Tiến hành thí nghiệm

- Ly tâm 100 ml dịch khuẩn ở tốc độ 7000 vòng/phút, ở 100C trong 10 phút để thu
dịch enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào.
- Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối và 50ml tủa dung môi hữu cơ.
- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu (trước
tủa)
- 2 Mẫu tủa sẽ ly tâm, thu tủa và hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa). Xác định
hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa.
- Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký ái lực.

Tinh sạch Amylase tái tổ hợp sắc kí ái lực Ni2+-NTA agarose

Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị cột

- Nhồi 1 lớp bông thủy tinh có độ dày khoảng 2 mm vào ống tiêm 3 ml. (Lưu ý: bề
mặt lớp bông bằng phẳng).
- Đặt một lớp giấy lọc lên cột
- Cố định cột lên giá đỡ và nối dây truyền dịch với cột.
- Rửa cột với 1 ml đệm chiết tách, lặp lại 3 lần.

Cân bằng Ni2+-NTA agarose

- Cho 500 µl dịch Ni2+-NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút trong
2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi.
- Huyền phù tủa trong 1 ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở
40C, loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước này được thực hiện 3 lần.

Tinh sạch protein

- Trộn 1 ml dịch enzyme sau tủa với Ni2+-NTA agarose cân bằng đã chuẩn bị ở bước
trên, lắc ở 40C trong 1 giờ.

1
 - Sau 1 giờ, cho toàn bộ hỗn hợp protein và Ni2+-NTA agarose lên cột và thu dịch qua
cột (FT – flow-through), để ổn định cột trong 10 phút.
- Rửa phức hợp protein gắn với Ni2+-NTA agarose với 5 ml đệm rửa. Thu nhận dịch
rửa giải. Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch rửa.
- Thôi giải protein mục tiêu với 1 ml đệm thôi giải, lặp lại 5 lần. Thu nhận các phân
đoạn protein thôi giải và bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Xác định hoạt tính và hàm lượng protein
trong các phân đoạn.

Kết quả: đường chuẩn Bradford và Tinh bột của nhóm

Nồng độ protein

Dịch OD 595nm
Enzyme thô trước tủa 0.118 0.12 0.121 Pha loãng 50 lần đo protein
Enzyme tủa cồn 0.138 0.131 0.136 Pha loãng 100 lần đo protein
Enzyme tủa muối 0.148 0.142 0.141 Pha loãng 100 lần đo protein

Dịch OD 595nm
TG1 0.138 0.132 0.131
TG2 0.133 0.135 0.131
TG3 0.139 0.131 0.129
TG4 0.127 0.127 0.123
TG5 0.099 0.091 0.091
Dịch rửa (5 ml) 0.127 0.127 0.123 pha loãng 20 lần (dịch rửa)

Hoạt tính enzyme

Dịch OD thử không - thử thật

Enzyme thô trước tủa (pha loãng 15 lần đo hoạt tính) 0.167 0.167 0.163
Enzyme tủa cồn (pha loãng 50 lần đo hoạt tính) 0.246 0.245 0.246
Enzyme tủa muối (pha loãng 50 lần đo hoạt tính) 0.188 0.189 0.181

2
Dịch OD thử không - thử thật
TG1 (Pha loãng 30 lần làm hoạt tính) 0.161 0.161 0.169
TG2 (Pha loãng 25 lần làm hoạt tính) 0.163 0.165 0.161
TG3 (Pha loãng 10 lần làm hoạt tính) 0.121 0.121 0.129
TG4 (Pha loãng 5 lần làm hoạt tính) 0.157 0.167 0.143
TG5 0.069 0.071 0.061
Dịch rửa (5 ml) 0.008 0.01 0.009