BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA SINH 1

BÀI 3.1

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA PROTEIN

I/ MỤC TIÊU BÀI THỰC HÀNH

 Trình bày được nguyên tắc của các phương pháp kết tủa protein.
 Thực hiện một số phản ứng hóa học dựa trên các tính chất hóa học và vật lý của acid
amin, peptide và protein đã học.
 Thực hiện được các phản ứng kết tủa protein.
 Nhận định, biện luận và giải thích kết quả

II/ THỰC HÀNH

1. Thí nghiệm 1: Phương pháp kết tủa protein bằng muối trung tính nồng độ cao
1.1. Kết tủa albumin và globulin bằng NaCl
a. Nguyên tắc:
Các muối trung tính có nồng độ cao như NaCl, (NH4)2SO4... để trung hòa điện tích và
kết tủa protein.
Các protein khác nhau sẽ tủa ở những nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể tách riêng
các protein ra khỏi hỗn hợp.
Sự kết tủa này là thuận nghịch, khi giảm nồng độ muối bằng cách pha loãng hay thẩm
tích thì albumin và globulin sẽ hòa tan trở lại.
b. Vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch protein trứng khoảng 1%

- Dung dịch NaCl bão hòa

- Bột NaCl mịn

- Dung dịch CH3COOH 1% (AcOH 1%)

- Thuốc thử Biuret (dd NaOH 10% và CuSO4 1%)

c. Dụng cụ và máy móc:

- Cốc thủy tinh, Đũa thủy tinh

- Ống nghiệm nhỏ, to. Giá đựng ống nghiệm

- Pipet 5ml

- Phễu nhỏ, giấy lọc

- Đèn cồn

d. Cách tiến hành

- Bước 1: Trong cốc thủy tinh cho 15 ml dung dịch protein trứng 1%. Thêm 15ml dd
NaCl bão hoà. Quan sát hiện tượng, lấy 2ml → dung dịch 1

- Bước 2: Thêm bột NaCl đến bão hòa hoàn toàn (còn một ít bột không tan). Sau vài phút,
globulin sẽ tủa. Lọc bỏ tủa globulin. Lấy 1/3 dung dịch → dung dịch 2

- Bước 3: Thêm vào dịch lọc 1 giọt acid acetic 1% rồi đun sôi, albumin sẽ kết tủa. Sau vài
phút, lọc lại tủa albumin → dung dịch 3

* Làm phản ứng Biuret như sau:

- Trong 1 ống nghiệm cho: 20 giọt dịch prtotein + Thuốc thử Biuret

(tỷ lệ dd:NaOH:CuSO4 = 5:3:1)

- Lắc đều. Quan sát kết quả phản ứng và biện luận.

e. Kết quả và biện luận

- Kết quả sau bước 1: Không có hiện tượng xảy ra

- Sau bước 2: Thấy có tủa trắng nổi lên trên

- Kết quả sau khi làm phản ứng Biuret:

STT Hiện tượng Giải thích

• Ở ống 1 có màu xanh tím đậm nhất
Sau khi làm phản ứng Biuret,
Ống nghiệm 1 thấy dung dịch chuyển dần sang vì nó có cả albumin và globulin nên
cả 2 cùng tham gia vào phản ứng
màu xanh tím.
Biuret vì vậy cho màu đậm nhất.
 • Màu
xanh tím ở ống 2 nhạt hơn ống
1 do đã bị lọc đi kết tủa của globulin
vì vâỵ khi phản ứng Biuret chỉ còn
albumin tham gia nên cho màu nhạt
hơn.
Vì sao khi cho NaCl bão hòa thì
globulin kết tủa?
➭ Vì khi NaCl bão hòa sẽ cho thêm
nhiều ion Na+ khi đó Na+ sẽ trung hòa
điện tích với globulin-. Nên globulin
sẽ kết tủa.
Vì sao globulin lại phản ứng với
Ống nghiệm 2 Có màu xanh tím nhưng nhạt hơn NaCl bão hòa trước albumin?
ống nghiệm 1. ➭ Vì phân tử globulin có trọng lượng
phân tử lớn hơn nên diện tích tiếp
xúc lớn vì vậy nó phản ứng với NaCl
bão hòa nhanh hơn albumin.
Vì sao ở ống nghiệm 1 cũng cho
dung dịch NaCl bão hòa nhưng
globulin lại không kết tủa trước?
➭ Vì khi cho NaCl dung dịch bão
hòa vào sẽ bị hòa tan với dung dịch
protein trứng nên NaCl sẽ không còn
bão hòa nữa. Vì vậy globulin không
kết tủa.
• Màu xanh lam ở ống nghiệm 3 thực
chất là màu của CuSO4 vì albumin
đã được loại bỏ ở bước lọc tủa.
Cho thêm 1 giọt acid acetic 1% có ý
Ống nghiệm 3 Chỉ thấy màu xanh lam nhạt. nghĩa gì?
➭ Cho thêm acid acetic tức là ion H+
sẽ được thêm vào làm cho tốc độ kết
tủa của albumin diễn ra nhanh hơn.

1.2. Kết tủa albumin và globulin bằng (NH4)2SO4

a. Nguyên tắc

Các muối trung tính có nồng độ cao như NaCl, (NH4)2SO4...để trung hòa điện tích và
kết tủa protein.
Các protein khác nhau sẽ tủa ở những nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể tách riêng
các protein ra khỏi hỗn hợp.

Sự kết tủa này là thuận nghịch, khi giảm nồng độ muối bằng cách pha loãng hay thẩm
tích thì albumin và globulin sẽ hòa tan trở lại.

b. Vật liệu thí nghiệm

- Dung dịch protein trứng khoảng 1%

- Dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa

- Bột (NH4)2SO4 mịn

- Thuốc thử Biuret (dd NaOH 10% và CuSO4 1%)

c. Dụng cụ và máy móc

- Cốc thủy tinh

- Ông nghiệm to, nhỏ

- Giá đựng ống nghiệm

- Pipet 5ml

- Phễu nhỏ, giấy lọc

d. Cách tiến hành

- Bước 1: Trong cốc thủy tinh cho 15 ml dung dịch protein trứng 1%, thêm 10 ml dung
dịch (NH4)2SO4 bão hòa, globulin sẽ tủa

- Bước 2: Sau 5 phút, lọc để loại tủa globulin. Trong dịch lọc còn lại albumin → dung
dịch 1
- Bước 3: Thêm một ít bột (NH4)2SO4 cho đến bão hòa (còn dư một ít không tan), tua
albumin sẽ nổi lên trên → lấy 1/2 dung dịch lọc tủa → dung dịch 2

- Bước 4: Thêm nước cất vào ống nghiệm để làm mất nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4.
Tủa albumin sẽ hòa tan trở lại > dung dịch 3.

- Bước 5: Trong 1 ống nghiệm cho: 30 giọt dịch protein hòa tan + Thuốc thử Biuret

(tỷ lệ dd:NaOH:CuSO4 = 5:3:1). Sau đó lắc đều các ống nghiệm.

e. Kết quả và biện luận

- Kết quả sau bước 1 và bước 2: Thấy xuất tiện tủa màu trắng đục.

- Ở bước 3: Khi cho bột (NH4)2SO4 đến bão hòa, không thấy có tủa nổi lên.
- Sau khi làm phản ứng Biuret, cả 3 ống nghiệm đều cho ra màu xanh lam nhạt.

* Giải thích hiện tượng trên:

- Tại bước 1 khi cho 10 ml dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa vào dung dịch protein trứng,
các phân tử muối (NH4)2SO4 phân ly thành các các ion, các ion này liên kết với các phân
tử nước làm cho protein mất lớp áo nước, đồng thời làm trung hòa điện tích của protein
khiến chúng liên kết lại với nhau và hình thành kết tủa. Tuy nhiên nồng độ (NH4)2SO4
cho vào quá cao sẽ làm cho cả 2 loại protein là albumin và globulin cùng kết tủa.

- Vì cả 2 loại protein là albumin và globuin cùng kết tủa nên khi lọc đã đồng thời lọc hết
protein ra khỏi dung dịch → từ đó ở ống nghiệm số 1, 2 và 3 đã không còn protein. Nên
khi làm phản ứng Biuret chỉ thấy được màu xanh lam nhạt - là màu của CuSO4.

2. Thí nghiệm 2: Phương pháp tủa protein bằng dung môi hữu cơ

2.1. Nguyên tắc

 Dung môi hữu cơ như aceton, ethanol với hằng số điện môi nhỏ ngăn cản sự phân tán
của các phân tử protein trong môi trường → Protein kết tủa bông hoặc bị vẩn trong
dung môi hữu cơ như alcol, aceton...
 Phản ứng tủa do protein bị mất lớp áo nước, tủa càng dễ dàng nếu có thêm các chất
điện giải NaCl.
2.2. Vật liệu thí nghiệm

- Dung dịch protein trứng khoảng 1%

- Ethanol 96%

- Dung dịch NaCl bão hòa

2.3. Dụng cụ và máy móc

- Ông nghiệm nhỏ, giá đựng ống nghiệm

- Pipet 5ml, 10ml

2.4. Cách tiến hành

- Cho vào một ống nghiệm: 5 giọt dung dịch protein trứng 1% + 1ml ethanol 96%

- Dung dịch sẽ vẩn đục: thêm 1 giọt NaCl bão hòa

2.5. Kết quả và biện luận

STT Hiện tượng Giải thích

• Bản
chất của dung dịch Ethanol
96% là cồn có nồng độ cao vì vậy
nó có tính háo nước. Khi cho tác
dụng với dung dịch protein trứng,
nó sẽ làm protein mất đi lớp áo nước
dẫn đến xuất hiện tủa.
Cho thêm 1 giọt NaCl có ý nghĩa
gì?
➭ NaCl là chất điện giải, khi cho
Ống nghiệm 1 Xuất hiện kết tủa màu trắng đục thêm NaCl vào các ion Na+ và Cl-
các ion này sẽ trung hòa điện tích
với các phân tử protein làm cho tốc
độ kết tủa xảy ra nhanh hơn.

• Khi các phân tử protein đã bị mất

đi cả 2 yếu tố hòa tan là:
+ lớp áo nước
+ điện tích cùng dấu
→ Protein kết tủa nhanh và rõ ràng
hơn.