Nuôi cấy virus Ebola ứng dụng chẩn đoán và nghiên cứu

1. Tổng quan về virus Ebola

1.1. Giới thiệu
Ebola virus (EBOV) là một chủng virus lây lan cực kỳ mạnh mẽ và gây bệnh sốt xuất
huyết gây tử vong ở người và động vật. Các đợt bùng phát Ebola virus disease (EVD)
diễn ra gần đây tại các nước Tây Phi đã được phân loại là một vấn đề sức khỏe quốc tế.
Để kiểm soát bệnh kịp thời, chúng ta cần có phương pháp điều trị/phòng ngừa hiệu quả,
tuy nhiên, trong tình trạng không có loại vaccine nào được chấp thuận, việc chẩn đoán và
theo dõi EBOV kịp thời vẫn là rất quan trọng. Các loại vaccine tiên tiến công nghệ như
vaccine vectơ virus, vaccine DNA và virus – liked partical đang được thử nghiệm chống
lại EBOV.
Bệnh Ebola (EVD) lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1976 và từ đó trở đi, đây là một
loại virú lây lan cực mạnh mẽ gây tử vong cho rất nhiều người. Bệnh này là bệnh chuyển
dịch từ động vật sang người, và có bằng chứng cho thấy dơi là nguồn chủ yếu.

Vi rút Ebola (EBOV) đã được liệt kê là vật gây bệnh thuộc loại A, yêu cầu mức độ kiểm
soát sinh học cấp độ 4 (BSL4) để xử lý các mẫu nghi ngờ. Triệu chứng bệnh bắt đầu bằng
sốt, đau bụng kèm nôn mửa và tiêu chảy, xuất huyết, đông máu trong mạch máu nội tạng,
suy tạng đa hệ thống và sốc giảm dịch máu, và trong các trường hợp cuối cùng, bệnh
nhân tử vong.
 Virus lây lan từ người bị bệnh sang người khỏe mạnh thông qua tiếp xúc trực tiếp. Virus
này có xu hướng tồn tại trong cơ thể dẫn đến các biến chứng khác như mất thị lực, mất
thính lực... cùng với việc lây truyền qua tinh dịch từ nam giới sang nữ giới và sang thai
nhi trong thai kỳ.

1.2. Virus và hệ gen của nó

EBOV thuộc bộ Mononegavirale (virus RNA chiều âm chuỗi đơn không phân đoạn) của
họ Filoviridae, chi Ebolavirus. Các thành viên khác của họ bao gồm Marburgvirus và
Cuevavirus, trong đó Marburgvirus cũng đã được liên quan đến việc gây ra các bệnh xuất
huyết tương tự EBOV, và cả hai đều là loại virus có hình dạng sợi.
EBOV lần đầu tiên được phân lập vào năm 1976.
Chi Ebolavirus bao gồm năm loài là
(1) Zaire ebolavirus (Zaire virus - ZEBOV)
(2) Sudan ebolavirus (Sudan virus - SUDV)
(3) Reston ebolavirus (Reston virus - RESTV)
(4) Taï Forest ebolavirus (Taï Forest virus - TAFV)
(5) Bundibugyo ebolavirus (Bundibugyo virus - BDBV) và Côte d'Ivoire ebolavirus
(CIEBOV).
Sự đa dạng về gen giữa các loài trong chi Ebolavirus dao động từ 25% đến 35%. Trong
số 5 loài này, ZEBOV và SUDV rất nguy hiểm, trong đó loài đầu tiên nguy hiểm nhất với
tỷ lệ tử vong trên 90%. ZEBOV thường được ghi nhận ở Trung Phi và đã gây ra các đợt
bùng phát lớn gần đây ở các quốc gia Tây Phi như Nigeria, Liberia, Guinea, Senegal và
Sierra Leone.

Cấu trúc Ebola và hệ gen của nó

Cấu trúc của các virus thuộc họ Filovirus thể hiện tính đa hình bao gồm những sợi dài, có
hình dạng giống như số '6', chữ 'U' hoặc hình tròn. Các sợi virus có đường kính 80 nm và
chiều dài lên đến 14.000 nm và được bao quanh bởi một màng lipid. Genom của EBOV
có chiều dài 19 kb, gồm 7 gen được sắp xếp như sau - 3" (leader)- NP-VP35-VP40-GP-
VP30-VP24-L-(trailer) 5". Bảy khung đọc mở này mã hóa các protein cấu trúc như
nucleoprotein (NP), glycoprotein vỏ (GP) và các protein ma trận như VP24 (protein liên
kết màng) và VP40. Ngoại trừ GP, mỗi gen này mã hóa 1 sản phẩm protein duy nhất.
Ngoài các protein cấu trúc, L (polymerase RNA), VP30 và VP35 (cả hai là các protein
ma trận polymerase) tương ứng với các protein phi cấu trúc chính. Những protein này có
vai trò khác nhau trong sự gây bệnh của virus, ví dụ như VP24 ức chế tín hiệu interferon,
VP35 là chất đối kháng của interferon, trong khi VP40 có vai trò trong quá trình giải
phóng virus. VP40 đã được phát hiện gần đây trong khu vực ngoại vi giống như exosome
có thể ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của vật chủ.
Gen GP mã hóa 3 phiên bản khác nhau của GP, gồm GP (chứa protein gắn kết GP1 và
protein nhập/suy diễn GP2), dạng tan chảy (sGP - được sản xuất từ RNA chưa chỉnh sửa)
và dạng tan chảy nhỏ (ssGP - là phiên bản cắt ngắn của sGP). Hầu hết các protein này có
nhiều chức năng. NP giúp đóng gói RNA genom để tạo thành hợp chất RNP (RNA + NP
+ L), đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép virus. GP và VP40 là các thành
phần cần thiết của vỏ virus. GP có vai trò trong quá trình gắn kết virus, xâm nhập vào tế
bào, gây ra sự làm tròn tế bào, giảm hoạt động của các protein bề mặt tế bào chủ, gây
viêm nhiễm, tổn thương tế bào và độc tính. Nhân gồm RNA virus phức tạp với 5 protein,
gồm NP, VP24, VP30 và VP35, và L. Khác với virus cúm A, tốc độ biến đổi gen rất chậm
trong EBOV, nhưng virus này đã phân nhánh từ vài ngàn năm trước.

1.3. Phạm vi vật chủ, vật mang và ổ chứa

EBOV gây sốt xuất huyết cấp tính ở người và các loài linh trưởng như cynomolgus
( Macaca fascicularis ) và khỉ rhesus ( Macaca rhesus ), khỉ xanh châu Phi
( Cercopithecus aethiops ) và khỉ đầu chó ( Papio hamadryas )

Các nghiên cứu đưa ra giả thiết rằng bệnh do Ebola virus gây ra bắt nguồn từ ba loài dơi
ăn quả là Epomops franqueti , Hypsignathus monstrosus và Myonycteris torquata . Dơi
ăn quả châu Phi được cho là ổ chứa tự nhiên của virus EBOV (Zaire) và virus Marburg.
4. Bệnh do Ebola Virus

Thời gian ủ bệnh dao động từ 1 đến 10 ngày. Các triệu chứng có thể xuất hiện từ 2 đến 21
ngày sau khi tiếp xúc với vi rút Ebola, trung bình là từ 8 đến 10 ngày.

Các dấu hiệu và triệu chứng chính của bệnh Ebola thường bao gồm một số hoặc một số
triệu chứng sau:

 Sốt
 Đau nhức, chẳng hạn như nhức đầu dữ dội và đau cơ và khớp
 Điểm yếu và mệt mỏi
 Đau họng
 Chán ăn, sưng hạch bạch huyết
 Các triệu chứng tiêu hóa bao gồm đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa
 Xuất huyết, chảy máu hoặc bầm tím không rõ nguyên nhân
.
Xuất huyết và nhiệt độ tăng đột ngột là hai dấu hiệu lâm sàng thường gặp được nhận thấy
và các dấu hiệu khác là đau ngực, khó thở và khó nuốt.

Có thể thấy máu trong phân và nước tiểu; hoặc các dấu hiệu đông máu như bầm tím hoặc
tổn thương mạch máu. Chảy máu từ lỗ mũi, nướu, niêm mạc âm đạo và đường tiêu hóa
(GI) là dấu hiệu phổ biến ở 40%–50% trường hợp và phát ban.

Chảy máu bắt đầu trong vòng 7 ngày kể từ khi bắt đầu có các triệu chứng lâm sàng ban
đầu, xuất huyết bên trong cũng như dưới da. Tử vong có thể xảy ra trong vòng 7–16 ngày
kể từ khi bắt đầu có triệu chứng lâm sàng và xảy ra do rối loạn chức năng một số cơ quan
và chảy máu nghiêm trọng. Tổng quan về sự lây truyền EBOV, cơ chế bệnh sinh và các
dấu hiệu lâm sàng được mô tả:

Có bốn giai đoạn lâm sàng:

(1) giai đoạn sốt sớm (bắt đầu từ 0–3 ngày) – sốt (lên đến 40 ° C), khó chịu, mệt mỏi, đau
nhức cơ thể, v.v.,
(2) giai đoạn tiêu hóa (bắt đầu từ 3–10 ngày ) – đau thượng vị, buồn nôn, nôn, tiêu chảy,
sốt dai dẳng, suy nhược, nhức đầu, tiêm kết mạc, đau ngực, đau bụng, đau khớp, đau cơ,
nấc, mê sảng, v.v.,

(3) giai đoạn sốc hoặc phục hồi (khởi phát 7–12 ngày) giảm ý thức hoặc hôn mê, mạch
nhanh,thở nhanh, và

(4) giai đoạn biến chứng muộn (khởi phát ≥10 ngày) liên quan đến xuất huyết tiêu hóa,
nhiễm trùng thứ phát, viêm màng não và các bất thường về nhận thức thần kinh

 Cơ chế tấn công:

Con đường lây nhiễm chính là qua niêm mạc hoặc da, từ đó đến các đại thực bào, bạch
cầu đơn nhân và tế bào đuôi gai, dẫn đến sự lây lan của virus đến các hạch bạch huyết
khu vực, gan và lá lách.

- Đại thực bào và bạch cầu đơn nhân được kích thích bởi EBOV giải phóng cơn bão
cytokine do đó làm tổn thương các mô và mạch máu.Tử vong xảy ra do mất hoặc
đông máu. Rối loạn đông máu xảy ra do giảm tiểu cầu, mất protein C chống đông
máu, phá hủy các yếu tố đông máu và cũng do phá hủy fibrin. Tổn thương mạch
máu gây ra đông máu nội mạch lan tỏa cũng như suy thận.
- Các tổn thương của EVD bao gồm xuất huyết lan rộng ở niêm mạc, hoại tử các cơ
quan khác nhau như gan, thận, tinh hoàn và buồng trứng. Các ổ hoại tử với các tế
bào viêm có thể được nhận thấy ở các tiểu thùy gan và có thể hình thành hợp bào
đa nhân trong các tế bào gan. Khí thũng nhẹ, phù nề ở phế nang tận cùng và ứ máu
trong nhu mô phổi.

 Con đường truyền bệnh

Các nhà khoa học cho rằng con người ban đầu bị nhiễm ebolavirus thông qua tiếp xúc với
động vật bị nhiễm bệnh, chẳng hạn như dơi ăn quả hoặc linh trưởng .Sau đó, virus lây lan
từ người sang người.

Ebolavirus lây lan qua tiếp xúc (chẳng hạn như qua da bị tổn thương hoặc màng nhầy ở
mắt, mũi hoặc miệng) với

- Máu hoặc dịch cơ thể (nước tiểu, nước bọt, mồ hôi, phân, chất nôn mửa, sữa mẹ,
nước ối và tinh dịch) của người mắc bệnh hoặc đã chết vì bệnh Ebola.
- Các đồ vật (như quần áo, ga trải giường, kim tiêm và thiết bị y tế) bị nhiễm chất
dịch cơ thể của người mắc bệnh hoặc đã chết vì bệnh Ebola.
- Dơi ăn quả bị nhiễm bệnh hoặc động vật linh trưởng (như vượn và khỉ).
- Ebolavirus có thể tồn tại trong một số chất dịch cơ thể (bao gồm cả tinh dịch) của
bệnh nhân đã khỏi bệnh Ebola, ngay cả khi họ không còn các triệu chứng của bệnh
nặng
Một người chỉ có thể truyền vi rút Ebola cho người khác sau khi họ phát triển các
dấu hiệu và triệu chứng của bệnh Ebola.

Ngoài ra, virus Ebola có thể lây lan qua việc xử lý và tiêu thụ thịt động vật hoang dã hoặc
bị săn bắt động vật hoang dã bị nhiễm virus Ebola.

2. Kỹ thuật nuôi cấy virus Ebola

2.1. Khái quát về nuôi cấy virus Ebola

Trước đây, nuôi cấy virus sống được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện virus, nhưng
hiện nay PCR và giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đang ngày càng trở nên quan trọng
trong chẩn đoán.

Việc phân lập virus Ebola có thể được thực hiện từ huyết thanh của bệnh nhân bằng cách
sử dụng dòng tế bào Vero E6 và cần vài ngày (từ 3 đến 6 ngày) để phát hiện tác động tế
bào. Phương pháp này không được sử dụng để chẩn đoán ban đầu vì độ nhạy kém hơn
PCR và yêu cầu phòng thí nghiệm cấp 4 (BSL - 4).

Tuy nhiên, phân lập virus rất hữu ích cho các nghiên cứu về độc lực hoặc cơ chế gây
bệnh. Hơn nữa, thông qua phân lập virus, người ta có thể thu được nồng độ virus nhất
quán có thể được sử dụng để giải trình tự toàn bộ bộ gen hoặc cho các nghiên cứu dịch tễ
học phân tử.

2.1.1. Điều kiện nuôi cấy

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là phương pháp tiêu chuẩn để xác nhận sự hiện diện của bệnh
virus Ebola. Tuy nhiên, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng nuôi cấy
virus Ebola do virus này nằm trong danh mục BSL 4 (biosafety level 4), tức tác nhân gây
bệnh cực nguy hiểm và có khả năng lây lan nhanh chóng. Vì vậy, việc nuôi cấy virus
Ebola phải được thực hiện ở những phòng thí nghiệm an toàn cao nhất và do các chuyên
gia đảm nhiệm. [1]

2.1.2. Dòng tế bào nuôi cấy

Dòng tế bào được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy virus Ebola là dòng tế bào vero cell E6.
Tế bào Vero lần đầu tiên được phân lập từ thận của một con khỉ xanh châu Phi vào năm
1962 bởi Yasumura và Kawakita. Tế bào vero có một số đặc điểm rất phù hợp cho việc
nuôi cấy virus như: [2]
- Tế bào Vero là tế bào biểu mô, có nguồn gốc từ các tế bào lót bề mặt của các cơ
quan. Virus thường xâm nhập vào cơ thể qua đường biểu mô, vì vậy việc nuôi cấy virus
trên tế bào biểu mô sẽ giúp tái tạo môi trường tự nhiên của virus và tăng khả năng nhân
lên của virus.
- Tế bào Vero là tế bào liên tục, có nghĩa là chúng có thể được nuôi cấy trong thời gian
dài mà không bị chết. Điều này rất quan trọng trong nghiên cứu virus, vì cần phải có thời
gian để virus nhân lên và phát triển.
- Tế bào Vero không sản xuất interferon do bị mất một đoạn lớn trên nhiễm sắc thể 12,
mang các gen interferon loại I và CDKN2., một loại protein có tác dụng chống
virus. Điều này khiến tế bào Vero dễ bị nhiễm virus hơn, giúp các nhà nghiên cứu có thể
dễ dàng quan sát các hiệu ứng của virus trên tế bào.
- VERO C1008 (Vero 76, bản sao E6, Vero E6) là một dòng tế bào biểu mô được phân
lập từ thận của khỉ xanh châu Phi. Dòng này là một bản sao của VERO 76 (ATCC CRL-
1587). Nó được nhân bản bằng phương pháp pha loãng vào các tấm vi mô vào năm 1979
bởi P.J. Price. Khi bị nhiễm các virus sốt xuất huyết [Machupo (Bolivia), Junin
(Argentina), Lassa (châu Phi)], virus Marburg hoặc virus Ebola, các tế bào này biểu hiện
vệt tan. VERO C1008 thể hiện một mức độ ức chế tiếp xúc nhất định sau khi tạo thành
lớp đơn, do đó hữu ích trong việc phát triển các virus nhân lên chậm. Dòng tế bào này có
thể được sử dụng trong nghiên cứu độc tính. [3]
Ngoài ra, dòng tế bào HEK – 293 cũng được nghiên cứu thử nghiệm và ứng dụng nhiều
trong nuôi cấy virus Ebola. Tế bào HEK 293 được phân lập từ các mô nuôi cấy của thận
phôi người và được chuyển gen với DNA adenovirus 5. Điều này cho phép sử dụng
promoter virus này để tăng cường phiên mã các sản phẩm như protein tái tổ hợp. Hiện
nay, có một số biến thể HEK 293 được sản xuất cho các ứng dụng cụ thể. Những tế bào
này ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học vì chúng dễ thao tác, mạnh mẽ, phát triển
nhanh và dễ chuyển gen. Tế bào HEK 293 thường được sử dụng để sản xuất protein và
virus điều trị [4]. HEK 293T là một ví dụ về một dòng tế bào HEK 293 được tối ưu hóa
cho các ứng dụng này. Trong trường hợp này, tế bào HEK 293 được chuyển gen để ổn
định biểu hiện “T-antigen” nhạy cảm với nhiệt độ lớn chứa nguồn gốc biểu hiện SV40
(virus) (và gen kháng Neomycin). Điều này có nghĩa là bất kỳ plasmid nào được chuyển
gen có nguồn gốc sao chép SV40 đều có thể được biểu hiện ở mức độ cao. Do đó, có thể
sản xuất protein hoặc virus với số lượng lớn hơn so với tế bào HEK 293 không có hệ
thống promoter bổ sung. [5]
2.2. Nuôi cấy ứng dụng chẩn đoán/định lượng
2.2.1. Phương pháp định lượng bằng vệt tan (plaque assay) (1981)
Đây là phương pháp kinh điển đã được phát triển từ năm 1981 bởi AMES B. MOE,
RHONDA D. LAMBERT và HAROLD W. LUPTON. [6] Hiện nay đây vẫn là phương
pháp phổ biến khi nghiên cứu virus Ebola
Các chủng virus được sử dụng trong nghiên cứu này là E-718 của dòng virus Zaire (EV)
và Boniface của dòng virus Sudan (EV). Cả hai chủng đều được phân lập bằng cách tiêm
nội phúc mạc cho chuột lang với huyết thanh người nhiễm bệnh. Chúng được truyền
thêm hai lần cho chuột lang bằng cách tiêm nội phúc mạc dịch đồng nhất gan chuột lang
bị nhiễm bệnh. Sau đó, chúng được truyền tiếp trong tế bào Vero. Trong phòng thí
nghiệm, virus được tiếp tục truyền bằng cách tiêm vào lớp đơn tế bào Vero 75 cm 2 flasks
với khoảng 103 liều gây nhiễm 50% cho chuột lang của mỗi chủng EV. Sau khi virus hấp
phụ trong 1 giờ, 30 ml Eagle basal meida có chứa 5% fetal bovine serum, kháng sinh
(100 U penicillin và 100 µg streptomycin sulfat/ml) và đệm HEPES (N-2-hydroxyethyl-
N'-2-ethanesulfonic acid) 30 mM được thêm vào mỗi bình. Flasks được đậy kín bằng nắp
kín khí và ủ ở 37°C trong 10 ngày trước khi cho đông lạnh. (Kháng sinh giúp ngăn ngừa
nhiễm trùng bởi các vi sinh vật khác, đệm hepes nhằm duy trì pH, nhiệt độ 37 độ là nhiệt
độ tối ưu cho sự phát triển của virus Ebola). Dịch nuôi cấy sau đó được giã đông và được
ly tâm ở 500 x g trong 10 phút để loại bỏ mảnh vụn tế bào, và dịch nổi thu được được bảo
quản ở -70°C cho đến khi sử dụng. Tính nhiễm của mỗi nhóm virus được kiểm tra bằng
cách tiêm nội phúc mạc cho chuột lang dòng Hartley
Đối với thí nghiệm định lượng bằng vệt tan, đầu tiên các mô lớp đơn của các dòng tế bào
được thử nghiệm được cấy lên các giếng của plate 12 giếng. Mỗi giếng được tiêm 0,2 ml
dung dịch pha loãng (10-1 đến 10-6) của một trong hai chủng virus Ebola (EV). Sau khi
tiêm virus, đĩa được để trong 1 giờ ở 37°C để virus hấp thụ. Sau đó, 1,5 ml Eagle basal
meida chứa 0,75% agarose, 2% huyết tương bò, kháng sinh và 30 mM HEPES được thêm
vào mỗi giếng. Các đĩa được chia thành các nhóm được ủ trong 3, 5, 7 hoặc 9 ngày ở
37°C. Kiểm soát khí bằng việc bọc kín đĩa trong lá nhôm. Sau các thời gian ủ khác nhau,
các mô lớp đơn được nhuộm bằng một lớp phủ agarose chứa neutral red 1:6.000. Các đĩa
được kiểm tra để xác định các vết bệnh sau 24 và 48 giờ sau khi thêm lớp phủ. Kết quả
cho thấy tế bào Vero là dòng tế bào duy nhất phát triển vết bệnh với cả hai chủng virus
Ebola Zaire và Sudan. Các vết tan không rõ ràng được hình thành trong tế bào phổi
rhesus thai nhi bị nhiễm bệnh với chủng virus Ebola Zaire nhưng không phải với chủng
virus Sudan. Những thay đổi về tế bào được quan sát trong các mô lớp đơn của tế bào
SW-13 (phát triển từ ung thư tuyến tiền liệt của con người) bị nhiễm bệnh với chủng
virus Ebola Zaire, mặc dù không có vết bệnh rõ ràng được hình thành. Ngược lại, phép
đo vết tan của chủng virus Ebola Zaire trong tế bào SW-13 đã được mô tả cho EV sau các
bước tinh chế virus bao gồm tập trung với polyethylene glycol 6000 và tách virus trong
các gradient tartrate kali
Sau 5 ngày ủ, các vết tan trên tế bào Vero có kích thước nhỏ. Vào ngày thứ 7, các vếttan
đã tăng lên đường kính từ 2 đến 5 mm, và 24 giờ sau khi nhuộm các vết bệnh đã dễ dàng
nhận thấy. Các chủng virus Ebola Zaire và Sudan đã tạo ra các vết bệnh khác nhau một
cách nhất quán. Các vết tan được tạo ra bởi chủng virus Zaire có hình dạng “đục ra”,
trong khi các vết tan được tạo ra bởi chủng virus Sudan có các tế bào sống còn trong vết
bệnh, tạo ra hình dạng “mắt bò”. Các vết tanlớn nhất và rõ ràng nhất cho mỗi chủng virus
Ebola xuất hiện sau 7 ngày ủ. Thời gian ủ ngắn hơn sẽ cho ra các vết tan nhỏ, không rõ
ràng và khó quan sát, trong khi vào ngày thứ 9, việc đếm các vết tan trở nên khó khăn do
các vết tan trộn lẫn với nhau. Do đó, 7 ngày được cho là tối ưu để quan sát các vết tan.
2.2.1. Phương pháp định lượng bằng vệt tan (plaque assay) (đã chuẩn hóa)
Hiện nay, phương pháp plaque assay là phương pháp tiêu chuẩn đối với mọi phòng thí
nghiệm nghiên cứu về virus Ebola. Các tiêu chí đã được đánh giá và xác nhận bởi hiệp
hội Filovirus Animal Nonclinical Group (FANG), và đã được cấp phép bởi FDA Hoa Kỳ.
[7]
Các tiêu chí quan trọng để kết quả của xét nghiệm vệt tan xác định virus Ebola thành
công được tóm tắt trong bảng sau:
Tiêu chí Yêu cầu
Dòng tế bào Vero cell E6, ATCC
Số lần cấy truyền 25 – 40 lần là tối ưu
Độ tăng sinh tới hạn 85% - 100%
Thể tích tế bào cấy 300 µL
vào giếng
Nồng độ agarose lớp 0.5%
phủ
Neutral red 4% với Gibco neutral red, 5% với Sigma neutral red
Thời gian ủ cần thiết 7 ngày
trước khi nhuộm
Thời gian đọc kết 24 – 48 giờ với Gibco, 48 giờ với Sigma
quả sau khi nhuộm

2.3. Nuôi cấy ứng dụng nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu phát triển tác nhân kiểm soát sinh học EbolaΔVP30
* Tổng quan về tác nhân kiểm soát sinh học EbolaΔVP30
Đây là phương pháp được nghiên cứu và phát triển bởi giáo sư Peter Halfmann và cộng
sự thuộc đại học Wisconsin [8]. Virus ebola sẽ được đột biến mất đoạn gen mã hóa cho
protein VP30, một protein quan trọng khởi đầu quá trình phiên mã hệ gen của virus Ebola
[9]. Kết quả là chủng EbolaΔVP30 chỉ có khả năng nhân lên nếu tế bào có biểu hiện
protein VP30. EbolaΔVP30 là ứng viên tiềm năng trong nghiên cứu vaccine thế hệ mới,
do chúng có tính chất y hệt chủng dại nhưng mất khả năng nhân lên, thực tế là vaccine
EbolaΔVP30 hiện nay đã được thử nghiệm giai đoạn 1 với kết quả tích cực. Ngoài ra
EbolaΔVP30 giúp mở ra nhiều nghiên cứu mới hơn về Ebola virus, vốn bị cản trở rất
nhiều vì BSL – 4.
* Quy trình phát triển chủng EbolaΔVP30

Tế bào và dòng tế bào.

- Tế bào Vero E6 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy EMEM bổ sung 10% FCS, l-
glutamine, vitamin, dung dịch axit amin không thiết yếu và kháng sinh.

- Dòng tế bào VeroVP30 được thiết lập bằng cách biến nạp đồng thời vào tế bào Vero
pCAG-VP30 (để biểu hiện VP30) và pPur, một plasmid biểu hiện protein cho gen kháng
puromycin (Clontech), sử dụng TransIT LT-1 (Mirus). Hai ngày sau khi chuyển gen, các
tế bào kháng puromycin được chọn lọc với 5 μg/ml puromycin (Sigma). Các dòng tế bào
riêng lẻ được sàng lọc biểu hiện VP30 bằng phương pháp flow cytometry với polyclonal
peptide antibody cho VP30.

- Tế bào thận phôi người 293T được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified
Eagle's medium bổ sung glucose cao chứa 10% FCS, l-glutamine và kháng sinh. Tất cả
các tế bào đều được duy trì ở nhiệt độ 37°C và 5% CO2.

Flow Cytometry

- Tế bào được tách lớp trong dung dịch PBS có chứa 0,02% EDTA, sau đó rửa một lần
bằng dung dịch PBS lạnh bổ sung 2% FCS và 0,1% natri azide (dung dịch rửa).

- Tế bào được ủ với kháng thể VP30 trong 20 phút.

- Sau khi rửa trong đệm, tế bào được ủ tiếp với kháng thể thứ cấp được gắn với isocyanat
huỳnh quang (Zymed).

- Sau đó, tế bào được rửa bằng đệm và phân tích bằng FACSCalibur với phần mềm
CellQuest (Becton Dickinson).

Virus EbolaΔVP30

- Plasmid pTM-T7G-Ebo-Rib chứa cDNA EBOV đầy đủ được chèn vào giữa trình tự
khởi động polymerase T7 RNA và ribozyme

- Đầu tiên, một đoạn bao gồm các nucleotide 6180–10942 được gắn vào một vector nhân
bản kháng kanamycin.

- Tiếp theo, ORF VP30 được thay thế bằng các ORF mã hóa neo hoặc eGFP, tương ứng,
bằng một loạt các bước khuếch đại PCR chồng lấn sử dụng Pfu Turbo (Stratagene). Các
đoạn dưới dạng gen phụ được thay đổi được chuyển trở lại plasmid cDNA EBOV toàn
phần bằng cách sử dụng hai restric enzyme SalI và SacI.

- Các plasmid kết quả, được chỉ định là pTM-EbolaΔVP30-neo hoặc pTM-EbolaΔVP30-
eGFP, được giải trình tự để xác minh sự thay thế của ORF VP30 và không có bất kỳ đột
biến không mong muốn nào.

- Để tạo ra EBOV nhân tạo, chúng tôi đã chuyển gen 5 × 10 5 tế bào HEK - 293T với 1,0
μg pTM-EbolaΔVP30, 2,0 μg pCAG-L, 1,0 μg pCAG-NP, 0,5 μg pCAG-VP35, 0,5 μg
pCAG-VP30 và 1,0 μg pCAG-T7 pol sử dụng TransIT LT1 (Mirus) trong điều kiện BSL-
4 (26).

- Năm ngày sau khi chuyển gen, dịch nuôi cấy được thu hoạch, mảnh vụn tế bào được
loại bỏ bằng cách ly tâm tốc độ thấp và virus được khuếch đại trong tế bào VeroVP30 ở
37 ° C và 5% CO2 với môi trường EMEM chứa 2% FCS, bổ sung l-glutamine, vitamin,
dung dịch axit amin không thiết yếu và kháng sinh mà không có puromycin.

Xét nghiệm vết tan (Plaque Assay) và xét nghiệm nhuộm miễn dịch (Immunostaining
Assay):

- Để xác định nồng độ virus EBOV hoang dã hoặc virus EbolaΔVP30, dịch pha loãng 10
lần của virus vào tế bào VeroVP30 hoặc Vero hoang dã trong 1 giờ ở 37°C, sau đó bất kỳ
virus nào không gắn kết đều được loại bỏ bằng cách rửa tế bào với môi trường nhân lên.

- Sau đó, các tế bào được phủ lên trên môi trường nhân lên chứa 1,5% methyl cellulose
(Sigma). Bảy ngày sau khi nhiễm trùng, tế bào được cố định bằng 10% formaldehyde, lấy
ra khỏi BSL-4, thẩm thấu bằng 0,25% Triton X-100 trong PBS trong 10 phút và chặn
bằng 4% huyết thanh dê và 1% BSA trong PBS trong 60 phút.

- Sau đó, các tế bào được ủ trong 60 phút với dung dịch pha loãng 1:1.000 của kháng thể
đơn dòng kháng VP40 của chuột, rửa bằng PBS và ủ trong 60 phút với dung dịch pha
loãng 1:1.000 của kháng thể thứ cấp anti-mouse IgG liên hợp peroxidase (Kirkegaard &
Perry Laboratories).

- Sau khi rửa bằng PBS, tế bào được ủ với 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
(Sigma) trong PBS. Phản ứng được dừng lại bằng cách rửa tế bào bằng nước.

Chuyển sang phương pháp Western Blot:

- Virus được tinh chế một phần được tái huyền phù trong dung dịch ly giải (50 mM Tris ·
HCl, pH 7,5 / 150 mM NaCl / 0,5% Triton X-100 / 0,1% SDS) chứa chất ức chế protease
được ủ ở 100°C trong 5 phút, lấy ra khỏi BSL-4 và tách trên gel polyacrylamide 4–20%.
- Protein được phân giải được chuyển sang màng polyvinylidene difluoride Western) và
chặn qua đêm ở 4°C với 5% sữa tách béo trong PBST [0,05% Tween 20 (Sigma) trong
PBS].

- Blot được ủ với kháng thể chính (kháng thể anti-NP chuột, kháng thể anti-VP35 thỏ,
kháng thể anti-VP40 thỏ, kháng thể anti-GP chuột, kháng thể anti-VP30 thỏ hoặc kháng
thể anti-VP24 chuột) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng, rửa ba lần bằng PBST, ủ với kháng
thể thứ cấp thích hợp liên hợp với peroxidaseeradish (Zymed) trong 60 phút và cuối cùng
rửa ba lần bằng PBST.

- Blot sau đó được ủ trong chất nền Western blotting Lumi-Light (Roche) và tiếp xúc với
phim X-quang

Phân lập RNA và RT-PCR:

- Dịch nuôi cấy tế bào từ tế bào VeroVP30 bị nhiễm virus được bất hoạt bằng đệm
guanidinium isothiocyanate và lấy ra khỏi BSL-4.

- RNA virus được phân lập bằng bộ dụng cụ RNeasy Mini (Qiagen). RT-PCR được thực
hiện với bộ dụng cụ RobusT One-Step RT-PCR (Finnzyme) sử dụng 1 μg RNA phân lập
và mồi đặc hiệu EBOV.

- Sản phẩm PCR thu được được nhân bản vào pT7Blue (Novagen) và giải trình tự.

TEM (Electron Microscopy - Kính hiển vi điện tử):

- 36 giờ sau khi nhiễm trùng, các tế bào VeroVP30 bị nhiễm virus EbolaΔVP30-neo được
cố định và bất hoạt bằng 2,5% glutaraldehyde trong đệm cacodylate 0,1 M, lấy ra khỏi
BSL-4 và cố định sau bằng 2% osmium tetroxide trong cùng đệm. Sau đó, các tế bào
được khử nước với một loạt các nồng độ ethanol tiếp theo là propylene oxide trước khi
được nhúng vào hỗn hợp Epon 812 Resin (TAAB Laboratories Equipment).

- Các lát mỏng được nhuộm bằng dung dịch 2% uranyl acetate và chì Raynold và kiểm
tra dưới kính hiển vi điện tử Hitachi H-7500 ở điện áp 80 kV.

Lựa chọn đột biến thoát:

- EbolaΔVP30-eGFP được pha loãng 10 lần (10−1 đến 10−6) và ủ với các mAb được chỉ
định ở nồng độ 250–500 μg mAb/ml ở 37°C trong 60 phút.
- Hỗn hợp virus/mAb được tiêm vào tế bào VeroVP30 trong 60 phút. Virus được khuếch
đại trong 5 ngày có kháng thể.

- Sau đó, virus phát triển trong sự hiện diện của mAb (như được xác định bởi biểu hiện
GFP) được thu hoạch ở pha loãng dương tính với virus cao nhất và được nuôi cấy tổng
cộng ba đến sáu lần trong sự hiện diện của kháng thể.

- RNA virus được phân lập và khuếch đại bằng RT-PCR, và trình tự GP được xác định
bằng phân tích trình tự.
3, Các thiết bị dùng trong nuôi cấy virus Ebola

a, Tủ ấm CO2, nuôi cấy tế bào, 850 lít Model: NB-203XXL Hãng N-Biotek, Hàn Quốc
Tủ ấm CO2, nuôi cấy tế bào, 850 lit NB-203XXL N-Biotek (vattuyte.vn)

Tính năng:
- Lý tưởng cho việc nuôi cấy tế bào động vật, trứng/tinh trùng, nuôi cấy tế bào kỵ khí, các
loại tế bào vi sinh; nảy mầm/ấp trứng và nuôi cấy mô đặc biệt
- Hệ thống gia nhiệt 6 mặt
Các thanh gia nhiệt bằng điện được lắp ở các mặt buồng tủ cho nhiệt độ đồng đều, ổn
định, gia nhiệt và phục hồi nhiệt độ nhanh chóng, 3 phần của bộ phận gia nhiệt được điều
khiển và hiệu chuẩn độc lập nhờ 3 cảm biến nhiệt độ.
- Kiểu gia nhiệt: áo khí
- Cảm biến CO2 hồng ngoại 2 chùm tia: Phát hiện nhanh chóng và chính xác khí
CO2 không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm
- Quá trình tạo ẩm tự nhiện nhờ khay nước: Gia nhiệt ở đáy tủ làm nóng nước trong khay
và tạo ẩm cho tủ. Quạt tuần hoàn chuyển hơi ẩm này tới toàn buồng tủ
- Không ngưng tụ: Bộ gia nhiệt ở cửa trước và khung ngăn quá trình ngưng tụ trong
buồng và trên mặt cửa kính
- Bộ điều khiển PID vi xử lý: Hệ thống điều khiển thông minh: nồng độ CO2, nhiệt độ,
cảnh báo
- Màng lọc khí HEPA được lắp sẵn
Thông số kỹ thuật chính:
- Dải nhiệt độ điều chỉnh: từ nhiệt độ môi trường+ 5oC đến 60oC
+ Độ chính xác nhiệt độ ±0.5℃ tại 37℃
+ Bước tăng nhiệt độ: 0.1℃
+ Điều khiển: PID vi xử lý kỹ thuật số
- Tủ ấm áo khí gia nhiệt trực tiếp 6 mặt, có quạt tuần hoàn
- Báo động mức CO2 cao thấp, báo nhiệt độ
- Khoảng CO2: 0% đến 20%
+ Độ chính xác CO2: ±0.1% tại 5% ở 37℃
+ Bước tăng: 0.1%
+ Cảm biến CO2: IR CO2 Sensor
+ Bộ điều khiển: Vi xử lý
+ Áp suất đầu vào: 0.9 – 1.0 bar
- Cửa ngoài: cửa từ đệm Silicon
- Cửa trong: cửa kính cường lực
- Hiển thị màn hình LED, 2 kênh
- Khoang tủ bằng thép không gỉ ( SUS 304)
- Dung tích: 850 lít
- Kích thước buồng: 698 x 799 x 1528 (rộng x sâu x cao) (mm)
- Kích thước ngoài: 820 x 950 x 1840 (rộng x sâu x cao) (mm)
- Số giá lắp tối đa: 15 cái
- Trọng lượng: 266 kg
- Nguồn điện: 220V; 50-60Hz, 1.2kW
Cung cấp bao gồm:
- 01 Tủ ấm CO2
- Cung cấp kèm theo 3 giá (tối đa lắp được 15 giá)
- 01 Van điều áp
- 01 Bình khí CO2 độ tinh sạch cao (cung cấp trong nước)

b, Máy biến nạp tế bào LONZA

Máy biến nạp tế bào < BCE Vietnam

– Hệ thống 4D-Nucleofector ™ sử dụng công nghệ Nucleofection, cùng với hóa chất
(kit) đi kèm để biến nạp trực tiếp vào nhân tế bào. Nguyên liệu biến nạp có thể là Acid
Nucleic (DNA, RNA, Plasmid) hay protein. Có thể thực hiện biến nạp đồng thời nhiều
nguyên liệu cùng lúc. Các protocol và kit đi kèm được phát triển tối ưu cho nhiều loại,
dòng tế bào khác nhau, bao gồm cả primary cell và cell lines, stem cell.

– Hệ thống 4D-Nucleofector ™ được thiết kế dưới dạng các mô-đun kết nối với nhau bao
gồm một bộ phận điều khiển Core Unit kết hợp với một hay nhiều các bộ phận chức năng
khác nhau như X Unit, Y Unit, LV unit, 96 Well shutle tùy theo các ứng dụng khác nhau

Bộ phận Core Unit

– Chức năng:

+ Điều khiển hệ thống 4D- Nucleofector

– Đặc điểm:

+ Có thể điều khiển lên đến 5 bộ phận (units) chức năng khác nhau, cùng lúc

+ Màn hình cảm ứng 5.7” điều khiển hệ thống có thể gập lại được

+ Phần mềm được cài đặt trực tiếp trong máy, hoạt động trực quan giúp cài đặt và lưu trữ
các thí nghiệm dễ dàng.

+ Cổng truy cập USB giúp cập nhật phần mềm, protocol và xuất dữ liệu.

+ Kích thước (W x H x D): 24.5 x 10.5 x 28 cm

+ Khối lượng: 4.4 kg;

Bộ phận Y Unit

– Chức năng:

+ Cho phép thực hiện “nucleofection” vào các dòng tế bào khác nhau được nuôi cấy dạng
bám dính (adherent)

– Đặc điểm:

– Thiết kế compact, không yêu cầu bảo dưỡng. Có thể đặt gọn cả Core unit và Y unit vào
trong tủ nuôi cấy.
– Ngăn kéo có giá đặt đĩa được điều khiển bằng điện:

– Giá đặt phù hợp cho loại đĩa nuôi cấy 24 giếng (24-well Dipping electrodes)

– Hiệu suất biến nạp lên tới 70%, có thể biến nạp tế bào ở nhiều giai đoạn nuôi cấy khác
nhau

– Có thể kết nối trực tiếp với Core Unit hoặc kết nối thông qua X Unit

– Các protocol được cài đặt sẵn tương ứng với các protocol đã được tối ưu và khuyến
nghị sử dụng cho mỗi loại tế bào (tra cứu trên database của hãng).

Thông số kỹ thuật:

+ Tốc độ biến nạp: 8-10 phản ứng một phút

+ Nhiệt độ môi trường làm việc từ 15-40oC

+ Kích thước: tương tự Core Unit

+ Khối lượng: 5.0 kg;

+ Nguồn điện: 100-240VAC, 50-60 Hz

+ Công suất tiêu thụ: 140VA

Bộ phận X Unit

– Chức năng:

+ Cho phép thực hiện Nucleofection vào các dòng tế bào khác nhau được nuôi dạng
huyền phù (suspension)

– Đặc điểm:

Ngăn kéo giữ cuvette và strip được điều khiển bằng điện:

+ Có 2 loại vị trí chức năng: 1 vị trí cho 20µl Nucleocuvette™ strips và 2 vị trí cho 100
μl Nucleocuvette đơn
+ Có cổng kết nối HV với hệ thống 96-well Shuttle™

+ Thiết kế compact, không yêu cầu bảo dưỡng. Có thể đặt gọn cả Core unit và Y unit vào
trong tủ nuôi cấy.

+ Các protocol được cài đặt sẵn tương ứng với các protocol đã được tối ưu và khuyến
nghị sử dụng cho mỗi loại tế bào (tra cứu trên database của hãng).

+ Sử dụng cùng 1 protocol cho thể tích chuyển 100 µl và 20 µl

+ Với 100 μl Nucleocuvette áp dụng cho lượng tế bào lớn từ 105 – 107

+ Với 20 µl Nucleocuvette™ strips áp dụng cho lượng tế bào thấp khoảng 104 – 105

+ Tối ưu hóa nhiều loại tế bào dễ dàng khi sử dụng hệ thống 96-well Shuttle Add-on
(high throughput)

Thông số kỹ thuật:

+ Tốc độ biến nạp: 16-32 Reaction/phút (16 well strip); 20-26 reaction/phút (single
cuvette)

+ Nhiệt độ môi trường làm việc từ 15-40oC

+ Kích thước: Tương tự Core Unit

+ Trọng lượng: 4.7 kg

+ Nguồn điện: 100-110VAC hoặc 230VAC, 50-60 Hz

+ Công suất tiêu thụ: 140VA

c, BD Accuri™ C6 Plus Personal Flow Cytometer

https://lifesciences.vn/product/1-bd-accuritm-c6-plus-personal-flow-cytometer-ruo/
Model: BD Accuri™ C6 Plus Flow Cytometer

Hãng sản xuất: BD – Becton Dickinson

Xuất xứ: Singapore

BD Accuri là hệ thống phân tích dòng chảy cá nhân được trích dẫn rộng rãi trong các
nghiên cứu trên thế giới

Chỉ dùng trong nghiên cứu (RUO)

- Thông số kỹ thuật:

 Dải động học mười mũ 7,2 (16 triệu kênh dữ liệu số)

 Độ nhạy cao: MESF <75 (FITC) và <50 (PE)

 Hệ thống bơm nhu động không cần tạo áp

  Tốc độ thu thập lên đến 10.000 sự kiện/giây

 Tương thích với nhiều loại ống khác nhau, bao gồm ống 12x75mm (hoặc nhỏ hơn)

 Dung dịch chạy máy có thể sử dụng nước cất theo chuẩn của phòng thí nghiệm

 Kích thước (Cao x Rộng x Sâu): 27,9 x 37,5 x 41,9 cm

 Trọng lượng: 13,6 kg

 Nguồn điện: 100–240 VAC, 50/60 Hz

- Tùy chọn bộ tải mẫu tự động BD CSampler Plus, tương thích với:

 Đĩa 48 giếng

 Đĩa 96 giếng

 Đĩa 96 giếng sâu

 Giá 24 ống cho ống tiêu chuẩn 12 x 75-mm

- Một số ứng dụng của máy BD Accuri™ C6 Plus

1. Phân tích kiểu hình miễn dịch (Immunophenotyping) và cytokine

Hệ thống BD Accuri C6 Plus là một máy để bàn thích hợp cho các nghiên cứu phân loại
miễn dịch trọng điểm và là cấu hình cho phép phân tích một cách chính xác và nhanh
chóng lên tới 6 thông số đối với cùng 1 tế bào đơn. Dải động học phát hiện rộng cũng làm
hệ thống này dễ dàng phân tích tế bào khác nhau về kích thước như tiểu cầu, tế bào ưa
axít trong cùng tệp dữ liệu.
2. Phân tích nhanh các quá trình của tế bào

Máy BD Accuri C6 Plus có thể phân tích một loạt các quá trình tế bào sau:

 Chu kỳ chết tự nhiên (Apoptosis)

 Truyền tín hiệu tế bào (Cell signaling)

 Hàm lượng DNA (liên quan đến mức độ bội thể)

  Các tổn thương trên DNA

 Chu kỳ tế bào

 Tăng sinh tế bào (Proliferation)

 Khả năng sống sót (Viability)

3. Nghiên cứu đặc điểm của tế bào gốc và các tế bào được tạo ra từ chúng

 Sử dụng máy BD Accuri C6 Plus, các nhà nghiên cứu có thể phân tích quá trình
nuôi cấy tế bào gốc một cách nhanh chóng và chính xác vì nó có khả năng phân
tích sự biểu hiện của nhiều dấu ấn bề mặt và các dấu ấn nội bào ở cấp độ tế bào
đơn một cách nhanh chóng và đơn giản

 Bộ kit BD Stemflow ™ tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu tế bào gốc
nhiều khía cạnh, từ đánh giá kiểu hình tế bào gốc đa năng và tế bào gốc trưởng
thành đến hiệu quả tái lập trình các tế bào gốc đa năng cảm ứng ở người iPSC.

 Danh mục kháng thể toàn diện của BD Life Sciences hỗ trợ cho việc nghiên cứu
đặc điểm của tế bào gốc và khả năng biệt hóa của chúng, bao gồm các loại tế bào
thần kinh, tuyến tụy, gan và tim.

4. Phân tích vi sinh vật trong một loạt các ứng dụng

 BD Accuri C6 Plus có thể cung cấp nguồn dữ liệu phong phú trong một loạt các
ứng dụng vi sinh, chẳng hạn như đo lường biểu hiện gen, theo dõi quá trình lên
men của vi khuẩn và nấm men, sản xuất protein tái tổ hợp trong vi khuẩn, nghiên
cứu môi trường, chế biến thực phẩm, theo dõi chất lượng nước uống.

d, BD FASCCalibur Flow cytometer

https://www.selectscience.net/register_product.aspx?
itemID=210457&itemTypeID=3&linktype=info
https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/clinical-
cell-analyzers/calibur-discontinuation

https://www.gmi-inc.com/product/gmi-bd-facscalibur-flow-cytometer/

e, MÁY LY TÂM LẠNH TỐC ĐỘ THẤP BKC-TL5RIV BIOBASE

https://biobase.com.vn/may-ly-tam-lanh-toc-do-thap-bkc-tl5riv-biobase_p906.html

Mã sản phẩm: BKC-TL5RIV

Đặc trưng:

* Màn hình LCD, điều khiển thông minh, có thể chạm và nhấn nút.

* Động cơ không chổi than: mô-men xoắn cao và tần số thay đổi, kết hợp với bộ giảm
xóc.

* Tự động ghi lại các thông số, có thể bắt đầu bằng RCF trực tiếp.
* Buồng bằng thép không gỉ.

* Tắt tiếng khóa cửa động cơ cơ điện tử.

* Hơn 20 quy trình có thể lựa chọn và các chế độ tự xác định tự do.

* 10 cấp độ điều khiển tăng tốc và giảm tốc độ.

Thông số kĩ thuật:

 Tối đa Sức chứa: 4 * 250ml

 Tối đa Tốc độ: 5500 vòng / phút

 Tối đa RCF: 4800 × g

 Tốc độ chính xác: ± 50 vòng / phút

 Hệ thống lạnh: Máy nén và van điều khiển không chứa CFC

 Nhiệt độ Phạm vi:-20 ~ 40 ℃

 Nhiệt độ Độ chính xác:± 1 ℃

 Hệ thống điều khiển và truyền động: Động cơ tần số, điều khiển vi mô, truyền
động trực tiếp

 Phạm vi thời gian: 0 ~ 99h59 phút

 Tiếng ồn:≤65dB

 Tiêu dùng: 1,8KW

 Nguồn cấp: AC110 / 220V, 50 / 60Hz

 Kích thước bên ngoài (W * D * H) mm: 630 * 760 * 400

 Kích thước gói (W * D * H) mm: 830 * 950 * 600

  Khối lượng tịnh / tổng (kg): 110/135

f, Hệ thống Western blot

https://bde.vn/san-pham/he-thong-western-blot-1862.html

Cấu hình cung cấp

f.1, Bộ điện di đứng kèm đầy đủ phụ kiện tiêu chuẩn: 01 bộ, Model: BlueVertical™
PriME, Catno:BV104, Xuất xứ: Serva-Đức

f.2, Bộ nguồn cho bể điện di Protein kèm đầy đủ phủ kiện tiêu chuẩn: 01 máy,
Model: BP-300-BLO, Xuất xứ: Serva-Đức

f.3, Bộ chuyển protein lên màng lai: 01 máy, Model: BlueBlot Semi-Dry Blotter SD,
Catno: BB-SD17, Xuất xứ: Serva-Đức

f.4, Thiết bị lên phim: 01 máy, Model: Gravity Blotter, Xuất xứ: serva-Đức

f.5, Hệ thống chụp ảnh Gel Western Blot:01 máy, Model: BIO-5000 plus, Hãng sản xuất:
Serva - Đức

Chỉ tiêu kỹ thuật

f.6, Bộ điện di đứng, Model: BlueVertical™ PriME, Catno:BV104, Xuất xứ: Serva-Đức

- Hệ thống bể điện di mini hoàn hảo để chạy gel đúc sẵn trong các ứng dụng SDS PAGE,
native PAGE, IEF hoặc axit nucleic PAGE. Hệ thống kẹp sáng tạo độc đáo giữ cho gel
cassettes ở vị trí chính xác bên trong module, không bị rò rỉ và sẵn sàng để bắt đầu trong
vài giây. Các tính năng hoạt động thuận tiện được tích hợp giúp cải thiện công việc hàng
ngày

- Thiết bị bao gồm một bể đệm bên ngoài và bộ phận lõi chạy bên trong. Gắn gel đúc sẵn
không yêu cầu kẹp mà chỉ mất vài giây. Các bể đệm bên ngoài được làm từ acrylic nhám
trong suốt – có thể quan sát gel của bạn trong khi chạy! Nắp an toàn đóng phía trên, tạo
cho thiết bị có một thiết kế rất nhỏ gọn và mạnh mẽ. Nhất thiết phải đặt máy vào một bề
mặt bằng phẳng. Máy phù hợp với các hướng dẫn an toàn châu Âu (có nhãn hiệu CE)

- Cấu tạo dạng module.

- Thể tích đệm sử dụng thấp: tối thiểu 200ml; tối đa 450ml

- Kích thước của tấm kính (W x H x T)): 10 x 10 x 0,7cm.

- Kích thước của gel (W x L): 10x10 cm.

- Điện áp max: 500 volt

- Điện cực: Dạng thanh, mạ platinum

- Kích thước hệ thống (W x D x H): 16 x 15.6 x 9.5 cm

f.7, Bộ nguồn cho bể điện di Protein, Model: BluePower 3000 HPE™, Xuất xứ: Serva-
Đức

BluePower 300 phù hợp với các ứng dùng yêu cầu dòng điện cao như Blotting hoặc
Semi-Dry Blotting đối với Gel protein lớn. Ngoài ra, cũng được dùng cho điện di Nucleic
acid.
Có 4 đầu ra và chương trình cài đặt

Nguồn dễ dàng sử dụng, an toàn và đáng tin cậy.

Bảo vệ quá tải. Tự động tắt khi không có tải kèm theo.

Thông số kỹ thuật

 Điện áp đầu ra/Inc: 0-300V/1V

 Dòng ra lên tới: 2A

 Công suất đầu ra: 300W

 Terminal pair: 4 pair

 Chương trình: 9 x 9 bước

 Hẹn giờ: theo đơn vị giờ (h) hoặc vh.

 Đăng nhập dữ liệu tự do, chuyển và điều khiển thông qua cáp USB

 Nguồn điện:100 - 240V

f.8, Bộ chuyển màng lai, Model: BlueBlot Semi-Dry Blotter SD 17, Catno: BB-SD17,
Xuất xứ: Serva-Đức

- Bộ chuyển mang lai BlueBlot tạo thành một khối đồng nhất, đảm bảo chuyển protein
nhanh chóng và hiệu quả từ gel sang màng.

-Thời gian chuyển màng lai các protein được thực hiện nhanh chóng và hiệu quả trong
vòng 15 phút.

- Ba định dạng cho các kích cỡ gel khác nhau BlueBlot có sẵn với các vùng blotting với
ba kích thước: 11 cm x 11 cm, 17 cm x 17 cm và 24 cm x 26 cm.

-Với hệ thống BB-SD17, có thể blotting đồng thời 8 gel nhỏ.

Tính năng, đặc điểm:

-Lưới thép phủ Platinum làm cực dương

-Cực dương gắn spring cho blotting xếp chồng

-Tấm thép không gỉ làm cực âm

-Vùng blotting từ 11 cm x 11 cm đối với minigel và lên đến 24 cm x 26 cm đối với 2D

gel

-Có thể triển khai cho gel dày hơn và blotting xếp chồng

- Lựa chọn BlueBlot™ SD17

-Vùng Blotting: 17 cm x 17 cm

- Phạm vi hoạt động: 0.8 – 3.5 mA/cm²

- Điện áp yêu cầu: 200 V, 1000 mA

- Kích thước: 31 cm x 23 cm x 11 cm

- Trọng lượng: 3 kg

f.9, Thiết bị lên phim, Model: Gravity Blotter, Xuất xứ: serva-Đức

- Khung nhôm nhẹ.

- cho phép đọc kết quả blot dựa trên phim IEF, TRANG SDS vàGel 2D với hiệu quả cao

- Tiếp xúc phim tối ưu đạt được bằng cách sử dụng miếng chèn được thiết kế đặc biệt
kích thước: 14x29 cm.

- Thời gian chuyển màng 4h hoặc qua đêm.

- Các nút ấn khóa nhẹ và cấu trúc nhôm nhẹ mang đến sự dễ sử dụng.

- Kích thước Cassette : 24 x 29 cm.

f.10, Máy scan bản Gel, Model: BIO-5000 plus, Hãng sản xuất: Serva - Đức
Đặc tính

Máy quét BIO-5000 Plus VIS Gel là một máy quét được thiết kế đặc biệt để quét các gel
điện di và blots bằng cách phát hiện trực quan.

Máy được trang bị đèn LED tiết kiệm năng lượng và một CCD quang có độ phân giải lên
tới 4.800 dpi. Phạm vi của mật độ quang học là từ 0,05 đến 3,77 OD cung cấp một cách
thông minh để biết sự khác biệt giữa mỗi lớp gel điện di được quét.

Với chức năng tự động lấy nét tích hợp, BIO-5000 Plus có khả năng chuyển độ dài tiêu
cự để cho hình ảnh có chất lượng tốt nhất. Bằng thiết kế của Emulsion Direct Image
Technology (E.D.I.T.) và bộ giữ gel điện di. Dễ dàng đưa mẫu và máy và giảm nguy cơ
lây nhiễm lẫn nhau trong các thí nghiệm. Do đó, BIO-5000 Plus là lựa chọn tốt nhất để
scan các gel điện di.

ø Bộ giữ gel để quét các gel điện di ướt trong chế độ truyền

ø Quét các màng màu đã được nhuộm ở chế độ hồi phục

ø Nguồn sáng LED tiết kiệm năng lượng.

ø Thời gian làm ấm ngắn

Cảm biến ảnh CCD

ø Độ phân giải lên tới 4.800 dpi

ø Phạm vi đo đến 3.7 O.D

ø Tự động lấy tiêu điểm cho chất lượng hình ảnh cao nhất

ø Phần mềm quét dễ sử dụng

ø Diện tích quét lên đến 216 mm x 254 mm

Thông số kỹ thuật

Chế độ quét: Màu và màu xám, quét một lần

Màu 48 bit
Màu xám 16 bit (65,536 gray)

Khu vực quét: Tối đa 216 x 356 mm

Truyền: tối đa. 216 x 254 mm

Độ tuyến tính: 3.7 OD

Độ phân giải: 4,800 dpi x 9,600 dpi

Giao diện: USB 2.0 tốc độ cao

Kích thước: 385 x 158 x 567 mm

Trọng lượng: 12 kg

g, Máy Real-time PCR LineGene 9600 Plus, Bioer (FQD-96A

https://www.tbr.vn/vi/product/108-may-realtime-pcr.html
LineGene 9600 là máy Real-time PCR thế hệ mới sử dụng công nghệ định lượng huỳnh
quang high-sensitivity photomultiplier (PMTs) với độ chính sác và độ đặc hiệu cao. Các
dòng máy thuộc gia đình LineGene có chất lượng ổn định, thể tích phản ứng đa dạng và
khả năng mở rộng các kênh màu khác nhau. Sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng ISO
(9001:2000), Ferrotec Pelitier / Met / CE / RoHS / CE-IVD

Bộ phận luân nhiệt:

- Hệ thống cung cấp kèm block nhiệt 96 giếng phân tích cùng lúc 96 mẫu, thể tích mẫu
5-100µl, Block. Sử dụng công nghệ cao chống bay hơi tới mức tối đa với nắp nhiệt tự
điều chỉnh. Việc điều chỉnh độ cao của nắp giúp cho thiết thị thích nghi với các loại tube
0.2ml thông dụng hiện nay ở dạng plate, strip hoặc riêng lẻ từng tube. Đây là đặc điểm rất
quan trọng, một số dòng máy có block nhiệt chỉ sử dụng tốt với các loại tube đặc dụng.
Hiện nay, các kit sinh học phân tử gần như sử dụng tube 0.2ml thông thường.
- Có chức năng tự động cài đặt chương trình PCR hoặc cho phép người sử dụng tùy chỉnh
chương trình. Số lượng chương trình lưu không giới hạn. Khi thực hiện PCR, real-time
PCR, có đồ thị hiển thị quá trình và các thông số của toàn bộ quy trình PCR, real-time
PCR. Tất cả các chức năng đều được điều khiển bằng máy vi tính, do đó đạt độ chính xác
tối đa.
- Trên thân hệ thống real-time PCR không thiết kế bất kỳ phím chức năng nào (ngoài
công tắc on/off) để người sử dụng không được can thiệp trực tiếp trên máy bằng tay, tất
cả các chức năng đều được điều khiển bằng máy vi tính, do đó đạt độ chính xác tối đa,
đây là thiết kế khuyến cáo cho các hệ thống kỹ thuật cao (trong đó có real-time PCR).
- Gia giảm nhiệt có thể lên đến 40C/s.
- Độ chính xác, ổn định nhiệt: ±0.20C. Khoảng nhiệt độ hoạt động: 40C-1050C.
- Độ đồng nhất nhiệt giữa các giếng: ±0.40C, độ đồng nhất nhiệt càng thấp thì độ chính
xác giữa các giếng cũng như mẫu thí nghiệm càng cao.

- Đặc biệt khả năng Gradient nhiệt độ với khoảng gradient 360C, phù hợp cho việc nghiên
cứu và set up quy trình thí nghiệm.

Bộ phận phân tích quang học:

- Đây là phần quan trọng nhất của 1 hệ thống real-time PCR, quyết định rất lớn đến kết
quả, do đó phải chọn hệ thống có công nghệ hiện đại và tối ưu nhất. Hệ thống quang học
sử dụng công nghệ high-sensitivity photomultiplier cho phép quét tín hiệu đến từng giếng
một. Cường độ tín hiệu thu nhận từ các giếng là đồng nhất, do đó, tận dụng được tất cả
các giếng của block (không phải bỏ trống các giếng cạnh và góc của block như CCD
Camera). high-sensitivity photomultiplier là công nghệ hiện đại nhất hiện nay có độ nhạy
và độ chính xác cao hơn hẳn công nghệ CCD Camera và Photodios, đã được hiệu chỉnh
bởi nhà sản xuất, người sử dụng không cần hiệu chỉnh trong suốt quá trình sử dụng như
CCD Camera (do đó không phải tốn tiền mua hóa chất chuẩn máy thường xuyên).
- Sử dụng nguồn sáng kích thích theo công nghệ longlife LED Bước sóng kích thích:
300-800nm. Bước sóng phát hiện: 500-800nm. Việc sử dụng đèn Leds giúp cho tín hiệu
huỳnh quang ổn định và nâng cao tuổi đời của thiết bị.
- Đọc được hầu hết các màu huỳnh quang hiện nay, với 5 kênh màu huỳnh quang sau:

F1: FAM/SYBR® Green I

F2: TET, HEX, JOE, VIC, Cy3, TAMRA, NED

F3: ROX, Texas Rad

F4: Cy5

F5: Cy5.5.

Phát hiện cùng lúc nhiều đối tượng mà không sử dụng các màu tham chiếu. Đặc biệt có
thể nâng cấp lên thành 8 kênh màu phục vụ tối đa các ứng dụng của real-time PCR.

Các đặc điểm chung:

- Đặc biệt, thông tin dữ liệu của lần thí nghiệm gần nhất luôn được lưu lại trên máy real-
time PCR, do đó nếu có sự cố về điện hay máy tính trong quá trình thí nghiệm thì vẫn có
thể lấy lại kết quả được mà không cần phải thực hiện lại thí nghiệm.
- Hệ thống có thể sử dụng cho chức năng real-time PCR hoặc PCR thông thường (không
cần bật hệ thống quang học khi sử dụng chức năng PCR).
- Hệ thống mở, có thể sử dụng tất cả các loại hóa chất có sẵn hoặc tự pha chế hiện nay.
Thực hiện được hầu hết các kiểu real-time PCR hiện nay: SYBR Green, Ethidium
Bromide, Molecular Beacon, Taq Man, Scorpions, Sunrise, Proximal, Elle Quencher,
Eclipse Dark, Double-Dye, Eclipse, ResonSense, Light-up, Hy-Beacon…
- Đường truyền tín hiệu thông qua cổng COM, việc kết nối và điều khiển trên 1 máy
tính . Vệ sinh, bảo dưỡng máy dễ dàng.
- Báo lỗi, ngừng khi gặp sự cố về điện hay lỗi chương trình.
- Phản ứng Realtime PCR diễn ra trong một tube kín, loại bỏ nguy cơ ngoại nhiễm sản
phẩm khuếch đại, không tiếp xúc với hoá chất độc, bảo vệ người sử dụng và môi trường.
- Kích thước: 410mm x 386mm x 352mm (LxWxH)

- Trọng lượng: 28Kg.

- Sử dụng điện 220V/50Hz, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam.

Phần mềm phân tích kết quả:

- Phần mềm hữu hiệu với tất cả các chức năng của real-time PCR. Tích hợp phân tích
đỉnh “chảy” – melt-curve analysis, Phân tích đa hình SNPs,…
- Phân tích định lượng bằng số copy, nồng độ dựa trên đường chuẩn và thuật toán hồi
quy.
- Dữ liệu về mẫu có thể truy xuất và phân tích lại bất kỳ lúc nào.
- Dễ dàng truy cập dữ liệu thô.
- Các kiểu báo cáo đa dạng và công cụ phân tích kết quả có thể được in ra trực tiếp hay có
thể truy xuất sang dạng văn bản Excel, Power Point...
- Phần mềm điều khiển, quản lý, phân tích dữ liệu, báo cáo dễ sử dụng, được liên tục cập
nhật miễn phí bởi nhân viên kỹ thuật của chính hãng.
Tài liệu tham khảo

[1] "Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP)," CDC, [Online]. Available:

https://www.cdc.gov/vaccines/acip/recs/grade/ebola-vaccine-etr.html. [Accessed 9 12 2023].

[2] A. M. Tatara, "Chapter 26 - Modeling viral infection with tissue engineering: COVID-19 and the next
outbreaks," in Tissue Engineering, 2022, p. 647.

[3] "products," ATCC, [Online]. Available: https://www.atcc.org/products/crl-1586. [Accessed 9 12

2023].

[4] "oxford instruments," oxford university, [Online]. Available:

https://andor.oxinst.com/learning/view/article/hek-293-cells. [Accessed 10 12 2023].

[5] E. Tan, "HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors," Front.
Bioeng. Biotechnol., 2021.

[6] t. R. D. L. A. H. W. L. AMES B. MOE, "Plaque Assay for Ebola Virus," JOURNAL OF CLINICAL
MICROBIOLOGY, , 1981.

[7] †. J. E. B. 2. A. E. K. 2. E. E. Z. 3. Amy C. Shurtleff 1, "Standardization of the Filovirus Plaque Assay for

Use in Preclinical Studies," Viruses, 2013.

[8] *. J. H. K. H. E. T. N. G. N. H. F. a. Y. K. Peter Halfmann, "Generation of biologically contained Ebola

viruses," Proc Natl Acad Sci U S A, 2008.

[9] 1. N. B. V. V. B. H. N. A.-D. O. R. S. B. a. V. V. Miguel J. Martínez, "Role of Ebola Virus VP30 in

Transcription Reinitiation," journal of virology, 2008.