Por consiguiente, también el amor de tu madre. Ella te
quiere ahora más que nunca, y tú eres responsable de tus actos
ante ella más que antes. De ti depende, de tus obras, el encontrarla,
el volverla a ver en otra vida. Debes, por tanto, por amor y
reverencia a tu madre, llegar a ser mejor y que goce de ti, de tu
conducta. Tú, en adelante, deberás en todo acto tuyo decirte a ti
mismo: ‘¿Lo aprobaría mi madre?’. Su transformación ha puesto
para ti en el mundo un ángel custodio, al cual debes referir todas las
cosas. Sé fuerte y bueno; resiste el dolor desesperado y vulgar; ten
la tranquilidad de los grandes sufrimientos en las grandes almas;
esto es lo que ella quiere’.

“¡Garrón!—añadió el maestro—: sé fuerte y está tranquilo; esto es lo

que ella quiere. ¿Comprendes?”.

Garrón indicó que sí con la cabeza; pero gruesas y abundantes

lágrimas le caían sobre las manos, sobre el cuaderno, sobre el
banco.
 VALOR CÍVICO
(CUENTO MENSUAL)

A medio día estábamos con el maestro ante el palacio municipal,

para presenciar la entrega de la medalla del valor cívico al chico que
salvó a un compañero suyo en el Po.

Sobre la terraza de la fachada ondeaba la bandera tricolor.

Entramos en el patio.

Ya estaba lleno de gente. Se veía allí, en el fondo, una mesa con

tapete encarnado y encima varios papeles, y detrás una fila de
sillones dorados para el alcalde y la Junta, varios ujieres del
Ayuntamiento estaban de pie alrededor del estrado con sus
dalmáticas azules y sus calzas blancas. A la derecha del patio había
formado un piquete de guardias municipales, todos los cuales se
hallaban condecorados con muchas y distintas cruces, y al lado otro
piquete de carabineros; en la parte opuesta, los bomberos con
uniforme de gala y muchos soldados sin formar, que habían venido
a presenciar la ceremonia, de caballería, infantería, cazadores y
artillería: de todas las armas, en fin. Y, por último, alrededor,
caballeros, gente del pueblo, oficiales, mujeres y niños que se
apretaban: un gentío inmenso. Nos arrinconamos en un ángulo del
patio.

Alumnos de otras escuelas estaban con sus maestros, y había cerca

de nosotros un grupo de muchachos del pueblo de diez a dieciocho
años, que reían y hablaban recio, y se comprendía que eran todos
del barrio del Po, compañeros o conocidos del que debía recibir la
medalla. Arriba, en todas las ventanas, estaban asomados los
empleados del Ayuntamiento; la galería de la biblioteca también
estaba llena de gente, que se apiñaba contra la balaustrada, y en la
del lado opuesto, que está sobre la puerta de entrada, se agolpaba
gran número de muchachos de las escuelas públicas, y muchas
huérfanas de militares, con sus graciosos velos celestes. Parecía un
teatro. Todos discurrían alegremente, mirando de vez en cuando el
sitio donde estaba la mesa encarnada, a ver si se presentaba
alguno. La banda de música se oía a lo lejos, en el fondo del pórtico.
Las paredes resplandecían con el sol. Estaba aquello muy hermoso.

De pronto todos empezaron a aplaudir; en los patios, en las

galerías, en las ventanas.

Yo, para ver, tuve que empinarme.

La multitud que estaba detrás de la mesa encarnada había abierto

paso, y se pusieron delante un hombre y una mujer. El hombre
llevaba de la mano a un niño.

Era el que había salvado al compañero.

El hombre era su padre: un albañil vestido de día de fiesta. La mujer,

su madre, pequeña y rubia, estaba vestida de negro. El muchacho,
también rubio y pequeño, tenía una chaqueta gris.

Al ver toda aquella gente y oír aquel ruido de aplausos, se quedaron

los tres tan sorprendidos, que no se atrevían a mirar ni a moverse.
Un guardia municipal les empujó al lado de la mesa, a la derecha.

Todos callaron un momento, y después resonaron de nuevo los

aplausos por todos lados. El muchacho miró hacia arriba, hacia las
ventanas, y luego a la galería de las huérfanas de los militares; tenía
el sombrero en la mano y parecía que no sabía bien en dónde
estaba. Me pareció que le daba cierto aire a Coreta en la cara, pero
era más sonrosado. Su padre y su madre no apartaban los ojos de
la mesa.

Entretanto, todos los muchachos del barrio del Po, que estaban
cerca de nosotros, pasaron delante y le hacían señas a su
compañero, para hacerse ver, llamándole en voz baja. A fuerza de
llamarle se hicieron oír. El muchacho les miró y se cubrió la boca
con el sombrero para ocultar una sonrisa.

En un momento dado, todos los guardias se cuadraron.

Entró el alcalde acompañado de muchos señores.

El alcalde, que tenía el pelo cano y llevaba una faja tricolor, se puso
de pie junto a la mesa; los demás, detrás y a los lados.

Cesó de tocar la banda, hizo el alcalde una señal y callaron todos.

Empezó a hablar. Sus primeras frases no las oí bien; pero

comprendí que estaba contando la hazaña del muchacho. Después
levantó la voz, y se esparció tan clara y sonora por todo el patio, que
no perdí ya ni palabra—“...Cuando vió desde la orilla al compañero
que se revolvía en el río, presa ya del terror de la muerte, se quitó la
ropa y acudió sin titubear un momento. Le gritaron: ‘¡Que te
ahogas!’. ‘No’, respondió; lo agarraron y se soltó; lo llamaron, y ya
estaba en el agua. El río iba muy crecido, y el riesgo era terrible
hasta para un hombre. Pero él desafió la muerte con toda la fuerza
de su pequeño cuerpo y de su gran corazón; alcanzó y agarró a
tiempo al desgraciado, que estaba ya bajo el agua, y lo sacó a flote;
luchó furiosamente con las ondas, que lo querían envolver, y con el
compañero, que se le enroscaba; varias veces desapareció bajo la
superficie y volvió a salir fuera, haciendo esfuerzos desesperados,
obstinados, y decidido en su santo propósito, no como un niño que
quiere salvar a otro, sino como un hombre, como un padre que
lucha por salvar a su hijo, que es su esperanza y su vida. En fin,
Dios no permitió que fuese inútil hazaña tan generosa. El pequeño
nadador arrebató su presa al gigante río y lo sacó a tierra, y aun le
prestó, con los demás, los primeros auxilios; después de lo cual se
volvió a su casa, sereno y tranquilo, a contar sencillamente el
suceso. Señores: hermoso, admirable es el heroísmo de un hombre;
pero en el niño, en el cual no es posible aún ninguna mira de
ambición o de otro interés; en el niño, que debe tener tanto más
arrojo cuando menos fuerza tiene; en el niño, en el cual nada
pedimos, que en nada es temido, que ya nos parece tan noble y
digno de ser amado, no ya cuando cumple, sino sólo cuando
comprende y reconoce el sacrificio de otro; en el niño el heroísmo es
divino. No diré más, señores. No quiero adornar con elogios
superfluos una grandeza tan sublime. He aquí delante de vosotros el
salvador, noble y generoso. Soldados, saludadlo como a un
hermano; madres, bendecidlo como a un hijo; niños, recordad su
nombre; estampad su rostro en vuestra memoria, que no se borre ya
de vuestra mente ni de vuestro corazón. Acércate, muchacho. En
nombre del rey de Italia te doy la cruz de Beneficencia”. Un viva
atronador, lanzado a la vez por multitud de voces, atronó el palacio.

El alcalde tomó la condecoración de la mesa y la puso en el pecho

del muchacho. Después lo abrazó y lo besó.

La madre se llevó la mano a los ojos; el padre tenía la barba en el

pecho.

El alcalde estrechó la mano a los dos; y cogiendo la orden de

concesión de la cruz, atada con una cinta, se la dió a la madre.
Después se volvió al muchacho y le dijo: “Que el recuerdo de este
día, tan glorioso para ti, tan feliz para tus padres, te sostenga toda la
vida en el camino de la virtud y del honor. ¡Adiós!”. El alcalde salió;
tocó la banda, y todo parecía concluido cuando de las filas de la
multitud salió un muchacho de ocho a nueve años, impulsado por
una señora que se escondió en seguida, y se lanzó al condecorado,
dejándose caer en sus brazos.

Otro rumor de vivas y aplausos hizo atronar el patio; todos

comprendieron desde luego que era el muchacho salvado en el Po
el que acababa de dar las gracias a su salvador. Después de
haberlo besado, se le agarró a un brazo para acompañarlo fuera.
Ellos dos primeros, y el padre y la madre detrás, se dirigieron hacia
la salida, pasando con trabajo por entre la gente, que les hacía calle,
confundiéndose guardias, niños, soldados y mujeres. Todos se
echaban hacia adelante y se empinaban para ver al muchacho. Los
que estaban más cerca, le daban la mano. Cuando pasó por delante
de los niños de la escuela, todos echaron sus sombreros por el aire.
Los del barrio del Po prorrumpieron en grandes aclamaciones,
agarrándole por los brazos y por la chaqueta gritando “¡Viva Pinot!
¡Bravo, Pinot!”. Yo lo vi pasar muy cerca. Iba muy encarnado y
contento; la cruz tenía la cinta blanca, roja y verde. Su madre lloraba
y reía; su padre se retorcía el bigote con una mano, que le temblaba
mucho, como si tuviese calentura. Arriba, por las ventanas y
galerías, seguían asomándose y aplaudiendo. De pronto, cuando
iban a entrar bajo el pórtico, cayó de la galería de las huérfanas de
los militares una verdadera lluvia de pensamientos, de ramitos de
violetas y margaritas, que daban en la cabeza del muchacho, en la
de sus padres y en el suelo. Muchos se bajaban a recogerlos y se
los alargaban a la madre. Y a lo lejos, en el fondo del patio, se oía la
banda que tocaba un aire precioso que parecía el canto de otras
tantas voces argentinas que se alejaban lentamente por orillas del
río.
 MAYO

LOS NIÑOS RAQUÍTICOS

Viernes 5
 OY he estado de vacación porque no me encontraba
bien, y mi madre me ha llevado al Instituto de los Niños
Raquíticos, donde ha ido a recomendar una niña del
portero; pero no me ha dejado entrar en la escuela...
“¿No has comprendido, Enrique, por qué no te he
dejado entrar? Para no presentar delante de aquellos desgraciados,
en medio de la escuela, casi como de muestra, un muchacho sano y
robusto; ¡demasiadas ocasiones tienen ya de encontrarse en
dolorosos parangones! ¡Qué cosa tan triste! El llanto me sube del
corazón al entrar allí dentro. Habría unos sesenta entre niños y
niñas. ¡Pobres huesos torturados! ¡Pobres manos, pobres pies
encogidos y crispados! ¡Pobres cuerpecillos contrahechos! Pronto
se observan muchas caras graciosas, ojos llenos de inteligencia y
de cariño; había una carita de niña, con la nariz afilada y la barba
puntiaguda, que parecía una viejecilla; pero tenía una sonrisa de
celestial dulzura. Algunos, vistos por delante, eran hermosos y
parecía que no tenían defecto; pero se volvían..., y angustiaban el
corazón. Allí estaba el médico que los visitaba. Los ponía de pie
sobre los bancos, y les levantaba los vestidos para tocarles los
vientres hinchados y las abultadas articulaciones; pero no se
avergonzaban nada las pobres criaturas: se veía que eran niños
acostumbrados a ser desnudados, examinados y vistos por todas
partes. Y eso que ahora están en el período mejor de su
enfermedad, y ya casi no sufren. Pero ¿quién puede pensar lo que
sufrieron cuando empezó su cuerpo a deformarse; cuando, al crecer
su enfermedad, veían disminuir el cariño en torno suyo, pobres
niños a quienes se dejaba solos horas y horas en el rincón de una
habitación o de un patio, mal alimentados, escarnecidos a veces y
atormentados meses enteros con vendajes y aparatos ortopédicos,
muchas veces inútiles? Ahora, en cambio, gracias a las curas, a la
buena alimentación y la gimnasia, muchos se mejoran. La maestra
les obligó a hacer gimnasia. Daba lástima verlos extender sobre los
bancos, al oír ciertas voces, todas aquellas piernas fajadas,
comprimidas entre los aparatos, nudosas, deformes; piernas que se
hubieran cubierto de besos! Algunos no podían levantarse del
banco, y permanecían allí con la cabeza apoyada en el brazo,
acariciando las muletas con la mano; otros, al mover los brazos,